Proteinas recombinantes (paper), Proyectos de Acuicultura. Escuela Politécnica de Chimborazo
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PR para la sintesis de nuevos productos
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Revista de Ciencias Biológicas y de la Salud www.biotecnia.uson.mx

Universidad de Sonora “El saber de mis hijos hará

mi grandeza”

8 Volumen XV, Número 3

PERSPECTIVAS ACTUALES DEL USO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y SU IMPORTANCIA EN LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA E INDUSTRIAL CURRENT PERSPECTIVES ON THE USE OF RECOMBINANT PROTEINS AND THEIR IMPORTANCE

IN SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH

Guevara-Hernández E1, López-Zavala AA1, Jiménez-Gutiérrez LR1 y Sotelo-Mundo RR1,2,* 1Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. Carretera a Ejido La Victoria Km 0.6. PO Box. 1735. Hermosillo, Sonora, 83304, México. | 2Departamento de Investigación en Polímeros y Materiales. Universidad de Sonora. Blvd. Rosales y Blvd. Luis Encinas. Hermosillo, Sonora 83000, México.

Autor para correspondencia: Dr. Rogerio R. Sotelo-Mundo Correo electrónico: rrs@ciad.mx; rsotelo@polimeros.uson.mx

Recibido: 31 de octubre de 2012 Aceptado: 12 de marzo de 2013

RESUMEN El descubrimiento de la estructura y el mecanismo

de replicación del ADN han permitido el desarrollo de téc- nicas biomoleculares para su manipulación, gracias a estos avances es posible sintetizar proteínas en organismos en los que no se encuentran de manera natural (sobreexpresión heteróloga). A las proteínas producidas de esta manera se les conoce como proteínas recombinantes (PR).

Las PR se pueden producir en una gran variedad de sistemas biológicos, como bacterias, levaduras y hasta célu- las eucariontes. Comercialmente están disponibles un gran numero de sistemas de expresión y uno de los más utilizados es el sistema basado en la ARN polimerasa del fago T7. Las PR pueden tener características estructurales y funcionales muy similares a las proteínas naturales y por lo general se producen con alta eficiencia. Sin embargo, algunas PR no son funcionales o sufren problemas de plegamiento cuando se expresan en células procariontes, formando agregados moleculares que se conocen como cuerpos de inclusión. La coexpresión con otras proteínas, como las chaperonas o el uso de cepas modificadas para la sobreexpresión, son algu- nas de las estrategias utilizadas para evitar la formación de agregados. A pesar de estas limitantes, la tecnología de PR es ampliamente utilizada en investigación y en la industria farmacéutica y alimentaria. Esta revisión tratará sobre los principales aspectos del proceso de producción de PR y sus aplicaciones. Palabras claves: Proteínas recombinantes, sobreexpresión heteróloga, plásmidos, biofármacos, sobreexpresión de pro- teínas.

ABSTRACT The discovery of DNA’s structure has allowed the

development of molecular techniques for its manipulation. With these advances it is possible to synthesize proteins in organisms that are not found naturally (called protein hete- rologous over expression). A protein produced in this way is known as recombinant proteins (PR), since it is the product of recombinant DNA. The PR can be produced in a variety of systems, like bacteria, yeast and eukaryotic cells. Likewise, there are several expression systems available; being the system based on phage T7 RNA polymerase one of the most

used. Usually, PR may have similar structural and functional properties as the natural protein, and they are produced in high yield. However, some PR is difficult to obtain due to the formation and accumulation of aggregates (inclusion bo- dies). The chaperone co-expression and the use of modified host strains are some strategies used to solve some of these problems. Despite these limitations, PR technology has been widely used in different industries such as pharmaceuticals, food, among others. On the other hand, the use of PR has enabled major advances in the understanding of diverse cellular processes in scientific research. Keywords: Recombinant proteins, plasmids, heterologous expression, protein expression

INTRODUCCIÓN El ácido desoxiribonucleico (ADN) contiene la

información necesaria para la síntesis de proteínas. El de- scubrimiento del código genético abrió la posibilidad de obtener péptidos y/o proteínas a gran escala a partir de diversos organismos en los cuales no se producen de manera natural. A las proteínas obtenidas de esta manera se les con- oce como PR. Éstas se pueden producir en microorganismos como bacterias, hongos, virus y levaduras, así como en líneas celulares cultivables de insectos, plantas y de mamíferos (Jonasson et al., 2002; Palomares et al., 2004), sistemas de expresión de proteínas “sin células” y también en animales y plantas trangénicas (Farrokhi et al., 2009).

La sobreexpresión de PR ofrece la ventaja de producir grandes cantidades de la proteína de interés con característi- cas similares a la proteína natural y de manera relativamente fácil y rápida. Esta tecnología cuenta con al menos 35 años y por su aplicación tanto en la industria farmacéutica y ali- mentaria, como en la investigación científica, se encuentra entre los desarrollos más importantes del siglo XX (Porro et al., 2005).

El procedimiento para producir una PR consiste en introducir el ADN que codifica para la proteína de interés en un vector de sobreexpresión (plásmidos, virus, cósmidos). El vector contiene un origen de replicación que le permite copiarse dentro de la célula hospedera, una región promo- tora que permite la producción de la proteína de interés, un sitio de clonación múltiple (SCM), que es una región que con-

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tiene diversos sitios de restricción que permiten la inserción de ADN entre ellos y en algunos casos, genes de resistencia a antibióticos y genes reporteros, que facilitan la selección de las colonias de bacterias que tendrían el vector con la información genética insertada.

Por ejemplo, para crear un plásmido recombinante, se lleva a cabo un procedimiento de ligación que permite insertar dentro del SCM del vector, un segmento de ADN que corresponde al marco de lectura funcional, que con- tiene la información para la generación de la proteína de interés. Al producto de este vector, más el fragmento de ADN codificante (inserto), se denomina “construcción”. El siguiente paso es la “transformación”, ésta se realiza al insertar la con- strucción dentro de la célula hospedera y ésta se convierte en una fábrica celular de la proteína de interés (Palomares et al., 2004). La bacteria Escherichia coli es uno de los sistemas de sobreexpresión más utilizados para la producción de PR. Algunas ventajas que ofrece son su rápida reproducción, utiliza medios de cultivo relativamente baratos, buen mane- jo en fermentaciones de alta densidad y fácil escalamiento. Además, ha sido uno de los organismos más utilizados como modelo de estudio, debido a esto se ha sido caracterizado ampliamente y se han desarrollado numerosas herramientas que han facilitado su clonación y expresión genética (Baneyx y Mujacic, 2004).

Otra ventaja del uso de las PR es que se puede hacer mutagénesis dirigida para modificar su secuencia de ami- noácidos, algunos ejemplos de estas técnicas son: la PCR de extensión por sobreposicionamiento (OE-PCR por sus siglas en inglés), mutagénesis de casete, el método de Kunkel entre otras. Esto permite cambiar la secuencia de aminoácidos y conferir o suprimir características específicas que se deseen estudiar, como la estabilidad térmica, la inmunogenicidad, propiedades estructurales o alguna otra de interés industrial, médico o farmacológico (Palomares et al., 2004).

Con los avances en el conocimiento de biología mo- lecular y biotecnología, es relativamente sencillo producir PR. Muchas proteínas pueden ser obtenidas con algún mé- todo que utilice la tecnología de la PR. Sin embargo, antes de iniciar un proceso de producción, se debe establecer un protocolo adecuado en base a las características de la PR que se desea expresar y esto definirá, por ejemplo: el sistema de sobreexpresión, el vector de sobreexpresión, si se expresará la proteína completa o algún dominio, las posibles dificulta- des que se puedan presentar en el proceso, las estrategias de purificación y almacenamiento de la PR.

En este artículo se hará una breve descripción de las principales técnicas de sobreexpresión de PR y se revisarán sus campos de aplicación en el ámbito científico e industrial, así como sus tendencias y perspectivas.

BASES DE DATOS DE SECUENCIAS GENÉTICAS En los últimos años los avances en la secuenciación

de genes han culminado en la elucidación de la secuencia completa del genoma humano, así como de otros organis- mos. Esta información se ha depositado en bases de datos

electrónicas disponibles para la comunidad científica, orga- nizadas en librerías que contienen los genomas completos, por ejemplo, la Librería Mayor de Genomas Microbianos (EMGLib, por sus siglas en inglés, http://pbil.univ-lyon1.fr/ emglib/emglib.html) contiene todos los genomas de bacte- rias secuenciados a la fecha (Perrière et al., 1999).

Existe un gran número de páginas electrónicas con bases de datos de genes, difieren básicamente en la infor- mación proporcionada, ya sea por el tipo de organismo de estudio o por la aplicación y estudios en los que se han enfocado. Una de las bases de datos más utilizada por la comunidad científica es la del Centro Nacional para la In- formación en Biotecnología (NCBI, por sus siglas en inglés, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esta base de datos almacena la información referente a secuencias genómicas en el Banco de Genes (GenBank). Además, contiene un índice de artículos científicos y una recopilación de enfermedades genéticas humanas (Perrière et al., 1999).

Otras bases de datos disponibles y de libre acceso son: El banco de datos de proteínas (PDB, por sus siglas en inglés; http://www.pdb.org/pdb/home/home.do), la iniciativa de Estructura de Proteínas del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NHI por sus siglas en inglés, http://www. nigms.nih.gov/Initiatives/PSI/) y la base de datos SPINE del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, por sus siglas en inglés, http://www.ebi.ac.uk/euprojects/index.html). Estas bases de datos proporcionan la información de los genes que codifican para la proteína de interés.

En algunos casos la información de la región codifi- cante está completa, pero en otros, se pueden encontrar eti- quetas de fragmentos expresados (conocidas como EST, por sus siglas en inglés). Estas regiones son de gran utilidad para completar la región codificante de la proteína que se desea estudiar y a partir de allí iniciar con el proceso de producción de PR. Esta propiedad es muy importante, ya que se puede investigar una proteína determinada de un organismo sin que sea necesario conocer su genoma completo, por ejem- plo, se puede hacer una búsqueda de secuencias similares conocidas de otros organismos en estas bases de datos y es posible encontrar el gen completo, o bien sólo fragmentos, que mediante el uso de primers degenerados (que son formados a partir de secuencias conservadas en todos los organismos) se pueden obtener los fragmentos restantes del gen mediante la técnica del PCR.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES La ARN polimerasa (ARNpol) es una enzima que realiza

una de las funciones más importantes de la célula: la tran- scripción del ADN. Este es el proceso por el cual se genera una copia de ARN mensajero (ARNm) a partir de un molde de ADN. En eucariontes y procariontes este proceso se lleva a cabo por un sistema complejo de proteínas que conforman la ARNpol, sin embargo, en organismos como los bacteriófagos (p.ej. fago T7), la ARNpol es menos compleja: se compone por una sola subunidad y es capaz de realizar todo el proceso de transcripción, como su homóloga en organismos superiores.

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Otra característica importante de esta ARNpol es que pre- senta una elevada velocidad de transcripción y sus regiones promotoras son altamente específicas (McAllister y Raskin, 1993; Tunitskaya y Kochetkov, 2002). Estas características ha- cen a la ARNpol del fago T7 (T7-ARNpol) un excelente modelo para implementarse en sistemas de expresión de PR, ya que en estos sistemas se requiere de una alta eficiencia de po- limerización de nucleótidos y al mismo tiempo una elevada capacidad de regulación sobre su función.

Los sistemas de expresión basados en la T7-ARNpol, fueron creados para la producción de PR en E. coli. El sistema de sobreexpresión pET® que utiliza esta enzima es el más con- ocido comercialmente para la sobreexpresión de PR (Studier y Moffatt, 1986). Como se mencionó anteriormente, esta po- limerasa posee una alta especificidad por su región promo- tora, asimismo, también tiene una alta capacidad de proces- amiento, de regulación y funciona adecuadamente en E. coli (Studier y Moffatt, 1986). En el sistema pET® se usa una cepa de E. coli llamada BL21, que contiene el gen de la T7-ARNpol. Para tener control de la síntesis de la PR y dado que es más eficiente este proceso durante la fase exponencial, la región promotora del vector generalmente está bajo el control del operador lac, el represor lacI se encuentra presente bloque- ando la expresión de la T7-ARNpol y por lo tanto, también la expresión de la proteína de interés. Al añadir un inductor como el isopropilo de tiogalctósido (IPTG), el promotor deja de estar reprimido y se inicia la síntesis de la PR.

El sistema T7 no es infalible, ya que se pueden pre- sentar bajos niveles de sobreexpresión de la proteína de interés. Si la proteína es tóxica para la bacteria, ésta sufre lisis y el cultivo no crece adecuadamente. En otros casos, la

proteína de interés no puede detectarse, tanto en la fracción soluble como en la insoluble. Sin embargo cuando el sistema T7 funciona correctamente, se puede tener rendimientos de hasta el 50 % de la proteína recombinante con respecto a la proteína total de la bacteria (Changchien et al., 2000; Studier et al., 1990). Por ello, se han desarrollado alternativas en el diseño de vectores de sobreexpresión, algunos de ellos contienen diferentes secuencias cercanas al sitio de clon- ación que expresan diversas etiquetas de fusión (“tags”, en inglés), que facilitan la purificación, solubilidad o transporte al periplasma de las proteínas que se desea expresar, por ejemplo, los vectores pET14-16 que contienen una etiqueta de fusión de histidinas que facilita la purificación por medio de cromatografía de afinidad a metales (IMAC), los vectores de sobreexpresión pET32 y pET41-42 contienen una etiqueta de fusión con tiorredoxina y GST (glutatión S-transferasa) que facilita la solubilidad de algunas proteínas y también su pu- rificación. En el mercado existen un gran número de vectores que ofrecen una alternativa al sistema pET, estos contienen diferentes características que se adecúan a casos particulares de sobrexpresión. Por mencionar algunos, se encuentran los vectores con diferentes promotores como el T5, ramnosa, arabinosa, entre otros. El vector pCold que es usado para proteínas que presentan problemas de solubilidad en siste- mas basados en el sistema T7 al disminuir la temperatura de sobreexpresión. Puede contener también secuencias para fa- vorecer el rendimiento de la proteína que se desea expresar, por ejemplo, una secuencia con proteínas chaperonas, para mejorar el rendimiento y plegado, o bien con lisozima, para ofrecer estabilidad a algunas proteínas y facilitar la lisis de células, vectores con diferentes inductores que permiten la

Figura 1. Diagrama general de producción y obtención de PR. Figure 1. General diagram for recombinant proteins production.

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expresión de proteínas tóxicas, como el sistema Rhamex® de DNA 2.0. El proceso general para la producción de proteínas recombinantes se describe gráficamente en la figura 1.

Primero, se puede obtener el ADN complementario (ADNc) mediante la transcripción reversa del ARN mensajero de interés y su posterior secuenciación para confirmar la identidad. Posteriormente se utilizan enzimas de restricción para clonar el ADNc (o fragmento de interés) en un vector de expresión basado T7-ARNpol (sistema pET®). En caso de ser necesario, esos sitios únicos de restricción se pueden introducir mediante PCR con iniciadores que se extiendan corriente arriba y abajo de la región codificante de interés (Barron et al., 2007; Geisse y Fux, 2009; Palomares et al., 2004).

Algunos de los vectores de expresión contienen una etiqueta en el amino o en el carboxilo terminal. Generalmente se utilizan etiquetas de histidinas, argininas o proteínas de fusión, como la GST o la tiorredoxina, lo que facilita en gran medida la purificación de la PR mediante cromatografía de afinidad o de intercambio iónico para el caso de la etiqueta de argininas (Terpe, 2003). Para algunas aplicaciones como la cristalografía de proteínas o la generación de anticuerpos, esta inserción debe ser eliminada y esto se logra incluyen- do un sitio de corte para una proteasa específica. Algunos ejemplos son la enterocinasa que reconoce una secuencia de 5 aminoacidos (DDDDK), la proteasa TEV (ENLYFGS) y la proteasa PreScission ® (LEVLFQ/GP).

Lo siguiente es Transformar una cepa de E. coli,como la BL21, que sea compatible con el plásmido recombinante, formado por el vector de expresión pET® u otro utilizado, que contenga la región codificante de interés y seleccionar la ce- pas de acuerdo a los criterios de selección de antibióticos del vector (resistencia a ampicilina, kanamicina, etc.). Las bacte- rias se inoculan en caldo LB o algún otro medio previamente optimizado para E. coli BL21 transformadas con el constructo. Al llegar a la fase exponencial (cuando la densidad óptica del cultivo esté entre 0,4-0,8 a 600 nm) se añade el inductor. Se continúa con el crecimiento del cultivo proveyendo aireación suficiente para mantener una adecuada oxigenación en el medio y se determina el tiempo más adecuado de expresión, mediante análisis de electroforesis en condiciones desnatu- ralizantes y reductoras SDS-PAGE (Lesley y Wilson, 2005). Para finalizar, se recupera la biomasa y se purifica la PR mediante lisis celular y técnicas cromatográficas. En algunos casos se puede secretar la PR al medio de cultivo mediante el uso de vectores especialmente diseñados para ello.

Las proteínas que mejor se expresan en bacterias y en particular en el sistema pET® son las citoplasmáticas, es decir, aquéllas que llevan a cabo su función en el citosol. Proteínas de membrana, secretadas o que contengan modificaciones post-traduccionales, como glicosilaciones, fosforilaciones amidaciones, formación de puentes disulfuro, etc. son prob- lemáticas al sobreexpresarse en E. coli.

La producción de PR es un proceso relativamente sencillo y ofrece muchas ventajas. Sin embargo, uno de los principales obstáculos es obtener la PR en su forma soluble y funcional. Muchas proteínas son complejos multi-proteicos y

a menudo requieren interaccionar con otras moléculas para su correcto plegamiento. En ocasiones, algunas proteínas no se pueden obtener en su forma funcional mediante procesos clásicos de PR.

Actualmente, es posible mejorar el plegado de la PR al co-expresarse con otras proteínas con las que interactúa (Gräslund et al., 2008). Además, se ha demostrado que la co-expresión de chaperonas facilitan el plegamiento de la PR de interés (Deuerling y Bukau, 2004). Por ejemplo, se ha reportado que el vector pG-Tf2 (Takara Bio Inc.) favorece la producción y el correcto plegado de PR que no había sido posible producirlas por técnicas de sobreexpresión clásicas, como es el caso de la lisozima y otras. Este vector contiene una combinación de las chaperonas tipo GroEL-GroES y Tig. Si bien se ha demostrado su efectividad a nivel laboratorio, aun hacen falta más estudios para evaluar su uso a escala industrial (Gräslund et al., 2008).

En nuestro grupo de investigación se han producido proteínas recombinantes en su forma soluble y funcional, utilizando este sistema de expresión, como la lisozima del camarón (gamba) blanco Litopenaeus vannamei (de-la-Re- Vega et al., 2004), la timidilato sintasa del WSSV (White Spot Syndrome Virus, por sus siglas en inglés) (Arvizu-Flores et al., 2009), la glutatión-S-transferasa (Salazar-Medina et al., 2010), la nucleótido cinasa (Quintero-Reyes et al., 2012), la timidina monofosfato cinasa del WSSV (Guevara-Hernandez et al., 2012), entre otras. Para el caso de la lisozima, que con- tiene enlaces disulfuros en su estructura, se establecieron las condiciones de sobreexpresión (Figura 2) y replegamiento in vitro para obtener proteína soluble a partir de cuerpos de inclusión.

FÁBRICAS BIOLÓGICAS PARA LA PRODUCCION DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Se han desarrollado una gran variedad de sistemas de expresión, tanto procariontes como eucariontes para la producción de PR. Los organismos más utilizados son: bacterias, levaduras, insectos, plantas y células de mamíferos (Basile y Peticca, 2009). En algunos de ellos se utiliza el micro- organismo completo (p.ej. E. coli) y en otros se utilizan células derivadas del organismo (p.ej. cultivos vegetales, células de insecto o de mamífero) o bien, se puede implementar la expresión de proteínas libre de células.

Los sistemas más utilizados para la producción de proteínas recombinantes en EUA y Europa son los microor- ganismos, con un 55 % (del cual 39 % corresponde a E. coli y un 15 % a levaduras ) y células de mamífero, específicamente células de ovario de hámster (CHO), con un 35 % (Rader, 2008).

La bacteria E. coli, es uno de los sistemas más utilizados para la producción de PR. Esta bacteria tiene la capacidad de crecer rápidamente y con alta densidad en medios de cultivo de bajo costo. Además, en el mercado hay una gran disponib- ilidad de cepas mutantes, un ejemplo es el sistema BL21 de Invitrogen® que carece de las proteasas lon y ompT, esto re-

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duce la degradación de las proteínas heterólogas expresadas en estas células y de vectores de expresión compatibles con E. coli.

E. coli no es capaz de realizar modificaciones post-tra- duccionales, necesarias para la mayoría de las proteínas de eucariontes. Sin embargo, existen algunos vectores que ayudan a realizar estas modificaciones. Por ejemplo, el vector pET12a® contiene una etiqueta de señalización que permite que la PR se acumule en el periplasma de la bacteria (EMD Chemical/Novagen, USA).

Aunque no todas las PR pueden ser sintetizadas en E. coli, se ha logrado mejorar el rendimiento y la versatilidad de este microorganismo (Baneyx, 1999; Shokri et al., 2003), cada línea celular puede presentarse de diferentes formas modifi- cando algunas características de su genoma, por ejemplo, la designación DE3 en las bacterias, indica que están basados en la RNA polimerasa del fago T7 y por lo tanto, se encuen- tran bajo el control del promotor LacUV5, la designación pLysS, indica que la bacteria hospedera contiene el gen que codifica la lisozima T7, que es un inhibidor natural de la RNA

polimerasa T7 y que permite disminuir la sobreexpresión basal, haciendo más estable la expresión de la PR.

Algunos insertos que codifican para proteínas eucari- ontes contienen codones (codones raros) cuyos tripletes no se presentan naturalmente en E. coli, por lo que es necesario modificar la secuencia del inserto para incluir los codones que si se presentan en la bacteria. Una alternativa es usar las cepas de Novagen®, Rosetta™, Rosetta-Blue™ y Rosetta-Ga- mi™, que contiene los tripletes para los codones raros (AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA). Otras líneas celulares, como Origami™ y Origami™B presentan una mutación en los genes trxB y gor que favorecen la formación de puentes disulfuro en el citoplasma (http://goo.gl/oRJkl). Algunos ejemplos de PR producidas en esta bacteria son proteínas para usos industri- ales, como renina, amilasas, proteasas y celulasas, proteínas terapéuticas, como insulina, hormonas de crecimiento e in- terferones, entre muchas otras (Lesley y Wilson, 2005). Otras bacterias que también han sido utilizadas como modelo para la producción de PR son: Lactococcus lactis y Bacillus subtilis, pero en menor grado(Morello et al., 2008; Nijland y Kuipers, 2008).

Otro de los organismos utilizados para producir PR son las levaduras. Las más usadas son Pichia pastoris y Sac- charomyces cerevisiae, en las cuales se han expresado cientos de proteínas diferentes (Cregg et al., 2000; Mattanovich et al., 2004; Porro et al., 2005). Generalmente las levaduras, al igual que las líneas celulares de insectos y mamíferos se utilizan para sobreexpresar proteínas que son tóxicas o que no se pueden plegar correctamente en E. coli (Kost et al., 2005; Oker-Blom y Vuento, 2003). Además, estos sistemas pueden realizar modificaciones post-traduccionales, excretar la PR al medio de cultivo y también se obtienen rendimientos may- ores al 50 % (Gräslund et al., 2008)

La expresión transitoria del gen (por sus siglas en inglés: TGE) en células de mamífero es una importante tec- nología para la generación de PR. La TGE, cumple todos los requisitos en materia de cantidad y calidad de los productos. Para las líneas celulares CHO y HEK293 se han optimizado protocolos que permiten la producción de proteínas con un alto rendimiento (Geisse y Fux, 2009). Por otro lado, en el 2009, Basile y Peticca utilizaron al parásito Leishmania tarentolae como modelo para la expresión de genes het- erólogos. La familia Tripanosomatidaea a la que pertenece este protozoo se caracteriza por ser ricos en glicoproteínas. Se ha reportado que las proteínas sobreexpresadas en este parásito presentan las glicosilaciones en la misma posición que las estructuras de las proteínas nativas. Si bien, su uso en la tecnología de PR es reciente, ya se han producido varias enzimas y receptores de membrana citoplasmática y además se pueden producir a nivel intracelular o pueden ser secreta- das al medio de cultivo.

Entre los diferentes sistemas basados en tejidos vegetales, la producción de PR en semillas es la plataforma más utilizada. Este sistema ofrece varias ventajas, tales como: mínimo costo de producción, no propaga virus y patógenos de mamíferos, confiere un almacenamiento estable de la PR

Figura 2. Cinética típica de sobre expresión de lisozima de camarón (Litopenaeus vannamei) en E. coli. La figura representa un gel de poliacrilamida donde las proteínas se separan en condiciones desnaturalizantes y reductoras y migran de acuerdo a su masa molecular. STD corresponde al estándar de masa molecular, el carril 1 corresponde al cultivo sin inducir, los carriles 2-10 corresponden a muestras colectadas de biomasa cada hora después de la inducción. El carril HEL corresponde a una muestra de lisozima de clara de huevo con una masa de 14 kDa. Figure 2. Expression pattern of recombinant shrimp lyso- zyme (Litopenaeus vannamei) expressed as a recombinant form in E. coli. The figure shows a polyacrylamide gel under denaturing and reducing conditions, where all bacterial pro- teins are separated. The proteins migrate according to their molecular weight. STD corresponds to the molecular weight marker, lane 2 corresponds to uninduced bacteria, and lanes 2-10 correspond to samples taken each hour post induction. Lane labeled with HEL contains hen egg white lysozyme, which has a molecular weight of 14 kDa.

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y además, es capaz de realizar modificaciones post-traduc- cionales en las proteínas (Jamal et al., 2009; Lau y Sun, 2009; Ahmad et al., 2010).

El primer producto biofarmacéutico producido en células de plantas fue la hormona del crecimiento humana, producida en tabaco transgénico en 1986 (Barta et al., 1986). Desde entonces, diversas especies de plantas, como cereales, legumbres, frutas y vegetales han sido utilizados para la pro- ducción de biofármacos, anticuerpos y vacunas (Miao et al., 2008; He et al., 2008).

No obstante, el principal obstáculo para la producción de PR en tejidos vegetales ha sido su bajo nivel de acumu- lación. Para solventar esta situación, se han implementado estrategias de transformación de los cloroplastos, expresión transitoria y fusión de proteínas (Ahmad et al., 2010). Sin embargo, se ha reportado que los tejidos de plantas son altamente influenciados por factores ambientales, como la temperatura, la luz, la salinidad, la sequía, la nutrición, los insectos y plagas (Jamal et al., 2009).

Una alternativa es la producción de PR en células de plantas en biorreactores, ya que se pueden controlar las condiciones de producción, aumentar la consistencia y homogeneidad del producto, simplifica la purificación (especialmente de proteínas secretadas extracelularmente), reduce la contaminación potencial de endotoxinas y mico- toxinas derivadas de las plantas y del suelo y minimiza el silenciamiento post-transcripcional de genes (PTGS) (Huang y McDonald, 2009).

El principal compartimento de almacenamiento de proteínas recombinantes de células de plantas generadas en bioreactores son las vacuolas (almacenamiento de proteínas en vacuolas, PVS por sus siglas en inglés). Ésta a su vez se divi- de en tres compartimentos morfológica y bioquímicamente diferentes: La matriz, la estructura globoide y la cristaloide. La matriz es el reservorio principal de proteínas solubles, la estructura globoide presenta un ambiente ácido que contie- ne ácido fítico o cristales de oxalato y la estructura cristaloide que puede estar conformada por proteínas de almacena- miento. Para que las proteínas recombinantes puedan alcan- zar estos depósitos se pueden agregar señales específicas que se encuentran en las proteínas naturales, esto permite a su vez seleccionar el compartimento de almacenamiento para la proteína recombinante (Miao et al., 2008).

Los “cuerpos grasos de las semillas” (OB por sus siglas en inglés), también son utilizados para la producción de PR en bioreactores. Algunas de las ventajas de este organelo, es que existen en diversos tejidos vegetales, como semillas, polen, frutas y oleaginosas. Además se pueden generar pro- teínas de fusión con oleosinas, que pueden ser purificadas fácilmente por centrifugación (Miao et al., 2008).

En la técnica de la expresión libre de células todos los componentes necesarios para la replicación de ADN son ais- lados y usados con un templado, que puede ser ADN o RNA para generar la proteína. Una de las principales ventajas de este sistema es que se puede evitar la toxicidad que presen- tan algunas proteínas heterólogas en los sistemas de expre-

sión en bacterias, promoviendo un correcto plegado en estos casos. Los sistemas de expresión libres de células más usados son los basados en extractos de E. coli, germen de trigo y sistemas derivados de células de mamífero (Farrokhi, 2009).

LIMITACIONES EN LA PRODUCCIÓN DE PR A pesar de la importancia y al amplio uso de la tec-

nología de PR tanto en la industria farmacéutica como en la investigación, aún no se cuenta con una estrategia infalible para la obtención de PR.

Se han analizado una gran cantidad de variables y fac- tores en el proceso de producción (temperatura, pH, oxígeno, cepas hospederas etc.) que se sabe están estrechamente re- lacionados con el rendimiento e integridad de la PR. También se ha evaluado la importancia de la composición del medio de cultivo (concentración, tipo y consumo de nutrientes, etc.) (Holmes et al., 2009), por lo que es necesario establecer experimentalmente las condiciones óptimas para cada PR. A continuación se mencionan algunas de las dificultades y limitaciones que suelen presentarse en los protocolos de síntesis y purificación de estas proteínas:

1- La recombinación de un plásmido recombinante que codifica la PR en el genoma del hospedero. Esto puede tener como consecuencia la interrupción de genes impor- tantes en el genoma del hospedero y dar origen a genotipos desconocidos que son incapaces de sintetizar la PR. En el mejor de los casos se puede producir la PR, pero con bajo rendimiento (Barron et al., 2007).

2.- Deterioro de la fisiología celular del hospedero. El estrés por manejo es uno de los principales factores que afectan el desarrollo y crecimiento del hospedero (Sevastsyanovich et al., 2010). Otro factor importante es el estrés nutricional al que están sujetos los microorganismos hospederos. En conjunto, estos factores pueden ocasionar errores de transcripción que repercuten en la integridad de la PR. Estos errores aleatorios son difíciles de detectar, ya que producen una mezcla heterogénea de polipéptidos. Las pro- teínas alteradas pueden estar presentes en cantidades muy pequeñas, pero el número total de moléculas defectuosas podría ser sustancial en el rendimiento de la PR (Barron et al., 2007; Mattanovich et al., 2004).

3- Una inadecuada aireación del cultivo puede pro- vocar limitaciones en la producción de aminoácidos y la estabilidad del plásmido (Holmes et al., 2009).

Se han empleado varias estrategias para minimizar estas limitaciones. Barron y Piskavera (2007), desarrollaron alternativas a los protocolos estándar para minimizar el error durante la síntesis de las PR. Estos protocolos se basan en la inserción directa del material genético en el hospedero. Además incluyeron marcadores de selección negativa en combinación con los marcadores tradicionales.

Los procesos de automatización son de gran ayuda para establecer los métodos de control y calidad, adecuados durante la síntesis de la PR. Esto permite hacer reproducibles los protocolos de producción de PR y ejecutarlos con mayor facilidad (Acton et al., 2005; Genomics:-GTL-Roadmap., 2005).

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Asímismo, se han desarrollado nuevas cepas de E. coli, más resistentes al manejo y al estrés producido por la sobreex- presión. Estas cepas incluyen mejores marcadores de selec- ción o modificaciones en el metabolismo (baja producción de acetato) (Eiteman y Altman, 2006). Para mejorar el problema de plegamiento se han probado diferentes estrategias, como modificaciones en la fuerza del promotor, la temperatura de cultivo, optimización de codones raros (tARN) en la cepa Ro- setta-Gami de E. coli; así como la co-expresión de chaperonas en cualquier tipo de cepa E. coli BL21(DE3) (Martinez-Alonso et al., 2010). Sin embargo, es posible que la co-expresión de chaperonas pueda reflejarse en un bajo rendimiento de la PR (Martinez-Alonso et al., 2010).

Con respecto a la recuperación de la PR, las proteínas de fusión y la adición de etiquetas de afinidad a metales han facilitado en gran de medida los procesos de purificación de la PR (Jonasson et al., 2002).

En la actualidad existe gran interés en producir PR para el uso de aplicaciones farmacéuticas, industriales o para el desarrollo de la investigación científica. Si bien, se han im- plementado un gran número de metodologías exitosas para la producción de PR, a menudo se presentan dificultades en las diferentes etapas de su proceso de producción. Por lo que es necesario determinar las condiciones ideales para la producción y recuperación de la PR que se está generando.

CAMPOS DE APLICACIÓN Y COMERCIALIZA- CIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Desde sus inicios en la década de los 70, la industria biotecnológica del ADN recombinante ha crecido continua- mente. Sus campos de aplicación se han expandido a dife- rentes ramas industriales, como la farmacéutica, ambiental,

textil, alimentaria y energética (Tabla 1). La industria farmacéutica ha sido una de las más

beneficiadas con la tecnología de producción de PR (Geisse y Fux, 2009). La insulina fue el primer biofármaco comer- cializado que se obtuvo mediante esta tecnología. Esta molécula ha sido valorada entre los 10 medicamentos más comercializados en el mundo en cuanto a producción y a las altas ganancias económicas que se derivan de su comerciali- zación. Este biofármaco se produce bajo diferentes nombres comerciales, como humulina®, InsulR®, Lantus® y Arasnep®, entre otros.

Desde mediados de la década pasada cientos de fár- macos habían sido probados para el tratamiento de diversas enfermedades y actualmente más de 100 fármacos han sido aprobados desde el año 2000 a lo que va del presente año (http://www.biopharma.com/approvals.html) y se estima que para los próximos años los biofármacos representarán el 12 % del total de las ventas mundiales de medicamentos de prescripción (Tabla 2).

En México también se producen PR de interés far- macológico. Laboratorios Silanes S.A. de C.V. es unos de los pioneros a nivel mundial en la producción de anti-venenos (http://www.silanes.com.mx/html/bioclon.html), en colab- oración con el Instituto Bioclon, comercializan varios fabo- terápicos para tratar picaduras de insectos y otros animales venenosos para el humano (Boyer et al., 2009, Casasola et al., 2009), aunque los faboterápicos no son PR, este laboratorio utiliza esta tecnología durante su desarrollo. Algunos de sus productos, como el Alacramyn® y el Antivipmyn® han sido aprobados por la FDA y son distribuidos en varios países.

Las industrias relacionadas con la producción de PR se han establecido prácticamente en todas las regiones

Tabla 1. Aplicaciones y beneficios Industriales de proteínas recombinantes. Tomado de: BIO-Report 2008. Table 1. Applications and industrial benefits of recombinant proteins. Source: BIO-Report 2008.

Campo de aplicación Usos Beneficios

Industria farmacéutica Producción de compuestos activos, intermediarios terapias.

Disminuye costos y tiempo de producción, fármacos más específicos, disminuye reacciones inmunológicas e

infecciones

Aplicaciones ambientales Detección de contaminantes mediante anticuerpos monoclonales

Más baratos y rápidos que las pruebas convencionales. Se pueden aplicar en

campo

Industria papelera Mejora el proceso de manufactura mediante el uso de enzimas

Disminuye la toxicidad de los residuos del procesamiento de la pulpa

Industria textil Aplicaciones en la fabricación secado y terminación de productos, adición

de enzimas en detergentes

Disminuye la toxicidad de residuos de producción, detergentes más efectivos

Industrias de los alimentos Procesos de producción, generación de aditivos y conservadores

Mejora de procesos, calidad de productos, técnicas de análisis

Industria energética Uso de enzimas en procesos de producción de biocombustibles

Generación de biocombustibles más limpios y a partir de desechos

industriales o agrícolas

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del mundo con ganancias de miles de millones de dólares (Tabla 3). Tan solo en EUA, entre el 2009-2010 se registró un incremento record de 4,5 billones de dólares en este sector. Además, Se espera que este sector tenga un crecimiento del 1,5 % para el año 2018. Por esta razón se considera que este sector tendrá uno de los crecimientos más importantes de la industria privada para los EUA.

Por otro lado, la tecnología de la PR se ha utilizado para el estudio y comprensión de los diferentes mecanis-

mos celulares (Mathews, 1999; Smithies et al., 1985). Una de las principales ventajas es que las PR se pueden obtener rápidamente y en abundancia. Esto permite tener acceso prácticamente ilimitado a la PR para realizar cualquier tipo de estudio relacionado con su función. Además, se pueden gen- erar variantes a la proteína de interés mediante técnicas de mutación de ADN. En la mayoría de los casos, el costo de pro- ducción de PR es relativamente bajo respecto a la obtención de la proteína a partir de su fuente natural. Debido a esto, la tecnología de PR se ha convertido en una de las técnicas más utilizadas en diversos campos de la investigación científica. (Genomics:-GTL-Roadmap., 2005).

CONCLUSIÓN Existe una gran variedad en sistemas de expresión y

organismos hospederos para la producción de PR. Además, la complejidad y diversidad de las características físico- químicas de las proteínas, hace que sea necesario plantear una estrategia adecuada para tener una solución a los problemas que puedan surgir durante la síntesis de PR. Por lo tanto, los protocolos de purificación y estrategias deben ser elaborados para cada caso en particular. Los avances tecnológicos y científicos han permitido que la síntesis de PR sea una herramienta disponible para diversas necesidades. Cada vez son más las aplicaciones en las que las PR han sido utilizadas, siendo la industria farmacéutica y la alimentaria las más beneficiadas. Asímismo, en el ámbito científico el uso de las PR ha permitido entender y elucidar rutas meta- bólicas y mecanismos celulares que son importantes para el desarrollo de la vida. La mayoría de las estructuras de proteínas depositadas en el PDB, han sido obtenidas a partir de PR. Diversas ramas del conocimiento científico hacen uso constante de la tecnología del ADN recombinante, ya que permite obtener una proteína de interés de manera rápida y abundante. La aplicación de enzimas recombinantes a tratamientos ambientales depende del costo del proceso, además de no ser recomendable liberar al medio ambiente material genético recombinante conteniendo plásmidos con resistencia a antibióticos. Su aplicación como catalizador en procesos químicos es mas factible, en particular catalizando reacciones estereoselectivas sobre sustratos racémicos. Esta y cualquier otra aplicación debe considerar que el costo de producción y purificación de la PR compense la aplicación a realizar.

AGRADECIMIENTOS Se agradece el financiamiento otorgado por el CO-

NACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología) de México (proyecto CB-2009-131859) y por las becas para estudios doctorales otorgadas a los primeros tres autores. Agradece- mos a la Dra. Ana María Calderón de la Barca su apoyo en la revisión del presente manuscrito.

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Benefix Genetics Institute 1997

Insuman Hoechst AG 1997

Apidra Aventis 2004

Advate Factor VIII Baxter AG 2004

Tabla 2. Fármacos recombinantes aprobados en el mercado. Tomado de Drago-Serrano, 2006. Table 2. Recombinant drugs approved for market. Source: Drago-Serrano, 2006.

Segmento Ventas (x109

dólares) Ejemplos

Bioenergética 26 Etanol, diesel

Ext. vegetales 24 Hidrocoloides (gomas, almidones

industriales) aceites esenciales

farmacéuticos 12 Productos biocatalíticos, antibióticos,proteínas terapéuticas

Polímeros 12 Hule natural, PLA, polioles

Alimenticio 9 Acido cítrico, lisina, acido glutámico, Vit. B12, ácidos grasos poliinsaturados

Olequímico 9 Surfactantes, alcoholes y glicerol

Enzimático 2.5 Enzimas en detergentes, procesamiento

de textiles, procesamiento de granos

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