MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO IN VITRO DE BROTES DE PAPA , Tesis de Agronomía
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MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO IN VITRO DE BROTES DE PAPA , Tesis de Agronomía

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En la investigación se realizó en el laboratorio de Micropropagación de la Facultad de Ingenieria Agronomica de la Universidad Nacional del Altiplano-Puno, en donde utilizaron segmentos uninodales de plántulas obtenidas ...
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NOMBR E: DAVID

MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO IN VITRO DE BROTES DE PAPA (Solanum tuberosum MEDIOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

MENCIÓN EN MICROBIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

PUNO – PERÚ

BIOT ECN

MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO IN VITRO DE BROTES DE PAPA (Solanum tuberosum)

MICROPROPAGATION AND BUDS IN VITRO CULTURE OF POTATO (Solanum tuberosum )

David Vilca Ticona* UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA

RESUMEN

En la investigación se realizó en el laboratorio de Micropropagación de la Facultad de Ingenieria Agronomica de la Universidad Nacional del Altiplano-Puno, en donde utilizaron segmentos uninodales de plántulas obtenidas por micropropagación, los que se cultivaron autotróficamente, sin agregar sacarosa ni reguladores del crecimiento; para ello fue necesario evaluar contenedores descartables, substratos y soluciones nutritivas. Además, se buscó un método que permitiera la propagación de las plántulas obtenidas autotróficamente, para lo cual se evaluaron microesquejes de distinta ubicación en la planta madre según su capacidad de regeneración y adaptabilidad al trasplante. Los segmentos, plantados en vermiculita en cajas de polipropileno y regados con solución nutritiva hidropónica, enraizaron a los 7 días y a los 15 días desarrollaron una plántula de varios nudos, con buen tamaño y vigor como para ser trasplantados en invernadero. Este crecimiento se comprobó en 10 variedades comerciales de papa. Los esquejes de los cortes sucesivos se plantaron en substrato a base de turba (Sphagnum). Tanto los esquejes apicales como los esquejes medios enraizaron sin la necesidad de aplicar reguladores del crecimiento; además las plántulas cortadas rebrotaron, optimizándose el uso del material utilizado. Las plántulas obtenidas autotróficamente presentaron un aspecto morfológico distinto a las obtenidas comúnmente in vitro, siendo aquéllas de baja altura, pero de tallos robustos y hojas anchas.

Palabras Clave:Micropropagacion, Plantula, Solamun tuberusm

RESUMEN

The investigation was conducted in the laboratory of micropropagation of the Faculty of Agronomic Engineering of the National University of the Altiplano-Puno, where they used uninodal segments of plantlets for micropropagation, which were grown autotrophically without adding sucrose or growth regulators; for it was necessary to evaluate disposable containers, substrates and nutrient solutions. Furthermore, a method that allows the propagation of plantlets autotrophically, for which different location microcuttings were evaluated according to the mother plant regeneration capacity and adaptability to transplantation sought. Segments, planted in vermiculite in boxes of polypropylene and washed down with hydroponics nutrient solution, rooted at 7 days and 15 days developed a

seedling of several knots, with good size and vigor to be transplanted in a greenhouse. This growth was found in 10 commercial varieties of potato. Cuttings successive cuts were planted in peat-based substrate (Sphagnum). Both the apical cuttings and rooted cuttings media without the need for growth regulators; also cut sprouted seedlings, optimizing the use of the material used. Autotrophically plantlets presented a commonly different than those obtained in vitro morphological appearance, with those low-rise, but sturdy stems and broad leaves.

Keywords :micropropagation, Plantula , Solamun tuberusm

INTRODUCCION

La papa (Solanum tuberosum,L) normalmente es propagada vegetativamente. El método de crecimiento mínimo in vitro es uno de los más utilizados y constituye una alternativa de las técnicas del cultivo de tejidos para mantener plántulas en mejores condiciones sanitarias.

Mediante esta técnica se obtiene un estricto control sobre plagas y enfermedades al encontrarse el material confinado en un microambiente aséptico, también el sistema ocupa muy poco espacio y al propagarse clonalmente permite el mantenimiento del genotipo (7, 8). Con el presente trabajo se ha querido lograr una metodología que permita evaluar y conservar variedades de papa (Solanum tuberosum L) para asegurar el mantenimiento de dicho material por largos periodos. La papa es uno de los cultivos más estudiados y versátiles en los últimos años en la implementación de nuevos medios y técnicas de cultivo de tejidos, que permitan el desarrollo de plantas completas y sanas a partir de meristemas apicales, yemas axilares, segmentos nodales, raíces, tubérculos, protoplastos y células cultivadas in vitro.

La conservación in vitro en papa se logra bajo la utilización de dos técnicas diferentes, por medio de la limitación del crecimiento hasta tasas mínimas (Conservación in vitro) o la supresión total del metabolismo celular (Criopreservación) (1). En papa, se ha comprobado que los cultivos de yemas, mantenidos a 9-10° C permanecen viables durante un año (11) y si esa temperatura disminuye a 6-8° C pueden mantenerse hasta períodos de 3 a 5 años (2).

En la multiplicación de plántulas in vitro de papa (micropropagación) se utilizan medios nutritivos que incluyen sacarosa y reguladores del crecimiento. Uno de los problemas comunes en los laboratorios de cultivos in vitro comerciales y de investigación, es la contaminación del medio con microorganismos. (Liefert et al., 1992; Reed et al., 1994) Esto no sólo afecta el crecimiento y la sanidad de las plántulas sino que repercute en el ya elevado costo de producción de estos laboratorios. El uso de antibióticos en el medio no ha resultado una solución práctica debido a que se han observado efectos fitotóxicos. (Lizárraga et al., 1991; Gilbert J. E et al., 1991). Kozai et al. (1992) investigaron las condiciones ambientales dentro de los envases

comúnmente utilizados en cultivos in vitro y determinaron que controlando el micro ambiente se logra favorecer el crecimiento y desarrollo de las plántulas, reducir los desórdenes fisiológicos, evitar pérdidas por contaminación y facilitar la aclimatación durante el trasplante de papa y otros cultivos, lo que llevaría a una reducción del costo de producción. Estos autores observaron que se pueden regenerar plántulas de papa por medios autotróficos debido a que los segmentos y las plántulas obtenidas poseen una alta capacidad para fotosintetizar.

OBJETIVO

• El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método de propagación rápido basado en los conceptos de un cultivo autotrófico que favoreciera el crecimiento de las plántulas de papa y además, redujera al mínimo las pérdidas debido a la contaminación y al shock de trasplante.

ANTECEDENTES

Henshaw et al, referidos por Lindsey (4), encontraron en cultivos de meristemas Solanum spp, que el nivel de sobrevivencia se incrementó a un 83% cuando las temperaturas diurna y nocturna fueron de 12° C y 6° C, respectivamente. Por otra parte, se ha logrado extender el período de transferencia de ápices caulinares de papa cuando la temperatura es reducida y se favorece la sobrevivencia cuando se incrementa el volumen del medio y la concentración de sacarosa (12). También se comprobó que se podía aumentar la tasa de sobrevivencia a un 60% después de 12 meses, combinando ácido abscísico y

manitol en el medio (13). Mientras que Warham et al (11) pudieron establecer las condiciones óptimas de conservación in vitro de algunos cultivares de papa. Encontraron que a 10° C bajo 500-1,000 Lux por 18 horas /día y añadiendo manitol al medio se lograba un 90-100 % de viabilidad al material vegetal.

En 1962, MURASHIGE y SKOOG (10) desarrollaron un medio con el cual se ha obtenido macho éxito en los cultivos de tejidos vegetales, ellos incrementaron los niveles de amonio y potasio en relación a otros medios nutritivos que existían para la época y demostraron que había un aumento proporcional en el desarrollo de las plántulas obtenidas. Los parámetros utilizados fueron: el incremento en el peso seco y peso fresco en cultivos de callo de Nicotiana tabacum, a medida que eran añadidos nuevos elementos al medio nutritivo en estudio. Aunque este medio se desarrolló para callos de tabaco, se ha demostrado que resulta excelente para el cultivo de meristemas de papa, sin embargo, los resultados que se obtienen dependen de la variedad de papa que se estudie.

En Venezuela, los trabajos pioneros en propagación de plantas "in vitro", se han realizado en el laboratorio de cultivos de tejidos vegetales de la Universidad Central, con el estudio de la propagación de Nicotiana glauca (11) iniciadas en 1975 y con la propagación de Dianthus heddwigi (clavel) (3). La presente investigación se realizó en Solanum tuberosum y no solo se analizan aspectos fisiológicos y morfológicos de la propagación "in vitro" de dicha especie, sine que además se estudian posibilidades de usar esta

metodología como un medio de obtención de plantas sanas a partir de plantas contaminadas con virus sistémico. La variedad utilizada es proveniente de los Andes venezolanos, "Arbolona negra" y ha sido estudiada anteriormepte por otros investigadores, DEBROT, LASTRA, LADERA (2).

Consistencia adecuada del medio

Los medios solidificados con agar tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

En este trabajo se cubrieron las siguientes fases: a) Determinación de un balance óptimo de sustancias de crecimiento para lograr el mejor desarrollo de los explantes de meristemas laterales y apicales, hasta la formación de plantas completes. b) Establecimiento del tamaño y constitución

del explante más adecuado, que garantice tanto el normal y rápido desarrollo de la plántula como la liberación de contaminación viral de las nuevas plántulas obtenidas. c) Determinación de las condiciones de cultivo para asegurar la su pervivencia de la planta obtenida "in vitro" en condiciones naturales.

MATERIALES Y METODOS

Materiales y equipos

• Materiales

• Papel craft.

• Papel aluminio.

• Pabilo.

• Agua destilada.

• Placas Petri.

• Autoclave

• Ligas.

• Tubos de ensayo

• Mechero bunsen.

• Lejía.

• Balanza

• Algodón

Métodos

En la investigación se realizó en el laboratorio de Micropropagacion de la Facultad de Ingenieria Agronomica de la Universidad Nacional del Altiplano - Puno, en el primer nivel de la misma, con ayuda de los reactivos y materiales del mismo laboratorio.

Se procedió a seleccionar plantas in vitro, que presentaron uniformidad en tamaño y vigor, llevándolas a la cámara de flujo laminar, previamente esterilizada, donde se seccionaron en nudos de 1 cm de longitud tomados de la parte media de las plantas, desprovistas de la yema apical, hojas y raicillas. La implantación aséptica se realizó en diferentes medios de cultivo. Fueron utilizados tubos de ensayos de 150 mm x 20 mm, que contenían 20 mi del medio básico de Murashige y Skoog de 1962 suplementado con los constituyentes orgánicos: Sacarosa, Manitol y Agar.

Se obtuvieron segmentos de un nudo (microesquejes uninodales) de plántulas in vitro de 20 días de crecimiento los cuales se plantaron en cajas plásticas descartables. Se comparó el crecimiento y desarrollo de los microesquejes en dos clases de cajas fabricadas con distintos materiales (polipropileno y acetato), dos tipos de substratos inertes (vermiculita y esponja vegetal) y dos soluciones nutritivas sin sacarosa ni reguladores de crecimiento (solución hidropónica SNH y medio MS líquido). La descripción de los elementos utilizados y condiciones de cultivo se presenta en la Tabla 1. A los 7 y 15 días se midió el crecimiento de la parte aérea (altura de los segmentos), tasa de multiplicación (segmentos nuevos producidos/esqueje trasplantado) y las pérdidas por contaminación. Se establecieron 8 tratamientos con 3 repeticiones. El sistema que produjo el mejor crecimiento de los microesquejes, se verificó con otros10 cultivares para los que se plantaron 24 microesquejes/cultivar

los explantes de los meristemas sembrados en los medios seleccionados se

mantuvieron en cámara de crecimiento hasta que se desarrollaron completamente, es decir, hasta la obtención de la planta completa. con el objeto de realizar las pruebas virales y verificar la erradicación del virus en éstas. >;e verificó la presencia de virus en las plantas indicadoras, las plantas seleccionadas fueron Nicotiana tabacum var. White burley y var.Sansum, Nicotiana glutinosa, Chenopodium amaranticolor, Datura metel, papa A6 y Gomphrena globosa.

RESULTADOS

Se determinó que el explante más adecuado para garantizar el desarrollo normal de la plántula complete, así como la erradicación del virus, fue el constituido por el Domo más dos primordios foliares, la longitud de éste fue de 0,8 mm.

Transcurridos los primeros días del ensayo, se hizo notoria la presencia de hongos en el T1, el cual tuvo que ser eliminado al poco tiempo, por esa razón no se cuenta con información del mismo

En el estudio del número de raíces formadas, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos T2, T4 y T6, mostraron una misma tendencia respecto a la variable en estudio, destacando el T4 a los 5 meses, momento en el cual culminó el ensayo. También se observó, que los tratamientos T3 y T5 presentaron una menor altura de plántulas (Tabla 1). Estos últimos tratamientos tienen en el medio menos concentración de azúcares y contienen ABA y CCC produciendo un efecto en la disminución de crecimiento. A pesar que T2 contenía los mismos inhibidores de crecimiento su

efecto fue contrarrestado con la presencia de mayor concentración de azúcares (3% sacarosa y 4% manitol).

Con respecto a la altura de las plántulas, se pudieron constatar diferencias significativas entre los tratamientos (Tabla 1), apreciándose que los que presentaron un menor desarrollo radical también mostraron el menor desarrollo del tallo y número de nudos al quinto mes de la implantación. Mientras que el T4, al que no se le suministró retardante de crecimiento en el medio, presentó un desarrollo aéreo y radical significativamente mayor que los restantes tratamientos, así como también del callo en la base de los nudos.

Tabla 1. Valores promedio observados en plántulas de papa (Solanum tuberosum L)

Figura N° 1. Segundo día de germinación del meristemo de la papa

Figura N° 2. Octavo día de germinación del meristemo de la papa

Figura N° 3. Dia 14 de germinación del meristemo de la papa

CONCLUCIONES

- El explante del meristemo más adecuado, que permitió el normal y rápido desarrollo del explante, además de la liberación de la contaminación viral, fue el constituido por

el Domo más dos primordios foliares y 0,8 mm de longitud.

- Respecto a la evaluación del crecimiento de los tejidos en el medio óptimo, se determinó que, en las primeras etapas de desarrollo de los explantes, estos experimentaban una disminución en el contenido de agua, debido a que estaban pasando por un período de adaptación a las condiciones de cultivo; el aumento posterior en el contenido de agua está asociado a los procesos de alargamiento celular que experimenta la planta durante su crecimiento.

- Durante las etapas de desarrollo de los explantes se observó un aumento en el contenido de nitrógeno total, que obedece a los procesos de formación y constitución que están ocurriendo en estos explantes; el, posterior descenso corresponde a un incremento en la acumulación de otro productos, tal como carbohidratos, que son necesarios en etapas posteriores del desarrollo de la planta.

LITERATURA CITADA

1. Bajaj, Y. 1981. Regeneraron of plants from potato meristems freezepreserved for 24 months. Euphytica 30: 141-135.

2. Golmirzaie, A.; Toledo, J. Noncryogenic, long term germoplasm storage. Methods in molecular Biology. En: Vol III: Plant Cell culture protocols, Ed. R. D. Hall Human Press Inc. Totowa, N. J. p. 95-101.

3. Hussey, G.; Stacey, N. 1981. In vitro propagation of potato. Am. Botany 48: 787-796.

4. Lindsey, A. 1980. Tissue culture storage for genetic conservation IBPGR. Technical Report. Rome. 14 p.

5. Murashige, T.; Skoog, F. 1962. A revise medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture. Physiology PL. 15:473-496-

6. Perdomo, D.; Páez de Cásares, J. 1989. Avance en la producción de plantas in vitro a partir de ápices caulinares de papa. Revista de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela. Alcance NQ 38, 109-119.

7. Roca, M.; Mroginski, L. 1991. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. CIAT, Colombia. 697p.

8. Slack, S. 1980. Meristem tip culture. Plant Disease 64 (1): 15-17.

9. Stace-Smith, R; Mellor, C. 1968. Erradication of potato viruses X and S by thermotherapy and axillary bud cultures. Phytopathology 58(2): 199-203.

10. Vásquez, R.; Páez de Cásares, J. 1989. Producción in vitro de brotes aéreos de papa (Solanum tuberosum L) cv. Atzimba. Revista de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela. Alcance No 28, 119-130.

11. Warham, E.; Burnett, P. 1989. In vitro storage of potato. ZuowupinzbongZiyuan N° 3, 42-43.

12. Wescott, R.J. 1981. Tissue culture storage of potato germplasm I.

excelente
información muy útil, gracias
muy concreta tu información me sirvio para mi clase de hoy
Me va a servir mucho para mi tesis ;)
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