microbiologia de los alimentos , Otro de Química Orgánica. IE University
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stiven-ortiz22 de septiembre de 2017

microbiologia de los alimentos , Otro de Química Orgánica. IE University

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GUIAS LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Antecedentes Desde hace tiempo la Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la seguridad y, en particular, la seguridad biológica son importantes cuestiones de interés internacional. En 1983, la OMS publicó la primera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio; en la que se alentaba a los países a aceptar y aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica, así como elaborar códigos nacionales de prácticas para la manipulación sin riesgo de microorganismos patógenos en los laboratorios que se encuentran dentro de sus fronteras nacionales. La tercera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) proporciona la información más actualizada para abordar los aspectos de la seguridad y la protección biológica que se plantean en el nuevo milenio. Asimismo, subraya la importancia de la responsabilidad personal. Además, hace reflexionar sobre los recientes acontecimientos mundiales que hacen evidente los peligros para la salud pública derivados de la liberación o el uso indebido de agentes y toxinas microbianos. Como profesionales de estas disciplinas, es importante conocer los principios básicos de seguridad en el trabajo con microorganismos, considerando los peligros relativos que implican su manejo. De acuerdo con el potencial que tienen los microorganismos para infectar al ser humano y los animales, se les ha clasificado en grupos de riesgo, que se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Clasificación de microorganismos infecciosos por grupos de riesgo.

La OMS y los National Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos, han propuesto las bases para la jerarquización de los laboratorios en función del grupo de riesgo al que pertenecen los microorganismos que manejan, indicando las condiciones de acceso, tipo de personal, equipo especial y diseño específico de las instalaciones. Normas de seguridad en los laboratorios de docencia El Consejo Divisional de CBS aprobó un Instructivo del Funcionamiento Interno y Operativo para Regular el Uso de los Servicios e Instalaciones de los Laboratorios de Docencia que fue aprobado por el Consejo Académico en la Sesión número 314 del 9 de noviembre de 2009. Un aspecto muy importante que se incluye en este instructivo es el de cumplir en forma estricta las normas de seguridad para evitar accidentes en el laboratorio, de manera particular en el capítulo IV de las Normas de Seguridad Artículo17 que dice:

En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad física de las personas involucradas; por ello, no podrá realizarse ninguna práctica o actividad experimental si el ejecutante no cuenta con los elementos de protección indispensables para su desarrollo o no cumple con las disposiciones normativas aplicables, para lo cual se deberán cumplir siempre las siguientes reglas.

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1. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es recomendable vestir ropa sencilla, que proteja la mayor parte del cuerpo, de preferencia de algodón, zapatos cerrados, con suelas gruesas y sin tacones o plataformas, así como traer el pelo recogido.

2. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni tocarse la cara o los ojos con las manos.

3. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salgan por breves periodos.

4. Al manipular sustancias químicas corrosivas o peligrosas se utilizarán guantes, lentes protectores y/o mascarillas. No se deberá pipetear oralmente ningún tipo de solución o cultivo microbiano. Siempre se utilizarán propipetas adecuadas para este fin.

5. No se admitirán visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo.

6. Evitar la acumulación de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las actividades de manera ordenada y en silencio para evitar accidentes.

7. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.

Sobre los procedimientos

1. Antes y después de cada sesión práctica, los alumnos limpiarán las mesas de trabajo con el desinfectante que se le proporcionará.

2. Cuando se utilice el mechero, este será colocado en un lugar alejado del microscopio y otros equipos.

3. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, tratar de conservar la calma, inmediatamente informar al profesor y/o realizar el siguiente procedimiento:

a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión.

b. Agregar abundante solución desinfectante sobre las toallas.

c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la eliminación de materiales contaminados.

4. Al concluir cada sesión práctica, el estudiante se asegurará de que los materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, así como en lugares apropiados. Deberán esterilizarse tal y como indique el profesor.

Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio

1. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra manera, solicitar la ayuda del profesor, del ayudante o del técnico del laboratorio, para adquirir la destreza necesaria.

2. Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento adecuado para apagarlo, desconectarlo, guardarlo y entregarlo al responsable de su custodia.

3. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas, autoclave, potenció- metros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.

4. Verificar que las tomas de agua, gas y aire en el lugar de trabajo estén bien cerradas. Dejar limpias y secas las mesas de trabajo.

Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio

1. Guía de laboratorio.

2 cubre bocas y 1 par de guantes de látex.

3. Un pedazo de tela sin pelusa (papel toalla), cerillos, tijeras, cinta de enmarcar (masking-tape), marcador indeleble o etiquetas pequeñas, jabón para manos.

Cuestionario

1. ¿Qué es la bioseguridad, de cuántos niveles consta y qué características posee cada uno de estos niveles?

2. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiología y un laboratorio convencional.

3. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo líquido bacteriano se derrama sobre una superficie.

4. ¿Cuáles son los riesgos y problemáticas en el grupo que se tendrán al no seguir las indicaciones recomendadas?

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Practica 1. ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

Objetivos Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso común en Microbiología. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio.

Introducción La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo.

La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan.

El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in2 ); con esta presión el material alcanza una temperatura de 121 °C y si se mantiene durante 15 minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.

Como en los estudios de microbiología se requiere la esterilización de espacios, superficies y materiales de naturaleza diversa (plástico, vidrio, instrumentos, medios de cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes métodos que se aplicarán de acuerdo con el tipo de materiales requeridos, tal como se observa en la Tabla .

Tabla. Metodo de Esterilización

Materiales por Grupo Equipos

12 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con rosca 2 autoclaves con base , canastilla y válvula

4 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin rosca 2 balanzas analíticas

15 cajas Petri de vidrio 1 horno (temperatura>150°C)

10 pipetas serológicas de 1.0 mL 1 incubadora

5 pipetas serológicas de 10 mL 1 refrigerador

2 pipetas Pasteur 2 pares de guantes de asbesto

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4 matraces Erlenmeyer de 500 mL Escobillones

1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL Fibra

1 matraz volumétrico de 100 mL Detergente

3 vasos de precipitados de 100 mL Toallas de papel

1 probeta de 250 mL

2 parrillas de calentamiento con agitación

2 agitadores magnéticos Medios y Reactivos

1 gradilla Caldo nutritivo (CN)

3 propipetas mecánicas (1.0, 5.0, 10 mL) Agar bacteriológico

3 espátulas Agar papa dextrosa (PDA)

2 mecheros Fisher Agar eosina azul de metileno (EMB)

1 Piseta con agua destilada Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7

1 Piseta con alcohol al 70% HCl

1 potenciómetro NaOH

Papel manila o estraza para envolver

Algodón y gasa

Procedimientos

El profesor hará la demostración para: envolver las cajas Petri y pipetas con papel estraza, así como elaborar tapones y capuchones para tubos y matraces.

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua corriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envolver.

3. Preparar 200 mL de CN en un matraz Erlenmeyer de 500 mL y ajustar el pH a 6.5 - 7.0 con un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCl 0.1M o solución de NaOH 0.1M en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo con tapón de rosca que se cerrarán sin llegar al tope.

4. Preparar agar nutritivo (AN) agregando 2.7 g a los 180 mL del CN restante (15 g/L).

5. Calentar el medio en una parrilla con agitación constante hasta ebullición (cuidar que no se proyecte) y vaciar 5 mL de medio en cuatro tubos con tapón de rosca. Enjuagar de inmediato la pipeta para evitar que se solidifique el agar.

6. Preparar 200 mL de medio de cultivo PDA en un matraz Erlenmeyer de 500 mL, ajustar el pH del medio a 5.6. Colocar un agitador magnético y calentar hasta ebullición, cuidando que no se proyecte o derrame. Vaciar 5 mL de medio en cuatro tubos sin rosca que se taparán con tapón de algodón y gasa.

7. Preparar 200 mL de medio de cultivo EMB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Colocar un agitador magnético y calentar hasta ebullición. NOTA: ¡Cuidar que no se derrame!

Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarán en un horno a 150ºC durante 2 horas. Después de sacarlas, dejar enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica (cerca del mechero).

2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones:

a. Revisar que el agua en la autoclave esté limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario cambiar o añadir agua destilada.

b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento máximo. Con el uso de guantes de asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro.

c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor por el orificio de purga, después cerrarlo con la válvula.

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d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs /in2 de presión y mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el manómetro y regular el control de temperatura a valor medio o mínimo.

e. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de cero. Quitar la válvula y con la ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación.

1. Cerrar los tubos con tapón de rosca, los que contienen agar se colocarán en una superficie inclinada para que el medio solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50°C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.

3. Limpiar la mesa con solución de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos a una distancia de 50 cm. Verter entre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres cajas Petri en esta zona aséptica. Dejar que los medios solidifiquen.

Prueba de esterilidad de materiales

1. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zonas no asépticas (patio, aulas, comedor) y etiquetarlas.

2. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zona asépticas (cerca del mechero) y etiquetarlas.

3. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30ºC durante 24-48 horas. Las cajas Petri se colocarán con la tapa hacia abajo.

4. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido, así como la formación de colonias microbianas en la superficie de los medios sólidos.

Resultados

A. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.

B. Describir la morfología de las colonias en el Cuadro 1.

C. Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo de los materiales.

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Discusión de resultados

1. ¿Qué características de un material o sustancia se requieren conocer para elegir el método adecuado de esterilización?

2. ¿Qué diferencias observó en los resultados obtenidos en tubos y en cajas de Petri? Explique.

3. Describa el tipo de contaminantes microbianos que se encuentran con mayor frecuencia en las cajas de Petri. ¿Cómo explican estos resultados?

4. ¿Cuáles son las tres principales recomendaciones de uso correcto de la autoclave?

Conclusiones

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TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS Y LEVADURAS

Objetivos Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias y levaduras en medios sólidos. Comprobar la utilidad que tienen los medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos.

Introducción El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros.

Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos; extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en caja de Petri; por estría en caja de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura en tubos con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado de los microorganismos de interés.

En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones, formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos de estudio más importantes en microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la técnica de estría cruzada para producir colonias aisladas en cultivos sólidos y así, obtener un cultivo puro o axénico, también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de microorganismo con la misma composición genética.

Cuando la técnica por estría se aplica para aislar un microorganismo de interés a partir de mezclas donde se encuentra en pequeñas cantidades, generalmente se obtendrán las bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de enriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarán la población del microorganismo de interés y se facilitará su aislamiento.

Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, es posible distinguir entre especies bacterianas por la forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en la apariencia del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas.

MATERILES

Por equipo Por grupo

4 cajas Petri con agar nutritivo (AN) 1 incubadora a 30°C

4 cajas Petri con agar eosina azul de metileno (EMB) 1 refrigerador

4 cajas Petri con agar papa dextrosa (PDA) 2 pares de guantes de asbesto

4 tubos con caldo nutritivo (CN) 2 balanzas analíticas

4 tubos inclinados con AN 2 autoclaves con base

4 tubos inclinados con PDA escobillones

2 mecheros Fischer detergente y toallas de papel

2 asas de inoculación papel estraza

1 Piseta con agua destilada algodón y gasa

Procedimientos

El profesor proporcionará cultivos puros (cepas) de bacterias Gram (+): Bacillus sp., Micrococcus sp., Gram (- ): Escherichia coli y un cultivo de la levadura Saccharomyces cerevisiae, así como una muestra problema (con al menos dos microorganismos diferentes).

Cada equipo de trabajo inoculará E. coli, una bacteria Gram +, la levadura y un cultivo problema en una caja de cada medio.

Técnica de estría cruzada (Figura 1)

A. Dividir cada una de las cajas Petri por la parte de atrás en cuatro cuadrantes. Esterilizar el asa con calor en el mechero.

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B. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.

C. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja. Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja Petri un cuarto de vuelta.

D. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar la superficie del de estrías recién hechas en un punto alejado del inicio. Hacer un segundo grupo de estrías como en el caso anterior.

Realizar el mismo procedimiento en el tercer cuadrante y en el último cuadrante, sin flamear el asa de siembra hará una estría más abierta (simple).

E. Las cajas con la base hacia arriba se incuban a 35°C durante 24-48 horas.

Siembra en tubos y condiciones de incubación (Figura 2)

A. Después de la incubación de los cultivos, seleccionar, de las cajas Petri con AN, la colonia más aislada de cada cepa.

B. Transferir con el asa, previamente esterilizada y fría, una pequeña muestra de la colonia a un tubo de CN.

C. Transferir de la misma forma una muestra de la misma colonia inoculando por estría los tubos inclinados con AN y PDA.

D. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 hrs. Observar la aparición de colonias y reportar la forma de crecimiento de los microorganismos.

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Resultados

A. Reportar en el Cuadro 2, sus resultados de siembra de las cepas en cada medio de cultivo.

B. Describir la morfología colonial representativa de cada cultivo microbiano de acuerdo con los criterios indicados en los cuadros 3 a 6.

C. Verificar el tipo de microorganismos que corresponden a la muestra problema, en comparación con los cultivos puros.

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Cuestionario

1. ¿Por qué se considera que un cultivo puro supone condiciones no naturales? ¿Qué reflexiones haría sobre los resultados obtenidos en laboratorio con este tipo de cultivo?

2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la técnica de estría cruzada? Proponga otras técnicas de aislamiento en medios sólidos que se aplican en microbiología.

3. ¿Para qué se inocularon tubos con medios líquidos y tubos con medios sólidos por estría?

4. Investigue la composición química de los medios AN, EMB y PDA. Explique qué tipo de medios son con base en composición y uso.

Discusión de resultados

Conclusiones

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Técnicas de tinción simple, diferencial y selectiva

Objetivos Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos. Que obtenga la información básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.

Introducción Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y cianobacterias), por los que no se observarán con facilidad en un microscopio óptico de campo claro por la falta de contraste entre las células y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis.

Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña suspensión de los microorganismos sobre una superficie transparente que, posteriormente, se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos; lo que causará la inactivación o muerte celular y algunas modificaciones de sus características.

Existen diferentes tipos de tinciones: simple, diferencial y selectiva, de acuerdo con el número y tipo de colorantes utilizados y de los objetivos de estudio. La tinción que hace uso de un solo colorante es la simple.

Las tinciones diferenciales permiten diferenciar microorganismos con características superficiales distintas, por lo que requieren más de un colorante. La más utilizada en bacteriología es la propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas.

Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas que son útiles para la clasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas permite identificar bacterias de tipo Bacillus y Clostridium.

Materiales

Por equipo Por grupo

1 probeta de 100 mL 2 autoclaves con base

1 vaso de precipitados de 100 mL 2 balanzas analíticas

2 mecheros Fisher 2 pares de guantes de asbesto

2 asas de inoculación escobillones

10 portaobjetos detergente y toallas de papel

1 parrilla de calentamiento con agitación papel estraza

1 gradilla algodón y gasa

1 piseta con agua destilada tira de papel filtro Wathman # 1

2 microscopios ópticos Medios y Reactivos

1 frasco gotero con aceite de inmersión 4 juego de colorantes de Gram

1 piseta con alcohol al 70% 2 frascos gotero con verde de malaquita 5% en agua

Etanol absoluto

Procedimientos

El profesor proporcionará cultivos líquidos y sólidos de cada una de las cepas de estudio y un cultivo problema. El equipo de trabajo preparará frotis de los dos tipos de cultivos y hará tinción simple de S. cerevisiae; tinción de Gram de Micrococcus sp., Escherichia coli., Bacillus sp., así como la tinción selectiva de endosporas en cultivos de Bacillus sp. También aplicarán estas técnicas en el cultivo problema.

Preparación de frotis (Figura 3)

A. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.

B. Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son de cultivos sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.

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C. Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la boca e introducir el asa para tomar la muestra. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en área circular de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire.

D. En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se realiza el mismo procedimiento antes descrito.

Fijación del frotis

E. Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor, pasando el portaobjetos rápidamente 2-3 veces por la flama del mechero.

F. Los frotis de medios líquidos se fijarán colocando dos gotas de etanol absoluto, que se dejarán secar al aire (precaución: hacer esto en zona alejada del mechero).

Tinción simple

1. Cubrir el frotis de S. cerevisiae y de la muestra problema con 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos.

2. Eliminar el exceso de colorante con la piseta de agua destilada y dejar secar al aire.

Tinción de Gram

1. Cubrir el frotis de Micrococcus sp., E. coli, Bacillus sp. y de la muestra problema con 2 gotas de cristal violeta durante 60 segundos. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

2. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar con precaución el frotis con agua.

3. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya más colorante. Lavar de inmediato con agua.

4. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. Lavar de nuevo con agua, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

Tinción selectiva de endosporas

1. Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre un frotis de Bacillus sp.

2. Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.

3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.

4. Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más, si es necesario).

5. Eliminar el colorante con agua destilada y cubrir con safranina durante 30 segundos.

6. Lavar nuevamente, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

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Observación al microscopio.

1. Limpiar con precaución los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación (iluminación Köhler), siguiendo las indicaciones del profesor.

3. Colocar los portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X, después pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

4. Al finalizar las observaciones, limpiar el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

Resultados

A. Reportar las observaciones microscópicas en los Cuadros 7- 9.

B. Comparar sus observaciones con la información reportada en la literatura.

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Cuestionario

1. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación y fijación de frotis?

2. ¿Cuál es la descripción general de un microorganismo que puede reportar en un estudio microscópico aplicando las técnicas de la práctica?

3. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la tinción de Gram?

4. Si se aplica la tinción de Gram de Bacillus sp. con endosporas ¿Cómo se observarían la célula vegetativa y la endospora? ¿Por qué?

Discusión de resultados

Conclusiones

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Cultivo y morfología de hongos filamentosos Objetivos Que el alumno adquiera los conocimientos básicos para la manipulación de hongos filamentosos y técnicas de cultivo. Que describa las características morfológicas macroscópicas y microscópicas e identifique algunas especies de hongos. Introducción Los hongos son organismos eucariotas, de mayor tamaño y complejidad que las bacterias. Se distinguen de otros eucariontes,como los animales, por ser inmóviles y, de las algas y plantas, por carecer de pigmentos fotosintéticos. Son de nutrición heterótrofa;es decir, dependen de nutrientes orgánicos disueltos por sistemas enzimáticos específicos, que son absorbidos a través de supared celular y membrana plasmática.En este grupo de organismos se encuentran formas unicelulares (levaduras) o pluricelulares (filamentosos). Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; con frecuencia se encuentran formando una cubierta pulverulenta fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen en forma asexual por gemación, un proceso por el cual brota una protuberancia o yema de la célula madre que, posteriormente se separa como célula individual. Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa característica denominada hifa. El conjunto de hifas ramificadas constituye el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los hongos que pertenecen al grupo Zygomycota, las hifas no presentan estos septos y se conocen como hifas cenocíticas. El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual por fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de esporas en conidióforos y esporangióforos, formados en hifas aéreas, llamadas reproductivas. La presencia de estructuras de reproducción sexual, es el principal criterio de clasificación que permite ubicar a los hongos en tres divisiones o phyla: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Otros criterios importantes para la clasificación de los hongos son las características de las hifas y las estructuras de producción de esporas asexuales.

Por equipo Por grupo

4 cajas Petri con 25 mL de PDA 2 autoclaves con base, canastilla y válvula

4 tubos inclinados con 7 mL de PDA 2 balanzas analíticas

1 matraz Erlenmeyer de 500 mL 2 pares de guantes de asbesto

1 probeta de 100 mL escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

2 mecheros Fisher 1 piseta con alcohol etílico al 70%

10 portaobjetos 1 incubadora a 30 °C

1 pinza de disección 1 frasco gotero con azul de lactofenol

1 asa de siembra

tiras de cinta adhesiva transparente de 1 pulgada de ancho

1 tijeras

2 microscopios ópticos

1 frasco gotero con aceite de inmersión

Procedimientos El profesor proporcionará a los alumnos cultivos de: Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Rhizopus oligosporus, Fusarium sp. Cada equipo de trabajo, inoculará tres cepas en cajas de Petri con PDA y hará la descripción macroscópica y microscópica de cada especie. Compartirán sus cuadros de resultados con los otros equipos.

Preparación de materiales e inoculación 1. Lavar y preparar todo el material para esterilizar. 2. Preparar medio PDA, esterilizar a 15 lb/pulg2 a 121°C durante 15 min, enfriar el medio hasta aproximadamente 45°C y vaciarlo en las cajas Petri.

Siembra de hongos filamentosos 1. Para sembrar los hongos filamentosos, se separa una parte de micelio de los hongos proporcionados por el profesor con asa de siembra, previamente esterilizada en la flama del mechero. 2. Se coloca el micelio en el centro de una caja de Petri con medio por inoculación or piquete.

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3. Se incuban las cajas de Petri en forma invertida, envueltas en papel o en una bolsa de plástico, a 28-30 ºC durante 3-5 días.

Descripción macroscópica Observar las siguientes características de los hongos filamentosos: a) Forma, tamaño y tipo de colonia b) Aspecto del micelio: algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio c) Color del micelio y color de las esporas d) Cambios en el medio de cultivo

Descripción microscópica en montaje con cinta adhesiva 1. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio. 2. Cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente; con pinzas de disección doblar la cinta en “U” con el adhesivo hacia afuera. 3. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la periferia de la colonia. 4. Colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando la formación de burbujas para no alterar las estructuras. La cinta funciona como cubreobjetos, no es necesario colocar uno. 5. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 40X. Localizar y observar hifas, estructuras especializadas como esporangióforos, esporangios, conidióforos, conidias y rizoides; determinar si las hifas presentan divisiones (septos).

Resultados A. Reportar en el Cuadro 1 las observaciones macroscópicas y microscópicas de las cepas, indicando el nombre de cada una. B. Comparar las observaciones realizadas con la bibliografía. C. Investigar en la literatura cómo se clasifican los hongos estudiados en la práctica.

Cuestionario 1. ¿Qué diferencias hay entre los procedimientos de observación e identificación de bacterias, levaduras y hongos filamentosos? 2. ¿Cuáles son los principales criterios de identificación de los hongos? 3. Describa los tipos de esporas sexuales y asexuales que caracterizan a los diferentes phyla de hongos. 4. Describa de manera breve tres problemáticas causadas al hombre por hongos y tres ejemplos de sus aplicaciones industriales. Discusión de resultados Conclusiones

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Cuantificación de microorganismos Objetivo Que el alumno aprenda la técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar microorganismos viables y que compare susresultados de la cuenta viable con los de cuenta directa en el microscopio. Introducción El crecimiento microbiano se define como el aumento del número de microorganismos o de biomasa en un periodo de tiempodeterminado. Existen diferentes métodos para detectar y medir el crecimiento de microorganismos.La forma de cuantificar células viables más utilizada en microbiología es la de recuento en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Consiste en inocular un volumen determinado de cultivo o muestra sobre un medio de cultivo sólido adecuado para el crecimiento de colonias el crecimiento de colonias. Cada una de esta deriva de una célula aislada; es decir, una unidad formadora de colonia (UFC). Hay dos variaciones en la forma de realizar esta técnica: la siembra en superficie o vertido en placa. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el método de diluciones sucesivas y cada dilución se deposita en cajas de Petri estériles. Es recomendable homogenizar las diluciones y hacer la adecuada inoculación de las muestras para evitar resultados erróneos. Si no se separan bien las células, se obtendrán valores bajos y los valores serán elevados si la toma de muestra se hace del fondo del tubo donde se concentran los microorganismos por gravedad. El recuento directo consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pequeños de suspensiones de bacterias. En portaobjetos especiales denominados cámaras de Petroff-Hausser o de Neubauer.

Por equipo Por Grupo

10 cajas de Petri con PDA 2 autoclaves con base, canastilla y válvula

15 pipetas de 1 mL 2 balanzas analíticas

2 pipetas de 10 mL 2 pares de guantes de asbesto

10 tubos con 9 mL de solución salina isotónica (SSI) escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de SSI 1 piceta con alcohol etílico al 70%

1 matraz aforado de 100 mL 1 frasco gotero con azul de metilo

1 pipetero metálico 1 equipo cuenta colonias

2 vasos de precipitados de 50 mL

1 parrilla con agitación

1 potenciómetro

1 agitador de tubos tipo Vórtex

1 cámara de Neubauer

2 microscopios ópticos

2 pipetas Pasteur

2 mecheros Fisher

2 propipetas de 5 y 10 mL

1 varilla de vidrio doblada en “L”

1 gradilla

1 piceta con agua destilada

Procedimientos El profesor proporcionará un cultivo líquido de Saccharomyces cerevisiae; todos los equipos de trabajo determinarán las UFC por diluciones decimales y siembra en placas con medio de cultivo. Se compararán estos resultados con los de cuenta directa en cámara. Al final, compartirán sus cuadros de resultados, calcularán la desviación estándar de los resultados y compararan los resultados del grupo.

Técnica de dilución y siembra en placa 1. En condiciones asépticas, pipetear 1 mL del cultivo del microorganismo o de la muestra problema y depositarla en el matraz

Erlenmeyer con 99 mL de SSI. Esta corresponderá a la dilución 10-2. Hacer diluciones decimales del cultivo

hasta 10-7.

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2. Para la inoculación por la técnica de superficie, se deposita 0.1 mL de cada una de las diluciones 10-3-10-

7. Distribuir cuidadosamente el inóculo en toda la superficie de la caja con una varilla de vidrio doblada en “L”

que previamente se sumergió en alcohol, se pasó en la flama del mechero y se dejó enfriar. 3. Dejar absorber el líquido durante 5-10 minutos. En caso de utilizar la técnica de vertido se deposita 1.0 mL de la dilución en la caja de Petri a la cual se le añaden ca. 20 mL de medio fundido (48-50°C). 4. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C durante 72 horas y realizar la cuenta de colonias.

Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer 1. Se coloca 1 mL de cultivo microbiano original en un tubo de ensaye y se agrega 1 gota de azul de metileno. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos. 2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el cubreobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecia una zona cuadriculada en forma de cruz. 3. Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar de inmediato una alícuota con pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara, evitando el exceso, dejando que la muestra se distribuya por capilaridad. 4. Reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco débil (10X) la zona de cuenta que se muestra en la Figura 5. El cuadro central mide 1.0 mm por lado y al observar en objetivo seco fuerte (40X) se encuentra dividido en 5X5 cuadros pequeños de 0.2 mm por lado. 5. Observar que las células que se tiñen de azul son las no viables y las que no se tiñen son las viables. La cuantificación de células se hace generalmente en el cuadro central a 40X, contando en diagonal las células de 9 cuadros (que a su vez están divididos en 16 cuadros más pequeños). Al dividir el número de células entre 9, se obtiene el # células/cuadro de 0.2 mm de lado. 6. Se multiplica el # células/cuadro (de 0.2 mm) X 25 para obtener el # total de células/0.1 mm3 (1 mm x 1 mm de cada lado del cuadrante central x 0.1 mm de profundidad de la cámara), que se multiplicará por 104 para obtener el # células/mL. Hacer esta cuenta por duplicado. 7. En el caso de que el cultivo esté muy concentrado, se recomienda hacer diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc. según sea necesario) para facilitar el conteo.

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Resultados A. Para calcular las UFC, células viables y no viables por mL de muestra original, se aplicará lo siguiente: En cajas de Petri: - Número de colonias promedio X (FD)= UFC/ mL, El factor de dilución (FD) se calcula tomando en cuenta la dilución que se seleccionó como válida para la cuenta (que tenga entre 30-300 colonias) y el volumen de muestra inoculado en cada caja. FD = 1 Dilución x Vol. inoculado En la cámara de Neubauer: - Número de células promedio/cuadro central X (Fd)= # células/ mL El factor de dilución (Fd) se aplicará solamente en casos de cultivos con alta densidad de células, en las que se hicieron diluciones de la muestra original para hacer una cuenta confiable. B. Reportar los resultados de cuantificación en los cuadros. C. Recopilar los resultados de los otros equipos y calcular la desviación estándar y coeficiente de variación de todos los datos.

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Cuestionario 1. Comparando el método de dilución en placa con el método de cuenta directa en cámara de Neubauer para la cuantificación de microorganismos ¿Qué ventajas y desventajas tiene cada uno? 2. Explique cuáles la importancia de realizar análisis estadísticos de los resultados en este tipo de métodos de cuantificación de microorganismos. 3. Explique la importancia de considerar el factor de dilución en el cálculo de UFC/mL. 4. Investigue algunas aplicaciones de estas metodologías en áreas de alimentos y microbiología industrial. Discusión de resultados Conclusiones

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