Appunti di Biomedicina - Il concetto di randomizzazione mendeliana in epidemiologia, Appunti di Biomedicina. Università degli Studi di Milano
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  La randomizzazione mendeliana  è un metodo che fornisce nuove opportunitàper testare la causalità ed esplorare i meccanismi biologici e mostra come nelprogetto sul genoma umano possa contribuire a capire e a prevenire ...
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Il concetto di randomizzazione mendeliana in epidemiologia Epidemiologia genetica

L’epidemiologia genetica è una branca che sta prendendo piede negl’ultimi anni ed essenzialmente sta diventando un utile supporto all’epidemiologia osservazionale. Essa in generale riguarda la comprensione degli aspetti ereditari delle malattie, la predisposizione individuale alle malattie stesse e la comprensione degli aspetti molecolari dei patogeni. Ma l’epidemiologia genetica può guidare anche alla migliore comprensione dei fattori ambientali che causano malattie non solo in sottopopolazioni predisposte ma anche nell’intera popolazione. Essa può anche essere semplicemente usata per confermare i risultati dell’epidemiologia osservazionale, essendo libera dal tipico confondimento di quest’ultima. Infatti l’associazione tra esposizioni modificabili e la malattia viste nell’epidemiologia osservazionale sono qualche volta confuse e quindi fuorvianti nonostante gli sforzi per migliorare il disegno e l’analisi degli studi.

Randomizzazione Mendeliana

La randomizzazione mendeliana è un metodo che fornisce nuove opportunità per testare la causalità ed esplorare i meccanismi biologici e mostra come nel progetto sul genoma umano possa contribuire a capire e a prevenire gli effetti avversi delle esposizioni modificabili sulla salute umana. La seconda legge di Mendel afferma che l’eredità di una caratteristica è indipendente dall’eredità di altre caratteristiche e questo è il principio fondamentale della randomizzazione mendeliana. L’idea di base è che alcuni polimorfismi genetici producono fenotipi diversi che riflettono gli effetti biologici di esposizioni ambientali modificabili, le quali a loro volta alterano il rischio di malattia. Queste relazioni generano un’associazione tra genotipo e rischio di malattia.

Vantaggi principali

I principali vantaggi che derivano dalla randomizzazione mendeliana sono il fatto che un’associazione tra polimorfismo e malattia può mimare l’associazione tra una data esposizione e la malattia stessa e che si elimina totalmente il problema della causalità inversa (in quanto la suddetta randomizzazione avviene al momento del concepimento e non è condizionata da variazioni nel comportamento) oltre che altri tipi di confondimento. Gli studi di coorte sono sempre molto limitati nel tempo e di conseguenza lo sono i relativi rischi. La randomizzazione mendeliana invece determina caratteristiche che durano tutta la vita, quindi permettono di estendere il rischio ad una vita intera o comunque di confermare la tendenza del rischio oltre gli anni considerati dallo studio di coorte.

Svantaggi

Gli svantaggi sono invece il confondimento da parte di altri polimorfismi legati in maniera instabile al polimorfismo in esame e con effetti fenotipici associati alla malattia, la mancanza di polimorfismi adatti allo studio e la canalizzazione. Quindi anche la randomizzazione mendeliana come l’epidemiologia genetica più in generale possono presentare un imprecisione nelle associazioni genetiche e perciò una non replicazione dei risultati. Questa imprecisione, la quale è un problema rilevante dell’epidemiologia genetica, è dovuta a varie fonti di variazione. Qui è un elenco numerato di tali fonti:

1) Altri fattori genetici o ambientali possono variare tra differenti popolazioni e modificare gli effetti in maniera diversa.

2) Misclassificazione del genotipo o del fenotipo 3) Confondimento dovuto alla struttura della popolazione 4) Bassa potenza dello studio 5) La casualità 6) Errori di pubblicazione 7) Variazione dell’associazione allelica tra sottopopolazioni: alleli in

legame con differenti marcatori (Il marcatore è una parte identificabile della sequenza di DNA, utile se legato ad un polimorfismo di interesse) in differenti popolazioni, oppure differenti varianti del gene in popolazioni diverse

Quando il genotipo è raro (o addirittura una mutazione) la potenza dello studio è necessariamente bassa in quanto il campione è troppo piccolo. Per studi sulle associazioni intermedie sono necessari campioni molto grandi. Ad esempio in uno studio di epidemiologia genetica che studiava

l’associazione tra il poliforfismo MTHFR, l’omocisteina e il rischio di malattia coronarica, sono stati necessari 9.500 casi e 9.500 controlli con un livello di significatività del 5% ed una potenza dell’80%.

Un approccio convenzionale sta studiando le interazioni tra le esposizioni ambientali e genotipo e diversi problemi sono sorti a questo riguardo. I risultati più attendibili negli studi sulle associazioni genetiche riguardano gli effetti principali dei polimorfismi sul rischio di malattia. La potenza per individuare interazioni gene-ambiente significative è bassa, con il risultato che c’è un largo numero di reports di interazioni gene-ambiente spurie nella letteratura medica.

Gli errori di pubblicazione sono probabilmente più numerosi in epidemiologia genetica che in quella osservazionale. Il motivo è probabilmente una conseguenza della necessità di molti casi per l’analisi e quindi spesso di una meta-analisi di studi troppo piccoli le cui variazioni dei risultati dovute al caso comportano una variazione nelle pubblicazioni stesse. Il valore di tali studi è tanto più alto quanto meglio sono caratterizzate le conseguenze funzionali dei polimorfismi.

La pleiotropia consiste invece nel fatto che un allele possa avere altri effetti, magari opposti a quello in studio, che confondono le associazioni in esame. L’effetto di un polimorfismo può infatti essere confuso da un altro polimorfismo ad esso associato e questo è dovuto principalmente alla pleiotropia di quasi tutti i geni, oltre che alle diverse varianti di un polimorfismo, le quali aumentano significativamente la probabilità di questi legami. Da un punto di vista biologico la pleiotropia riguarda il multieffetto delle possibili codificazioni di una proteina o (più raramente) la codificazione di più di una proteina da parte delle diverse varianti di un polimorfismo.

La canalizzazione è una misura dell’abilità di una popolazione di produrre lo stesso fenotipo indipendentemente dalla variabilità del suo genotipo o ambiente. Essa è divisa in canalizzazione genetica e ambientale; la prima si riferisce alla produzione dello stesso fenotipo da parte d i genotipi distinti, mentre la seconda alla produzione dello stesso fenotipo con lo stesso genotipo indipendentemente dalla variazione ambientale. Ciò è dovuto a meccanismi compensativi che si manifestano nello sviluppo ed in particolare in quello fetale. Questo può avvenire sia perché più di un gene ha la stessa funzione, sia tramite percorsi metabolici alternativi, dove

la complessità dei percorsi stessi permette di avere diverse possibilità per arrivare allo stesso fenotipo.

Studi ossevazionali

Gli studi di epidemiologia osservazionale sono a volte contraddetti da esperimenti controllati e randomizzati su larga scala, soprattutto quando l’associazione tra esposizione e malattia è correlata alla posizione socioeconomica, a fattori comportamentali ed all’utilizzazione del servizio sanitario, in quanto succede che non tutti i confondenti legati a questi aspetti sono considerati. Un approccio per migliorare gli studi osservazionali è la misura più accurata del confondimento ed un’analisi della sensibilità per l’errore della misura stessa. Inoltre i risultati vanno confrontati in termini di variazioni fra ed entro le popolazioni, per stabilire quali sono i veri fattori (diverse popolazioni hanno generalmente diversi confondenti). In ogni caso generalmente gli studi osservazionali classici sono più soggetti a confondimento rispetto a quelli di epidemiologia genetica. Comunque le associazioni che si determinano durante la vita e le associazioni all’interno del DNA sono ben diverse e di conseguenza lo sono i confondenti, perciò la randomizzazione mendeliana permette di avere comunque un diverso punto di vista ed è proprio per questo che viene spesso utilizzata come supporto all’epidemiologia convenzionale.

Altri concetti importanti

Un metodo per stabilire correlazione tra alleli e rischio di malattia è effettuare una stratificazione per diversi sottoinsiemi della popolazione, in modo che diversi rischi associati a diverse frequenze alleliche ci diano le giuste indicazioni.

Un polimorfismo è l’esistenza di due o più varianti nello stesso locus genetico. Il locus è invece la posizione nella sequenza del DNA e può essere riferita ad un singolo polimorfismo nucleotide o ad una regione più ampia del DNA. Un singolo polimorfismo nucleotide è una posizione lungo un cromosoma in cui il codice genetico varia tra individui per una singola coppia di elementi (alleli). Nel resto del testo mi riferisco al polimorfismo in particolare con quest’ultimo significato. I polimorfismi si possono essenzialmente dividere in due categorie, una che ha una funzione regolatrice sul livello di una sostanza, la quale è più

facile da interpretare, l’altra che influenza la struttura (e quindi la funzione) del prodotto del gene stesso. Ogni variante del polimorfismo deve avere una prevalenza nella popolazione superiore all’un per cento, altrimenti si parla di mutazioni. La legge di H-W descrive la situazione più semplice di equilibrio genetico di una popolazione: nonostante le condizioni dell'equilibrio di Hardy- Weinberg sembrino difficili da ottenere, esse valgono per molti caratteri in parecchie situazioni.Le condizioni per cui un locus in una popolazione segue la legge di H-W sono le seguenti:

• HW1 Popolazione teoricamente infinita. Ciò è richiesto affinché si possa applicare la Legge dei grandi numeri, e quindi le frequenze siano praticamente coincidenti con le probabilità. Basta comunque una popolazione di poche centinaia di individui, pur essendo possibili (ma improbabili) fluttuazioni.

• HW2 Assenza di immigrazione ed emigrazione. In questo modo il pool genetico è influenzato solo dalle sue dinamiche interne.

• HW3 Panmissia (incrocio casuale). Significa che la probabilità che due individui si incrocino non è influenzata dal genotipo per il carattere in questione. In questo modo è come se i geni di tutti gli individui fossero mescolati nel pool genetico ed estratti a sorte per creare i genotipi dei nuovi individui. La panmissia manca, ad esempio, nel caso di forti preferenze matrimoniali all'interno di caste chiuse, specie se con diversa origine etnica.

• HW4 Non selezione. Il successo riproduttivo medio degli individui (detto anche fitness) non deve essere influenzato dal genotipo per il carattere in questione. I due (o più) alleli devono quindi avere la stessa probabilità, una volta presenti, di essere trasmessi alle successive generazioni.

• HW5 Non mutazione. Ovviamente le mutazioni alterano la composizione del pool genetico delle nuove generazioni. Sono comunque eventi rari.

La legge di Hardy-Weinberg stabilisce che nelle condizioni suindicate le frequenze geniche rimangono costanti e le frequenze genotipiche si stabilizzano in una generazione in modo che la frequenza degli omozigoti sia il quadrato di quella dell'allele, mentre quelle degli eterozigoti saranno il doppio prodotto delle frequenze degli alleli posseduti.

Un esempio: Alcool e malattia coronarica

Il possibile effetto protettivo di un consumo moderato di alcool sul rischio di malattia coronarica (MC) rimane una questione controversa. I non bevitori sono ad alto rischio di MC perché i problemi di salute (probabilmente indotti da un precedente abuso di alcool) li dissuadono dal bere? Il confondimento può giocare un ruolo, tanto quanto questa forma di causalità inversa, con i non bevitori che sono più predisposti a mostrare un profilo socioeconomico avverso od altri fattori di rischio comportamentali per la MC (la moderazione nel bere potrebbe essere un indicatrice di moderazione in tutte le cose). Alternativamente l’alcool potrebbe avere un effetto biologico diretto che abbassa il rischio di MC, per esempio incrementando i livelli del colesterolo protettivo HDL (ad alta densità lipoproteica). Risulta difficile eseguire un esperimento controllato e randomizzato sull’assunzione di alcool che sia in grado di testare l’ipotesi di un effetto protettivo causale sugli eventi coronarici avversi. Polimorfismi funzionali di geni relazionati al metabolismo dell’alcool possono essere utilizzati per investigare questa associazione, dato che in questo caso la distribuzione dei confondenti dovrebbe essere poco differente fra i gruppi definiti dal genotipo. L’alcool deidrogenasi (ADH) ossida l’alcool trasformandolo in acetaldeide, la quale a sua volta è ossidata dall’aldeide deidrogenasi (ALDH) e quindi trasformata in acido acetico. Uno degl’isoenzimi ADH, l’ADH3, ha due varianti poliformiche che producono due differenti sottounità enzimiche polipeptidi; ADH3*1 produce F0671 e ADH3*2 produce F0672. Le frequenze degli alleli nelle popolazioni di origine europea sono a grandi linee del 60% per F0671 e del 40% per F0672 e fra i due tipi ci sono differenze nella velocità massimale dell’ossidazione dell’alcool, con gl’individui F0671 F0671 che mostrano un tasso di velocità due volte superiore rispetto agl’individui F0672 F0672. Perciò se c’è un effetto biologico protettivo dell’alcool sul rischio di MC allora ci si dovrebbe aspettare che le persone che ossidano più lentamente abbiano un più basso rischio di malattia, dal momento che ogni alcoolico da loro bevuto dovrebbe essere eliminato dal loro sistema meno velocemente. Infatti questo è quello che è stato trovato in uno studio caso-controllo, con rischi relativi confrontati con gli omozigoti F0671 F0671 (“ossidatori veloci”) uguali a 0.90 negli eterozigoti F0671 F0672 e 0.72 negli omozigoti F0672 F0672. L’aggiustamento per i fattori confondenti ha avuto una piccola influenza su queste misure, indicando che potenziali fattori confondenti non differiscono significativamente fra genotipi. Questo è vero anche per l’assunzione di alcool, che ci si sarebbe potuto aspettare che fosse associata con il genotipo, ma la mancanza di una forte associazione con le

varianti polimorfiche in questione è in accordo con altri studi. Questa mancanza di associazione con l’assunzione di alcool è in contrasto con gli effetti delle varianti dell’ALDH2 che sono associate con una lenta ossidazione dell’acetaldeide, arrossamento del viso e malesseri in risposta al consumo di alcool. Nello studio caso-controllo di sopra la potenza statistica rispetto alla MC era debole, ma c’era più potenza per analizzare l’associazione tra genotipo e livelli di colesterolo HDL. Esperimenti controllati e randomizzati (RCTs) hanno dimostrato che l’assunzione di alcool aumenta il colesterolo HDL secondo una relazione dose-risposta crescente e quindi ci si dovrebbe aspettare che gl’individui F0671 F0671 (“veloci”) abbiano livelli di colesterolo HDL più bassi rispetto agl’individui F0672 F0672 (i quali in modo semplicistico potrebbero essere visti come aventi un più alto livello di esposizione all’alcool ad una data assunzione dello stesso). Inoltre l’effetto è stato confinato alle persone con più del consumo minimale di alcool, dato che ci si aspetta che in assenza di alcool il genotipo non dovrebbe avere un’influenza biologica sul colesterolo HDL. La grandezza dell’associazione tra genotipo e livelli di colesterolo HDL può essere indicata dall’incremento nell’HDL visto negli RCTs, e in termini approssimativi ogni allele F0672 è l’equivalente di 18 g al giorno di consumo d’alcool (che equivale circa ad una pinta di birra). Perciò il range biologico degli effetti di queste varianti è equivalente ad un moderato incremento nel consumo di alcool. Sarebbero necessari più dati per studiare la relazione tra ADH3, HDL e rischio di MC, ma l’attuale evidenza fornisce supporto all’ipotesi di una protezione biologica diretta di un consumo moderato di alcool contro le malattie coronariche. Queste scoperte però non implicano che chi beneficerà di un particolare fattore ambientale (in questo caso la dieta) siano solo le persone con uno specifico genotipo, ma piuttosto l’intera popolazione. Questo metodo ha quindi fornito una forte evidenza, più robusta di quella degli studi epidemiologici osservazionali di tipo convenzionale, di come le manipolazioni ambientali possano beneficiare alla salute della popolazione.

Alcool, ALDH2 e cancro esofageo: una meta-analisi che illustra il potenziale e le limitazioni dell’approccio della randomizzazione mendeliana

Bere alcoolici è stato classificato come un fattore di rischio per il cancro esofageo basandosi su dati epidemiologici, tuttavia l’etanolo nella sua forma pura non agisce come cancerogeno nei modelli sperimentali. Ragioni potenziali del motivo per cui l’assunzione di alcoolici aumenta il rischio di cancro esofageo sono che l’alcool agisce come solvente per i cancerogeni del tabacco o che gli agenti cancerogeni siano le impurità presenti negli alcoolici. Un’altra ipotesi che compete con le prime due è che l’esposizione ad alti livelli di acetaldeide, il principale prodotto metabolico dell’alcool, è responsabile dell’aumentato rischio. Tuttavia una diretta evidenza che l’acetaldeide sia una causa di tumori della testa e del collo negli esseri umani è difficile da ottenere. Inoltre un’ulteriore complicazione è dovuta al fatto che l’assunzione di alcool tende ad essere correlata con tanti altri stili di vita, inclusi il fumo e la dieta, i quali sono a loro volta fattori di rischio per la malattia e che quindi porterebbero ad una sovrastima. In un largo studio di coorte giapponese infatti è stato mostrato che il consumo di sigarette è fortemente correlato al consumo di alcool, mentre non è affatto correlato col polimorfismo ALDH2. In questo caso la randomizzazione mendeliana è quindi servita ad eliminare un fortissimo confondente. Per di più il consumo di alcool è facilmente soggetto ad errori di misurazione, che portano generalmente ad una sottostima del rischio, congiuntamente agl’individui che riducono il consumo di alcool in coincidenza con l’inizio della malattia (causalità inversa). La causalità inversa è spesso un problema negli studi osservazionali in quanto i livelli di esposizione cambiano non di rado in presenza della malattia. Inoltre, un'altra forma di causalità inversa può verificarsi attraverso gli errori di reporting se i casi espongono la storia della loro esposizione differentemente dai controlli, in quanto stanno cercando una potenziale ragione per la loro malattia. In generale comunque nel reporting c’è una tendenza alla non accuratezza dello stesso, molto spesso c’è infatti un underreporting, che però utilizzando il genotipo come variabile proxy indicatrice dell’ assunzione di alcool (nel caso specifico), cesserebbe di essere un problema.

Il principale enzima responsabile dell’eliminazione dell’acetaldeide è l’ALDH2. In alcune popolazioni l’ALDH2 è polimorfico ed un genotipo in questo locus determina le concentrazioni di acetaldeide nel sangue dopo aver bevuto. L’allele ALDH2*2 produce un sottotipo di proteina inattivo e che non è in grado di metabolizzare acetaldeide, portando ad un accumulazione di acetaldeide dopo aver bevuto. Gli omozigoti ALDH2*2*2 sono caratterizzati da arrossamento della faccia dopo il consumo di alcool, unito a nausea, assopimento, mal di testa ed altri

sintomi fastidiosi che di fatto li prevengono dal bere tanto se non proprio dal bere alcoolici. Gli eterozigoti ALDH2*1*2 rispetto agli omozigoti ALDH2*1*1 hanno un’abilità limitata nel metabolizzare l’acetaldeide, ma hanno una reazione decisamente meno severa rispetto agli omozigoti ALDH2*2*2.

Diagramma schematico della relazione tra ALDH2, consumo di alcool, livelli di acetaldeide e cancro esofageo nei due diversi genotipi omozigoti:

ALDH2*1*1 ALDH2 Alcool Acetaldeide Acido acetico Cancro esofageo

ALDH2*2*2 ALDH2 Alcool Acetaldeide Acido acetico

Inibizione Sintomi fastidiosi

Hanno eseguito quindi una meta-analisi per stabilire l’effettivo apporto della randomizzazione mendeliana all’individuazione dell’eventuale relazione di causalità tra assunzione di alcool e cancro esofageo. L’ipotesi di partenza dello studio era che l’ALDH2*2*2 fosse protettivo rispetto al rischio di cancro e che invece l‘ALDH2*1*2 aumentasse il rischio rispetto all’*1*1 rispetto ad un consumo di alcool simile. Si è eseguita quindi un’analisi stratificata per l’assunzione di alcool: 0 = non bevitori ; 1 = tutti gli individui non classificati né come non bevitori né come forti bevitori ; 2 = forti bevitori. Inoltre sono stati utilizzati modelli ad effetti casuali, cioè i livelli di esposizione considerati sono un campione di tutti i possibili livelli. L’influenza dell’assunzione di alcool sulla relazione tra il genotipo ALDH2 ed il rischio di cancro esofageo è stata stabilita usando una meta-analisi di regressione. Si calcola poi la deviazione dall’equilibrio di Hardy-Weinberg per le popolazioni controllo.

Sette studi sono stati identificati per la meta-analisi, per un totale di 905 casi di cancro esofageo. Essi sono riassunti nella seguente tabella:

Studio Popolazione N.ro casi N.ro controlli Freq. *2 controlli

Hori et al. Giappone 93 70 individui sani 0.33 Chao et al. Taiwan 88 (53

bevitori) 105 non bevitori 0.29

Matsuo et al. Giappone 102 241 pazienti ambulatoriali ospedalieri

0.28

Yokoyama et al. (1) Giappone 112 bevitori

526 bevitori 0.05

Boonyaphiphat et al. Tailandia 202 261 ricoverati ospedalieri

0.10

Itoga et al. Giappone 74 241 individui sani 0.22 Yokoyama et al. (2) Giappone 234 634 (popolazione) 0.27

Le relative frequenze del genotipo in tutti i gruppi di controllo non sono deviate dai valori predetti dall’equilibrio di Hardy-Weinberg. Le frequenze dell’allele ALDH2*2 nelle popolazioni di controllo sono più basse nello studio di Yokoyama et al. in cui i controlli erano bevitori ed inoltre sono più basse nello studio sui tailandesi rispetto agl’altri studi. Da ciò si può già dedurre che chi ha l’allele *2 ha una minore probabilità di bere rispetto a chi non lo ha e che i tailandesi avendone una minore frequenza tendenzialmente dovrebbero bere di più ed essere più soggetti alla malattia in esame, nonostante metabolizzino meglio l’alcool. La meta-analisi ha portato ad un OR complessivo di 0.36 (I.C. 95%, 0.16-0.80) per il rischio di cancro esofageo negli omozigoti *2*2 confrontato con gli omozigoti *1*1 e ad un OR complessivo di 3.19 (I.C. 95%, 1.86-5.47) per gli eterozigoti rispetto ancora agli omozigoti *1*1. Tra i non bevitori non vi è stata una forte evidenza di un incremento del rischio fra gli eterozigoti (OR=1.31, I.C. 95%, 0.70-2.47) relativamente agl’individui *1*1. Tuttavia tra i forti bevitori c’era un incremento del rischio notevole (OR=7.07, I.C. 95%, 3.67-13.6). Fra tutti gli altri bevitori intermedi lo stesso OR è stato di 2.49 (I.C. 95%, 1.29-4.79). La meta- analisi di regressione ha mostrato evidenza del fatto che l’assunzione di alcool influenza l’effetto del genotipo *1*2 sul rischio di cancro esofageo (p-value=0.008) e che più largo è il consumo di alcoolici più il rischio aumenta.

Non vi è stata evidenza di eterogeneità fra studi nell’analisi del genotipo *2*2 contro *1*1 ( F0632 = 2.14, p-value = 0.71, I2 = 0.0%; da notare che quel Chi quadro rappresenta il test Q di Cochran, che è appunto un test di eterogeneità basato su tale distribuzione, mentre l’I2 indica la percentuale di eterogeneità non giustificabile dal caso), ma c’è stata evidenza di eterogeneità nell’analisi del genotipo *1*2 contro *1*1 ( F0632 = 53.5, p-value < 0.001, I2 = 81.3%). Questa eterogeneità era leggermente ridotta negli strati dopo la stratificazione per assunzione di alcool ed era confinata ai bevitori di alcoolici, sia quindi i forti bevitori ( F0632 = 9.01, p-value = 0.03, I2

= 66.7%) che gli altri bevitori ( F0632 = 11.6, p-value = 0.009, I2 = 74.0%). Ciò probabilmente riflette differenze nelle stime grezze sulle assunzioni di alcool tra gli studi, soprattutto considerando che non è stata riscontrata eterogeneità tra gli studi nei non bevitori ( F0632 = 0.35, p-value = 0.84, I2 = 0.0%). Il test complessivo di eterogeneità fra i tre effetti stimati degli strati di sopra ha dato i seguenti risultati: F0632 = 32.6 e p-value = 0.001. Anche qui non si specifica il tipo di test utilizzato ma generalmente si usa quello di Breslow-Day sia per i rischi relativi che per gli ORs, comunque questo test è diverso da quello usato prima e ci indica sostanzialmente la presenza di interazione (in particolare ci indica come il consumo di alcool modifichi l’effetto del genotipo sulla malattia ed essendo l’interazione simmetrica indica anche come il genotipo modifichi l’effetto dell’alcool sulla malattia). Un test di Egger (di asimmetria della regressione) non ha fornito alcuna evidenza del fatto che gli effetti stimati fossero condizionati dall’ampiezza dello studio (p-value = 0.61 per le analisi degl’individui *2*2 e p-value = 0.11 per l’analisi degli *1*2), dando qualche rassicurazione sugli errori dovuti a studi troppo piccoli, come gli errori di pubblicazione, che sono alimentati dalla maggiore eterogeneità fra i risultati di studi non abbastanza larghi, in quanto alcuni tipi di risultati potrebbero avere maggiore probabilità di essere pubblicati rispetto ad altri tipi.

Categorie di bevitori per il genotipo ALDH2 nei controlli:

Studi Categorie *1*1, n (%)

*1*2, n (%)

*2*2, n (%)

Matsuo et al. Altri 104 (82.5) 92 (95.8) 19 (100) Forti bevitori 22 (17.5) 4 (4.2) 0 (0)

Yokoyama et al. (1)

Bevitori 476 (100) 50 (100) 0

Boonyaphiphat et al.

Non bevitori 104 (48.4) 24 (60.0) Esclusi(numero troppo basso)<= 60 g/g 66 (30.7) 11 (27.5)

> 60 g/g 45 (20.9) 5 (12.5) Itoga et al. Non bevitori 8 (5.6) 23 (26.1) 10 (100)

Bevitori 135 (94.4) 65 (73.9) 0 (0) Yokoyama et al. (2)

Mai bevuto/ raramente

21 (6.2) 80 (32) 41 (95.3)

Leggeri bevitori 96 (28.2) 103 (41.2) 2 (4.7) Moderati bevitori 135 (39.6) 35 (14) 0 (0) Forti bevitori 78 (22.9) 27 (10.8) 0 (0) Ex bevitori 11 (3.2) 5 (2) 0 (0)

Negli studi che hanno fornito il consumo di alcool per genotipo nel gruppo di controllo, i forti bevitori sono più comuni tra gl’individui con genotipo *1*1 confrontati con il genotipo *1*2 ed inoltre non vi è alculn forte bevitore con genotipo *2*2. Una meta-analisi di studi osservazionali sulla relazione tra il consumo di alcool ed il rischio di cancro esofageo ha trovato rischi relativi di 1.8, 2.38 e 4.36 rispettivamente tra i leggeri, moderati e forti bevitori confrontati con i non bevitori. Nella popolazione di controllo nello studio di Yokoyama et al. (2) il 9.4% degl’individui *1*1 sono non bevitori (compresi sia quelli che non hanno mai bevuto sia gli ex bevitori) ed il 28.2%, 39.6%, 22.9% rispettivamente leggeri, moderati e forti bevitori. Mentre il limite tra bevitori leggeri e moderati è differente nei due studi (29 grammi al giorno nello studio di Yokoyama et al. e 39.99 grammi al giorno nella meta-analisi di studi osservazionali), altri punti limite sono simili. Quindi si sono usati i rischi relativi associati a diversi livelli di consumo di alcool nella meta-analisi di studi osservazionali per calcolare una probabilità approssimata e complessiva di malattia data l’assunzione di alcool come riportata dallo studio di Yokoyama et al (2) per i controlli omozigoti *1*1, che vengono quindi chiamati a rappresentare la popolazione. Per calcolare questa probabilità si è utilizzata la seguente equazione: RR= F0E5(RRi * Pi), dove i denota la categoria di bevitore ( non, leggero,moderato e forte), RRi è il rischio relativo nella i-esima categoria stimata dalla meta-analisi e Pi è la proporzione assunta nella i-esima categoria tra i controlli. Si è stimato un rischio relativo complessivo per questo gruppo rispetto ai non bevitori (equivalenti agl’individui *2*2, se si

considera che virtualmente tutti siano non bevitori) di circa 2.54. In questa meta-analisi l’OR di cancro esofageo per gli omozigoti *1*1 contro *2*2 era di 2.77 (I.C. 95%, 1.25-6.12). Rapporti di rischi (RR) e rapporti di odds (OR) possono essere considerati virtualmente equivalenti per il cancro esofageo dal momento che la malattia è molto rara. Tuttavia il maggior rischio visto tra gli omozigoti *1*1 è quanto ci si può aspettare dato il loro comportamento di bevitori ed i risultati degli studi epidemiologici osservazionali alla relazione tra il bere alcoolici ed il rischio di cancro esofageo. Ci sono livelli decisamente più elevati di acetaldeide tra gli eterozigoti che bevono alcoolici e si è già osservato che l’OR complessivo tra gli stessi eterozigoti e gli omozigoti *1*1 risulta essere 3.19, che quindi sta ad indicare che approssimativamente gl’individui *1*2 rischiano 3 volte di più degl’individui *1*1. Questo suggerisce che l’acetaldeide potrebbe essere il meccanismo attraverso il quale l’alcool incrementa il rischio di cancro esofageo. Questa meta-analisi ed i risultati della meta-regressione mostrano che l’associazione tra il genotipo eterozigota ALDH2 ed il cancro esofageo è dipendente dal consumo di alcool. Tra i non bevitori non c’è una forte evidenza di un aumento del rischio. Ma poiché tra i forti bevitori si è rilevato un sostanziale incremento del rischio, ciò suggerisce che il possedere un allele ALDH2*2 non incrementa il rischio di cancro esofageo a meno che non vengano consumati alcoolici.

Questo tipo di studio basato sulla randomizzazione mendeliana e sull’epidemiologia genetica più in generale presenta comunque alcune limitazioni. C’è infatti una notevole eterogeneità fra gli studi della meta- analisi dovuta alle diverse classificazioni del consumo degli studi stessi ed all’impossibilità di risalire ai consumi personali di ogni individuo (questo è il problema già citato dell’errore del reporting). Inoltre in questo esempio i fenotipi associati ai rispettivi genotipi sono ben distinguibili, ma spesso non è così.

In conclusione affermerei che l’utilizzo del concetto di randomizzazione mendeliana al fine di evitare diversi tipi di confondimento è sicuramente uno strumento utile in più nelle mani dell’epidemiologia. Inoltre alcune interazioni tra genotipo ed esposizione (come quella tra ALDH2 ed effetto dell’alcool sul cancro esofageo) sono innanzitutto previste almeno a grandi linee per via della conoscenza supposta della relazione tra genotipo e

fenotipo oltre che fra comportamento e fenotipo stesso. Perciò proprio in base a certe modificazioni di effetto si conferma l’ipotesi dell’effetto di un’esposizione. Certo è che stratificando per il genotipo si può dare un ulteriore conferma alla relazione strettamente monotona crescente o decrescente (seppur diversa per ogni genotipo nel caso di interazione) tra esposizione e malattia. Il genotipo come variabile indicatrice (proxy) di un’esposizione in realtà si usa in alternativa del polimorfismo come modificatore d’effetto dell’esposizione stessa. Nello studio effettuato, nel quale non è stata utilizzata una proxy completa, il genotipo si utilizza in tutti e due i modi. Da notare poi che in questo caso nella relazione *2*2 con la malattia prevale nettamente il ruolo di proxy rispetto a quello di modificatore d’effetto e questo è importante perché altrimenti con un associazione più blanda tra il genotipo stesso ed il comportamento il ruolo si trasformerebbe in quello di confondente (infatti in questo caso il confine che divide la variabile proxy da una variabile confondente è abbastanza sottile, ma in ogni caso l’essenziale è conoscere a priori l’associazione).

Rappresento qui alcuni schemi relazionali che dovrebbero chiarificare i concetti sopra espressi:

Relazione volta a chiarificare gli aspetti biologici:

GENOTIPO FENOTIPO MALATTIA Relazione volta a chiarificare la relazione tra comportamento e malattia:

GENOTIPO FENOTIPO(1) MALATTIA

COMPORTAMENTO

Relazione di prima considerando il genotipo una variabile proxy:

GENOTIPO FENOTIPO(2) COMPORT. R:MALATTIA

Relazioni nello studio del rischio di cancro esofageo:

ALDH2 METABOL.ACETALD.R. CANCRO ESOFAGEO

ASSUNZIONE ALCOOL

ALDH2 SINTOMI(SI/NO) ALCOOL(SI/NO) R.CANCRO

Percorso unico per l’ALDH2*2*2:

ALDH2*2*2 SINTOMI NO ALCOOL RISCHIO CANCRO

N.B.: Tutte le frecce indicano un’associazione causale, tranne , che indica interazione (diretta col fenotipo e più indiretta, ma identica in caso di perfetta associazione causale tra genotipo e fenotipo, con il genotipo stesso).

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