TEMA 1- Enginyeria Genetica, Apuntes de Biotecnología. Universitat de Barcelona (UB)
laiajene
laiajene

TEMA 1- Enginyeria Genetica, Apuntes de Biotecnología. Universitat de Barcelona (UB)

PDF (973 KB)
16 páginas
3Número de visitas
Descripción
Asignatura: enginyeria genetica, Profesor: carlos balsamonte, Carrera: Biotecnologia, Universidad: UB
20 Puntos
Puntos necesarios para descargar
este documento
Descarga el documento
Vista previa3 páginas / 16
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 16 páginas totales
Descarga el documento
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 16 páginas totales
Descarga el documento
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 16 páginas totales
Descarga el documento
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 16 páginas totales
Descarga el documento
ENGINYERIA GENÈTICA

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

1

TEMA 1: AÏLLAMENT I PURIFICACIÓ DELS ÀCIDS

NUCLEICS

INTRODUCCIÓ A L’ENGINYERIA GENÈTICA (definició: ADN recombinant)

• Manipulació de la informació genètic amb l’objectiu de l’anàlisi genètic o de la millora

d’un individu o espècie. Però no sempre és així, pot ser que no sigui per millorar. Però

la manipulació sempre està implicada.

• Conjunt de tècniques que permeten alterar l’estructura del material genètic per

comprovar la hipòtesi sobre la funció dels gens o per permetre l’expressió de productes.

• Enginyeria: Conjunt de coneixements i tècniques que permeten aplicar el saber científic

a la utilització de la matèria (i energia) mitjançant invencions o construccions útils per

l’home.

Precedents:

- 1994: Descobriment de que el material genètic és ADN (Avery, McLeod, McCarthy).

- 1953: Descobriment de l’estructura molecular del DNA, neix la biologia molecular

(Watson i Crick).

- 1970: Començament de la manipulació enzimàtica de l’ADN, l’aparició de l’enginyeria

genètica molecular.

- 1974: Primer clonatge realitzat (Cohen i Boyer)

- 1979: Producció de la insulina per bacteris.

CLON I CLONATGE

Clon: Conjunt d’individus genèticament idèntics. Aquest fenomen existeix en la natura, és a dir,

trobem rèpliques exactes d’individus, per exemple en organismes que es reprodueixen de forma

asexual, en bessons univitel·lins...

Clonatge: Procés pel qual es produeix un clon, en el que s’hi modifica la informació genètica.

Consisteix en fer individus genèticament idèntics a partir d’una molècula d’ADN recombinant.

És el manteniment d’aquest ADN recombinant (molècula estable) en una població, no només in

vitro: si no es manté i passa a la descendència (in vivo) no és clonatge. La molècula recombinant

ha de tenir capacitat de replicació i segregació.

És a dir, es produeix in vitro un organisme amb DNA recombinant i es fan clons. Obtenim un DNA

recombinant amb el gen que vull, i aquest es passa a una cèl·lula viva, com una bacteria, que al

reproduir-se produeix clons.

Un exemple seria el cas de la insulina. Per fer bacteris que produeixin insulina s’agafen cèl·lules

d’un individu que fabriqui insulina. Llavors s’aïlla la molècula d’ADN i es selecciona el fragment

que codifica per la insulina. S’introdueix en un vector de clonació i aquest en el bacteri per tal

de que fabriqui la insulina.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

2

OBJECTIUS del clonatge

- Anàlisi genètic: estudi de gens

- Producció de proteïnes d’interès sanitari o industrial

- Detecció de malalties i patògens

- Producció de bioproductes en general

Un dels principals objectius és que el bacteri on s’introdueix

el gen estrany adquireix aquesta nova propietat. Un cop es

té el bacteri amb el DNA recombinant, es pot utilitzar de

dues formes, per una banda es pot haver introduït una

mutació que fa que tot l’organisme canvi una propietat, i per

altra banda es pot haver introduït la producció d’una

proteïna.

Alguns exemples d’objectius aplicats serien:

- Industria alimentaria

- Medi ambient (utilitzant el bacteri sencer)

- Industria general o clínica (utilitzant part del bacteri o

producte)

APLICACIONS

Els objectius del clonatge s’engloben en:

- La medicina:

▪ Disseny de vacunes

▪ Teràpia de vacunes

▪ Ús com a agents terapèutics

▪ Identificació de malalties: genètiques i infeccioses

▪ Producció de compostos d’interès

➢ Hormona del creixement

➢ Insulina

➢ INF,IL...

▪ La ciència bàsica

▪ La industria

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

3

AÏLLAMENT I PURIFICACIÓ

GENOMA: Contingut total de material genètic d’un individu (cromosòmic i extracromosòmic).

VECTOR: Molècula petita amb capacitat de replicació i segregació. Les més importants solen ser:

- Plasmidis

- Bacteriòfags (virus)

Tenen mida petita i són fàcilment manipulables. Ens interessa que hi hagi una expressió del gen

d’interès.

Inicialment totes les tècniques desenvolupades es basaven en bacteris, però en principi

l’aïllament dels àcids nucleic és independent de l’ésser que provingui. Nosaltres ens centrarem

en procariotes.

Cal aïllar el tros de DNA d’interès i també el vector. Aquestes dues molècules s’hauran de

fusionar. Així tindrem una molècula que es pot replicar i té la proteïna d’interès.

AÏLLAMENT I PURIFICACIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS

Si plantegem un experiment de clonatge, partim d’un DNA d’interès que té diferents orígens:

- Animal

- Vegetal

- Bacterià

- Víric

El que hem de fer és aïllar-lo,

introduir-lo en un vector i fer-lo

expressar. Hi ha dos elements

molt importants: vector i DNA

d’interès. L’objectiu és obtenir un

DNA recombinant.

AÏLLAMENT DE L’ADN GENÒMIC O D’INTERÈS (ADN total)

Ho expliquem en bacteris gram negatius, gairebé

sempre en E.coli.

És impossible diferenciar qui és el teu DNA d’interès.

Es fa una genoteca o llibreria genòmica i es va fent

expressar els diferents DNA clonats (fragmentes tot

el DNA genòmic amb proteases i s’incorporen a

diferents plasmidis vectors), fins a trobar el que

expressi la proteïna que es buscava. Una genoteca és

una biblioteca de fragments del DNA genòmic de la

cèl·lula.

1 gen= 1Kb.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

4

Per probabilitats el gen d’interès s’ha d’incorporar a un vectors després de ser tallat pels extrems

mitjançant enzims, per tant tard o d’hora, acabaràs aconseguint el clon del gen d’interès.

Posteriorment s’haurà d’identificar el clon d’interès, amb les genoteques. Es pot aïllar ADN de:

eucariotes vegetals o animals i procariotes gram positives o gram negatives. El ADN genòmic

vol dir tot el DNA, el cromosòmic i l’extracromosòmic.

AÏLLAMENT D’ADN GENÒMIC EN PROCARIOTES

L’ADN d’una cèl·lula no depèn del medi de creixement (l’ARN sí, ja que és l’expressió d’ADN), és

a dir la quantitat de DNA és independent de les condicions de cultiu, ja que no varia la seca

expressió.

Per tal de purificar l’ADN es necessita una quantitat considerable de cèl·lula de partida.

En un cultiu líquid (cèl·lules + medi de cultiu) hi creixen les cèl·lules. Primerament, es realitza

una centrifugació per tal de separar les cèl·lules i eliminar el medi líquid. Seguidament es

resuspenen les cèl·lules en un buffer conegut. Ara, cal lisar les cèl·lules per tal d’alliberar l’ADN

(extracte de cèl·lula). Hem de purificar l’ADN d’aquest extracte: es separen les restes cel·lulars i

finalment es degrada l’ARN i les proteïnes, de manera que queda DNA pur. Finalment es fa un

procés de concentració.

1) Ruptura de cèl·lules

Es poden utilitzar dos tipus de mecanismes:

• Físics

• Químics

Segons el tipus de bacteri s’usarà un mètode o un altre o bé una combinació d’ambdós.

Normalment en els bacteris gram negatius, com E.coli (té paret cel·lular i membrana),

s’utilitzen mètode químics, degut a que són més barats i no requereixen d’un equip

especialitzat. En bacteris gram positius, s’acostuma a optar per mètodes físics, ja que el

tractament químic és un procés llarg i costós, degut a la seva paret de mureïna molt més

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

5

gruixuda (s’ha d’afegir molt lisozim). És per això que hi ha mètodes alternatius, com per

exemple els ultrasons (mètodes físics).

El tractament químic contra Gram negatius es basa en tres compostos afegits al buffer

de resuspensió:

- Lisozim: Enzim que es troba naturalment en secrecions i que trenca la capa de mureïna

del peptidoglicà que hi ha entre les dues membranes.

- Detergents: degraden la membrana cel·lular. Són molècules iòniques que

desestructuren les capes lipídiques de manera molt eficaç.

▪ EDTA: àcid etilen diamino tetraacètic. És un agent quelant de ions divalents de

suspensions o molècules orgàniques. Té afinitat pels cations divalents, els

segresta concretament és un agent quelant de ions com el magnesi i el

manganès. Les bicapes lipídiques són estables gràcies als ions divalents com el

magnesi: estabilitzen perquè neutralitzen els fosfolípids. Si no hi ha ions

divalents, la membrana es torna inestable. Tots els enzims biològics, a més,

requereixen de ions divalents per ser actius (neutralitzen les càrregues de les

proteïnes). Per tant, amb EDTA eliminem gran part de l’activitat enzimàtica i

d’aquesta manera no hi ha degradació d’ADN per part de les nucleases (forma

de protegir de la degradació de l’ADN.

▪ SDS: S’afegeix aquest detergent per trencar la membrana, un cop aquesta ja

està dèbil per l’EDTA.

▪ En ADN: No s’ha de treballar en condicions completament estèrils: el material

és estèril i net. No fa falta guants ni flama.

▪ En ARN: molt més sensible. Més esterilitat necessària.

Amb aquesta combinació de substàncies totes les cèl·lules gram negatives són

destruïdes i s’aconsegueix l’extracte cel·lular.

Els tractaments físics per gram positius sol ser altes pressions o amb ultrasons de

determinada freqüència. Té un alt risc afegit: poden arribar a danyar l’ADN segons la

intensitat del tractament.

Els ultrasons es basen en petites partícules, com de sorra, que xoquen i trenquen les

cèl·lules.

2) Eliminació de les restes cel·lulars

Un cop les cèl·lules s’han lisat, es centrifuga de tal manera que obtenim totes les restes

cel·lulars al pellet i un extracte que conté majoritàriament RNA, DNA i proteïnes al

sobrenedant.

3) Purificació de l’ADN

Un cop tenim l’extracte cel·lular, s’ha de purificar l’ADN, eliminant tota la resta.

Eliminem l’ARN i les proteïnes.

▪ Per eliminar RNA: Afegim RNAses, enzims que degraden l’ARN (es troben a la

cèl·lula per tal d’eliminar RNA innecessari a la cèl·lula, com l’mRNA quan ja ha

estat traduït molts cops).

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

6

▪ Per eliminar les proteïnes:

• Afegim proteinasaK, enzim que degrada absolutament totes les

proteïnes. L’EDTA no s’ha retirat però s’ha diluït, de manera que no es

tant quelant de ions i permet l’acció d’aquests enzims.

• Fenolització: Per acabar d’eliminar les proteïnes hi ha un tractament

amb fenol cloroform: dissolvents orgànics. El fenol és altament tòxic i el

cloroform és un producte que no és tant tòxic però que no és bo: tots

dos tenen capacitat per desnaturalitzar les proteïnes i fer que precipitin

gràcies a la seva insolubilitat. Si després de barrejar-ho es centrifuga, es

produeix una separació col·loïdal on queda en fenol a baix, una capa o

interfase amb les proteïnes coagulades i a la part superior una part

aquosa (correspon a l’ADN o RNA). No és fàcil treballar en aquestes

condicions, per la seva alta toxicitat, tot i que és un mètode molt eficaç-

Quan es fenolitza, la concentració de DNA és molt elevada (a la part

superior hi ha DNA, monòmers: ntds i ribonucleòtids... que no han

precipitat per la fenolització).

• Cromatografia: És més fàcil fer

columnes cromatogràfiques que són

capaces de retenir el DNA (quan es vol

aïllar una gran quantitat de ADN).

Posem la mostra per la part superior

(extracte cel·lular, líquid) i en passarlo a

través de la columna, per càrregues

l’ADN es queda retingut en la columna.

Es repeteix el procés varis cops i quan

canvies el pH cau el DNA, i reculls els

que ha caigut, de manera que tens DNA

aïllat. És molt car.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

7

4) Concentració

El DNA del sobrenedant resultant de l’eliminació de proteïnes i ARN es troba a baixa

concentració. A aquesta concentració resulta impossible treballar amb ell. D’aquesta

manera, generalment hi ha un procés de concentració de l’ADN. Per tal d’aconseguir-ho

s’ha d’eliminar l’aigua biodisponible per tal de que l’ADN precipiti.

Es precipita el DNA de forma específica, és a dir, els aminoàcids i monòmers es queden

al sobrenedant: només precipita la macromolècula. Com es precipita? Mitjançant l’ús

de dos components que s’afegeixen a la solució d’ADN:

▪ Concentració elevada de sals (acetat Na o K): 3M pH 4,8

▪ Etanol al 70%, òptim per la precipitació del DNA

El DNA es manté soluble gràcies a la bipolaritat d’aquesta molècula. Quan afegim sals el

que fem és “segrestar” l’aigua: hi ha major afinitat de l’aigua amb les sals que no pas de

l’aigua amb l’ADN. Afegint l’etanol es provoca un efecte semblant. L’aigua forma un

complex amb les molècules d’etanol i sal, de manera que no hi ha massa interacció de

l’ADN amb l’aigua, fins a arribar a un punt on l’ADN és incapaç de solubilitzar-se amb

aigua: el que fem és baixar de forma considerable la solubilitat de l’ADN en aigua. L’ADN

forma complexes amb les altres molècules de DNA que és el que causa la precipitació.

Per tal de millorar la precipitació, l’ADN es pot incubar des de -20ºC fins a -80ºC.

En afegir l’etanol, es veu com una mucositat i un precipitat blanc quan l’ADN passa de

soluble a insoluble. Antigament l’ADN precipitat es recollia posant una vareta de vidre i

anar girant i estirant cap a dalt, i això es pot tornar a suspendre en un volum de solució

inferior, de manera que el tenim més concentrat (80% de recuperació). La millor manera

de recuperar l’ADN (es recupera un % més alt) és fent una centrifugació (91% de

recuperació).

Amb tot aquest procés, hem eliminat tots els aa i nucleòtids (sobrenedant) i l’hem

concentrat.

En el pellet sovint poden quedar-hi sals a part de l’ADN. Per eliminar-les es fa un pas

previ de rentat de sals per tal de que l’ADN no es quedi amb aquestes. El que es fa és

afegir 70 ml d’etanol amb 30 ml d’aigua. En aquesta concentració d’etanol (70%) permet

la no dissolució de DNA (tindrem el DNA precipitat igualment) i la dissolució de les sals

per part de l’aigua, és a dir, rentem les sals però l’ADN encara està precipitat.

Posteriorment es fa una altre centrifugació per

eliminar les sals dissoltes en aigua i es torna a

resuspendre el DNA en aigua o bé en TE (tampó

amb pH de 7 a 8: T de tris i E de EDTA). El DNA és

molt estable i es sol conservar a 4ª o -20ªC per

una llarga duració.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

8

AÏLLAMENT I PURIFICACIÓ DEL DNA GENÒMIC EUCARIOTA

El procés d’aïllament del DNA eucariota només es diferencia del procariota en el procés de

ruptura cel·lular.

Partim de cèl·lules en suspensió procedents d’un cultiu o bé d’homogeneïtzat de teixit (si es

tracta d’un animal agafarem les cèl·lules de qualsevol teixit i si es tracta d’una persona agafarem

sang, per exemple). Per tal de lisar les cèl·lules, com és lògic, no s’utilitza lisozim, perquè no

tenen peptidoglicà. El que s’utilitza són detergents per desestabilitzar i trencar la membrana

plasmàtica i nuclear. S’usa:

- SDS: detergent aniònic. Cal parar atenció, ja que podria danyar l’ADN.

- Tritó X-100: no aniònic.

Aquests detergents són eficients per la degradació de les estructures lipídiques com les

membranes. Un cop realitzada la ruptura de les cèl·lules eucariotes, la resta de passos són els

mateixos que en procariotes.

En cèl·lules vegetals, com que hi ha una paret cel·lular molt gruixuda i rígida, s’ha de buscar

alguna cosa que trenqui la cel·lulosa i tots els components. Generalment es fa un tractament

químic amb cel·lulases i xilanases (enzims que degraden els components de la paret cel·lular),

juntament amb un tractament físic, consistent en trencar les parets mitjançant la pressió

(matxacar). Amb això ens queda una solució amb elevada concentració de carbohidrats. El que

fem és un tractament amb CTAB (cetil trimetil amoni bromur), que és capaç d’interaccionar amb

el DNA i formar un complex insoluble. A continuació es centrifuga i el sobrenedant es llença

(contindrà els carbohidrats i algunes proteïnes). EL pellet serà el complex DNA-CTAB i altres

proteïnes. Per últim, es resuspen en NaCl 1M per trencar el complex DNA-CTAB (forma un

complex amb el CTAB i allibera l’ADN) i s’afegeix l’etanol per fer precipitar l’ADN i poder-lo

separar del CTAB.

AÏLLAMENT DE L’ADN PLASMÍDIC (dels vectors)

Els plasmidis són les molècules vectors més importants en enginyeria genètica. Un ADN

plasmídic és una molècula idèntica a l’ADN genòmica.

Característiques plàsmiques:

- Replicació independent del genoma: té el seu propi origen de replicació.

- Seqüencies que permeten la seva segregació durant la divisió cel·lular.

- Conté funcions accessòries que poden representar un benefici per la cèl·lula.

- Molt conegut com a vector per la transferència de material genètica.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

9

Característiques genètiques:

- Independents del cromosoma: extracromosòmic.

- Ha d’haver-hi un protocol que permeti separar-lo completament de l’ADN cromosòmic:

pot incorporar- se un tros del material cromosòmic del

microorganisme dins el plasmídic, i això pot interferir

en el teu clon.

El problema és que l’estructura química del cromosoma és molt semblant a l’estructura química

del plàsmid. L’única diferència és el tamany. Els plasmidis són molt petits: 3, 5, 10kb. A més a

més, els plasmidis es troben situats molt a prop del cromosoma.

És molt important aïllar perfectament el DNA plasmídic ja que si quedessin restes del

cromosòmic al fer un clonatge es podrien incorporar trossos del cromosoma en el plasmidi.

a) Procés de separació per diferència en el tamany

Era el mètode utilitzat antigament: es va dissenyar un procés de

separació segons el tamany. La diferència de pes es d’unes 1000

vegades aproximadament (entre l’ADN cromosòmic i el plasmídic).

Com que es sap que el cromosoma està unit a la membrana plasmàtica

i aquesta és molt gran, si es trenquen amb suavitat les cèl·lules i es

centrifuga, el DNA cromosòmic hauria de quedar a baix i el plasmídic

en el sobrenedant. Per lisar suaument les cèl·lules s’utilitza lisozim,

una elevada concentració de sacarosa (25%) i EDTA. D’aquesta manera

obtenim la cèl·lula bacteriana sense paret i gràcies a la sacarosa evitem

que es trenqui la membrana plasmàtica. Seguidament s’afegeix el

tampó Tritó X-100 que trenca la membrana, es centrifuga i es separen

les mostres. És impossible aïllar el DNA cromosòmic sense trencar-lo,

ja que té molts llocs d’anclatge a la membrana cel·lular, així que al

trencar-la es trenca també la molècula de DNA cromosòmic. Aquests

petits fragments de DNA cromosòmic es poden confondre per tamany

amb el DNA plasmídic, de manera que aquesta separació per mida ja

no es pot fer.

b) Procés de separació per diferència en la conformació

També conegut com el mètode de Birmboin.

Com que l’ADN cromosòmic sempre es trenca, podem separar-lo

segons DNA lineal i circular. El cromosòmic sempre es trenca, sempre

quedarà lineal: separem segons la conformació. Es basa en trencar les

cèl·lules i obtenir fragments lineals del DNA cromosòmic i circulars d’ADN plasmídic. A

continuació es fa una ràpida alcalinització de l’extracte cel·lular i una posterior

repolarització a pH neutre. Quan modifiquem el pH d’una solució d’ADN hi ha una

desnaturalització del DNA: hi ha un canvi d’estructura de doble cadena a cadena simple.

Els fragments lineals queden separats en cadenes senzilles lliures, mentre que en els

plasmidis no es poden separar físicament les dues cadenes. Quan es renaturalitza, el

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

10

que passa és que les cadenes senzilles separades són molt difícils de renaturalitzar, ja

que hi ha complementarietat parcial entre algunes molècules de cadena simple, de

manera que es forma diferents estructures entre les cadenes simples amb les altres

cadenes simples però pràcticament mai es fa una doble cadena de nou: es forma una

malla no estructurada de DNA lineal, formant trossets amb doble cadena parcial, de

manera que es forma un agregat macromolecular. Això, en aplicar una centrifugació,

forma un precipitat que va al fons del tub i en suspensió queda l’ADN plasmídic.

Per tant el procés seria:

1) Trencar cèl·lula: EDTA/SDS/lisozim (estat líquid més o menys perfecte)

2) Addició de NaOH (puja pH): observació de un medi més mucós degut a la

desnaturalització de proteïnes i ADN.

3) Addició de acetat sòdic: neutralització de la solució. Observació de estat líquid amb

un precipitat blanc que eliminem per centrifugació (ADN cromosòmic, proteïnes...).

Un cop superat aquest punt, es segueix amb el protocol d’ADN cromosòmic.

c) Aïllament del DNA plasmídic per gradient de clorur de cesi

Permet obtenir un elevadíssim grau de puresa (gairebé del 100%) i amb una gran

quantitat de ADN plasmídic.

Partim del sobrenedant del procés de Birmboin de separació de DNA cromosòmic de

plasmídic. L’extracte conté RNA, proteïnes i DNA plasmídic amb molt poc de

cromosòmic. S’afegeix clorur de cesi (CsCl) i bromur d’etidi (EtBr) i es

sotmet a centrifugació. Quan hi ha una sal i es sotmet a centrifugació, es

genera un gradient de densitats. Aquest gradient permet separar l’ADN

plasmídic del cromosòmic. És pràcticament impossible aïllar un DNA

cromosòmic sencer (es trenca molt fàcilment), mentre que el plasmídic es

manté com a una estructura covalentment tancada. El bromur d’etidi

s’intercala fàcilment pel DNA i causa una pressió molecular que fa que

l’ADN tingui un volum major, per tal d’alliberar tensió. En una molècula que

sigui covalentment tancada, aquest increment de volum no es dóna sinó

que es va enrotllant sobre si mateixa, perquè no pot alliberar la tensió de

cap altre manera perquè no té cap extrem lliure. Per tant el bromur d’etidi

fa que variï la densitat en el DNA plasmídic (major) i en el cromosòmic (menor). Quan

tenim un extracte cel·lular (proteïnes, RNA i DNA: plasmidi i cromosòmic, encara que

molt poc) i posem clorur de cesi i ho posem a la centrifuga: es crea un gradient de

densitat i les molècules es desplacen al lloc on hi ha la mateixa densitat. En finalitzar la

centrifugació:

▪ Proteïnes: menor densitat. Part superior del tub.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

11

▪ RNA: major densitat que el DNA (al fons del tub). El RNA és la molècula més

densa perquè al ser monocatenari no deixa espais buits com el bicatenari, cosa

que fa que guanyi densitat.

▪ DNA: major densitat en el plasmídic que en el cromosòmic. El DNA plasmidic i

genòmic queden a la part mitja del tub i com que són químicament idèntics no

serien diferenciables. Gracies al bromur d’etidi son diferenciables: queden dues

bandes de DNA diferents.

D’aquesta manera es poden aconseguir grans quantitats de DNA plasmídic pur. Al

laboratori no s’acostuma a fer això, perquè es tarda molt temps a fer-ho. Només es

fa quan es vol una mostra 100% pura. En aquesta mostra hi haurà clorur de cesi

(desactiva els enzims) i bromur d’etidi (cancerigen) també. Per tal d’eliminar el

bromur d’etidi, es fa una extracció amb butanol (agafes el mateix volum de solució

i ho barreges amb la mostra: les sals van a l’alcohol). També es fa una diàlisi per

eliminar el clorur de cesi.

Bromur de etidi: és un agent intercalant, és a dir, s’incorpora entre les dues cadenes

d’una molècula d’ADN. S’incrementa una mica el volum del complex (DNA+agent

intercalant), perquè es separen les cadenes una mica. A més a més, quan el bromur

d’etidi és excitat amb llum UV produeix fluorescència. No s’utilitza perquè és un

agent mutagènic i d’elevada perillositat.

AÏLLAMENT I PURIFICACIÓ DEL DNA VÍRIC

Els virus també són utilitzats com a vector: petits i amb capacitat de duplicació i segregació. De

vegades volem DNA víric per crear vacunes també. Es tracta d’un procés senzill. La part

complicada és tenir suficient concentració de virus com per obtenir una mostra de DNA

significatiu. Per obtenir grans quantitats de DNA víric cal fer una infecció. Centrifuguem una

infecció vírica: al sobrenedant obtindrem els virus i al pellet els bacteris.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

12

En alguns casos, quan el virus infecta a la cèl·lula pot trencar la cèl·lula i alliberaria el DNA

genòmic en el medi. Per això quan tenim un medi molt ric pot ser que hi hagi DNA al medi de la

cèl·lula hoste. Per evitar-ho, podem introduir DNAses.

Quan tenim una suspensió rica en virus, ens plantegem com extreure l’ADN: un virus és una

estructura nucleoproteica (proteïnes de la càpsida i àcid nucleic). Si posem alguna cosa que

destrueixi la càpsida, obtenim l’àcid nucleic. La concentració de DNA (i partícules víriques en

general) un cop feta la centrifugació, acostuma a ser baixa, per tant requereix un procés de

concentració .Aquesta concentració de partícules víriques es fa mitjançant l’addició de PEG (poli

etilen glicol): molècula que crea interaccions amb proteïnes de la càpside, les fa precipitar, i

NaCl. Si posteriorment a aquesta addició, centrifuguem, en el pellet trobem els virus, ja que la

interacció amb el PEG fa que les capsules proteiques precipitin, i per tant els virus. Posteriorment

es tracta per eliminar proteïnes amb proteïnases K i ens quedem amb el DNA. Per eliminar les

proteïnases afegim fenol i separem per cromatografia de columna.

AÏLLAMENT I PURIFICACIÓ DE L’ARN

Els ARNs tenen composicions semblants a l’ADN. En algunes ocasions ens interessa l’aïllament

de l’ARN. Es parteix d’una mostra on hi ha RNA, DNA i proteïnes. La diferència de purificació és

que s’afegeix una DNAsa en comptes d’una RNAsa. Les proteïnes s’eliminen igual que en la

purificació de l’ADN. Des del punt de vista empíric, hi ha una altra diferència: l’ARN és molt fàcil

de degradar, perquè hi ha moltes RNAses que estan a molts llocs i són enzims molt estables (no

es degraden amb cap substància del procés). S’ha de prendre mesures de seguretat molt

estrictes. En el cas de l’ARN s’ha de controlar en quin medi de cultiu ha crescut, ja que la

composició varia segons les condicions fisiològiques i ambientals en les quals creix la mostra.

L’ARN eucariota és una mica més estable que el procariota degut a la cua de poli A. Gràcies a la

cua de poli-A és més fàcil d’aïllar el mRNA dels altres dos. Un exemple d’aquest aïllament és una

columna amb partícules que tenen cues poli-T, on queden retingudes les molècules de mRNA

eucariòtic. Tot el material ha de ser nou, l’aigua ha de ser RNAsa FREE...

S’aïlla tot el RNA, format pel rRNA, el tRNA i el mRNA, a part d’altres amb menys quantitat. És

molt interessant aïllar el mRNA dels altres dos.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

13

GENOTECA O LLIBRERIA GENÒMICA

Una genoteca o llibreria genòmica és un conjunt de vector que cadascun té un fragment de

genoma o cromosoma d’una bactèria. Per fer una genoteca, es parteix d’un genoma, es

fragmenta en molts trossos i cada tros s’adjunta a un vector. El conjunt d’aquests vectors és el

que s’anomena llibreria genòmica. Posteriorment es selecciona el fragment que interessa i

s’introdueix en un ésser viu, intentant que l’incorpori, l’expressi i el pugui transmetre a la

descendència. Si s’aconsegueix, s’ha aconseguit un clonatge. Existeixen també llibreries de

cDNA.

LLIBRERIA cDNA

DNA que és una còpia del RNA. S’ha aconseguit gràcies a l’estudi de l’activitat enzimàtica:

necessitem mostres de RNA molt bones. Avanç científic molt gran perquè permet clonar amb

molta facilitat certes parts del genoma. Per exemple, necessitem hormona de creixement: en

passar de RNA a cDNA, eliminem el problema de l’splicing, ja que en RNAm ja s’ha donat

l’splicing: només hi ha la sequencia codificant per la proteïna. En una cèl·lula que produeix

l’hormona de creixement del nostre cos, si aïllem l’RNAm, veiem que aquesta seqüència

d’interès es troba en molta freqüència en aquesta cèl·lula. Si per exemple agafem cèl·lules del

pàncrees, tindrem la seqüència d’expressió per la insulina amb una freqüència elevadíssima i

serà molt fàcil trobar la seqüència de producció d’insulina. Aquest ARN el passarem a DNA i

tindrem la seqüència d’interès.

Pot fer-se una llibreria de cDNA per bacteris? No. Perquè? Perquè la transcripció i la traducció

són simultànies (no és la causa principal). Fer una llibreria de DNA de forma efectiva, és molt

difícil, ja que l’ARNm representa una part molt petita de tot l’ARN (la majoria de l’ARN és

ribosòmic). En eucariotes és fàcil triar el RNAm perquè té una cua de poliadenalització, però en

procariotes no hi és, de manera que no podem

distingir quin tipus de RNA és. Com ho fem? No

hi ha diferències entre RNAt i RNAm, ja que són

químicament iguals, per tant no hi ha mètodes

efectius d’aïllament. Com es fa en eucariotes? Es

fa una columna d’afinitat on hi hagi boletes amb

politimines, de manera que les poliadenines

s’enganxen a les politimines i queden atrapades

en la columna. Posteriorment es posa una

substància que trenqui aquesta afinitat (rentat) i

recollim una mostra altament enriquida amb

RNAm, que és l’únic que té la cua d’adenines (ni

el ribosòmic, ni el de transferència...). A partir

d’aquí podem fer la llibreria de cDNA. En

bacteris, s’aïlla l’RNA total, no RNAm.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

14

QUANTIFICACIÓ I CONSERVACIÓ

L’ADN es conserva a 4ºC o a 20ºC. L’ARN s’ha de conservar a -80ºC degut al perill de degradació

per les RNAses. La seva quantificació es fa mitjançant lectures d’absorbància.

L’ADN absorbeix llum als 260 nanometres: DO260nm. Es mesura la densitat òptica a a λ=260 nm

de tal manera que 1 O.D (260 nm)=50 μg/mL de DNA aproximadament (només per cadena

doble!). Si és RNA o DNA de cadena senzilla, l’equivalència varia. Simultàniament es llegeix la

densitat òptica a λ=280 nm per tal de mesurar la presència de proteïnes. Així es pot valorar la

quantitat de la mostra amb la relació DO(260/280), veient així el grau de puresa. DO260 nm

/DO280 nm :Si el valor és inferior o igual a 1,8 indica que el DNA està contaminat amb proteïnes

(mala mostra, es llença, donaria mals resultats).

Per tal de llegir la densitat òptica es fan servir espectròmetres que llegeixen la densitat òptica

de cubetes amb un volum de varis mL (volums massa grans per les nostres mostres de DNA).

Així que sovint s’ha d’optar per fer una cromatografia. No és eficient aquesta tècnica, perquè

tot el DNA obtingut s’utilitzava per la quantificació (es necessita 1 mL i només s’obtenen 100

microlitres en la purificació). Actualment existeix el Nanodrop, un espectrofotòmetre que

utilitza només 1 μL (una gota) per llegir la lectura. En una superfície es posa una mostra de DNA,

i la màquina baixa fins a tocar la gota, de manera que es queda la gota tocant les dues superfícies.

Passa la llum a través de la gota i es mesura l’absorbància a dins la gota.

ELECTROFORESI

Es feia també amb electroforesi: migració de una molècula orgànica a través d’un camp elèctric.

L’ADN està carregat negativament i migra cap el pol positiu, no hem d’afegir cap substància que

li doni càrrega. La fem migrar a través d’un camp però es troba una dificultat, una malla: un gel

que dificulta el seu camí. Les separem per pes molecular: menys pes, més rapidesa, travessen

els més ràpidament.

- Electroforesi en gel d’agarosa

▪ Matriu d’agarosa (agar molt purificat) d’entre 0,6% i el 2%, segons la mida de

separar. Amb una major concentració, malla més tupida, es separarà el DNA

amb menys diferència de PM i més petits. Separació entre 0,5kb i unes 20-30kb.

▪ Tampó TPE/TAE/ TBE (les electroforesis d’àcids nucleics sempre es fan en

líquid): Tris (pH neutre) + P/A/B (àcid fosfòric /acètic/ bòric: per tal que corri bé

el DNA, és indiferent l’àcid que s’usi) + EDTA (quelant de ions divalents que evita

l’acció enzimàtica).

▪ DNA tractat amb EtBr per poder-lo veure amb llum UV.

Per separar l’ADN amb molt poca diferència de mida entre si (1kb) s’usa la matriu de

poliacrilamida. L’acrilamida s’utilitza per proteïnes. S’utilitza per la seqüenciació. L’estat

de líquid a sòlid no depèn de la temperatura, sinó d’uns catalitzadors.

Tenim un motlle i hi posem l’agarosa líquida i afegim una pinta perquè es facin els forats

o pouets. Quan es refreda es solidifica i es carreguen en els pouets les mostres. Les

mostres de ADN tenen un colorant per saber on es posa (el tampó de càrrega conté

aquest colorant). Sempre que es fa una electroforesi, a part de les mostres a analitzar,

s’ha d’afegir un marcador, on hi ha molècules de mida coneguda. Hi afegim també un

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

15

agent que s’uneixi al DNA i emeti color o fluorescència un cop s’hagi enganxat a la

molècula, perquè sinó no es veu res. Si hi afegim el marcador, podrem comparar. Si no

ens surt cap marca, el marcador ens serveix per comparar si el problema ha sigut en el

marcatge (no surt cap marca) o bé en el procés (marcador fluorescent i no hi ha coloració

en les columnes de DNA).

Marcador: molècules de DNA de tamany conegut. Ens permet saber el PM de la mostra,

segons l’alçada que hagi quedat el DNA. El marcador també té una concentració

determinada. Pots estimar el PM i la concentració de cada banda segons l’amplada que

tingui.

Hi ha molècules com el bromur d’etildi que són intercalants amb el DNA: es posa entre

les dues cadenes. S’acumula el bromur d’etidi on es trobi l’àcid nucleic,

proporcionalment amb la quantitat de DNA que tu tinguis: més DNA, més bromur

d’etidi. El bromur d’etidi es posa en l’agarosa líquida (tot queda contaminat amb el

bromur d’etidi, s’ha de vigilar molt) o bé posar el gel en bromur d’etidi un cop s’ha fet

l’electroforesi i les mostres ja han corregut a través del gel. Agarosa separa entre 5-

20/30 Kb. Què passa si una molècula és més gran? No es pot separar? Es fa una

electroforesi diferent: nova metodologia.

- PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis)

Electroforesis de gel en camp pulsant. Permet separar DNA enormes (inclús

cromosomes sencers de megabases de mida). La matriu usada és la mateixa, el que varia

és la forma del camp elèctric. És una electroforesi física: hi ha un canvi de direcció en la

migració (pols) de forma continua, de manera que el DNA es mou com un zig-zag i cap

endavant, de manera que fa un recorregut molt més ample. Aquest canvi de direcció fa

que hi hagi una compactació de DNA, que permet una separació molt millor de grans

molècules de DNA. Hi ha dos pols positius i dos negatius posats en diagonal. Es van

intercalant en el temps els dos camps elèctrics de tal manera que el DNA corre en zig-

zag. És una tècnica molt utilitzada, per exemple per comparar genomes de soques

diferents.

ENGINYERIA GENÈTICA Biotecnologia 2017-2018

16

comentarios (0)
No hay comentarios
¡Escribe tú el primero!
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 16 páginas totales
Descarga el documento