Memoria de prácticas, Ejercicios de Emriología
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Memoria de prácticas, Ejercicios de Emriología

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Asignatura: Embriología Básica, Profesor: Pablo Pablo, Carrera: Biología, Universidad: UAM
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Memoria de prácticas de Embriología Básica. Pablo Marco Moreno

Memoria de prácticas de Embriología general

Índice de la memoria Pág. 2-() Presentación, conceptos generales y material de estudio

() Pág. 12- Espermatogénesis en invertebrados (ortópteros)

 Marco histórico  Marco teórico  Material y métodos  Observaciones realizadas  Cuestiones

() Pág. 19- Espermatogénesis en vertebrados (mamíferos)

 Maco histórico  Marco teórico  Material y métodos  Observaciones realizadas  Cuestiones

()Pág. 27- Ovogénesis en invertebrados (ortópteros) y en vertebrados (anfibios)

 Marco histórico  Marco teórico  Material y métodos  Observaciones realizadas  Cuestiones

() Pág. 32- Foliculogénesis en vertebrados (mamíferos)

 Marco histórico  Marco teórico  Material y métodos  Observaciones realizadas  Cuestiones

Pág. 36-() Fecundación en equinodermos

 Marco histórico  Marco teórico  Material y métodos  Observaciones realizadas  Cuestiones

() Pág. 43- Bibliografía

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Memoria de prácticas de Embriología Básica. Pablo Marco Moreno

Presentación, conceptos generales y material de estudio

Embriología básica, conceptos teóricos básicos

La embriología es la rama de la biología que estudia el desarrollo embrionario de los seres vivos y su morfogénesis entre la fecundación y el nacimiento, mientras que la biología del desarrollo amplía a otros procesos de desarrollo posteriores. Nosotros nos centraremos en animales.

Las etapas del desarrollo que pueden ser más o menos generalizables al conjunto del reino son:

Fecundación: fusión de material genético a partir de dos gametos.

Embriogénesis: periodo que se desarrolla entre la fecundación y (la etapa adulta ). Existe una gran variedad de tipos embrionarios, pero la mayoría de los patrones son variaciones sobre cinco tópicos principales:

Segmentación: divisiones mitóticas rápidas donde el volumen total del embrión se mantiene constante. Las unidades celulares formadas durante esta fase se denominan blastómeros y el embrión en esta fase mórula. Posteriormente y fruto de esta proliferación se genera el blastocele, que originará posteriormente el celoma o el pseudoceloma, dando lugar a la blástula.

Gastrulación: los blastómeros experimentan movimientos morfogenéticos de reorganización del embrión, originando la gástrula. Como resultado el embrión adquiere las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo, así como una nueva cavidad, el gastrocele, conectada con el exterior a través del arquénteron.

Organogénesis: las células intraccionan recíprocamente entre ellas, reorganizándose y diferenciándose para constituir órganos y tejidos a partir de las tres hojas embrionarias. Algunos órganos contarán con tejidos provenientes de más de una capa germinal.

Estadios larvarios: estadios en los que los individuos no son sexualmente maduros. Se pueden dar procesos de metamorfosis o cambios más graduales hasta adquirir las características secundarias.

Gametogénesis: las células de la línea germinal, diferenciadas de las células somáticas gracias a la acción del plasma germinal (plasma contenido en este tipo celular que inhibe la diferenciación de la célula) producirán los precursores de los gametos: células “n” y “c”, es decir, (con una sola carga genética y un número de cromosomas correspondiente a una sola dotación de homólogos)

Modelos experimentales

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En embriología, como en casi todas las ramas de la biología, se escogen como material de estudio ejemplares de ciertas especies que responden bien al tipo de estudio que pretendemos llevar a cabo, y que son más o menos representativas dentro de un grupo mayor. De esta forma se suele hacer una generalización a partir de un caso conocido a la hora de explicar las características de un proceso en un grupo de animales, aunque conviene siempre matizar en qué modelo experimental se ha llevado a cabo el estudio para no caer en el error. Expongo a continuación los modelos de análisis más frecuentes, especificando cuales hemos utilizado nosotros en el laboratorio.

Invertebrados

Equinodermos: Los utilizaremos en la práctica de fecundación. Son fácilmente asequibles. Además se puede forzar su eyaculación y ovulación, son fáciles de fecundar y tienen un embrión transparente por lo que se pueden establecer mapas de destino.

Caenorhabditis elegans (nematodo): Se tienen gran cantidad de datos sobre su desarrollo (como el nñumero exacto de células en cada etapa). Sólo hay machos y hermafroditas y son transparentes.

Parascalis aequorum(nematodo): Tiene 2n=4, por lo que es fácil su estudio génico y cromosómico.

Locusta migratoria (artrópodo, insecto, ortóptero): Los utilizaremos en la práctica sobre espermatogénesis y oogénesis de invertebrados.

Drosophila melanogaster (artrópodo, insecto, díptero): un inmenso banco de datos y gran colección de mutantes de este díptero. Genoma conocido, número cromosómico bajo y fácil cría.

Vertebrados

Peces: el más utilizado es Brchydanio rerio (pez cebra)  Ranas y sapos (anfibios, anuros): Principalmente Xenopus

laevis, un sapo africano carnívoro muy expansivo que tiene un embrión grande y transparente.

Aves: principalmente aves comestibles, a causa de nuestro consumo tradicional de huevos de dichas aves hay numerosos estudios al respecto de su desarrollo embrionario.

Roedores: principalmente ratas, ratones y hámsters. También gran conocimiento de su genoma y gran colección de mutantes.

Primates: actualmente sólo en mandriles porque su espermatogénesis es similar a la de humanos.

Humanos: enfocado principalmente en los primeros estadios del desarrollo)

Gametogénesis

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La gametogénesis es un conjunto de procesos por los cuales se forma el gameto masculino y el femenino. Todos los gametos se originan a partir de célula germinales primordiales (CGP). En muchos casos, como ranas, nematodos y moscas, las CGP son especificadas autónomamente por componentes citoplasmáticos presentes en el gameto femenino, que luego, durante la segmentación serán repartidos a células específicas. En otros casos, como en salamandras y mamíferos, las CGP son especificadas mediante interacciones entre las células vecinas. En aquellas especies en las que la determinación de las CGP es ocasionada por localización autonómica de proteínas y mRNA específicos, estos componentes son referidos en su conjunto como plasma germinal. En el resto (reptiles y mamíferos) no hay plasma con las características indicadas.

Determinación de las CGP en nematodos

Los datos principales están recogidos sobre Parascaris aequorum. Se trata de un nematodo con únicamente dos cromosomas por célula haploide, los cuales presentan en sus extremos regiones de heterocromatina sin cinetocoro, lo que hace que dicha heterocromatina no se incorpore a la segunda división. El proceso comienza con una división en el plano ecuatorial (segmentación holoblástica rotacional), distinguiéndose ya un polo animal o anterior y un polo vegetal (el que se encuentra por debajo). En la primera división mitótica del polo animal (células de la línea somática), los extremos de los cromosomas del blastómero se fragmentan en una docena de partes justo antes de que la célula se divida. Este fenómeno se denomina disminución del cromosoma, ya que sólo sobrevive una parte del original, dado que cuando se restablece la membrana nuclear, esta no incorpora todos los fragmentos. En el otro blastómero (germinal), los cromosomas siguen siendo normales. Las células del polo animal se dividen meridionalmente, mientras quelas del vegetal siguen dividiéndose ecuatorialmente, quedando el plasma germinal en la célula inferior. El plasma germinal impide, por tanto, la disminución del cromosoma. En el estadio de 16 células, sólo dos no han experimentado disminución cromosómica (las más posteriores). De estas dos, una dará lugar a la línea germinal y la otra terminará perdiendo parte del cromosoma.

Todo esto ha sido demostrado mediante centrifugación de los huevos de Parascaris poco antes de su primera división, lo que produjo un reparto del plasma germinal y por lo tanto una inhibición de la pérdida cromosómica.

Determinación de la CGP en insectos

El trabajo está basado en Drosophila melanogaster. El huevo es centrolecito, y la segmentación de tipo meroblástica (es decir, que no se divide todo el embrión, sino sólo los núcleos) periférica. El núcleo se rodea de citoplasma activo. Se denomina enérgida al conjunto del núcleo con el citoplasma circundante. En las primeras divisiones se forman núcleos pero no se divide el citoplasma. Cuando el embrión tiene 8 enérgidas, todas excepto la del polo posterior (caracterizado por estar en el extremo opuesto

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al micrópilo, orificio de entrada del espermatozoide) pierden 32 de los 40 cromosomas, de tal modo que 2n=8. Esto es debido a que el plasma germinal se encuentra en el polo posterior por lo que es denominado plasma polar (experimento de Geyer-Duzynska (1959): estrangulamiento del embrión de modo que se imposibilitase la migración de los núcleos al polo posterior, lo que originó individuos estériles). Esta enérgida formará las células polares en el momento en que ocurra la migración de las enérgidas a la periferia (9ª división=512 núcleos) y su celularización.

El plasma polar de insectos dípteros está compuesto por una colección de mitocondrias, fibrillas, gránulos polares que impiden la actividad RNA polimerasa II y mRNAs maternos entre los que se encuentran el mRNA del gen germ cell-less (gcl), que se transcribe en las células nodrizas del ovario materno. La proteína que codifica parece ingresar en el núcleo y es esencial para la producción de células polares (mutaciones en ese gen producen embriones estériles). Otros mRNAs son los que codifican para la proteína Oskar, esencial para la formación de CGPs ya que parece ser un paso limitante en la formación de dichas células (más mensajeros de Oskar favorece la formación de un mayor número de CGPs) También encontramos en el plasma RNA nanos, cuyo producto es esencial para la formación del segmento posterior, ya que las células polares que carecen de él no migran hacia el dicho polo, así como el RNAm que codifica para la proteína Vasa, de unión al RNA.

Además de mRNA se observa la presencia de RNA ribosómico mitocondrial (mtrRNA), que está involucrado en dirigir la formación de célula polares, pero que no ingresa en ellas cuando se celularizan. La proteína Tudor es la que media el transporte de este mtrRNA de las mitocondrias al citoplasma. También está presente otro RNA no traducible llamado componente del gránulo polar, que, aún desconociendo su función exacta, se sabe que está involucrado en la posterior migración de la célula polares a las gónadas (transgénicos deficientes en este componente fracasan en la migración de las CGP a las gónadas).

Determinación de la CGP en anfibios

Estudios principalmente en Xenopus. Existen analogías entre el plasma polar de dípteros con el plasma germinal de anuros (propiedades similares de tinción). El plasma germinal consiste en gránulos germinales rodeados de una matriz, que se encuentran principalmente en el córtex de las células del polo vegetal. En estos gránulos se encuentran muchos de los RNAs y proteínas presentes en Drosophila (o análogos a ellos, como el Xcat, análogo de Xenopus de Nanos). El plasma germinal formando los agregados (gránulos más su matriz) permanece anclado a la masa de vitelo cerca de la corteza vegetal, moviéndose junto a ella durante la rotación cortical justo después de la fecundación y liberándose después para fusionarse entre sí y migrar al polo vegetal. La agregación depende de microtúbulos y los movimientos de una proteína tipo cinesina.

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Hipótesis del genoma inerte

La diferenciación celular depende de la producción de factores de transcripción que reprimen ciertas regiones DNA para que no se expresen, de modo que los productos de la traducción tiendan hacia un camino funcional)) Para permanecer en la totipotencialidad se necesita, por tanto, reprimir la transcripción y la traducción de forma que la célula no se diferencie. La hipótesis del genoma inerte establece que el plasma germinal no es sino eso, un conjunto de inhibidores de la transcripción y traducción que actúan de modo que las CGP puedan seguir siendo totipotentes.

Migración de las CGPs

- Insectos

Modelo para Drosophila. La primera etapa de la migración es pasiva, desplazándose unas 30-40 CGPs hacia el intestino medio posterior por los movimientos de gastrulación. Allí se dividen en dos grupos (uno para cada gónada) y experimentan movimiento activo ameboideo hasta extravasar a la región de las gónadas para su colonización.

- Anfibios

Estudiado sobre anuros (principalmente Xenopus). El plasma germinal, durante las primeras etapas de la embriogénesis, finalmente llega a estar asociado con las células endodérmicas que revisten el piso del blastocele. Las CGP acaban estando concentradas en la región posterior del intestino larval y a medida que se forma la cavidad abdominal, migran a lo largo del lado dorsal del intestino hacia las crestas genitales. Éstas migran a su vez, hasta que alcanzan las gónadas en desarrollo.

Las CGP se mueven con movimientos ameboideos a través de único filopodio que emiten para luego retraer a través de una red de fibronectina (guía por contacto, demostración con anticuerpos para fibronectina, Heasman y col. 1981). Las fibrillas por las que viajan pierden su polaridad poco después de que la migración. Las CGPs de Xenopus se dividen cerca de tres veces, colonizando la gónada aproximadamente 30 CGPs.

- Reptiles y aves

Las CGPs son derivadas del epiblasto. Desde ahí, migran a una zona del hipoblasto anterior llamada semiluna germinal, donde se multiplican. La migración posterior se produce a través del torrente sanguíneo hasta la región donde se está formando el intestino posterior. Se mantienen adheridas por medio de selectinas al endotelio hasta alcanzar su destino, donde atraviesan el endotelio por diapédesis para alcanzar las crestas urogenitales. La diapédesis comienza por la expresión en el endotelio cercano de una selectina diferente que ancla a las CGPs.

- Mamíferos

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Como he comentado antes, no hay plasma germinal detectable en mamíferos, ni una morfología distintiva de las CGPs durante las etapas iniciales del desarrollo. Las células de la línea germinal estás determinadas por interacciones entre células vecinas.

En estudios en ratones y tempranamente en el desarrollo embrionario, se observa que BMP4 y BMP8b presentes en el ectodermo extraembrionario le confieren a ciertas células de esta región la capacidad para producir células germinales. Los grupos de células capacitadas para la producción de CGPs expresan fragilis, que codifica para una proteína transmembrana. Estas células pueden formar CGPs pero también algunas células somáticas. En el centro de del grupo de células fragilis+ hay un pequeño conjunto de células que también expresan stella y que forman el grupo determinado para el destino celular germinal.

En observaciones in vivo tratadas con proteína fluorescente verde se evidencia que estas CGP migran hacia el endodermo desde la región posterior de la línea primitiva. Se piensa que las células que ingresan en el alantoides mueren. Tras permanecer en el intestino posterior, las CGP stella+ salen de este y posteriormente ingresan en las crestas genitales. Durante el transcurso de la migración van proliferando hasta que llegan un número entre 2500 y 5000, pasando a denominarse gonocitos una vez instalados en las gónadas.

La migración se produce por movimientos ameboideos a través de filopodios mediante guía por contacto con el tejido subyacente, atravesando las láminas por (diapédesis). Las CGPs son atraídas a las crestas por quimiotaxis ante factores paracrinos que son detectados por el receptor CXOR4.

Los gonocitos sufrirán destinos diferentes dependiendo si se trata de una hembra o un macho. En el caso de los machos su ciclo celular se paralizará en G0 hasta llegar a la adolescencia, mientras que los gonocitos femeninos comenzarán la ovogénesis paralizándose en dictiotena, reactivándose años más tarde uno en cada ciclo menstrual.

Ciclo celular

En el ciclo celular a partir de una célula se forman dos exactamente iguales. Hay una etapa en la que la célula no tiene actividad en su núcleo y otra en la que hay movimiento de la cromatina, son la interfase y la mitosis respectivamente. Al analizar bioquímicamente la interfase se ve que hay una gran actividad, el material genético se va a duplicar, es la fase S, antes hay un periodo presintético G1 y después un periodo postsintético G2 en los que no hay duplicación del ADN. La mitosis se divide en varias fases: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. Una célula tiene varias formas de salir del ciclo: en G1 o G2 en una situación que le permite volver a entrar, es el G0/G1 o G0/G2; o salir del ciclo definitivamente y diferenciarse.

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La carga del ADN es el peso del ADN, se define como 2C el peso que tiene cada uno de los núcleos de una célula en telofase. En número cromosómico 2n es constante en todo el ciclo celular.

ETAPA NUMERO CROMOSÓMICO

CARG A DNA

G1 2n 2c S 2n 2c-4c G2 2n 4c Dos células

formadas 2n 2c

1

Meiosis

La meiosis no se desarrolla de la misma manera durante la génesis de gametos femeninos y masculinos. En ambos casos el proceso puede durar mucho tiempo, aunque en el caso de la oogénesis es significativamente más larga (ver oogénesis en las respectivas prácticas dedicadas a su estudio)

La meiosis se presenta solamente en células germinales, en donde las células reducen su dote cromosómica y su carga de DNA a la mitad, con el fin de ser aptos para la fecundación

La meiosis consiste en dos divisiones celulares con una sola división cromosómica. La división meiótica, por tanto, se divide en dos partes: una primera división reduccional y la segunda división ecuacional.

Primera división meiótica

- Profase I: Es significativamente más larga que la profase mitótica. Consta de cinco estadios: Leptotene, cigotene, paquitene, diplotene y diacinesis.

Leptoteno e : En este estadio los cromosomas se hacen completamente visibles por compactación de la cromatina.

1 Representación de la carga de DNA en las diferentes etapas del ciclo y en el proceso meiótico y de fecundación.

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Cigotene: En esta parte de la profase los homólogos se buscan y se acercan para comenzar a unirse produciéndose el apareamiento de los mismos. Paquitene: Es el periodo que lleva más tiempo para llevarse a cabo. Se forman los bivalentes por apareamiento de los cromosomas homólogos. A continuación dos cromátidas homólogas se fragmentan al mismo nivel. Una vez se han fragmentado los cromosomas intercambian el material hereditario. Este intercambio de material genético se denomina entrecruzamiento o crossing over. El entrecruzamiento, es crucial en los mecanismos genéticos pues permite el intercambio de material hereditario y por tanto es productor de variabilidad en la reproducción sexual. En el lugar donde se llevo a cabo el entrecruzamiento, las cromátidas quedan unidas, mientras que el resto del bivalente se rechaza violentamente. El punto por el cual quedan unidas las cromátidas homólogas recibe el nombre de quiasma. Diplotene:La separación entre homólogos se hace enérgica y se visualizan bien los quiasmas. En un bivalente existe por lo menos un quiasma. Es raro hallar más de seis. Diacinecis:Se producen fenómenos de terminalización por los que los quiasmas se van desplazando hacia los extremos hasta desaparecer.

Así entonces nos quedan separados los cromosomas homólogos ya que los bivalentes desaparecen. Tales cromosomas homólogos de cualquier modo han quedado formados por dos cromátidas que permanecen unidas.

- Prometafase I: Los cromosomas homólogos (constituidos por dos cromátidas ) se dirigen hacía el ecuador.

- Metafase I: Los cromosomas se disponen en el plano ecuatorial. - Anafase I: Cada cromosoma homólogo (constituido por dos cromátidas)

se dirige hacia los polos respectivos. - Telofase I: Los cromosomas homólogos llegan al polo correspondiente. Se

reconstituye la membrana nuclear y se dividen las células. Segunda división meiótica.

- Profase: los cromosomas se hacen patentes. - Prometafase II: Cada cromosoma homólogo, en esta fase, se dispone en

el plano ecuatorial pausadamente. Tal ordenamiento terminará en la metafase.

- Metafase II: Los cromosomas se disponen decididamente en el ecuador celular.

- Anafase II: Cada cromátida de los cromosomas se dirige hacia un polo. - Telofase II: Los cromosomas han abordado los polos. Se reconstituye la

membrana nuclear - Citocinesis: Se divide la célula.

Métodos de laboratorio

Durante el transcurso de las sesiones de laboratorio hemos utilizado muestras de cortes de diverso tejidos sometidas a diferentes procesos de fijación y tinción. Dichos procesos son los siguientes:

Inclusión en parafina

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Se incluyen los tejidos en un medio sólido para poder realizar secciones de los mismos y poder analizar fácilmente las relaciones entre células de un tejido, o entre tejidos en un órgano. En general, los métodos de inclusión consisten en la sustitución del agua existente en las células, tejido y órganos, por un medio sólido. Como medio sólidos suelen utilizarse o bien una resina sintética o bien parafina. Este último método es e máas clásico para el análisis de tejidos animales mediante microscopía óptica. Tiene varias etapas:

- Fijación: Su finalidad es preservar lo mejor posible las estructuras celulares. Si el material está fijado e etanol-ácido acético (3:1) no necesita lavado tras ser fijado. Por el contrario, si la fijación se realiza utilizando formol o Bouin se debe lavar en agua corriente al menos por espacio de dos horas, pudiéndose prolongar hasta cuatro.

- Deshidratación: Tiene como finalidad el reemplazar el agua de los tejidos por otro líquido que puede ser alcohol o acetona. En nuestro caso se ha utilizado una serie de alcohol a distintas concentraciones.

En material vegetal se puede comenzar con alcohol al 10% mientras que en material animal se suele hacer con alcohol al 50%. Los tiempos de exposición para el reemplazo del agua son los siguientes dependiendo de las concentraciones:

alcohol etílico minutos

50% 20-60

60% 20-60

70% 20-60

80% 20-60

96% dos pases de 10

Absoluto tres pases de 10

- Aclaramiento: Su fin es reemplazar el alcohol por un líquido miscible con la parafina así como el reblandecimiento del material.

Benzoato de metilo tres pases de 10 minutos

Benceno dos pases de 15 minutos

* En benzoato de metilo se puede dejar almacenado el material hasta una semana.

** Es importante que las piezas se hundan en el benzoato de metilo.

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- Impregnación : Su finalidad es recambiar el líquido que hay en los espacios intercelulares y en la misma célula por parafina y de este modo poder realizar secciones.

Parafina-Benzol (1:1) de 20 a 40 minutos

Parafina pura tres pases de 20 minutos

* Si es necesario se puede dejar una noche en parafina sin que se deteriore el material en exceso.

- Inclusión: Su finalidad es obtener un soporte sólido en el que se encuentran incluidas las células o tejidos para poder realizar secciones suficientemente finas de los mismos en un microtomo.

* No se deben dejar las muestras en la estufa con parafinas ni en los alcoholes altos. Si es necesario almacenar una vez comenzado el proceso dejar en benzoato de metilo o bien en alcoholes por debajo del de 70%.

- Obtención de cortes: Las secciones de los bloques de parafina se obtienen en un microtomo, normalmente con cuchilla de acero. Estas secciones tienen un grosor variable trabajando normalmente con grosores entre 5 μm y 10 μm. Una vez obtenida una serie de cortes se depositan sobre agua a 40º C con objeto de que éstos se estiren.

-

Con portaobjetos sobre los que previamente se ha extendido albúmina se recoge la tira de cortes y se colocan planos en una estufa a 37º C durante toda la noche para evitar que se despeguen con los tratamientos posteriores.

Se pueden almacenar indefinidamente los cortes pegados en los portaobjetos preservándolos del polvo y del calor excesivo.

- Desparafinado: Los cortes sólo se desparafinan en el momento de realizar las tinciones. Para esto, se introducen sucesivamente en los siguientes líquidos:

Xilol tres pases de 10 minutos

Etanol absoluto dos pases de 10 minutos

Etanol 96% 10 minutos

Etanol 70% 10 minutos

Etanol 50% 10 minutos

Etanol 30% 10 minutos

Agua destilada 10 minutos

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Si el colorante que se va a emplear no está disuelto en agua se detiene en el alcohol en el que esté disuelto el mismo. Como en este caso vamos a realizar la tinción con tricrómico de Masson debemos llevar los preparados hasta agua.

Tinción con tricrómico de Masson

Colorear con hematoxilina férrica de Weigert durante 5 minutos. Se introducen posteriormente las preparaciones en agua corriente durante 5 minutos para diferenciar la hematoxilina.

Introducir los preparados en fucsina ácida-Ponceau durante 5 minutos y lavar con agua acidulada con ácido acético (1%) durante 2 minutos.

Se introducen las preparaciones por espacio de 5 minutos en orange G y se lavan 2 minutos con agua acidulada.

Por último se tiñe con verde luz durante 3 minutos, se lava con agua acidulada y se pasan por etanol absoluto rápidamente, el tiempo justo para deshidratar los preparados. Se pasan los preparados por xilol y se montan en definitivo.

Ttinción con hematoxilina-eosina

1.- Meter los cortes en la estufa a 60º C 20 min aproximadamente. 2.- Desparafinar: xilol y alcoholes 100%, 96% y 70% 5 min en cada. 3.- Lavar en agua destilada. 4.- Meter las preparaciones en la hematoxilina 2 min. 5.- Lavar con abundante agua del grifo. 6.- Pasarlas a eosina alcohólica 5 min. 7.- Lavar en alcohol 96% 5 min. 8.- Deshidratar: pasando por alcohol 100% y xilol. 9.- Montar con Depex.

- Preparación de los colorantes  Eosina

- Eosina: 1,5g de E en 100cc de agua destilada. - Floxina B: 2g de F en 100cc de agua destilada.

Se mezclan 100cc de E con 10cc de F y se añaden 780cc de EtOH 95% y 4cc de ác. acético glacial.

 Hematoxilina - Hematoxilina: 5g de H en 50cc de EtOH 100%. - Alumbre alumínico o potásico: 100g de alumbre en 1L de

agua destilada (agitarlo mientras se calienta). Mezclar las dos cosas y calentarlas durante 1 min. Retirar del calor, añadir lentamente 2,5g de óxido de mercurio y volver a

calentar hasta que se ponga oscuro. Sumergir el matraz en agua fría y añadir 30cc de ác. acético glacial. Por

último f Filtrar.

Tinción de Feulgen

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La reacción de Feulgen cuenta con los siguientes pasos

1- Hidrólisis ácida: Se introduce directamente el portaobjetos en una solución de ClH 5N durante 30 min a una Tª de 25ºC.

2- Lavado en agua corriente durante un minuto, seguido de otros dos lavados de un minuto en agua destilada. Se agitan suavemente los portaobjetos con el fin de eliminar la mayor cantidad posible de impurezas.

3- Tratamiento con el reactivo de Schiff durante una hora a una Tª de 25ºC y en oscuridad. Se procura que los portaobjetos tengan la menor cantidad de agua posible al entra en el reactivo de Schiff, pero evitando que se sequen. El baño tiene una capacidad de tinción de unas 75 preparaciones antes de que adquiera un color rosado.

4- Lavado en baño sulfuroso durante un minuto, a Tª ambiente tres veces consecutivas para eliminar el exceso de colorante.

5- Lavado en agua corriente durante 10 min.

6- Deshidratación y montaje de las muestras para su estudio.

Espermatogénesis en invertebrados (Ortópteros) 2

2 Corte de testículo de saltamontes teñido con tricrómico de Masson. Elaboración propia: 4x

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Introducción

Marco histórico

La primera referencia al espermatozoide proviene de Ham y Leuwenhoek, al haber observado el primero el semen a través del microscopio y haber detectado unos “animáculos” móviles en 1677. Ham inició la corriente animaculista, que establecía que el “animáculo” del esperma contenía un humano en miniatura. Paralelamente se desarrolló la tesis ovulista, que decía que los individuos estaban contenidos en el óvulo y entre cuyos representantes fueron Malphigio y Spallanzani. Éste último, no obstante, comprobó más tarde que sin los espermatozoides (animáculos) del semen los óvulos n eran fertilizados. Sin embargo el comienzo de las investigaciones más fructíferas en el desarrollo de las células reproductivas masculinas coincide casi exactamente con la llegada de la teoría celular que facilitó la relación de dichos animáculos con el resto de células. La palabra espermatozoa (semilla animal) aparece en 1827 por primera vez, se cree, en boca de Rudolph Wagner, que examinó los fluidos frescos provenientes de los túbulos seminíferos de mamíferos, evidenciando “gránulos peculiares o esférulas” de formas y tamaños muy variables. Wagner también observó “Samenthierchen”, o animálculos de esperma, espermatozoa, sintiéndose seguro de que los varios tipos de esférulas vistos con anterioridad eran estados anteriores al espermatozoa. Años más tarde, Albert Koelliker (1841) presenta un tratado tras varios años de investigación, en el que enseña por primera vez los aspectos fundamentales concernientes a la espermatogenesis, que se resumen en que en el semen de casi todos los animales se encuentran espermatozoides, siendo éstos parte esencial del semen; que dichos espermatozoides se desarrollan individualmente en paquetes a partir de células que se forman a partir de procesos análogos al desarrollo celular pero diferentes al desarrollo cigótico en animales; y que las formas de los espermatozoides son similares en especies de un mismo género o grupo cercano, y prácticamente idénticos en la misma especie.

LÍNEA DE TIEMPO: ALGUNOS EVENTOS EN BIOLOGÍA CELULAR 1639 Robert Hooke observa “células” de corcho con un

microscopio primitivo 1680 A.Leeuwenhoek (1632-1702)

descubre espermatozoides en el semen 1688 Redi

publica su trabajo sobre la generación espontánea

1839 Johannes Müller efectúa investigaciones

microscópicas e histológicas 1839 Jacob Henle

realiza una descripción general de la epidermis y el epitelio

1839 Schleiden y Schwann proponen la Teoría Celular

1839 Robert Remak (1815-1865)

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descubrimiento de las células ganglionares del corazón humano

1841 Albert Koelliker (1817-1905) descubre que cada espermatozoide es una célula,

la célula germinal masculina 1852 Robert Remak

demostró que el óvulo es una célula 1855 Rudolf Virchow

afirma que todas las células provienen de células 1873 Camillo Golgi

Da a conocer su procedimiento de tinción de las células nerviosas

1888 Santiago Ramón y Cajal Modifica el método de tinción de Golgi y logra

esclarecer todas las estructuras del sistema nervioso Gráfico extraído de Historia de la Teoría CelularHISTORIA DE LA TEORÍA CELULAR por María Paula Berón Facultad de Cs.Exactas y Naturales Universidad Nacional de Mar del Plata

A partir de este momento, y con los avances tenológicos que se van sucediendo, el estudio de los espermatozoides y de los procesos relacionados con su génesis se estudia en profundidad. Primero, con el desarrollo de las técnicas citológicas clásicas como la inclusión de los cortes en parafina, se aprecian diferentes morfologías de los espermatozoides y se estudian los tejidos en los que se originan. Más tarde, con la llegada del microscopio electrónico, las técnicas citoquímicas, y otros tipos de microscopía se han evidenciado los detalles de la ultraestructura del espermatozoide, de la espermatogénesis de los procesos implicados en la espermiogénesis.

Marco teórico

Podríamos definir a la espermatogénesis como el conjunto de cambios que ocurren en una célula prácticamente indiferenciada,espermatogonia, y que tienen como final la formación de una célula altamente especializada, con un número haploide de cromosomas recombinados y capaz de fecundar: el espermatozoide.

Teniendo en cuenta los cambios que se producen en la espermatogonia, y por tanto los nuevos tipos celulares y los procesos en los que participan, podemos dividir a la espermatogénesis como proceso en las siguientes etapas:

Proliferación. Las espermatogonias, descendientes de las CGPs van a dividirse varias veces antes de diferenciarse (cursar la

meiosis) con el fin, por un lado, de aumentar la población que se va a diferenciar, y por otro, de mantener la cantidad de

espermatogonias preexistente. Las dos primeras células originadas por la primera mitosis sufrirán destinos diferentes. Una de ellas se quedará para la población troncal, mientras que la otra generará,

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Esquema de las divisiones por las que pasa el cisto

Memoria de prácticas de Embriología Básica. Pablo Marco Moreno

mediante divisiones sucesivas, un cisto. El cisto está formado por la células producto de las divisiones normalmente unidas por

puentes citoplasmáticos, de forma que presentan

sincronía en si ciclo celular. La cantidad de divisiones

que experimentan las espermatogonias durante

la fase de proliferación varía en función de la

especie, estando el máximo observado en 8 divisiones. Al final de la fase de proliferación comienza la meiosis, divisiones de población espermatogonial

llegan en algunas especies hasta ocho.

.

Crecimiento y meiosis. Como ya ha sido explicado, la meiosis se caracteriza por presentar dos divisiones sucesivas del material hereditario (División I y División II) precedidas por un único período S (de síntesis de ADN). La profase de la primera división meiótica es extremadamente larga pudiendo durar desde días (en machos) hasta años (generalmente en hembras). Para su estudio, se ha dividido en base a la morfología del núcleo celular en varias etapas: leptotene, cigotene, paquitene, diplotene y diacinesis (ver meiosis en presentación). La primera división está separada de la segunda por un periodo de tiempo muy corto y a veces inexistente llamado intercinesis, La segunda división meiótica es análoga a la mitosis, ero con la mitad de los cromosomas habituales. Las células que están experimentando la primera división se denominan espermatocitos primarios, y las que están en la segunda, espermatocitos secundarios. Una vez han terminado la meiosis, las células resultantes se denominan espermátidas.

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Memoria de prácticas de Embriología Básica. Pablo Marco Moreno

Esquema comparativo de la duración de la meiosis con la mitosis. Extraido de las transparencias de teoría.

Espermiogénesis. Las espermátidas tienen ya una carga “c” y una dote cromosómica “n”, pero aún no están preparadas para fecundar. La espermiogénesis es el proceso de diferenciación de las espermátidas para generar espermatozoides, células ya preparadas potencialmente para fecundar (salvo por algunos cambios posteriores conocidos como capacitación –ver capacitación en la práctica de fecundación-). Se trata de cambios tanto citoplasmáticos como nucleares. La espermiogénesis es una cadena de mecanismos propios de cada especie, pero globalmente se centran en la compactación de la cromatina en el núcleo, la pérdida de casi la totalidad del citoplasma y la adquisición de un aparato locomotor por parte de la célula. Decir que en las espermatogonias, al haberse segregado los cromosomas sexuales (en el caso de ortópteros sólo hay X, siendo sun sistema XX, X0), algunos genes presentes en dichos cromosomas no se expresarán en las espermátidas que carezcan de ellos. Sin embargo, al existir conexión citoplasmática entre las células del cisto, no se observan variaciones en las cantidades de esos productos, comportándose todas las células de forma parecidamuy parecido.

Material y métodos

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Esquema comparativo de los procesos meióticos y mitóticos en función del tiempo de su transcurso. Extraído de las transparencias de teoría.

Memoria de prácticas de Embriología Básica. Pablo Marco Moreno

En la práctica se utilizaron des tipos diferentes de material y dos metodologías de trabajo.

Primero se realizó un aplastado de testículo de ortópteros (Locusta migratoria) fijados en etanol y ácido acético en proporción 3:1, y teñidos con Feulgen (ver introducción; tinción de Feulgen). Se hidrataron las muestras dejándolas en agua destilada 10min antes de las observaciones. Para el aplastado se cogieron los tubos seminíferos y se colocaron en un portaobjetos con una gota abundante de ácido acético al 50%, con cuidado de que no se secaran. Luego, pusimos un cubre encima y, con un lápiz y con papel de filtro para recoger el rebosado exendimos el material. Luego realizamos el aplastado con apretando fuertmente con el dedo y recogiendo el rebosado, con cuidado de que no huiese desplazamiento del cubre sobre el porta (para mantener la morfolgía celular). Por último observamos los aplastados con microscopía óptica con el fin de determinar las etapas de la meiosis y los estadios de la espermiogénesis.

El otro material de trabajo fueron cortes de testículo de saltamontes (Locusta migratoria) fijado con Bouin e incluido en parafina teñidos con tricrómico se Masson (ver proceso en la introducción) con el fin de estudiar la organización celular y la espermatogénesis mediante la observación al microscopio óptico.

Observaciones

En el primer estudio observamos las etpas de l meiosis en los espermatcitos, tanto primarios como secundarios. A continuación diferenciamos los tipos de espermatogonias atendiendo a su avance en la espermioénesis y a su dote cromosómica, en función de si se observaba el cromosoma X o no. Además detectamos espermátidas aberrantes que disponían de más de un adjunto centriolar o con una dote cromosómica mayor delo habitual (con un núcleo significativamente más grande). Vimos el proceso de condensación del núcleo y determinamos las diferentes morfologías de las espermátidas en función de su estadio de la espermiogénesis. Por último observamos espermatozoides ya desarrollados unidos en espermatóforos

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En el segundo estudio observamos la estructura histológica del tubo seminífero del saltamontes. Reconocimos las espermatogonias, la zona de proliferación con el aumento en el número de células por cisto, los espermatocitos primarios y los secundarios, y como se disponían a lo largo del tubo seminífero (en el extremo apical las gonias y en el basal las espermátidas).

3 Espermátidas tempranas. Se tiñe más intensamente el cromosoma X. Elaboración propia: 100x Feulgen, aplastado de testículo de saltamontes 4 Vista general del aplastado de testículo de saltamontes. Resaltan los espermatóforos. Elaboración propia: 4x Feulgen

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La primera imagen es un corte de testículo de saltamontes. Ver sincronía en las fases dentro de las células de cada cisto. Se observa también una espermátida aberrante (dos nucléolos). Elaboración propia. 100x tricrómico de Masson La segunda es la zona media del tubo seminífero. Se pueden distinguir los cistos en las diferentes etapas de la espermatognénesis. Elaboración propia. 20x, tricrómico de Masson

1.Espermátidas tempranas. Se tiñe más intensamente el cromosoma X. Elaboración propia: 100x Feulgen, aplastado de testículo de saltamontes. 2.Vista general del aplastado de testículo de saltamontes. Resaltan los espermatóforos. Elaboración propia: 4x Feulgen

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Memoria de prácticas de Embriología Básica. Pablo Marco Moreno

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1.Cisto de espermátidas. Se advierte ya el adjunto centriolar (teñido de rojo). Observar espermátida aberrante con dos adjuntos centriolares y un núcleo mayor de lo habitual. Elaboración propia. Tricrómico de Masson 100x. 2.Grupo de espermátidas en la misma fase que la anterior. Rodeado en rojo e indicado con una flecha una espermátida aberrante. Elaboración propia. Tricrómico de Masson, 100x.

Cuestiones

1- ¿Qué tipos celulares aparecen en el aplastado de testículo de saltamontes? ¿De qué etapa de la espermatogénesis son característicos cada uno de ellos? ¿Detectas células de la línea somática? Dibujar ejemplos representativos de cada tipo celular, tal y como se observan en una aplastado de ortóptero teñido con la técnica de “Feulgen”.

Deberían aparecer en el aplastado espermatogonias, espermatocitos primarios y secundarios, espermátidas y espermatozoides, además de células somáticas que conforman el epitelio del túbulo seminífero. Sin embargo no hemos observado estas últimas, que son las que provienen de la línea somática. Las espermatogonias están en la fase de proliferación, los espermatocitos en meiosis y las espermátidas en espermiogénesis.

2- ¿En qué se diferencian las espermátidas tempranas presentes en el testículo de saltamontes? ¿A qué es debido? ¿Son todas iguales?

Las espermátidas tempranas de saltamontes (Lacusta migratoria) son células que ya han cursado la meiosis por completo. Están en el comienzo de la espermiogénesis y se caracterizan porque no han terminado de condensar su cromatina. Aún no se distingue en ellas el adjunto centriolar y son redondas. La principal diferencia que permite distinguir dos tipos de cromátidas tempranas es la existencia o no en su núcleo de un cromosoma X. Tal y como ya se ha explicado en el marco teórico, los saltamontes tienen gametos X o no. Oras observaciones que se pueden hacer, son acerca de la morfología celular, o el tamaño del núcleo, para casos aberrantes. Cundo se detectan tamaños nucleares significtivamente mayaores puede deberse a casos de polipliodia. En espermátidas más avanzadas en la espermiogénesis también se pueden detectar aberraciones por el número de adjuntos centriolares.

3- ¿Qué es un espermatóforo? Dibuja uno de saltamontes

Un espermatóforo es conjunto de espermatozoides unidos entre sí por medio de una célula de sosténunión. Los ortópteros los introducen en la

espermatoteca femenina durante la cópula, sirviendo para fecundar gran cantidad de huevos.

4- ¿Qué es una espermatogonia? ¿Dónde se localiza en el túbulo seminífero y qué dotación genética presenta? ¿Qué carga de ADN tiene?

Es una célula precursora de los espermatocitos. Proviene de la línea germinal pero no ha cursado la meiosis aún, por lo que presenta una carga de DNA 4 o 2 “c” (dependiendo de la fase del ciclo en la que se encuentre) y una dotación cromosómica 2n. La población de espermatogonias origina por una lado por mitosis los espermatocitos, y por otro mantiene el número de gonias para poder seguir abasteciendo de célula germinales. Se localiza en la zona apical del túbulo seminífero.

5- ¿Qué es un cisto? Dibujar uno y determinar en qué tapa de la primera profase meiótica se encuentran los espermatocitos que lo integran. ¿Cómo has llegado a esa conclusión?

Un cisto es una agrupación de espermatocgonias, espermatocitos o espermátidas (dependiendo de la fase de la espermatogénesis) comunicados por uniones citoplasmáticas que hacen que sus ciclos celulares se desarrollen sincrónicamente. Todas las células que forman el cisto provienen de la misma espermatogonia al entrar en espermatogénesis.

He deducido que está en paquitene porque están formados los bivalentes. Se observan unos cormosomas como entrelazados y más patentes de lo normal, de lo que interpretamos que cada hebra no es un cromosoma sino dos formando una tétrada.

6- Dibujar y rotular un tubo seminífero completo de un corte de testículo de saltamontes indicando los diferentes cistos que aparecen desde el extremo proximal al distal. Basándote en tu dibujo y observaciones determina el número aproximado de células que componen un cisto de espermatocitos primarios. ¿Cómo se ha originado?

Aproximadamente el número de espermatocitos secundarios que he podido contabilizar en las muestras es de dieciséis. Se habrían producido cuatro divisiones en la fase de proliferación.

7- ¿E l número de células que componen un cisto en la región de crecimiento y meiosis del túbulo es igual al de otro cisto presente en la región de espermiogénesis? Razonar la respuesta.

No, porque de cada espermatcito que se encuentra en meiosis se originan 4 espermátidas que pasarán a diferenciarse en la región de espermiogénesis, donde únicamente se diferenciarán para la fecundación. Por lo tanto en la región de espermiogénesis habrá aproximadamente 4 veces el número de espermatocitos que cursen la meiosis por cada cisto. Si

hablamos de cistos en la fase de proliferación, tendríamos que añadirle, además, las mitosis que cursase dicho cisto antes de entrar en meiosis.

8- ¿Cuál será el número de espermátidas presentes en un cisto que contenga una espermátida poliploide aberrante? Razonar la respuesta.

El número de espermátidas dependería de la división meiótica en la que no segregase los cromosomas/cromátidas. Si el problema surgiese durante la primera división, el número de espermátidas sería el mismo restándole dos. Si surgiese en a segunda división, sólo habría que restarlse una. En el caso de que el problema se hubiese generado antes, durante alguna mitosis de la fase de proliferación, habría que analizar los detalles del proceso.

9- Dibuja espermátidas normales y anormales presentes en el corte de testículo de saltamontes. En qué te has fijado para clasificarlas en normales y aberrantes.

Para determinar si son normales o aberrantes nos fijamos en primer lugar en el volumen de su núcleo. Si el volumen no responde al patrón normal significa que probablemente cuenten con más de una dotación n y, por tanto, se trataría de una espermátida aberrante. En segundo lugar nos fijamos en el número de adjuntos centriolares. El número normal es uno, por lo que en el caso de que observemos más estaríamos ante una aberración.

Práctica 2: Espermatogénesis en vertebrados (mamíferos)

Marco histórico

El desarrollo del estudio de la espermatogénesis tiene los mismos precedentes para mamíferos que para saltamontes (ver marco histórico de la espermatogénesis en saltamontes)

Marco teórico

- Ttestículo de mamíferos

Los testículos en mamíferos, son órganos pares que pueden encontrase en la cavidad abdominal, pero en la mayoría están en una bolsa denominada escroto debido a que la espermatogénesis se produce a dos grados por debajo de la temperatura corporal.

Un corte longitudinal de un testículo revela que está rodeado de tejido conjuntivo, la túnica albugínea, del que salen unos tabiques que lo dividen

en lobulillos testiculares donde se encuentran los túbulos seminíferos. En cada lobulillo hay de 2-6 túbulos seminíferos cuya longitud es 30-70cm, que en mamíferos aparecen cerrados sobre sí mismos. El sistema de conductos comienza en la rete testis, aún dentro del testículo, y continúa con los conductos eferentes que comunican ésta con el epidídimo. Este último órgano se continúa con el conducto deferente.

El epidídimo juega un papel importante, sirviendo como almacén de espermatozoides y, además, en él termina la maduración de los mismos. Los espermatozoides son almacenados por un tiempo variable hasta el momento de ser eyaculados en la parte distal del epidídimo. El epitelio que recubre el epidídimo es pseudoestratificado.

El sistema de conductos se continúa con el conducto deferente, el cual comunica la región distal del epidídimo con la primera región de la uretra.

.El testículo es una glándula mixta, la secreción exocrina es el semen (espermatozoides más la segregación glandular), y la secreción endocrina de andrógenos.

El análisis del lobulillo revela una estructura que puede dividirse en varias regiones:

  Región tubular: forma en su conjunto el epitelio seminífero. En él se distinguen dos poblaciones celulares. Por un lado están las céñelulas de Ssertoli, cuyas funciones se detallarán más adelante, y que pertenece la línea celular somática. Po otro lado encontramos las células protagonistas de la espermatogénesis; las espermatogonias, espermatocitos, espermátidas y espermatozoides, todas provenientes de la línea germinal. En el centro del epitelio se encuentra la luz del túbulo donde se vuelcan los espermatozoides pendientes de terminar su maduración.

  Región peritubular: alrededor del epitelio seminífero se encuentra una o varias filas de células mioepiteliales (planas)

Esquema del testículo humano con todos sus elementos significativos. Extraído del guión de prácticas.

Perdón, y lxs profesorxs son julio sanchez rufas, alberto y ángeles juarranz
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