spectrophotométrie cour , Notes de Chimie. Université Paris Nord (Paris XIII)
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le cours et les exemples de spectrophotométrie
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Spectrofluorimétrie

SPECTROFLUORIMETRIE D’ABSORPTION EMISSION MOLECULAIRE

    1 Principe = aspect qualitatif

  1.1 Rappels sur le rayonnement visible : 1.2 Principe de la fluorescence

2 Aspect quantitatif

2.1 Rendement quantitatif de fluorescence 2.2 Intensité de la fluorescence 2.3 Expression des spectres 3 Molécules concernées 4 Appareillage

5 Phénomènes parasites  

5.1 Phénomènes liés à l’appareillage 5.2 Phénomèes liés aux mesures en solution 5.3 Phénomènes liés à l’échantillon (phénomènes internes, externes)

6 Applications analytiques de la fluorescence  

6.1 Applications qualitatives 6.2 Applications qualitatives

7 Conclusion

Introduction

 La fluorescence est définie comme l’émission de lumière par des molécules sans dégagement de chaleur.

 Selon la source d’apport d’énergie, on distingue : o La chimiluminescence  Energie fournie par une réaction chimique o Bioluminescence  Energie fournie par une réaction enzymatique o Fluorescence  Energie fournie directement par absorption photonique / lumière

 La grande sensibilité et la sélectivité de cette technique ont permis de développer de nbses

applications, notamment dans le domaine de l’analyse des médicaments, des substances naturelles et de leurs métabolites dans les milieux biologiques.

1 Principe : aspect qualitatif

1.1 Rappels sur le rayonnement visible :

   Les ondes électromagnétiques visibles ont une longueur d’onde qui s’étant de 400 à 800nm  Les ondes UV s’étendent de 200 à 400 nm.

 Ces rayons électromagnétiques transportent une énergie E exprimée par la relation suivante :

E = h.υ = h.c / λ

   

                                                   Fréquence         1,6.1015  à  3,8.1014    

 Ces énergies correspondent aux énergies de transition électronique de molécules  à T° ambiante, la plupart des molécules sont dans leur état électronique et leur état de vibration fondamental, plusieurs états de vibrations peuvent être occupés conformément à la répartition de Bolztman.

1.2 Principe de l’absorption-émission de fluorescence :

 La fluorimétrie étudie l’EMISSION de lumière par des molécules, en solution ou à l’état solide, après excitation par des photons appartenant au domaine du visible ou du proche ultraviolet.

 Lorsque qu’une molécule fluorescente absorbe un photon d’énergie, les électrons vont passer de l’état fondamental E0 à l’état excité E1 (instable). Il vont ensuite revenir à l’état vibrationnel le plus bas de E1 par perte de microchaleur  C’est la relaxation

 Ils vont finalement retourner à l’état fondamental E0 avec émission d’un photon de fluorescence = énergie

 Seule les transitions ππ et n π donnent lieu à une fluorescence.  L’énergie ainsi émise, est inférieure à l’énergie d’excitation (inverse pour la λ).  Le spectre d’émission est l’image du spectre d’absorption dans un miroir.

NB : La phosphorescence passe par une étape supplémentaire  l’état triplet ou il y a retournement de spin (phénomène plus long).

Diagramme de Jablonski et spectre de fluorescence

                                                             

   

2 Aspect quantitatif

2.1 Rendement quantitatif de fluorescence

 Rapport du nombre de photons émis au nombre de photons absorbés :

Rendement quantique φ = If / Ia (sans unités)

 φ est compris entre 0 (absence de fluorescence) et 1 (fluorescence maximale).

 φ dépend, il est caractéristique : o de la molécule o du solvant, du pH o de l a T° (φ diminue lorsque la T° augmente)

 φ ne dépend pas :

o de l’intensité de la source lumineuse o de la longueur d’onde d’excitation (seuls les photons absorbés sont pris en compte) 2.2 Intensité de fluorescence +++

 L’intensité de fluorescence, à longueur d’onde λ, est proportionnelle à l’intensité lumineuse

absorbée et au rendement quantique de fluorescence.

IF = φ x IA = φ x( I – I0) Avec IF = intensité de fluorescence IA = intensité absorbée (I0-I)

 L’intensité absorbée, IA, est donnée par la loi de Beer-Lambert, l’intensité de fluorescence devient alors :

IF = φ x I0 x (2,3.ε.l.c) Avec I0 = intensité incidente

 Or l’appareil ne capte qu’une partie de la fluorescence, on a donc :    

IF’ = k x (φ x I0 x (2,3.ε.l.c)) = K x c

   L’intensité est exprimé en Einstein par secondes (1 einstein = 6.1023 photons)  

   L’intensité dépend de :  

o La T° ( si T° augemnte  fluo baisse) o I0 de la source (contrairement à l’UV-visible) o De la concentration en solution fluorescente o De l’appareillage (contrairement à l’UV-visible) o La λ d’excitation o La nature du solvant et du pH

2.3   Expression des spectres

 Le spectre d’excitation d’une substance est obtenu en mesurant la fluorescence EMISE à une

longueur d’onde fixe et en laissant varier la longueur d’onde d’EXCITATION  Le spectre d’émission d’une substance est obtenue en mesurant la fluorescence EMISE aux

différentes longueurs d’onde d’émission, en EXCITANT avec une longueur d’onde fixe.

                                                                                     

3 Molécules concernées    Pour que la fluorescence se manifeste, pls caractéristiques sont nécessaires :

o Absorption dans l’UV (mais seulement 5% des substances absorbantes dans l’UV sont fluorescentes).

o Forte probabilité maximale d’absorption (εmax) o Faible énergie de transition électronique o Absence d ‘atomes ou de gpts favorisant les phénomènes non radiatifs dans la molécule.

Les molécules les plus fluorescentes sont :

o Des polycycles aromatiques  structure planes et rigides  Les substituants ortho ou para directeurs (-NR > -NH> -OR > -OH) sont

activateurs de la fluorescence  Les substituants méta-directeurs (-COOH, -COOR, --CHO, -COR, -NO2, -NO) et

les atomes, sont désactivateurs de la fluorescence. o Gpts alkyls et acide sulfonique n’ont pas d’effet

Ex :

o Les fluorochromes :  Fluorescéine = FITC  Rhodamine  Rouge Texas  Phycoerythrine…

o Vitamines o Cathécholamines o Médicaments : Aspirine, amphétamine, barbiturique, quinine, quinolones, furosémide o AA : Tyrosine, tryptophane5HT

NB : possibilité aussi de doser des ions minéraux après chélation. 4 Appareillage    Une source lumineuse :

o Lampes à arc au xénon :

 Emission continue entre 220 et 700 nm  Leurs énergies varient en fct de la longueur d’onde  Ce sont les plus performantes

o Les lampes à vapeur de mercure :

 N’émettent qu’un spectre discontinu (raies entre 254 et 366 nm)  Ne sont utilisables que pour des composés absorbants dans l’UV

o Les sources lasers :

 Apparition récente  Encore peu utilisées

Un monochromateur d’excitation (prisme ou réseau)

Une cuve (en quartz)

Un monochromateur d’émission : o Permet la sélection d’une bande étroite de longueur d’onde d’émission (car après

excitation, l’éch émet dans toutes les diections) o Semblable au monochromateur d’excitation

Un photomultiplicateur (transforme la lumière émise en courant électrique).  Un système de lecture du signal

NB : Fluorimètre = 2 filtres (pas de monochromateur)  Analyse uniquement quantitative 5 Phénomènes parasites  

5.1 Phénomènes liés à l’appareillage  

5.2 Phénomèes liés aux mesures en solution

5.3 Phénomènes liés à l’échantillon : La fluorescence est modifiée en raison de phénomènes provenant de la molécules elle-même (phénomènes internes) ou d’une interaction avec les molécules du solvant (phénomènes externes).

6 Applications analytiques de la fluorescence  

6.1 Applications qualitatives    Méthode sensible (identification de traces) et spécifique (/ interférences)  Détermination du spectre d’absorption d’une substance dans les conditions ou la spectropho UV-

visible est inadapté /sensibilité  Permet de tracer le spectre d’excitation d’une molécule à très faible concentration ou en présence

de substances absorbantes interférantes.  

6.2 Applications quantitatives  

 Analyse des médicaments ou de substances naturelles à concentration svt faible dans les milieux biologiques.

 Analyse après excitation à une longueur d’onde déterminée  Analyse directe de substances naturellement fluorescentes (ex : quinine, quinidine)  Les molécules peu fluorescentes sont amplifiées par hétérocyclisation.  Les molécules non fluorescentes peuvent être rendues fluorescentes par dérivation de

fluorescence. Parmi ces composés de dérivation, la fluorescamine et la bromométhoxycoumarine peuvent interagir avec certains gpts fct d’AA, amines biogènes, prostaglandines…

 La fluorimétrie est également utilisable dans le cadre des méthodes immunologiques en phase homogène ou hétérogène, le traceur étant constituer par la molécule à doser marquée par un fluochrome.

Ex : le microscope à fluorescence                                     7 Conclusion    Méthode sensible, sélective et possédant un large éventail d’applications en biologie et pour le

dosage des médicaments.  L’appareillage est cependant onéreux et la mise en œuvre de ces techniques assez délicate.

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