BIOLOGIA APPLICATA - DISPENSE PER MEDICINA E ODONTOIATRIA - ALBERTS, Dispense di Biologia Applicata

Scarica BIOLOGIA APPLICATA - DISPENSE PER MEDICINA E ODONTOIATRIA - ALBERTS e più Dispense in PDF di Biologia Applicata solo su Docsity! CAPITOLO 12 I SISTEMI DI MEMBRANA FORMANO COMPARTIMENTI CHIUSI E A CAUSA della SEMI PERMEABILITÀ DEL DOPPIO STRATO LIPIDICO LA MEMBRANA: • CONTIENE PROTEINE DI TRASPORTO , RESPONSABILI Dell' IMPORTAZIONE ED ESPORTAZIONE DI METABOLITI SPECIFICI • INCORPORARE PROTEINE SPECIFICHE COMPARTIMENTI PRINCIPALI : → Nucleo SINTESI DNA E RNA , CONTIENE IL GENOMA → CITOPLASMA CITOSOL + ORGANELLI → CITOSOL SINTESI E DEGRADAZIONE PROTEINE , SVOLGE LA MAGGIOR PARTE DEL METABOLISMO INTERMEDIO della cellula ( REAZIONI IN CUI PICCOLE MOLECOLE SONO DEGRADATE E Altre SONO SINTETIZZATE PER FORNIRE LE UNITÀ DI COSTRUZIONE Delle macromolecole) → RE RUVIDO HA RIBOSOMI sulla superficie citosolica (SINTESI PROTEINE SOWBIU e INTEGRALI DI MEMBRANA) . Produce LA MAGGIOR PARTE DEI LIPIDI PER IL RESTO della ceuu.ua → RE USUO BIOSINTESI lipidi , REAZIONI DETOSSIFICAZIONE , ACCUMULO E Rilascio toni Ca " MANTIENE IL POTENZIALE REDOX : QUANDO PROTEINE BEN CONFORMATE CON ESPOSTI GRUPPI SOLFURO , A CAUSA dell' AMBIENTE OSSIDATO , SI CREA UNO STRESS OSSIDATIVO → APPARATO DEL GOLGI Riceve PROTEINE E LIPIDI DAL RE , LI MODIFICA COVALENTEMENTE E INVIA AD Altre DESTINAZIONI → MITOCONDRI GENERANO ATP UTILIZZANDO L' ENERGIA DERIVATA DAL TRASPORTO DI ELETTRONI E dalla FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA → LISOSOMI CONTENGONO ENZIMI DIGESTIVI PER LA DIGESTIONE INTRACELLULARE → ENDOSOMI VESCICOLA CHE SI ORIGINA IN SEGUITO A INVAGINAZIONE E distacco dalla MEMBRANA PLASMATICA . TAPPA DI PASSAGGIO DEL MATERIALE ENDOcitato → PEROSSISOMI CONTENGONO ENZIMI OSSIDATIVI IN BASE alla FUNZIONE della cellula , VARIA UA QUANTITÀ E le PROPRIETÀ DEGLI ORGANELLI . EVOLUZIONE MEMBRANE LE PRIME CELLULE EUCARIOTICHE SI SONO POTUTE EVOLVERE MEDIANTE INVAGINAZIONE E DISTACCO Dalla MEMBRANA PLASMATICA DI UNA cellula ANCESTRALE . QUESTO HA PORTATO Alla CREAZIONE DI COMPARTIMENTI CIRCONDATI DA MEMBRANA CON UN LUME TOPOLOGICAMENTE EQUIVALENTE All' ESTERNO della ceuuua EVOLUZIONE MITOCONDRI POICHÉ POSSIEDE UN PROPRIO GENOMA , SI PENSA CHE SI SIANO EVOLUTI DA BAITERI CHE SONO STATI INGLOBATI DA Altre cellule con cui vivevano IN SIMBIOSI . LA MEMBRANA INTERNA CORRISPONDE Alla MEMBRANA PLASMATICA ORIGINARIA DEL Batterio , IL LUME SI È EVOLUTO DAL GTOSOL Batterico. EVOLUZIONE INVOLUCRO NUCLEARE INVAGINAZIONE della MEMBRANA PLASMATICA DI UN ANTICO ARCHEO . QUESTO INVOLUCRO POI SI È STACCATO FORMANDO UN PROPRIO COMPARTIMENTO CONTENENTE IL DNA PRODUZIONE PROTEINE a > TRASPORTATE FUORI SU ORGANELLI DAL UTOSOL DIPENDE dalla PRESENZA DI SEGNALI DI SMISTAMENTO LA SINTESI DI Tutte LE PROTEINE INIZIA SUI RIBOSOMI NEL CITOSOL , eccetto Quelle PROTEINE CHE SONO SINTETIZZATE SUI RIBOSOMI DEI MITOCONDRI . MOVIMENTO PROTEINE TRA COMPARTIMENTI → TRASPORTO REGOLATO CITOSOL- nucleo Attraverso IL COMPLESSO DEI PORI NUCLEARI CHE TRASPORTANO Attivamente MACROMOLECOLE E COMPLESSI MACROMOLECOLARI specifici TRA I 2 SPAZI TOPOLOGICAMENTE EQUIVALENTI , CIOÈ PERMETTONO LA DIFFUSIONE LIBERA DI Piccole molecole → TRASLOCAZIONE PROTEICA LE PROTEINE TRASUOGATRIU DI MEMBRANA TRASPORTANO LE PROTEINE DAL CITOSOL AD UN COMPARTIMENTO TOPOLOGICAMENTE DISTINTO . LA PROTEINA TRASPORTATA IN GENERE PERDE I SUOI RIPIEGAMENTI PER INSINUARSI NEL TRASLOCATORE → TRASPORTO VESCICOLARE LE VESCICOLE SI CARICANO DI MOLECOLE PROVENIENTI DAL LUME DI UN compartimento QUANDO SI DISTACCANO dalla SUA MEMBRANA E SCARICANO IL CONTENUTO IN UN SECONDO COMPARTIMENTO FONDENDOSI CON LA MEMBRANA TOPOLOGICAMENTE EQUIVALENTE SEQUENZA SEGNALE (15 - 60 RESIDUI All' N - TERMINALE) • SPESSO RIMOSSA Dalla PROTEINA DA UNA PEPTIDASI DEL SEGNALE SPECIALIZZATA • POSSONO ANCHE ESSERE TRAM INTERNI DI AMMINOACIDI CHE RESTANO PARTE DELLA PROTEINA ( NEL TRASPORTO REGOLATO ) , ANCHE SEQUENZE MULTIPLE (ZONE SEGNALE ) , USATE , AD ESEMPIO , NELL' IMPORTAZIONE NUCLEARE E NEL TRASPORTO VESCICOLARE OGNI SEQUENZA SEGNALE SPECIFICA UNA PARTICOLARE DESTINAZIONE : • ALCUNE PASSANO DAL RETICOLO AL GOLGI • ALCUNE CON 4 AMMINOACIDI ALL' N - TERMINALE RESTANO NEL RE LE SEQUENZE SEGNALE DI tutte LE PROTEINE CHE HANNO LA STESSA DESTINAZIONE SONO FUNZIONALMENTE INTERCAMBIABILI E NEL PROCESSO DI RICONOSCIMENTO DEL SEGNALE ALCUNE PROPRIETÀ FISICHE , COME L' IDROFOBICETÀ , SEMBRANO ESSERE SPESSO PIÙ IMPORTANTI della SEQUENZA esatta DEGLI AMMINOACIDI. TRASPORTO I COMPLESSI Recettore_ CARICO SI MUOVONO LUNGO LA VIA LEGANDOSI RIPETUTAMENTE Alle SEQUENZE FG , ciò PORTA A ROMPERE LE INTERAZIONI TRA le FG STESSE E A dissolvere LA FASE GELATINOSA DI GROVIGLIO PROTEICO CHE RIEMPIE IL PORO , permettendone IL PASSAGGIO . ARRIVO NEL Nucleo → DISSOCIAZIONE DEL recettore → RITORNO DEL recettore DAL SUO CARICO NEL CITOSOL RICONOSCIUTO DAI ESPORTAZIONE → SEGNALE ESPORTAZIONE - recettori DI ESPORTAZIONE nucleare , LE ESPORT/Ne d SONO CODIFICATI DA CARIOFERINE (GENI DI Recettori di TRASPORTO NUCLEARE) . I recettori SI LEGANO SIA AL SEGNALE DI ESPORTAZIONE CHE A PROTEINE DEGLI NPC PER GUIDARE il LORO CARICO Attraverso l' NPC FINO AL CITOSOL L' IMPORTAZIONE È PERMESSA dall' ENERGIA IMMAGAZZINATA IN GRADIENTI DI CONCENTRAZIONE della FORMA LEGATA A GTP Della GTPASI MONOMERICA RAN . RAN PUO' ESSERE LEGATO A GDP 0 GTP . La conversione NEI 2 STATI È DATA DA : • GAP CITOSOLICA (PROTEINA CHE Attiva UA GTPASI) , INNESCA L' IDROLISI DI GTP E CONVERTE RAN - GTP IN RAN - GDP • GEF Nucleare ( fattore DI SCAMBIO DELLA GUANINA) , CONVERTE RAN - GDP IN RAN - GTP QUESTO GRADIENTE delle 2 RAN SPINGE IL TRASPORTO Nucleare. LEGANO Recettori_ RIPETIZIONI FG SUL LATO CITOSOLICO - ENTRANO nel poro d RAN - GTP SI LEGA SE IL recettore _ RAGGIUNGONO IL LATO NUCLEARE TRASPORTA UN CARICO a RILASCIO DEL CARICO NEL Nucleo IL Recettore - RANGTP VIENE TRASPORTATO A RITROSO NEL CITOSOL . QUI RAN- GAP LO CONVERTE IN RAN- GDP CHE SI DISSOCIA DAL Recettore L' ESPORTAZIONE È SIMILE SOLO CHE NEL Nucleo RAN - GTP PROMUOVE L' Attacco DEL CARICO AL Recettore E NON LA DISSOCIAZIONE . GIUNTO NEL CITOSOL RAN - GAP IDROLIZZA IL GTP E IL Recettore RILASCIA NEL CITOSOL IL CARICO E RAN- GDP . ALCUNE PROTEINE CONTENGONO SIA SEGNALI DI LOCALIZZAZIONE NUCLEARE CHE DI ESPORTAZIONE . LA LOCALIZZAZIONE All' EQUILIBRIO DI QUESTE PROTEINE NAUEITA ( SHUITLING PROTEINS) È DETERMINATA dalle RELATIVE VELOCITÀ DI IMPORTAZIONE ED ESPORTAZIONE : VARIANDO LE VELOCITÀ , VARIA ANCHE LA LOCALIZZAZIONE . QUESTI SEGNALI VENGONO REGOLATI TRAMITE FOSFORILAZIONE DI AMMINOACIDI ADIACENTI Alle SEQUENZE SEGNALE . LAMINA Nucleare SI TROVA SUL LATO NUCLEARE della MEMBRANA NUCLEARE INTERNA ED È UN RETICOLO DI SUBUNITÀ PROTEICHE INTERCONNESSE CHIAMATE LAMINE NUCLEARI TRASPORTO MITOCONDRI CITOSOL→ MITOCONDRI I MITOCONDRI SONO ORGANELLI RACCHIUSI DA UNA DOPPIA MEMBRANA SPECIALIZZATI NELLA SINTESI DI ATP , UTILIZZANDO L' ENERGIA DERIVANTE DAL TRASPORTO DEGLI ELETTRONI E DALLA FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA . I MITOCONDRI PRESENTANO sottoCOMPARTIMENTI SEPARATI : • SPAZIO DELLA MATRICE INTERNO • SPAZIO INTERMEMBRANA ( IN CONTINUITÀ CON LE CRESTE ) • MEMBRANA INTERNA ( FORMA INVAGINAZIONI , LE CRESTE E RACCHIUDE LO SPAZIO DELLA MATRICE ) • MEMBRANA ESTERNA CIASCUN SONO COMPARTIMENTO PRESENTA UNA SERIE DISTINTA DI PROTEINE . IMPORTAZIONE → LE PROTEINE MITOCONDRIALI PRIMA VENGONO SINTETIZZATE COME PRECURSORI delle PROTEINE MITOCONDRIALI NEL GTOSOL , POI VENGONO TRASLOCATE NEI MITOCONDRI CON UN MECCANISMO| POST- TRADUZIONALE AVVIENE TRAMITE SEQUENZE SEGNALI , LE QUALI VENGONO SPESSO TAGLIATE DA PEPTIDASI DEL SEGNALE . ALTRE HANNO UNA SEQUENZA. SEGNALE INTERNA CHE NON VIENE RIMOSSA . STRUITURA SEQUENZA SEGNALE • ✗ ELICA antipatica > RESIDUI CARICHI + SI TROVANO SU UN LATO{RESIDUI IDROFOBICI PRIVI DI CARICA sull' ALTRO lo QUESTA CONFIGURAZIONE VIENE RICONOSCIUTA DAI Recettori PROTEICI CHE INIZIANO LA TRASLOCAZIONE Delle PROTEINE UA TRASLOCAZIONE delle PROTEINE ATTRAVERSO le MEMBRANE MITOCONDRIALI È MEDIATA DA PROCESSI PROTEICI MULTISUBUNITÀ , I TRASLOCATORI DI PROTEINE . • COMPLESSO TOM TRASFERISCE PROTEINE Attraverso LA MEMBRANA ESTERNA • COMPLESSI TIM (22 E 23) TRASFERISCONO PROTEINE Attraverso LA MEMBRANA INTERNAdi QUESTI COMPLESSI CONTENGONO COMPONENTI CHE FANNO DA RECETTORI AI PRECURSORI DI PROTEINE MITOCONDRIALI E ALTRI CHE FORMANO IL CANALE di TRASLOCAZIONE COMPLESSI : • TOM IMPORTA PROTEINE MITOCONDRIALI prodotte NEL Nucleo TRASPORTA SEQ . SEGNALE → ARRIVA Nello SPAZIO INTERMEMBRANA → INSERISCE LE PROTEINE TRANSMEMBRANA NELLA MEMBRANA INTERNA SE HO PROTEINE B-BARILE (ABBONDANTI NELLA MEMBRANA ESTERNA) VENGONO TRASFERITE AL COMPLESSO SAM , che le AIUTA A RIPIEGARSI IN MODO corretto . • TIM 23 TRASPORTA PROTEINE SOLUBILI NELLO SPAZIO della MATRICE E AIUTA A INSERIRE PROTEINE TRANSMEMBRANA NELLA MEMBRANA INTERNA IMPORTAZIONE DI PROTEINE CON MOTIVI DI CISTEINA LEGAME DISOLFURO TEMPORANEO DI QUESTE PROTEINE CON LA PROTEINA MIA40 di Rilascio PROTEINA OSSIDATA CON LEGAMI DISOLFURO INTRACATENA di PROTEINA MIA40 VIENE RIDOTTA ED È POI RIOSSIDATA TRASFERENDO Elettroni Alla CATENA DI DI TRASPORTO DEGLI ELETTRONI L' ENERGIA IMMAGAZZINATA NEL POTENZIALE REDOX NELLA CATENA DI TRASPORTO DEGLI Elettroni MITOCONDRIALE È UTILIZZATA PER SPINGERE L' IMPORTAZIONE DI PROTEINE I MITOCONDRI SONO IL SITO PRINCIPALE DI SINTESI DI ATP NELLA CELLULA TRASPORTO DI PICCOLE MOLECOLE NELLA MEMBRANA INTERNA VA M . ESTERNA E ' PERMEABILE Alle piccole molecole GRAZIE Alle PORINE , MA LA M. INTERNA NON NE HA → MEDIATO DA UNA FAMIGLIA DI PROTEINE TRASPORTATRIU SPECIFICHE PER METABOLITI → TRAMITE PROTEINE TRANSMEMBRANA A PASSAGGI MULTIPLI CHE HANNO SEQUENZE SEGNAU INTERNE → Attraversano TOM E SONO GUIDATE DA CHAPERON NEL 17m22 → TIM22 LE INSERISCE NELLA M.IN/z-RNA MEDIANTE UN PROCESSO CHE Richiede POTENZIALE DI MEMBRANA PEROSSISOMI LE PROTEINE ARRIVANO NEI PEROSSISOMI PER IMPORTAZIONE selettiva DAL CITOSOL CARATTERISTICHE O TRAMITE IL RE . → CIRCONDATI DA UNA SINGOLA MEMBRANA] → NON CONTENGONO DNA E PROTEINE → CONTENGONO ENZIMI OSSIDATIVI (ES . GATAUSI E URATO OSSIDASI) → SITI DI UTILIZZO dell'OSSIGENO → SI ADATTANO BENE AL CAMBIAMENTO DI CONDIZIONI AMBIENTALI I PEROSSISOMI CONTENGONO ENZIMI CHE USANO OSSIGENO PER RIMUOVERE ATOMI DI IDROGENO DA SUBSTRATI ORGANICI PRODUCENDO ACQUA OSSIGENATA (Haq) va CATAUSI UTILIZZA Hao, PER OSSIDARE VARI ALTRI SUBSTRATI TRAMITE LA REAZIONE PEROSSIDATNA ↳ IMPORTANTE Nelle cellule DEL FEGATO E DEL RENE: I PEROSSISOMI DETOSSIFICANO VARIE MOLECOLE TOSSICHE CHE ENTRANO NEL SANGUE FUNZIONE PEROSSISOMI : B- OSSIDAZIONE → Demolisce molecole DI ACIDI GRASSI IN ACETIL COA , IL QUALE VIENE ESPORTATO NEL citosol PER ESSERE USATO IN REAZIONI BIOSINTETICAe FORMAZIONE PUASMALOGENI : SONO I FOSFOUP /DI PIÙ ABBONDANTI Nella MIELINA . L' ASSENZA DI PUASMALOGENI PORTA A PROFONDE ANOMALIE Nema MIEUNIZZAZLONE DEGLI ASSIONI Delle cellule NERVOSE , E QUESTA È UNA RAGIONE PER cui molte ANOMALIE DEI PEROSSISOMI PORTANO A Malattie NEUROLOGICHE . IMPORTAZIONE PEROSSISOMI SEQUENZA SEGNALE : • TRIPLETTA DI AMMINOACIDI SERINA - USINA - LEUCINA AL C- TERMINALE RICONOSCIUTA DA • Altre UA CONTENGONO VICINO All' N- TERMINALE recettori PROTEICI SOLUBILI NEL CITOSOL TRASLOCATORE : FORMATO DA 6 PEROSSINE IL PROCESSO DI IMPORTAZIONE È SPINTO DA IDROLISI DI ATP . IL PORO FORMATO DAL TRASPORTATORE E ' DINAMICO E SI ADAITA Alla GRANDEZZA DEL CARICO CHE DEVONO TRASPORTARE . VA PEROSSINA PEX5 , UN recettore SOLUBILE DI IMPORTAZIONE , Riconosce IL SEGNALE DI IMPORTAZIONE AL C- TERMINALE E SI LEGA ADESSO ti PORTA IL CARICO A DESTINAZIONE , nel PEROSSISOMI di RITORNA NEL CITOSOL DOVE SUBISCE UBIQUITINAZIONE PER ESSERE Riciclata di UN ATPASI COMPOSTA DA PEXI e PEXG , UTILIZZA L' ENERGIA DI IDROLISI DI ATP PER IL RLUASÙO DI PEX5 DAI PEROSSISOMI SINDROME DI ZELLWEGER ( MALATIA EREDITARIA ) • GRAVE Deficienza DI PEROSSISOMI A CAUSA DI UN Difetto delle PROTEINE DI IMPORTAZIONE • LE cellule PRESENTANO PEROSSISOMI " VUOTI " , E I SOGGETTI PRESENTANO GRAVI ANOMALIE CEREBRALI , NEL FEGATO E NEI RENI E MUOIONO POCO DOPO LA NASCITA • DOVUTA DALLA MUTAZIONE DEL GENE CHE CODIFICA LA PROTEINA PEX5 • UN Difetto IN PEXZ , IL Recettore PER IL SEGNALE DI IMPORTAZIONE All' N- TERMINALE CAUSA UNA FORMA PIÙ LIEVE DELLA MALATIA RETICOLO ENDOPLASMATICO LE CISTERNE 9 ORGANIZZATO IN UN LABIRINTO RETICOLARE DI TUBULI RAMIFICATI E DI SACCHI Appiattiti CHE SI ESTENDE PER tutto IL CITOSOL . I TUBULI E I SACCHI SONO INTERCONNESSI E LA LORO MEMBRANA E ' IN CONTINUITÀ CON LA MEMBRANA NUCLEARE ESTERNA . LO SPAZIO TRA LA MEMBRANA DEL RE (TUBULI + SACCHI) E LA M. NUCLEARE ESTERNA È DETO LUME DEL RE 0 SPAZIO DELLE CISTERNE DEL RE . VI SONO Delle REGIONI DISTINTE del re Altamente specializzate : → RE liscio → RE RUVIDO IL RIBOSOMA CHE STA IMPORTAZIONE DI PROTEINE NEL RE → Processo CODRADUZLONAUE → SINTETIZZANDO LA Proteina SI Attacca Al Re RE RUVIDO✓ di UN' ESTREMITÀ Della PROTEINA E ' TRASLOCATA NEL RE E RE DI TRANSIZIONE : AREE DI RE Uscio DA cui GEMMANO L' ALTRA È ANCORA IN VESCICOLE DI TRASPORTO CHE PORTANO PROTEINE FASE DI SINTESI E UPIDI DI NUOVA SINTESI All' APPARATO DEL GOLGI FUNZIONI DEL RE • BIOSINTESI DEI LIPIDI • REAZIONI DI DETOSSIFICAZIONI 4 AVVIENE NEL RE USUO DOVE SONO PRESENTI LA FAMIGLIA DEI CITOCROMO Pli50 , QUESTI ENZIMI SONO PARTICOLARMENTE ABBONDANTI NEGU EPATOCITI E SI OCCUPANO della DETOSSIFICAZIONE DI SOSTANZE ENDOGENE ED ESOGENE , TRAMITE IL LEGAME SULLA MOLECOLA DA TRAITARE DI UN OH . L' ADDIZIONE DEL GRUPPO 04 RENDE IL COMPOSTO PIÙ SOLUBILE , FAVORENDO L' ESCREZIONE Della cellula . • DEPOSITO E Rinasco DI IONI (a " NEL CITOSOL PER STUDIARE IL RE VA ISOLATO , POICHÉ È FINTAMENTE INTRECCIATO CON ALTRI COMPONENTI DEL CITOSOL . QUANDO TESSUTI O cellule VENGONO ROITI PER omogeneizzazione, IL RE SI ROMPE IN FRAMMENTI E SI RISALDA IN PICCOLE vescicole , I MICROSOMI . MICROSOMI → RUVIDI : FACILMENTE OTENIBIU DA PORZIONI DI RE RUVIDO si USCI : NON SONO FACILMENTE OTENIBIU POICHÉ CONTENGONO FRAMMENTI { UESUCOUATI Della MEMBRANA PLASMATICA , Dell' APPARATO DEL GOLGI , DEGU ENDOSOMI E DEI MITOCONDRI SONO FACILMENTE ottenibile → cellule MUSCOLARI (RETICOLO SARCOPLASMATICO) da cellule recate d' ☒ "suo ↳ epatociti IL RE CAITURA PROTEINE DI 2 TIPI : • PROTEINE TRANSMEMBRANA : TRASLOCATE IN PARTE Attraverso LA MEMBRANA DEL RE E VI RIMANGONO IMMERSE • PROTEINE SOLUBILI IN ACQUA : TRASLOCATE COMPLETAMENTE ATTRAVERSO LA MEMBRANA DEL RE E RILASCIATE NEL SUO WME IMPORTAZIONE→ SEQUENZA SEGNALE DEL RE , GUIDATA AL RE DA : • SRP (PARTICELLA DI RICONOSCIMENTO DEL SEGNALE) : NELLA MEMBRANA DEL RE & E ' UN COMPLESSO RLBO NUCLEOPROTEICO FORMATO DA 6 SUBUNITA ' PROTEICHE E UNA MOLECOLA DI RNA . SI LEGA A VARIE SEQUENZE : LE S.S. HANNO VARIE SEQUENZE AMMINOACIDICHE ,MA Tutte HANNO 8 O PIÙ AMMINOACIDI NON POLARI AL CENTRO . IL SITO DI LEGAME DELLA 5.5. È UNA TASCA IDROFOBICA RIVESTITA DI METIONINE , LE QUALI SONO ABBASTANZA PLASTICHE GRAZIE Alle LORO CATENE UATERAU FLESSIBILI NON RAMIFICATE , E UA TASCA PUO' ACCOGLIERE 5.5. IDROFOBICHE CON SEQUENZA , FORMA E DIMENSIONE DIVERSA . VIA A ⟶ se ci sono più amminoacidi carichi positivamente che precedono il nucleo idrofobico della sequenza segnale VIA B ⟶ se ci sono più amminoacidi carichi positivamente successivamente al nucleo idrofobico della sequenza di inizio del trasferimento. Poiché la traslocazione non può iniziare prima che una sequenza di inizio del trasferimento fuoriesca dal ribosoma, la traslocazione della porzione N-terminale può avvenire soltanto dopo che questa porzione è stata sintetizzata. PROTEINE A PASSAGGI MULTIPLI CASO SEMPLICE: • Sequenza segnale interna funge da segnale di inizio della traslocazione • La traslocazione termina con una sequenza di stop CASO COMPLESSO: • Molte α-eliche idrofobiche attraversano la membrana Una seconda sequenza di inizio del trasferimento avvia la traslocazione più a valle lungo la catena fino all’arrivo della sequenza di stop causa il rilascio della catena. COME DISTINGUIAMO SEQUENZE DI INIZIO E DI STOP? È data dall’ordine in cui le sequenze sono disposte all’interno della catena. La ricerca di segmenti idrofobici viene fatta dall’SRP che procede dall’N-terminale verso il C-terminale, nella direzione in cui la proteina è sintetizzata. SRP riconosce il primo segmento idrofobico come INIZIO, il traslocatore dopo l’inizio riconosce il successivo segmento idrofobico come segnale di stop. MEMBRANA ASIMMETRICA DEL RE Le proteine di membrana vengono sempre inserite nel RE sul lato citosolico, e tutte le copie della stessa catena avranno lo stesso orientamento nel doppio strato, in modo da creare un’asimmetria. Quest’asimmetria si mantiene in tutti i processi di trasporto proteico. L’inserimento nel RE della proteina determina il suo orientamento in tutte le membrane. PROTEINE ANCORATE MEDIANTE LA CODA Si tratta di proteine di membrana ancorate mediante un’α-elica idrofobica transmembrana posta al C- terminale. Tra queste sono importanti le SNARE, che guidano il traffico vescicolare. Quando queste proteine si inseriscono nella membrana del RE, solo alcuni amminoacidi al C-terminale arrivano al lume del RE, mentre la maggior parte della proteina rimane nel citosol. • Un complesso solubile di preindirizzamento cattura l’α-elica idrofobica C-terminale quando esce dal ribosoma • Associazione a una ATPasi Get3 • Il complesso risultante interagisce con il complesso recettore Get1-Get2 (funziona come una macchina per inserire proteine nella membrana) • Get3 idrolizza il suo GTP e la proteina viene rilasciata dal recettore per essere inserita nella membrana • Il rilascio di ADP e il nuovo legame di ATP riportano Get3 nel citosol PROTEINE NEL LUME DEL RE: • Proteine residenti • Proteine in transito PROTEINE RESIDENTI: contengono un segnale di ritenzione nel RE di 4 amminoacidi al loro C-terminale. Alcune di queste proteine funzionano come catalizzatori che aiutano le molte proteine traslocate nel RE a ripiegarsi e ad assemblarsi correttamente. Un’importante proteina residente nel RE è la PDI (proteina disolfuro isomerasi) che catalizza l’ossidazione di gruppi sulfidrilici (SH) liberi su cisteine per formare legami disolfuro (S-S). i legami disolfuro vengono a formarsi solo nello spazio extracellulare, perché l’ambiente citosolico è molto riducente. Un altro esempio di proteina residente nel RE è la proteina chaperone BiP. BiP riconosce proteine ripiegate male, legandosi a sequenze esposte che generalmente dovrebbero essere interne. La BiP legata impedisce alla proteina di aggregarsi e la mantiene nel RE. BiP idrolizza ATP per trattenere e lasciare andare il suo substrato proteico in un ciclo dinamico. GLICOSILAZIONE Perché avviene la glicosilazione? • Per raggiungere un corretto ripiegamento nel RE • Per proteggere dall’attacco di proteasi • Permette lo svolgimento del controllo della qualità L’aggiunta covalente di zuccheri alle proteine è una delle funzioni biosintetiche principali del RE. MECCANISMO • Un’oligosaccaride precursore (composto da N-acetilglucosammina, mannosio e glucosio che contiene un totale di 14 zuccheri) viene trasferito al gruppo NH2 di una catena laterale di asparagina • Il trasferimento è catalizzato da un oligosaccaril trasferasi • L’oligosaccaride precursore viene mantenuto nel RE da una molecola lipidica: il dolicolo • il trasferimento all’asparagina bersaglio avviene dopo che l’amminoacido è emerso nel lume del RE • l’oligosaccaride precursore viene costruito sul dolicolo legato alla membrana e poi viene trasferito a una proteina • gli zuccheri vengono prima attivati nel citosol dalla formazione di UDP (intermedi nucleotide) • UDP poi dona lo zucchero al lipide (direttamente o indirettamente) • A metà processo l’oligosaccaride legato al lipide viene capovolto con l’aiuto di un trasportatore, passando così dal lato citosolico a quello luminale. Quando sono ancora nel RE, 3 glucosi e un mannosio vengono rimossi. Perché le proteine nel RE vengono glicosilate? SISTEMA DI CONTROLLO Studi su 2 proteine chaperone del RE: calnessina e calreticulina. FUNZIONE: esse si legano a lectine (carboidrati) o ad oligosaccaridi su proteine non completamente ripiegate trattenendole nel RE. Þ Calnessina e calreticulina riconoscono oligosaccaridi legati a N che contengono un singolo glucosio (e perciò legano proteine soltanto dopo che 2 dei 3 glucosi che vengono inizialmente attaccati sono stati rimossi da glicosidasi del RE). Questo glucosio viene posto dall’enzima glicosil trasferasi, che aggiunge glucosio ad oligosaccaridi che sono attaccati a proteine non ripiegate. Una proteina ben ripiegata è priva del 3° glucosio. Þ Riconosciuta la proteina cercano di aiutarla a raggiungere la giusta conformazione Þ Se la proteina è correttamente conformata subisce il taglio ed esce, altrimenti viene aggiunto altro glucosio finché non raggiunge la giusta conformazione. RETROTRASLOCAZIONE (2° sistema di controllo) Molte molecole proteiche (>80% per alcune proteine) traslocate nel RE non riescono a raggiungere il loro corretto ripiegamento, dunque vengono degradate nei proteasomi. Prima della degradazione bisogna distinguere la proteina mal ripiegata dagli intermedi di ripiegamento delle proteine appena sintetizzate (queste non vanno degradate): Þ Gli N-oligosaccaridi (oligosaccaridi legati a N) fanno da timer per misurare quanto a lungo una proteina è rimasta nel RE Þ Rimozione di un mannosio ad opera dell’enzima mannosidasi nel RE, e così crea una nuova struttura oligosaccaridica che è riconosciuta da lectine del lume del RE per essere degradata Þ Le proteine che si ripiegano ed escono dal RE più velocemente dell’azione della mannosidasi sfuggono alla degradazione ACCUMULO DI PROTEINE MAL RIPIEGATE RICORDA UPR: unfolded protein response. Si attiva in seguito ad accumulo di proteine mal ripiegate nel RE. Si occupa di ripristinare la funzione normale della cellula attraverso la riduzione della sintesi proteica ed incrementando la produzione di chaperoni molecolari. UPR inizia la sua attività dopo l’avvio di 3 specie solubili allo stress: Þ Perk (pancreatic ER kinase) Þ ATF6 (activating transcription factor 6) Þ IRE1 (inositol-requiring enzyme 1) La membrana plasmatica contiene un tipo diverso di traslocatore di fosfolipidi: ⟶ flippasi, appartenenti alla famiglia delle pompe di tipo P, riconoscono specificatamente quei fosfolipidi che contengono nei loro gruppi di testa amminoacidi liberi e li trasferiscono dal foglietto extracellulare a quello citosolico, utilizzando l’energia d’idrolisi dell’ATP. MECCANISMO FLIPPASI: flip-flop di fosfatidilserina e fosfatidiletanolammina dalla metà extracellulare a quella citosolica, creando il doppio strato asimmetrico ⟶ scramblasi: è attivata soltanto in alcune situazioni (es. apoptosi) ALTRI PRODOTTI DEL RE Þ CERAMIDE: condensazione della serina con un acido grasso per produrre sfingosina, ad essa viene aggiunto un secondo acido grasso per formare il ceramide (condensazione serina + acido grasso = sfingosina, sfingosina + acido grasso = ceramide). Il ceramide è esportato nel Golgi dove funge da precursore per la sintesi di 2 tipi di lipidi: o Glicosfingolipidi (ceramide + catene oligosaccaridiche) o Sfingomielina (ceramide + gruppi di testa di fosfocolina) Þ COLESTEROLO 1 CAPITOLO 13 ESOCITOSI → una vescicola di trasporto si fonde con la membrana. Il contenuto è versato nello spazio extracellulare, mentre la membrana della vescicola è in continuità con quella del compartimento. ENDOCITOSI → è un processo in cui una membrana plasmatica è internalizzata per formare una vescicola di trasporto (rimuovendo, così, componenti della membrana plasmatica). Il suo contenuto proviene dallo spazio extracellulare e li trasferisce ai compartimenti intracellulari (endosomi). VIA SECRETORIA → dal RE all’apparato del Golgi e alla superficie cellulare. Porta all’esterno VIA ENDOCITICA → dalla membrana plasmatica all’interno VESCICOLE DI TRASPORTO Compartimento cellulare a forma di sacca che gemma da una membrana e si fonde con un’altra in continuazione, trasportando componenti di membrana e molecole solubili presenti nel lume definite nel loro insieme cargo. Ciascuna vescicola di trasporto che gemma da un compartimento deve essere selettiva. Via endocitica, via secretoria, vie di recupero per il flusso a ritroso di componenti selezionati Le vescicole di trasporto si formano a partire da regioni specializzate e rivestite dalle membrane: gemmano come vescicole rivestite di proteine che ne ricopre la superficie citosolica. Il rivestimento è scartato quando una vescicola si deve fondere con una membrana bersaglio. Il rivestimento ha 2 principali funzioni: Þ Rivestimento interno: concentra proteine di membrana specifiche in una zona specializzata (che dà poi origine alla membrana della vescicola). Lo strato interno seleziona le molecole di membrana appropriate per il trasporto. Þ Rivestimento esterno: modella la vescicola, dando origine ad un reticolo curvo a forma di canestro che deforma la zona della membrana Vi sono 3 tipi di vescicole rivestite, ed ognuno è usato per passaggi di trasporto diversi: Þ Rivestite di clatrina: mediano il trasporto dall’apparato del Golgi, dalla membrana plasmatica e tra i compartimenti endosomiale Þ Rivestite di COPI (COP1): gemmano dal Golgi e regolano il trasporto da questo compartimento Þ Rivestite di COPII (COP2): gemmano dal RE e regolano il trasporto da questo compartimento 2 VESCICOLE RIVESTITE DI CLATRINA Costituite prettamente da clatrina. SUBUNITÀ DI CLATRINA → 3 catene polipeptidiche grandi + 3 catene polipeptidiche piccole, che insieme formano una struttura a 3 gambe chiamata trischelio. I trischeli di clatrina, in condizioni appropriate, si assemblano, in provetta, in tipiche gabbie poliedriche. Come già accennato prima, le vescicole hanno sia un rivestimento interno che un rivestimento esterno. RIVESTIMENTO INTERNO → è formato da proteine adattatrici. Ogni proteina adattatrice è diversa per una serie di recettori del cargo (recettori transmembrana che catturano molecole cargo solubili dentro la vescicola). Un esempio è dato dalla proteina adattatrice AP2: quando si lega ad un fosfoinositide (uno specifico lipide fosfatidilinositolo), altera la sua conformazione ed espone i siti di legame per i recettori del cargo sulla membrana. Le proteine adattatrici ancorano il rivestimento esterno alla membrana e concentrano proteine transmembrana che devono essere impacchettate nelle vescicole. RIVESTIMENTO ESTERNO → si assembla dando origine ad un reticolo curvo che modella la vescicola. Nel caso della membrana plasmatica, piatta e rigida (data la sua composizione lipidica ricca di colesterolo e la corteccia ricca di actina sottostante), la curvatura va introdotta da zero. Per questo motivo la formazione di vescicole rivestite di clatrina è coadiuvata da proteine con domini a forma di mezzaluna, i domini BAR. Sono formati da coiled coil che dimerizzano in moduli con una superficie interna carica positivamente, che interagisce elettrostaticamente con i gruppi di testa lipidici carichi negativamente per piegare la membrana. Più semplicemente: i domini BAR si legano alla membrana e le impongono la loro forma, interagendo elettrostaticamente con i gruppi di testa dei lipidi. Si pensa che queste proteine con dominio BAR aiutino AP2 ad avviare l’endocitosi mediata da clatrina, conformando la membrana plasmatica in modo tale da permettere la formazione della gemma rivestita da clatrina. MECCANISMI DI REGOLAZIONE PIP → (fosfoinositidi o fosfatidilinositolo fosfati) Molti tipi diversi di PIP sono localizzati in membrane e domini di membrane diverse, dove sono associati a eventi di trasporto vescicolare specifico. Poiché molte proteine nei trasporti vescicolari contengono domini che legano con alta specificità i gruppi di testa polari di specifici PIP, si può distinguere una forma fosforilata dall’altra. 1) FOSFOLIPIDI INOSITOLO → subiscono rapidi cicli di fosforilazione e defosforilazione nelle posizioni 3’, 4’ e 5’ del gruppo di testa del loro zucchero inositolo al fine di produrre vari tipi di PIP. Questi procesis avvengono grazie a specifiche chinasi e fosfatasi. In che modo sono coinvolti nella regolazione della formazione della vescicola? 5 o Motori proteici: guidano le vescicole lungo i filamenti di actina o lungo i microtubuli verso le loro membrane bersaglio o Proteine di attracco: attraverso il legame con Rab subiscono un cambiamento conformazionale che avvicina le 2 membrane (funzionano come “lenze da pesca”) MECCANISMO DI FUSIONE TRA LE MEMBRANE Dopo l’associazione con la membrana bersaglio, per scaricare il carico le 2 membrane devono fondersi. Il processo di fusione è catalizzato dalle proteine SNARE. Esistono 35 differenti SNARE nella cellula animal, ognuna associata a uno specifico organello delle vie secretoria o endocitica. Queste proteine transmembrana sono in serie complementari: Þ v-SNARE: presenti sulle membrane delle vescicole, sono costituite da una singola catena polipeptidica Þ t-SNARE: presenti sulle membrane bersaglio, sono costituite da 3 catene polipeptidiche Queste proteine sono costituite da domini elicoidali che quando sono abbastanza vicini si fondono per formare complessi trans-SNARE, che associa saldamente le 2 membrane, e allontanano le molecole d’acqua. La fusione è ritardata finché un segnale extracellulare specifico non provoca la secrezione. Le proteine Rab esercitano un ulteriore grado di controllo: le t-SNARE sono spesso associate a proteine inibitrici che devono essere rilasciate affinché le t-SNARE possano funzionare, così le proteine Rab e i loro effettori inducono il rilascio delle proteine che inibiscono le SNARE. In questo modo le proteine SNARE sono concentrate e attivate nella zona corretta della membrana, dove le proteine di attracco catturano le vescicole in arrivo. Le proteine Rab accelerano il processo in cui le SNARE appropriate presenti nelle 2 membrane possono accoppiarsi. Per mediare nuovi cicli, i complessi SNARE disassemblati da una proteina chiamata NFS: è un’ATPasi esamerica della famiglia delle AAA-ATPasi che usa l’energia d’idrolisi dell’ATP per districare le interazioni profonde fra i domini a elica delle proteine SNARE accoppiate. In tal modo SNARE non sono sempre attive e le membrane non possono fondersi appena entrano in contatto. Non è noto come sia controllata l’attività di NFS e non è noto neanche come le v-SNARE vengano selettivamente recuperate e riportate ai loro compartimenti di origine per essere riutilizzate in una nuova vescicola di trasporto. TRASPORTO VESCICOLARE RE-GOLGI Le vescicole coinvolte in questo tipo di trasporto sono rivestite da COP2 e gemmano a partire da regioni specializzare del RE, chiamate siti di uscita del RE, le quali sono prive di ribosomi. Uno dei recettori reclutato da COP2 è ERGIC-53 (ERGIC = Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment): Þ è una lectina che lega il mannosio di specifiche proteine Þ presenta una coda citosolica, riconosciuta da COP2 (RE → ERGIC) e da COP1 (a ritroso) 6 Þ poiché si lega al mannosio di fattori 5 e 8 della coagulazione, una mutazione di ERGIC causa una rara forma di emofilia Þ è una calcio dipendente: il rilascio della proteina all’ERGIC avviene grazie ad una minore concentrazione di calcio. BULK FLOW → proteine inserite in vescicole senza la mediazione di un recettore. Una volta gemmate dal RE e dopo aver perso il rivestimento, le vescicole si fondono tra loro mediante: Þ fusione omotipica: fusione di 2 membrane dello stesso compartimento Þ fusione eterotipica: fusione di 2 membrane di compartimenti diversi Le strutture che si formano dalla fusione sono detti gruppi vescicolari tubulari, e costituiscono un compartimento che è separato dal RE ed è privo di molte delle proteine che sono in funzione nel RE. I gruppi si muovono lungo i microtubuli dal RE verso il Golgi, dove si fondono. TRASPORTO RETROGRADO Dopo la formazione del gruppo vescicolare, da esso gemmano vescicole che hanno il compito di riportare al RE proteine sfuggite a recettori: queste vescicole sono rivestite da COP1. Le proteine da riportare indietro presentano specifiche sequenze segnale: Þ proteine di membrana residenti nel RE: 2 lisine + 2 amminoacidi qualunque al C-terminale. Tale sequenza è detta sequenza KKXX Þ proteine solubili residenti nel RE: contengono una sequenza Lys-Asp-Glu-Leu. Tale sequenza è detta sequenza KDEL Queste sequenze segnale sono complementari a specifici recettori che viaggiano con esse nella vescicola e successivamente la riportano. Ciò è possibile perché i recettori presentano nel reticolo bassa affinità per le sequenze segnale e viceversa, differenza garantita dal diverso pH (nei compartimenti del Golgi il pH è più basso, garantito dalle pompe H+). APPARATO DEL GOLGI È un compartimento cellulare formato da strutture appiattite racchiuse da membrana, le cisterne (pile del Golgi, costituite ognuna da 4-6 cisterne) Distinguiamo 2 importanti regioni all’interno del Golgi: Þ faccia CIS: faccia di entrata, verso il nucleo. È associata ad un compartimento specifico, composto da una rete di strutture tubulari e a cisterna interconnesse: il reticolo del CIS-Golgi (CGN), è un insieme di complessi di vescicole tubulari fuse che arrivano al RE. Le proteine e i lipidi entrano nel reticolo del CIS-Golgi ed escono dal TRANS-Golgi, diretti alla superficie cellulare o ad un altro compartimento, o essere riportate nel RE (senza entrare nel TRANS-Golgi). Þ faccia TRANS: faccia di uscita, verso la membrana plasmatica. Al suo interno distinguiamo una zona più statica, le cisterne mediali. È associata ad un compartimento specifico, composto da una rete di strutture tubulari e a cisterna interconnesse: il reticolo del TRANS-Golgi (TGN), qui le proteine possono andare avanti per essere smistate agli endosomi, alle vescicole secretorie, alla superficie cellulare, oppure essere riportate in un compartimento precedente. Queste 2 zone sono dinamiche per la continua gemmazione e fissione di vescicole. 7 FUNZIONE PRINCIPALE → generazione delle strutture oligosaccaridiche presenti nelle proteine mature. La principale maturazione delle proteine è legata alla modifica delle catene oligosaccaridiche legate ad N, aggiunte nel RE. 1. CIS-Golgi: riconoscimento del mannosio-6-fosfato e fosforilazione della catena 2. Cisterna CIS: rimozione di 3 mannosi 3. Cisterna mediale: aggiunta N-acetilglucosammina e rimozione di 2 mannosi 4. Cisterna TRANS: ad alcuni oligosaccaridi viene aggiunto acido sialico e galattosio 5. TRANS-Golgi: ad alcuni oligosaccaridi vengono aggiunti fosfati che insieme all’acido sialico incrementano la carica negativa Attraverso queste modificazioni, otteniamo diversi oligosaccaridi maturi: Þ Oligosaccaridi ad alto mannosio: rimozione di mannosio e aggiunta di N-acetilglucosammina. Poi vengono aggiunti altri 3 residui di mannosio. Þ Oligosaccaridi complessi: l’oligosaccaride originario legato a N aggiunto nel RE viene tagliato e vengono aggiunti ulteriori zuccheri (acido sialico, N-acetilglucosammina e galattosio). La N-glicosilazione promuove il ripiegamento delle proteine in 2 modi: Þ Ha un ruolo diretto nel rendere le proteine nella fase intermedia di ripiegamento più solubili, impedendone l’aggregazione Þ Le modificazioni sequenziali degli oligosaccaridi legati a N stabiliscono un “codice glucidico” che marca la progressione del ripiegamento della proteina e ne media il legame a proteine chaperone e a lectine (che partecipano allo smistamento delle proteine nel reticolo del TRANS-Golgi) Oltre all’N-glicosilazione, possiamo avere anche l’O-glicosilazione. Questo processo implica l’aggiunta di zuccheri all’ossidrile di catene laterali di treonine e serine (o alle catene laterali ossidrilate di proline o lisine per il collagene). O-GLICOSILAZIONE → PROTEOGLICANI → catene di glicosamminoglicani (lunghi polimeri non ramificati composti da unità disaccaridiche ripetute) vengono aggiunte su serine della proteina centrale. La differenziazione dei tipi di maturazione è possibile perché ogni reazione è enzimatica; quindi, si verifica solo quando si crea il preciso complesso sito attivo-substrato. La gradualità è garantita dalle differenti cisterne, che presentano differenti enzimi. Per spiegare il mantenimento degli enzimi nelle cisterne sono stati ipotizzati 2 modelli: Þ Modello di maturazione delle cisterne: le cisterne del Golgi vengono viste come strutture dinamiche che maturano, insieme al loro carico, dallo stadio precoce a quello tardivo acquisendo e poi perdendo specifiche proteine residenti del Golgi. Dunque, nuove cisterne CIS si formano continuamente da gruppi vescicolari tubulari che arrivano al RE e maturano progressivamente per diventare una cisterna mediale e poi una cisterna TRANS: una cisterna quindi si muove lungo la pila del Golgi con il carico nel suo lume. 10 VIA CHE PORTA LE IDROLASI LISOSOMIALI DAL TGN (TRANS-GOLGI NETWORK) AI LISOSOMI Gli enzimi vengono inizialmente consegnati agli endosomi in vescicole di trasporto che gemmano dal TGN, prima di giungere agli endolisosomi e ai lisosomi. Vescicole gemmano dal TGN → arrivano agli endosomi → endolisosomi → lisosomi In che modo le idrolasi lisosomiali sono riconosciute e selezionate nel TGN con l’accuratezza necessaria? Nelle cellule animali le idrolasi hanno un marcatore unico sottoforma di gruppi di mannosio-6-fosfato (M6P), che sono aggiunti agli oligosaccaridi legati a N di questi enzimi lisosomiali solubili mentre passano attraverso il lume del CIS-Golgi. Þ Le idrolasi sono marcate da mannosio-6-fosfato (M6P) Þ M6P viene riconosciuto da recettori proteici di M6P transmembrana (presenti nel TGN) Þ I recettori proteici si legano alle idrolasi lisosomiali sul lato luminale della membrana e a proteine adattatrici presenti nei rivestimenti di clatrina in assemblaggio sul lato citosolico Þ I recettori aiutano a impacchettare le idrolasi in vescicole rivestite di clatrina che gemmano dal TGN e trasferiscono il contenuto in endosomi precoci Þ Il recettore di M6P lega M6P a pH 6,5-6,7 nel lume del TGN e lo rilascia a pH 6 (che è il pH nel lume degli endosomi) Þ Dopo la consegna del recettore, le idrolasi lisosomiali si dissociano dal recettore di M6P Þ Il recettore di M6P viene recuperato in vescicole di trasporto che gemmano dagli endosomi, le quali sono rivestite di retromero (un complesso proteico di rivestimento specializzato per il trasporto dagli endosomi al TGN, che riporta i recettori al TGN per essere riutilizzati) Il trasporto in entrambe le direzioni richiede segnali nella codaa citoplasmatica del recettore di M6P che dirigono il trasporto di questa proteina agli endosomi o indietro al TGN. Questi segnali sono riconosciuti dal complesso del retromero che recluta recettori di M6P all’interno di vescicole di trasporto che gemmano dagli endosomi. 11 MALATTIE DA DEPOSITO LISOSOMIALE Sono causate da difetti genetici che colpiscono una o più idrolasi lisosomiali. Il difetto porta all’accumulo di substrati indigeriti nei lisosomi, con gravi conseguenze patologiche, più spesso nel sistema nervoso. Nella maggior parte dei casi c’è una mutazione in un gene strutturale che codifica una singola idrolasi lisosomiale. Þ Malattia di Hurler: l’enzima necessario per la demolizione di alcuni tipi di glicosamminoglicani è difettoso o assente. Þ Malattia da inclusioni cellulari (I-cell disease): è la forma più grave di malattia da deposito lisosomiale. È un disordine metabolico ereditario raro in cui quasi tutti gli enzimi idrolitici sono assenti nei lisosomi di molti tipi cellulari e i loro substrati indigeriti si accumulano nei lisosomi, che di conseguenza formano grosse inclusioni nelle cellule. La patologia è complessa e colpisce tutti gli organi, l’integrità dello scheletro e lo sviluppo mentale: gli individui affetti sopravvivono raramente oltre i 6-7 anni. La malattia è dovuta al difetto di un singolo gene, è recessiva, e tute le idrolasi assenti nei lisosomi si trovano nel sangue. Le idrolasi sono secrete invece di essere trasportate ai lisosomi perché non riescono a essere smistate in modo appropriato nell’apparato del Golgi. Lo smistamento sbagliato è dovuto a una GlcNAc (N-acetilglucosammina) fosfotrasferasi difettosa o assente. Poiché gli enzimi lisosomiali non sono fosforilati nel reticolo del CIS-Golgi, non sono segregati dai recettori di M6P nelle vescicole di trasporto appropriate nel TGN e vengono invece portati sulla superficie cellulare e secreti. ENDOCITOSI Tale processo è caratterizzato dalle vie che portano dalla superficie cellulare verso l’interno. Nell’endocitosi il materiale da ingerire è avvolto da una porzione di membrana plasmatica che prima si invagina e genera la vescicola endocitica. ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI 1. Nella maggior parte dei casi il processo inizia a partire da fosse rivestite di clatrina, che sono zone specializzate della membrana. Ma si possono formare anche come caveole (è un microdominio presente nelle membrane biologiche caratterizzato da una peculiare composizione lipidica. In particolare, questa regione è ricca in colesterolo, sfingolipidi e proteine di membrana ancorate per mezzo di GPI. Sono strutture statiche, ma possono distaccarsi e agire da vescicole endocitiche per trasportare il carico agli endosomi precoci o alla membrana plasmatica sul lato opposto di una cellula polarizzata), formate da proteine strutturali dette caveoline (proteine 12 integrali di membrana che si inseriscono ognuna su un’ansa idrofobica nel versante citosolico della membrana senza attraversarla) 2. Formazione del complesso ligando-recettore-proteina adattatrice: ESEMPIO: la maggior parte del colesterolo è trasportata nel sangue sottoforma di LDL (lipoproteine a bassa densità). Quando una cellula ha bisogno di colesterolo per la sintesi della membrana, produce recettori transmembrana per le LDL e li inserisce nella membrana plasmatica, dove i recettori delle LDL diffondono fino ad associarsi a fosse rivestite di clatrina che si stanno formando. La tipica proteina adattatrice AP2 si lega al segnale citoplasmatico dei recettori delle LDL, dopo un cambio di conformazione causato dal legame con il PI (4,5)P2 (fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato) sulla membrana plasmatica. AP2 recluta la clatrina per iniziare l’endocitosi. Þ Fosse rivestite di clatrina si distaccano continuamente formando vescicole rivestite Þ Distacco del rivestimento di clatrina Þ Le vescicole portano il loro contenuto agli endosomi precoci Þ A basso pH degli endosomi precosi, le LDL si distaccano dai recettori delle LDL Þ Le LDL vengono portate attraverso di endosomi tardivi ai lisosomi. Nei lisosomi gli esteri del colesterolo delle particelle di LDL sono idrolizzati a colesterolo libero, che ora è disponibile per la sintesi di nuove membrane da parte della cellula. 3. Il recettore con il suo cargo viene internalizzato attraverso l’invaginazione di una porzione di membrana e la formazione della vescicola 4. Dopo aver perso il rivestimento di clatrina, la vescicola si fonde con l’endosoma precoce. Questo è caratterizzato da proteine Rab sulla superficie: Þ Rab5: dominio vacuolare Þ Rab4 e Rab11: dominio tubulare All’interno dell’endosoma precoce il basso pH porta al rilascio dei recettori. Dai domini tubulari gemmano vescicole di recupero che portano i recettori alla membrana plasmatica per poter essere riutilizzate. ESEMPIO: il recettore della trasferrina segue una via di recupero simile al recettore delle LDL, ma, diversamente da questo, recupera anche il suo ligando. La trasferrina è una proteina solubile che trasporta ferro nel sangue. I recettori di superficie della trasferrina portano trasferrina con ferro legato agli endosomi precoci tramite endocitosi mediata da recettore. Il pH basso nell’endosoma induce la trasferrina a rilasciare il ferro legato, trasformandosi in trasferrina libera (apotrasferrina) che resta legata al recettore. Il complesso recettore-apotrasferrina viene mandato alla membrana plasmatica, dove a pH neutro l’apotrasferrina si dissocia dal suo recettore e inizia nuovamente il ciclo. Nota: DOWN REGULATION → meccanismo cellulare che riguarda la disponibilità dei recettori per il ligando. È un evento in cui dei recettori non sono disponibili. Alcuni recettori eseguono il loro compito internalizzandosi o inattivandosi. 5. MATURAZIONE DELL’ENDOSOMA Þ L’endosoma in maturazione, chiamato anche corpo multivescicolare, migra lungo i microtubuli verso l’interno della cellula, perde i tubuli e le vescicole di membrana che riportano materiale alla membrana plasmatica e al TGN, e ricevono proteine lisosomiali di nuova sintesi Þ Modificazione delle molecole sul lato citosolico della membrana dell’endosoma (Rab5 → Rab7), portando a un cambiamento delle caratteristiche funzionali dell’organello Þ Pompe di tipo V nella membrana dell’endosoma pompano H+ dal citosol nel lume dell’endosoma e acidifica l’organello. Il pH è molto importante per differenziare l’endosoma precoce, tardivo e lisosoma, in quanto dal pH dipende l’attivazione delle idrolasi Nel caso in cui alcuni recettori devono essere degradati insieme al loro cargo, essi vengono marcati con etichette di ubiquitina e riconosciute dai complessi ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport, complesso di smistamento dell’endosoma necessario per il trasporto) reclutati dal citosol i quali li 15 VIE DI SMISTAMENTO DELLE PROTEINE: Þ Proteine marcate con M6P vanno verso i lisosomi Þ Proteine che seguono la via secretoria regolata Þ Proteine che seguono la via secretoria costitutiva. Essa rappresenta una via di default, poiché l’ingresso delle proteine in questa via non richiede un segnale particolare. VIA SECRETORIA REGOLATA I prodotti da esocitare sono contenuti in vescicole secretorie che si formano dal TGN, e rilasciano il loro contenuto (una piccola molecola o una proteina, come un ormone o un enzima digestivo) all’esterno della cellula in risposta a specifici segnali. Le proteine secretorie contengono tutte un segnale che le concentra in zone del TRANS-Golgi dove formano aggregati proteici (internalizzati in vescicole secretorie). Quando le vescicole maturano, si fondono le une con le altre e il loro contenuto diventa concentrato, probabilmente come risultato sia del continuo recupero della membrana che è riciclata al TGN, sia della progressiva acidificazione del lume della vescicola, che deriva dalla progressiva concentrazione di pompe ATPasi di tipo V nella membrana della vescicola che acidificano tutti gli organelli sia endocitici che esocitici. Le proteine secretorie e di membrana si concentrano man mano che si muovono dal RE attraverso l’apparato del Golgi a causa di un esteso processo di recupero retrogrado mediato da vescicole di trasporto rivestite di COP1 che riportano indietro nel RE le proteine solubili lì residenti ed escludono le proteine secretorie e di membrana. Durante la maturazione delle vescicole, molti ormoni e neuropeptidi sono sintetizzati come precursori inattivi (l’attivazione avviene tramite il taglio proteolitico del pro-peptine all’N-terminale). Queste proteine sono sintetizzate come pre-pro-proteine, in cui in pre-peptide è costituito dal peptide segnale del RE (che è 16 stato rimosso in precedenza nel RE ruvido) a cui si legano le SRP. Molte proteine necessitano della modificazione proteolitica perché sennò sarebbero troppo brevi per contenere il segnale necessario al trasporto cotraduzionale nel lume del RE o per includere il segnale necessario per essere impacchettate in vescicole secretorie. IMPORTANTE FUNZIONE → avvento della membrana plasmatica tramite la fusione di vescicole Una volta caricata, la vescicola secretoria deve raggiungere il sito di secrezione, che in alcune cellule è molto lontano dal TGN → le cellule nervose sono un chiaro esempio: le proteine secretorie sono prodotte e impacchettate in vescicole secretorie nel corpo cellulare e devono poi viaggiare lungo l’assone fino alle terminazioni nervose (possono essere lontane anche 1 metro), e sono i motori proteici a spingere le vescicole lungo i microtubuli assonali. Un segnale di secrezione può essere un impulso nervoso elettrico (un potenziale d’azione). Le cellule nervose contengono 2 tipi di vescicole secretorie: Þ Vescicole secretorie a nucleo denso (via secretoria regolata) Þ Vescicole sinaptiche Le vescicole sinaptiche immagazzinano piccoli neurotrasmettitori che mediano la segnalazione rapida dalla cellula alla sua cellula bersaglio a livello delle sinapsi chimiche: potenziale d’azione → terminazione nervosa → afflusso di Ca2+ → fusione delle vescicole sinaptiche con la membrana plasmatica → rilascio del contenuto nello spazio extracellulare prima della fusione abbiamo una fase di preparazione: Þ Le SNARE sono parzialmente accoppiate e le loro eliche non sono completamente avvolte nel fascio finale a 4 eliche (richiesto per la fusione) poiché sono bloccate dalle proteine complessine in questo stadio metastabile Þ Un aumento del Ca2+ citosolico innesca il legame della sinaptotagmina ai fosfolipidi e alle SNARE, facendo spostare le complessine Þ Quando i fasci di SNARE si avvolgono completamente, si apre un poro di fusione e il neurotrasmettitore viene rilasciato Poiché è necessario che gli impulsi nervosi siano continui, le vescicole sinaptiche non possono attraversare tutto il processo di formazione a partire da endosomi precoci. Per questo motivo le vescicole sinaptiche si formano a seguito di un riciclo locale della membrana plasmatica presinaptica nelle terminazioni nervose, e la maggior parte delle vescicole endocitiche, anziché fondersi con gli endosomi, si riempiono immediatamente di trasmettitori per diventare vescicole sinaptiche. CELLULE POLARIZZATE Le cellule nei tessuti sono in gran parte polarizzate e hanno 2 o più domini della membrana plasmatica molecolarmente e funzionalmente distinti. Ciò solleva un problema: come deve essere organizzato il trasporto dall’apparato del Golgi per mantenere le differenze fra un dominio e l’altro della superficie della cellula? Una cellula epiteliale tipica ha: Þ Un dominio apicale: guarda il lume di una cavità interna oppure guarda l’esterno. Spesso ha caratteristiche specializzate come ciglia o un orletto a spazzola di microvilli. È ricca di glicosfingolipidi, che aiutano a proteggere questa superficie esposta a lesioni. Þ Un dominio basolaterale: copre il resto della cellula. È separato dal dominio apicale da giunzioni strette, che impediscono a proteine e lipidi (nel foglietto esterno del doppio strato lipidico) di diffondere fra i 2 domini, così da mantenere composizioni diverse. 17 Il trasporto di vescicole è diretto solo ad uno dei 2 domini. Pertanto, le cellule presentano sistemi per digerire vescicole coi carichi diversi verso domini differenti, dovuti principalmente a segnali di smistamento presenti nella coda citosolica delle proteine di membrana da trasportare. (zona in cui la membrana interna corre parallela alla membrana esterna, tra le creste). La presenza delle creste aumenta notevolmente la superficie di membrana, che arriva a costituire circa 1/3 delle membrane della cellula, disponibile per la fosforilazione ossidativa. Questa membrana è ricca di ATP sintasi e di complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni coinvolti nella produzione di ATP, e i grandi complessi proteici della catena respiratoria. È la membrana biologica a più alta densità di proteine (25% di lipidi e 75% di proteine). Þ Giunzioni delle creste: punti di unione tra i due domini, formano degli stretti tubi o fessure di membrana. Dispongono di complessi proteici che costituiscono una barriera di diffusione per le proteine di membrana specifiche dei due domini, e vengono segregate tra le 2 regioni della membrana interna. Matrice mitocondriale: è la componente principale che svolge il lavoro nel mitocondrio. Contiene gli enzimi coinvolti nel ciclo dell’acido citrico. I mitocondri possono usare sia piruvato sia acidi grassi come combustibile. Þ Il piruvato deriva dal glucosio Þ Gli acidi grassi derivano dai grassi Piruvato e acidi grassi sono trasportati attraverso la membrana mitocondriale interna da proteine di trasporto specializzate e poi convertiti in acetil-CoA. Þ I gruppi acetile vengono ossidati nella matrice attraverso il ciclo dell’acido citrico (o ciclo di Krebs) producendo CO2 come prodotto di rifiuto e NADH e FADH2 come trasportatori di elettroni Þ Anche se il ciclo di Krebs fa parte del metabolismo aerobico NON utilizza O2, richiesto invece nel passaggio finale del metabolismo ossidativo Þ In questa parte, gli elettroni passano attraverso la catena respiratoria nella membrana mitocondriale interna Þ Questi elettroni, portati per la maggior parte da NADH, si combinano con O2 per formare acqua Þ L’energia rilasciata durante la serie di trasferimenti da NADH a O2 genera un gradiente elettrochimico, tramite pompaggio di ioni H+ nello spazio intermembrana, che guida la conversione di ADP+Pi (ADP+fosfato) in ATP. Il movimento di ioni H+ attraverso la membrana ha 2 conseguenze principali: 1. Viene generato un gradiente di pH attraverso la membrana mitocondriale interna, con un pH più alto nella matrice e più basso nello spazio intermembrana 2. Viene generato un gradiente di voltaggio attraverso la membrana mitocondriale interna, creando un potenziale di membrana con il lato verso la matrice negativo e quello dello spazio della cresta positivo La differenza di pH rinforza l’effetto del potenziale di membrana e insieme costituiscono il gradiente elettrochimico. Questo gradiente produce una forza motrice protonica, che tende a portare indietro nella matrice gli H+. il gradiente elettrochimico spinge non solo la sintesi di ATP ma anche il trasporto di molecole selezionate come alcune di provenienza citoplasmatica. È presente DNA mitocondriale correlato alla macchina di biosintesi delle proteine. Come si presenta: Le membrane mitocondriali sono particolarmente dinamiche e plastiche, cambiano forma, si dividono e si fondono continuamente. In base alle necessità della cellula, le membrane mitocondriali possono presentarsi come organelli multipli (ad esempio durante la divisione cellulare) fino ad arrivare ad un singolo organello altamente ramificato detto reticulum. Questa plasticità è garantita da due processi: Þ Fusione: la fusione delle due membrane mitocondriali avviene separatamente ma in processi sequenziali e coordinati. La fusione della membrana esterna avviene grazie ad una GTPasi della membrana esterna (Mitofusina Mfn), che forma un complesso contenente subunità ancorate alle due membrane che devono fondersi. La fusione richiede GTP e l’energia derivata dal gradiente protonico. Subito dopo la fusione della membrana esterna, avviene attraverso un meccanismo simile anche quella della membrana interna, guidata dalla proteina della membrana interna OPA1 la quale richiede GTP e la componente elettrica del potenziale di membrana. Ha un effetto antiapoptotico in quanto garantisce il sequestro di citocromo C. Þ Fissione: avviene contemporaneamente per le due membrane grazie alla proteina DRP1, della famiglia delle dinamine. Posssiede un dominio che la assicura alla membrana e un dominio GTP- asico. La dinamina è assemblata in oligomeri elicoidali che si avvolgono intorno alla doppia membrana del mitocondrio causandone un restringimento. I due foglietti della membrana interna che a questo punto si trovano in contatto si fondono per sigillare la strozzatura. L’idrolisi di GTP provoca un cambiamento conformazionale nella dinamina che fornisce la forza motrice necessaria per separare le membrane mitocondriali interna es esterna in un unico passaggio. NB: un’elevata frammentazione delle membrane mitocondriali corrisponde ad una situazione di stress della cellula. Interazioni I mitocondri interagiscono con gli altri sistemi di membrane, soprattutto con il reticolo endoplasmatico. Possiamo individuare infatti molti siti di contatto tra i due sistemi di membrane in cui i tubuli del RE si avvolgono intorno ai mitocondri. In queste zone viene reclutato il DPR1. Si crede che queste zone di contatto facilitino gli scambi tra RE e mitocondri, specialmente di ioni calcio e di lipidi per le membrane. Spesso nelle regioni della membrana mitocondriale in contatto con il RE sono presenti enzimi utili per l’adattamento dei lipidi di membrana prodotti dal reticolo. La dinamicità della rete mitocondriale e del reticolo aumenta anche le probabilità di contatto tra le due strutture. SITI DI CONTATTO CON I MICROTUBULI: la loro associazione determina il loro orientamento e distribuzione. Perciò i mitocondri in cellule molto polarizzate possono percorrere lunghe distanze, perché vengono spinti lungo il citoscheletro microtubulare. Genoma mitocondriale A sostegno della teoria endosimbiontica, vi è l’evidenza che il mitocondrio presenta un proprio genoma. Nelle cellule di mammifero il genoma mitocondriale rappresenta meno dell’1% del genoma cellulare. Þ Si presenta come un anello circolare costituito da circa 15000 basi che costituiscono 37 geni: 13 di questi sono codificanti per proteine idrofobiche dei complessi della catena respiratoria e dell’ATP sintasi, il resto sono codificanti per molecole coinvolte nella sintesi di queste proteine. Questo perché i processi di duplicazione, trascrizione e sintesi proteica del DNA mitocondriale avvengono all’interno della matrice stessa. Þ Tutto il genoma è codificante (non sono presenti introni) Þ ci sono solo 22 tRNA, le regole di accoppiamento sono meno rigide per cui molti t-RNA riconoscono uno qualunque dei quattro nucleotidi in terza posizione del codone, inoltre quattro dei 64 codoni hanno significati diversi rispetto al genoma nucleare. Þ C’è un margine di mutazioni circa 100 volte maggiore rispetto al DNA nucleare Queste leggere variazioni sono rese tollerabili dal fatto che il numero di proteine codificate è davvero molto limitato. Il genoma mitocondriale è ereditato per via materna, questo perché durante la maturazione degli spermatozoi il DNA viene degradato e inoltre i mitocondri paterni vengono riconosciuti dalla cellula fecondata ed eliminati tramite autofagia (ubiquitazione + invio ai lisosomi). Il mitocondrio, però, svolge moltissime funzioni e per questo necessita di moltissime proteine, la maggior parte delle quali sono codificate del DNA nucleare (circa il 95%). Circa 1000 proteine mitocondriali sono quindi sintetizzate sui ribosomi nel citosol e vengono successivamente trasportate nell’organello attraverso le proteine mitocondriali traslocasi TOM (esterna) e TIM (interna) MALATTIE GENETICHE MITOCONDRIALI Il genoma mitocondriale è soggetto a molte mutazioni, è quindi comune che un individuo presenti una popolazione mista di genomi mitocondriali normali e mutanti che viene trasferita ai figli. Nel momento in cui il processo di segregazione mitotica porta ad una maggioranza di genoma mutante si presenta una malattia mitocondriale. Ovviamente queste malattie colpiscono prevalentemente tessuto muscolare e nervoso, tessuti ad alta richiesta energetica e sono trasmesse per via materna in maniera non mendeliana. Considerato che molte proteine mitocondriali sono prodotte nel nucleo, alcune malattie mitocondriali sono di tipo mendeliano. Atrofia ottica dominante: porta alla perdita progressiva di un tipo particolare di cellule della retina (cellule ganglionari retiniche) responsabili della trasmissione delle immagini dall’occhio alla porzione del cervello reputata alla loro elaborazione. Meccanismo di produzione dell’energia: Meccanismo chemiosmotico: la formazione di legami chimici in cui viene accumulata l’energia (quelli che sintetizzano l‘ATP) è collegata al trasporto di membrana. Questo meccanismo si concretizza nella presenza di due sistemi di organizzazione nella membrana interna: catena di trasporto degli elettroni e ATP sintasi. Il trasferimento di elettroni lungo la catena respiratoria è accompagnato dal pompaggio di H+ attraverso la membrana. Questo pompaggio crea una differenza di concentrazione sui 2 versanti. A causa del gradiente, gli H+ tendono a rientrare, ma per farlo necessitano di ATP sintasi. Le proteine della catena di trasporto si dispongono su entrambi i lati delle creste in modo da permettere la diffusione di protoni lungo la membrana verso il crinale della cresta, dove è concentrata la maggiore quantità di ATP sintasi In questo modo i protoni vengono intrappolati all’interno delle creste per massimizzare il gradiente protonico (i protoni nello spazio intermembrana diffonderebbero nel citosol a causa della presenza di numerose porine) CATENA DI TRASPORTO DEGLI ELETTRONI Breve quadro della respirazione cellulare: Il glucosio che entra nella cellula viene degradato a piruvato tramite la glicolisi con la produzione netta di due molecole di ATP Il piruvato entra nel mitocondrio e subisce decarbossilazione ossidativa: viene trasformato in acetil CoA con la liberazione di CO2. Nel ciclo dell’acido citrico viene rilasciata ulteriore CO2 e si liberano elettroni che vengono recuperati dal NAD+ e dal FAD che si riducono a NADH e FADH2 e vengono poi consegnati alla catena. Il trasferimento di elettroni lungo la catena avviene spontaneamente perché ogni componente possiede un’affinità per gli elettroni maggiore rispetto al precedente e minore rispetto al successivo: • Il NADH possiede affinità minore rispetto agli altri > è un forte donatore di elettroni • l’O2 possiede la massima affinità > è un potente accettore. Ciò provoca un cambiamento conformazionale delle subunità beta dello statore, le quali si legano ad ADP e Pi. Un ulteriore cambiamento conformazionale indirizza le subunità a catalizzare il legame ADP+Pi e a sintetizzare ATP. L’ossidazione completa di una molecola di glucosio porta alla formazione di circa 30 molecole di ATP L’efficiente conversione di ADP in ATP mantiene un’elevata concentrazione di quest’ultimo rispetto al precedente. Per questo motivo l’idrolisi dell’ATP porta ad una grande variazione favorevole di energia libera che viene utilizzata per dirigere molte altre reazioni chimiche nella cellula che altrimenti non potrebbero avvenire. L’ATP sintasi funziona anche in senso opposto idrolizzando ATP e trasportando protoni dalla matrice allo spazio intermembrana. Tutto ciò è stato verificato sperimentalmente attraverso il GFP che è una proteina fluorescente CAPITOLO 16 CITOSCHELETRO È un sistema di filamenti da cui dipendono le funzioni spaziali e meccaniche della cellula. È un sistema dinamico ed adattabile, ma dà vita anche a strutture stabili. FUNZIONI Þ Movimenti intracellulari degli organelli e delle vescicole Þ Riposizionamento dei compartimenti cellulari Þ Segregazione dei cromosomi nel corso di mitosi e meiosi Þ Direzionalità dei movimenti di trasporto cellulare (polarità cellulare) Þ Adesione cellula-cellula e cellula-matrice Þ Determinazione della forma della cellula Le diverse funzioni del citoscheletro si basano sul comportamento di 3 famiglie di filamenti proteici: Þ Filamenti di actina: determinano la forma della superficie della cellula e sono necessari per la locomozione dell’intera cellula Þ Microtubuli: sono costituiti da una struttura cilindrica cava all’interno fatta da tubulina. determinano le posizioni degli organelli racchiusi da membrana, dirigono il trasporto intracellulare e formano il fuso mitotico che segrega i cromosomi durante la divisione cellulare. Sono capaci, dunque, di riorganizzarsi rapidamente e possono formare ance ciglia e flagelli. Þ Filamenti intermedi: forniscono la forza meccanica, compongono in buona parte la lamina nucleare (un reticolo che sostiene la membrana interna del nucleo), tengono unite le cellule epiteliali tramite l’interazione con i desmosomi e permettono anche la formazione di capelli e unghie (cheratina). Queste 3 famiglie di filamenti proteici derivano dalla polimerizzazione di subunità proteiche tenute insieme da legami non covalenti. Tutte queste strutture, inoltre, condividono la grande dinamicità e adattabilità ai cambiamenti, che li porta a cambiare o a persistere a seconda delle necessità. ACTINA I filamenti di actina sono situati sotto la membrana plasmatica della cellula, in una zona chiamata cortex cellulare. FUNZIONI Þ conferisce resistenza e forma sottile al doppio strato lipidico Þ costituiscono strutture per la locomozione della cellula, che possono essere: o Dinamiche: lamellopodi e filopodi, che permettono alla cellula di muoversi o Stabili: permettono alla cellula di aggrapparsi a un substrato sottostante e fanno sì che il muscolo possa contrarsi. Costituiscono le stereociglia (presenti sulle cellule capellute dell’orecchio: i fasci stabili di actina si inclinano come sbarre rigide in risposta al suono) e i microvilli (presenti sulla superficie delle cellule epiteliali intestinali: aumentano l’area della superficie apicale della cellula per aumentare l’assorbimento di nutrienti). SUBUNITÀ I filamenti di actina sono costituiti da subunità di actina globulare, l’Actina G: Þ Polipeptide di 375 amminoacidi Þ Ha una struttura asimmetrica: i filamenti sono polari e hanno delle estremità strutturalmente diverse. Un’estremità cresce più lentamente (estremità meno o a punta) e una che cresce più velocemente (estremità più o a spina). Presenta una fessura con un sito di legame per ATP o ADP, rivolta verso l’estremità meno. Þ Forma interazioni testa-coda con altre subunità identiche per formare un’elica destrorsa, attraverso il processo di polimerizzazione, chiamata actina filamentosa o actina F Le sequenze amminoacidiche di actine di specie eucariotiche diverse sono di solito identiche al 90%, ma piccole variazioni nella sequenza possono causare notevoli differenze funzionali. Nei vertebrati ci sono 3 isoforme di actina: Þ α-actina, espressa solo nelle cellule muscolari Þ β-actina e γ-actina si trovano insieme in quasi tutte le cellule non muscolari POLIMERIZZAZIONE Þ Fase di latenza: l’assemblaggio delle subunità avviene lentamente, perché deve avvenire la nucleazione (formazione di un piccolo aggregato iniziale di subunità che è stabilizzato da molti contatti subunità-subunità e può allungarsi tramite l’aggiunta di altre subunità: un dimero non è stabile, un trimero è stabile). L’instabilità dei piccoli nuclei di actina è una barriera cinetica alla nucleazione, che determina questa fase di latenza durante la quale non si osservano filamenti, però viene superata da alcuni aggregati che passano ad una forma più stabile e danno il via alla nucleazione e quindi all’allungamento del filamento. Þ Fase di allungamento: subunità si aggiungono alle estremità del filamento più velocemente di quanto si dissociano. La velocità di aggiunta delle subunità è proporzionale alla concentrazione di actina G libera nell’ambiente (Kon), mentre la velocità di dissocciazione dell’actina è costante (Koff) che non dipende dalla concentrazione. Man mano che le subunità libere si esauriranno, la velocità di crescita diminuirà sempre fino alla velocità di dissociazione. Þ Fase di equilibrio: la velocità di aggiunta di actina è uguale alla velocità di dissociazione di actina. In tal modo, anche se vi è un flusso di subunità, la lunghezza del filamento è costante. La concentrazione di actina che resta libera in questa fase di equilibrio è detta concentrazione critica (CC). PROTEINE CHE TAGLIANO I FILAMENTI Þ Gelsolina: attivata da alti livelli di ioni Ca2+, taglia i filamenti di actina creandone di più piccoli, che possono andare incontro a depolimerizzazione o rapida crescita a seconda delle proteine accessorie presenti Þ Cofilina (o fattore depolimerizzante dell’atina): costringe il filamento ad avvolgersi più strettamente, causando un indebolimento di contatti tra le subunità e provocando quindi una depolarizzazione. Si lega più spesso a filamenti di actina che contengono ADP, ovvero i filamenti più vecchi. L’azione della cofilina può essere contrastata da quella della tropomiosina. COMPLESSI DI ACTINA Þ Reti dendritiche: ARP 2/3 Þ Fasci: filamenti formati dalle formine Þ Strutture a rete PROTEINE CHE FORMANO FASCI Þ Fimbrina: impedisce l’unione al fascio formato dalla miosina II, poiché la fimbrina crea un fascio così stretto che non ha proprietà contrattile Þ %-actinina: crea un fascio meno compatto di quella della fimbrina; quindi, vi è possibilità di inserzione della miosina II (funzione contrattile). Queste 2 proteine hanno funzioni che si escludono a vicenda PROTEINE CHE FORMANO STRUTTURE A RETE Þ Strutture compatte come la filamina: promuova la formazione di un gel lasso e molto viscoso fissando insieme 2 filamenti di actina all’incirca ad angolo retto. I gel di actina formati da filamina sono necessari alle cellule per estendere i sottili foglietti di membrana chiamati lamellopodi, che le aiutano a strisciare su superfici solide. Le filamine interagiscono con un gran numero di proteine cellulari con grande diversità funzionale, che comprendono i recettori di membrana per le molecole di segnalazione. Le filamine possono agire anche da proteine impalcatura nella segnalazione in quanto connettono e coordinano molti processi cellulari diversi con il citoscheletro di actina. Þ Spectrina: proteina lunga e flessibile composta da 4 catene polipeptidiche allungate (2 subunità α e 2 subinità β). È stata identificata per la prima volta nel globulo rosso, e in questa cellula si trova appena sotto la membrana plasmatica, dove forma una rete bidimensionale tenuta insieme da brevi filamenti di actina, le cui lunghezze sono regolate da proteine cappuccio a ciascuna estremità. La spectrina collega questa rete alla membrana plasmatica perché ha siti di legame separati per proteine periferiche di membrana, che sono esse stesse posizionate vicino al doppio strato lipidico da proteine integrali di membrana. La rete che ne risulta crea una corteccia cellulare forte ma flessibile che fornisce supporto meccanico alla membrana plasmatica sovrastante, permettendo al globulo rosso di tornare repentinamente nella sua forma originaria dopo aver subito uno schiacciamento passando per un capillare. (non so se è importante questa proteina, non c’è nei riassunti di globuli rossi) MALATTIE Eterotropia periventricolare ⟶ causata da mutazioni nel gene della filamina A, che porta a difetti nella migrazione delle cellule nervose durante lo sviluppo embrionale precoce. Le cellule nella regione periventricolare del cervello non riescono a migrare nella corteccia e formano dei noduli, causando questa sindrome. Le mutazioni nella filamina possono causare anche difetti nello sviluppo delle ossa, nel sistema cardiovascolare e in altri organi. © 978-88-08-62126-9 963 CAPITOLO 16 Il citoscheletro Alcune delle principali proteine accessorie del citoscheletro di actina. A eccezione delle proteine motrici miosina, è mostrato un esempio dei tipi principali, ciascuno dei quali è discusso nel testo. Tuttavia, la maggior parte delle cellule contiene più di un centinaio di proteine diverse che legano l’actina, ed è probabile che vi siano tipi importanti di proteine associate all’actina che non sono ancora stati individuati. lamento di actina subunità di actina – + – + – + – –+ + tropomiosinacolina mbrina -actinina lamina spectrina si lega a lamenti di ADP-actina, accelera il disassemblaggio timosina si lega alle subunità, impedisce l’assemblaggio formina nuclea l’assemblaggio e resta associata all’estremità più in crescita complesso Arp2/3 nuclea l’assemblaggio per formare una rete e resta associato all’estremità meno prolina si lega alle subunità, accelera l’allungamento proteina del cappuccio impedisce l’assemblaggio e il disassemblaggio all’estremità più – + tropomodulina impedisce l’assemblaggio e il disassemblaggio all’estremità meno stabilizza il lamento gelsolina taglia i lamenti e si lega all’estremità più + + – – formazione di fasci di lamenti, formazione di legami crociati e attacco alle membrane ERM – – – – – – + + + + + + membrana plasmatica I lamenti di actina QUADRO 16.3 MIOSINA Tutte le proteine motrici actino-dipendenti appartengono alla famiglia delle miosine. Þ Miosina II: muscolare, è una proteina allungata formata da 2 catene pesanti e 4 catene leggere (2 copie di ciascuno dei 2 tipi di catene leggere). Ogni catena pesante presenta un dominio di testa globulare all’N-terminale che contiene il macchinario per generare la forza per la contrazione muscolare. Le 2 catene leggere si legano vicino al dominio di testa, mentre la coda a spirale di α- elica forma un fascio con code di altre molecole di miosina. Queste interazioni coda-coda portano alla formazione di filamenti spessi bipolari, che contengono centinaia di teste di miosina orientate in direzioni opposte alle 2 estremità. Ciascuna testa della miosina lega e idrolizza ATP, per muoversi verso l’estremità più del filamento di actina. L’orientamento opposto delle teste permette di avvicinare coppie di filamenti di actina. Lo scivolamento dei filamenti di actina porta ad una potente contrazione. I cambiamenti nella conformazione della miosina durante i cicli di idrolisi di ATP sono accoppiati con cambiamenti dell’affinità di legame per l’actina, che permette alle teste della miosina di rilasciare la presa sul filamento di actina in un punto e di far presa sullo stesso in un altro punto. La maggior parte delle cellule non muscolari contiene piccole quantità di miosina2, utilizzate soprattutto per l’anello contrattile. Una miofibrilla è una struttura cilindrica che è spesso lunga quanto una cellula muscolare: Þ Consiste in una lunga catena ripetuta di minuscole unità contrattili, cioè i sarcomeri, che danno alla miofibrilla dei vertebrati un aspetto striato. Un sarcomero: Þ È formato da una schiera in miniatura di filamenti sottili, spessi, paralleli e parzialmente sovrapposti. I filamenti sottili sono composti da actina e da proteine associate, e sono attaccati a livello delle loro estremità più a un disco Z a ciascuna estremità del sarcomero. Le estremità meno incappucciate di filamenti di actina si estendono verso la parte centrale del sarcomero, dove si sovrappongono ai filamenti spessi, gli assemblaggi bipolari formati da isoforme di miosina 2 specifiche del muscolo. I filamenti di miosina sono disposti in una struttura regolare esagonale, e i filamenti di actina sono spaziati in modo uniforme. Þ L’accorciamento del sarcomero è dovuto allo scivolamento dei filamenti di miosina sui filamenti sottili di actina, senza cambiamento nella lunghezza dei 2 tipi di filamenti. Þ I filamenti spessi bipolari camminano verso le estremità più di 2 serie di filamenti orientati in modo opposto, spinti da decine di teste indipendenti di miosina posizionate in modo da interagire con ciascun filamento sottile Þ Non c’è coordinazione tra i movimenti delle teste di miosina, per questo è necessario che rimangano attaccate al filamento di actina soltanto per una piccola frazione di ciascun ciclo ATPasico, in modo da non tirarsi indietro a vicenda Non so se sono importanti Þ Tutti gli altri tipi di miosine contengono un dominio motore all’N-terminale e poi si differenziano molto grazie a vari domini di coda al C-terminale. Ciò che le differenzia le miosine, dunque, sono i domini al C-terminale. Tutte le miosine, tranne la VI, si muovono verso l’estremità più di un filamento di actina. Þ Miosina I: contiene un secondo sito che lega l’actina o la membrana plasmatica ed uno che lega il filamento di actina, ed è coinvolta nei movimenti dell’actina nei pressi del cortex cellulare (componente cellulare caratterizzato da una fitta rete proteica aderente al monostrato citosolico della membrana plasmatica, tendenzialmente costituito da actina, miosina, spettrina e da altre proteine associate) e nell’organizzazione intracellulare. Þ Miosina V: a differenza della miosina 2 che subisce cicli di attacco e stacco, la miosina 5 si muove sul filamento senza lasciarlo mai. È coinvolta nel trasporto intracellulare di vescicole e di grandi macromolecole (come l’mRNA). Inoltre, media la corretta suddivisione di mitocondri e perossisomi tra cellula madre e cellula figlia. PROTEINE CHE SI LEGANO AI MICROTUBULI La dinamica di polimerizzazione dei microtubuli è molto diversa nelle cellule rispetto alle soluzioni di tubulina libera. I microtubuli nelle cellule hanno una velocità di polimerizzazione molto più alta una frequenza maggiore di catastrofe e pause più prolungate nella crescita dei microtubuli, un comportamento dinamico osservato raramente nella tubulina libera in soluzione. Queste e altre differenze sono dovute al fatto che la dinamica dei microtubuli nella cellula è regolata da molte proteine che legano i dimeri di tubulina o i microtubuli. Þ MAP (proteine associate ai microtubuli): o alcune MAP possono stabilizzare i microtubuli per evitare il disassemblaggio. o Una sottoclasse di MAP può anche mediare l’interazione dei microtubuli con altri componenti cellulari (rilevante nei neuroni, in cui fasci stabilizzati di microtubuli formano il core degli assoni e dei dendriti che si estende dal corpo cellulare). Queste MAP hanno un dominio che si lega alla superficie dei microtubuli e uno che sporge verso l’esterno. PROTEINE CHE LEGANO LE ESTREMITÀ PIÙ DEI MICROTUBULI Le cellule contengono numerose proteine che legano le estremità dei microtubuli, influenzandone la dinamica e la stabilità. Queste proteine possono influenzare la velocità alla quale un microtubulo passa da uno stato di crescita a uno di accorciamento (la frequenza di catastrofi) o da uno stato di accorciamento a uno di crescita (la frequenza di salvataggi). Þ Fattori di catastrofe: si legano alle stremità dei microtubuli e sembra che separino i protofilamenti, abbassando la normale barriera di energia di attivazione che impedisce a un microtubulo di separarsi nel protofilamento curvo (caratteristico dello stato di accorciamento). La patronina protegge le estremità meno dai fattori di catastrofe. Þ XMAP215: lega le subunità libere di tubulina e le porta alle estremità, più promuovendo la polimerizzazione dei microtubuli e contrastando contemporaneamente l’attività del fattore di catastrofe. o La fosforilazione di XMAP215 durante la mitosi ne inibisce l’attività e sposta l’equilibrio della sua competizione con i fattori di catastrofe. o Questo spostamento causa un aumento di dieci volte dell’instabilità dinamica dei microtubuli durante la mitosi, una transizione che è cruciale per l’efficiente costruzione del fuso mitotico Þ + TIP (proteine che seguono le estremità più): proteine associate ai microtubuli. Regola l’allungamento e l’accorciamento del filamento. Molte di queste lavorano con le proteine EB1, piccole proteine dimeriche, riconoscono caratteristiche dell’estremità più in crescita per potersi accumulare alle estremità più PROTEINE CHE SEQUESTRANO LA TUBULINA E CHE TAGLIANO I MICROTUBULI DESTABILIZZANDOLI Þ Statmina (o Oncoproteina18): si lega a 2 eterodimeri di tubulina e impedisce la loro aggiunta alle estremità dei microtubuli. Questa proteina diminuisce la concentrazione di subunità di tubulina disponibili per la polimerizzazione (un’azione analoga a quella della colchicina) e aumenta la probabilità che un microtubulo in crescita passi allo stato di accorciamento. o La fosforilazione della statmina inibisce il suo legame alla tubulina o Segnali che provocano la fosforilazione della statmina possono aumentare la velocità di allungamento dei microtubuli e sopprimere l’instabilità dinamica o La statmina è coinvolta nella regolazione sia della proliferazione che della morte cellulare Þ Katanina: è una proteina che taglia i legami longitudinali nei protofilamenti. È composta da una subunità che idrolizza ATP e che esegue il taglio, ed un’altra che dirige la katanina verso il centrosoma. Il taglio effettuato dalla katanina è un altro sistema utile a favorire la destabilizzazione dei microtubuli. Þ MAP2 e TAU: sono presenti solamente in cellule specializzate (come i neuroni). o MAP2 ha un unico dominio di legame e funziona da organizzatore di fasci di microtubuli e da spaziatore. o TAU ha 2 domini di legame e funziona da stabilizzatore dei microtubuli Mutazioni di Tau e/o fosfotau conducono all’Alzheimer o al Parkinson. PROTEINE MOTRICI Þ Chinesine: ci sono circa 45 tipi diversi di chinesine che spesso in comune hanno un dominio all’N- terminale e si spostano verso l’estremità più. Fa eccezione la chinesina 14 che possiede il dominio al C-terminale e si sposta verso l’estremità meno. Tutte le chinesine, tranne la chinesina 13, utilizzano cicli di idrolisi di ATP per spostarsi lungo i microtubuli o Chinesina 1 (chiamata anche “chinesina convenzionale”): possiede 2 catene pesanti che formano 2 domini motori globulari di testa tenuti insieme da una coda a spirale allungata responsabile della dimerizzazione delle catene pesanti. Una catena leggera della chinesina- 1 si associa a ogni catena pesante mediante il suo dominio di coda. La maggior parte delle chinesine ha nella sua coda un sito di attacco per un altro microtubulo o per un carico da trasportare. A e resta associato centrosoma all'estremità meno gm è si lega alle subunità, ù restano associate alle estremità più impedisce l'assemblaggio in crescita e possono collegare ad altre strutture, come le membrane stabilizza le estremità più e accelera l'assemblaggio induce la catastrofe n taglia i microtubuli stabilizza i microtubuli legandosi lungo lati formazione di fasci di filamenti e di legami crociati si collega ai filamenti intermedi Alcune delle principali proteine accessorie del citoscheletro di microtubuli. A eccezione di due classi di proteine motrici, è mostrato un esempio dei tipi principali, ciascuno dei quali è discusso nel testo. Tuttavia, la maggior parte delle cellule contiene più di un centinaio di proteine diverse che legano i microtubuli; come per le proteine associate all'actina, è probabile che vi siano tipi importanti di proteine associate ai microtubuli che non sono ancora stati riconosciuti. Þ possono piegarsi con facilità ma sono molto difficili da rompere e possono essere allungati fino a 3 volte Il disassemblaggio dei filamenti intermedi è effetto della loro fosforilazione La famiglia più diversificata di filamenti intermedi è quella delle cheratine. Ciascun filamento presenta in parti uguali cheratina I (acida) e cheratina II (neutro/basico). Queste formano una subunità di filamento eterodimerica. Reti di cheratina tenute insieme da legami disolfuro possono anche sopravvivere alla morte delle loro cellule, formando forti rivestimenti negli animali, come nello strato esterno della pelle, nei capelli, nelle unghie, negli artigli e nelle scaglie. I filamenti di cheratina conferiscono resistenza meccanica ai tessuti epiteliali: Þ i filamenti di cheratina ancorano i filamenti intermedi ai desmosomi (a livello di siti di contatto cellula-cellula) Þ i filamenti di cheratina ancorano i filamenti intermedi agli emidesmosomi (a livello di siti di contatto cellula-matrice) La diversità delle cheratine è utile nella diagnosi di tumori epiteliali, per comprendere il tessuto epiteliale in cui il cancro si è originato. Proteine accessorie come la filaggrina fasciano i filamenti di cheratina nelle cellule dell’epidermide, per dare durezza gli strati estremi della pelle. MALATTIE Þ Individui con mutazioni nel gene che codifica la filaggrina sono fortemente predisposti a malattie caratterizzate da pelle secca, come l’eczema. Þ Epidermolisi bollosa semplice: quando cheratine difettose sono espresse nello strato delle cellule basali dell’epidermide. La pelle forma vesciche in risposta a stress meccanici minimi, che rompono le cellule basali. Neurofilamenti: membri di un’altra famiglia di filamenti intermedi che si trovano in alte concentrazioni lungo gli assoni dei neuroni dei vertebrati. 3 tipi di proteine dei neurofilamenti (NF-L, NF-M, NF-H) si coassemblano in vivo, formando eteropolimeri. MALATTIE La malattia neurodegenerativa sclerosi laterale amiotrofica (SLA, o malattia di Lou Gehrig) è associata a un accumulo e a un assemblaggio anormali dei neurofilamenti nei corpi cellulari e nell’assone dei motoneuroni, che possono interferire con il normale trasporto lungo l’assone. La degenerazione degli assoni porta a debolezza e ad atrofia muscolare, che è in genere fatale. PLACHINE Famiglia proteica che connette i filamenti intermedi al citoscheletro. Le plachine sono grandi e modulari e contengono più domini che connettono i filamenti citoscheletrici uno all’altro e a complessi giunzionali. Un esempio è la plectina, che oltre a formare fasci di filamenti intermedi, può interagire con i complessi proteici che connettono il citoscheletro con l’interno del nucleo. COMPLESSI PROTEICI: Þ proteine SUN: della membrana nucleare interna. All’interno del nucleo si legano alla lamina nucleare o ai cromosomi. Þ proteine KASH (chiamate anche nesprine): nel citoplasma si legano direttamente ai filamenti di actina e indirettamente ai microtubuli e ai filamenti intermedi attraverso, rispettivamente, l’associazione a proteine motrici e plachine. Questi complessi proteici si legano alla lamina nucleare. Si uniscono nel lume dell’involucro nucleare per formare in parte che connette il citoscheletro nucleare con quello citoplasmatico. SEPTINE Proteine che legano GTP agiscono da sistema aggiuntivo di filamenti in tutti gli eucarioti (ad eccezione delle piante terrestri). Le septine si assemblano in filamenti non polari che formano anelli e strutture a gabbia, che funzionano da impalcature per suddividere le membrane in domini distinti o per reclutare e organizzare i citoscheletri di actina e di microtubuli. I filamenti di septina, inizialmente identificati nel lievito gemmante, si trovano nella strozzatura tra la cellula madre di lievito in divisione e la gemma in crescita. In questo punto le septine bloccano il movimento delle proteine da un lato della strozzatura all’altro, concentrando così la crescita cellulare soprattutto nella gemma. Þ Nelle cellule animali le septine hanno un ruolo nella divisione cellulare, nella migrazione e nel traffico vescicolare. Il legame del GTP è necessario per il ripiegamento dei polipeptidi di septina, ma il ruolo dell’idrolisi del GTP nella funzione della septina non è chiaro. Le strutture di septina si assemblano e si disassemblano all’interno della cellula, ma non sono dinamiche come i filamenti di actina e i microtubuli. CAPITOLO 17 L’unico modo per produrre una nuova cellula è la duplicazione di una cellula esistente. Tutti gli organismi viventi, infatti, sono frutto di cicli ripetuti di crescita e divisione cellulare, detti ciclo cellulare. La divisione cellulare è necessaria, oltre che per la crescita, per la sostituzione di cellule morte. Per produrre due cellule figlie, geneticamente identiche, il DNA di ogni cromosoma deve prima essere duplicato (fase S) e poi equamente distribuito (mitosi). Oltre a duplicare il DNA, le cellule devono anche duplicare gli organelli e le macromolecole, altrimenti le cellule figlie diventerebbero sempre più piccole. Il ciclo cellulare eucariotico è diviso in 4 fasi sequenziali: G1, S, G2 e M. Þ Le prime 3 (G1, S, G2) insieme sono chiamate interfase ed occupano la maggior parte del tempo o La durata della fase G1 può variare a seconda delle condizioni favorevoli o sfavorevoli. o Coinvolto nel far rimanere la cellula in G1 è P53, un oncosoppressore che agisce quando vi sono danni o mutazioni nel DNA. o P53 attiva P21, una CKI, che inibisce i complessi G1/S Cdk e S Cdk bloccando il ciclo cellulare nella fase Gap 1 (non permettendo quindi al DNA di essere duplicato). o Quando non ci sono danni nel DNA, P53 è legato da MdM2, che lo ubiquitina e lo destina, quindi, alla degradazione nei proteasomi. Þ la fase M è costituita da due eventi principali: la divisione del nucleo, o mitosi, e la divisione del citoplasma, o citochinesi. Le fasi gap, oltre a permettere la crescita cellulare, danno anche il tempo alla cellula di assicurarsi che le condizioni siano adatte allo svolgimento della fase S e della mitosi. Þ Se le condizioni extracellulari sono sfavorevoli, ad esempio, le cellule entrano in uno stato di riposo specializzato, chiamato G0, in cui possono rimanere per settimane, anni o anche per sempre (neuroni). Þ Se invece le condizioni sono favorevoli, le cellule progrediscono attraverso un punto di impegno verso la fine di G1, chiamato Start o punto di restrizione. Dopo aver superato questo punto, le cellule si impegnano nella fase S (duplicazione del DNA) e non possono più tornare indietro. Þ All’inizio della mitosi, in uno stadio detto profase, le due molecole di DNA vengono condensate in bastoncelli rigidi e compatti detti cromatidi fratelli, che rimangono uniti. Þ Quando l’involucro nucleare si disassembla, le coppie di cromatidi fratelli si attaccano ai poli opposti di una grande schiera bipolare di microtubuli, detta fuso mitotico e alla fine si allineano all’equatore in uno stadio detto metafase. Þ Con la perdita di coesione dei cromatidi fratelli, all’inizio dell’anafase, si ha la loro separazione, poiché vengono attratti ai poli opposti. Þ Il fuso, quindi, si disassembla e i cromosomi vengono racchiusi in nuclei diversi nella telofase. Þ Infine, la citochinesi divide la cellula in due, in modo che i due nuclei si trovino in due cellule distinte. Il sistema di controllo del ciclo cellulare opera in modo molto simile ad un timer, che scatena gli eventi in una sequenza fissa. Nella maggior parte delle cellule, questo sistema di controllo risponde alle informazioni di determinatori sensori ed interruttori biochimici, che sono generalmente binari (acceso o spento). Il sistema di controllo governa la progressione del ciclo cellulare in tre punti di transizione principali: Þ Start: le cellule entrano nella fase S (duplicazione del DNA) del ciclo cellulare e duplicano i cromosomi Þ punto di controllo G2/M: allineamento dei cromosomi al fuso nella metafase Þ transizione tra metafase ed anafase: separazione dei cromatidi fratelli L’assemblaggio e la funzione del fuso mitotico dipendono da 4 motori proteici in particolare: Þ Chinesina 5: ha due domini motore, che interagiscono con le estremità più dei microtubuli, e tendono a far distanziare i poli. Interagisce con i microtubuli interpolari scorrendo verso il lato più di entrambi. Þ Chinesina 14: hanno un solo dominio motore, che si muove verso l’estremità meno, e tendono ad avvicinare i poli. Interagisce con i microtubuli interpolari scorrendo verso il lato meno di uno dei 2 e restando agganciato all’altro. Þ Chinesina 4 e 10: dette anche cromochinesine, sono motori proteici diretti verso le estremità più, che si associano al braccio dei cromosomi, allontanandoli dai poli del fuso. Þ Dineina: le dineine sono motori diretti verso l’estremità meno, che tirano i poli del fuso verso la corteccia cellulare, allontanandoli l’un l’altro. Interagisce con i microtubuli astrali e con la corteccia cellulare per contribuire al posizionamento dei poli. I microtubuli originano dal centromero, costituito dalla matrice periventricolare che avvolge i 2 centrioli. Sulla matrice sono presenti anelli di γ-tubulina dalla quale parte la nucleazione dei microtubuli. Diversi meccanismi generano le forze che muovono i cromosomi avanti e indietro sul fuso mitotico: Þ La prima forza deriva dalla depolimerizzazione delle estremità più dei microtubuli del cinetocore, ai quali sono attaccati cromatidi, che vengono così spostati verso il polo. Þ Una seconda forza in direzione del polo è fornita dal flusso dei microtubuli, per il quale gli stessi microtubuli subiscono una depolimerizzazione all’estremità meno, ma un’aggiunta di tubulina all’estremità più. In questo modo la lunghezza rimane invariata, ma il movimento dei microtubuli è verso il polo. Þ Una terza forza, in direzione contraria rispetto alle precedenti, è la forza di espulsione polare o vento polare STRUTTURA DEL FUSO MITOTICO ⟶ le estremità più si proiettano lontano dai centrosomi, mentre le estremità meno sono ancorate ai poli del fuso La formazione del fuso inizia durante la profase, quando il complesso M-Cdk avvia la migrazione dei centrosomi (avviene grazie alle dineine) e la loro maturazione (aumento anelli di tubulina). PROMETAFASE Affinché i microtubuli possano attaccarsi ai cromosomi, l’involucro nucleare deve essere demolito. Þ Fosforilazione da parte di M-Cdk di alcune subunità dei complessi del poro Þ Fosforilazione di componenti della lamina METAFASE I microtubuli del fuso possono attaccarsi ai cinetocori mediante un complesso che è il NdC 80: Þ È ancorato sia ai microtubuli, per permettere polimerizzazione e depolimerizzazione, che al cinetocore La coppia di cromatidi deve presentare biorientamento, ovvero i 2 cinetocori devono attaccarsi ai poli opposti del fuso. Þ Durante la metafase, le coesine che tengono uniti i cromatidi fratelli resistono alle forze dirette verso il polo che tendono a separarli. L’anafase, invece, richiede la separazione dei cromatidi fratelli; quindi, APC/C ubiquitina la proteina securina e la destina alla distruzione. Þ Prima dell’anafase la proteina securina aveva legato una proteasi detta separasi, che, al momento della distruzione della securina, viene rilasciata e lasciata libera di tagliare le coesine. Questo permette ai cromatidi fratelli di separarsi. Þ Oltre alla securina, APC/C indirizza anche le cicline S ed M alla distruzione, permettendo alle fosfatasi di defosforilare le proteine bersaglio di Cdk nella cellula, evento necessario per il completamento della mitosi. Quando non si verifica ciò, cosa accade? Gli attacchi impropri vengono riconosciuti, perché un attacco corretto presenta un’altra tensione dovuta all’attrazione in direzioni opposte dei cinetocori. Quando non c’è tensione, una proteina detta AURORA B riduce la forza di attacco per i microtubuli. Quando si raggiunge il biorientamento AURORA B viene inibita aumentando l’affinità tra il microtubulo e il sito di attacco. A questo punto il fuso subisce una serie di variazioni finché il cromosoma non viene posizionato in una zona a metà fra i 2 centrosomi: piastra metafasica. PUNTO DI CONTROLLO METAFASE-ANAFASE La progressione attraverso il punto di transizione tra metafase ed anafase è scatenata dalla distruzione di proteine e non dalla loro fosforilazione. Il regolatore della transizione tra metafase ed anafase è il complesso che promuove l’anafase, o ciclosoma, noto come APC/C, membro della famiglia di enzimi ubiquitina ligasi. L’APC/C catalizza l’ubiquitinazione e la distruzione di due proteine importanti: la securina e le cicline M e S. La cellula controlla che tutti i cromosomi siano biorientati per entrare in anafase. Il complesso APC/C aggiunge code di ubiquitina a proteine da degradare: 1. UBIQUITINAZIONE SECURINA: la securina è una proteina che protegge i collegamenti che uniscono le coppie di cromatidi fratelli. La distruzione della securina al momento della transizione tra metafase e anafase attiva una proteasi che separa i cromatidi fratelli e avvia l’anafase. La securina inattiva la proteina separasi, che ha il compito di tagliare le subunità della coesina, che tiene uniti i 2 cromatidi fratelli. La degradazione della securina porta alla separazione dei cromatidi fratelli. 2. UBIQUITINAZIONE DELLE CICLINE M E S: queste disattivano la maggior parte dei complessi Cdk. La disattivazione delle cicline porta alla defosforilazione delle proteine bersaglio delle Cdk. Avvenimento necessario per lo smantellamento del fuso, la decondensazione dei cromosomi e la riformazione dei nuclei. APC/C è attivato da Cdc20: Þ L’attivazione è promossa da M-Cdk mediante feedback negativo Þ Qualsiasi cinetocore non attaccato correttamente al fuso blocca l’attività di APC/C – Cdc20. Proteine tra cui Mod2 si legano al complesso inibendolo con il corretto biorientamento Mod2 si dissocia e il complesso viene attivato ANAFASE Segregazione dei cromosomi. Þ Anafase A: i microtubuli del cinetocore si accorciano tramite depolarizzazione in corrispondenza del cinetocore e dell’estremità meno Þ Anafase B: allontanamento dei poli grazie alla dineina e Chinesina-5. Non appena i cromatidi fratelli si dividono in anafase, l’actina e la miosina 2, normalmente situate nella zona del cortex cellulare (sotto la membrana plasmatica), iniziano ad accumularsi nell’anello contrattile insieme a proteine che offrono supporto strutturale. Dopo l’anafase, le schiere sovrapposte di filamenti di actina e miosina II si contraggono per generare la forza che divide il citoplasma in due. Alla fine della divisione, l’anello contrattile è eliminato del tutto. TELOFASE Þ Disattivazione M-Cdk. Þ Smantellamento del fuso Þ Formazione dei nuclei figli Þ Decondensazione dei cromosomi CAPITOLO 18 La crescita, lo sviluppo e il mantenimento degli organismi pluricellulari non dipendono solamente dalla produzione di cellule ma anche dai meccanismi utili a distruggerle. APOPTOSI ⟶ morte cellulare programmata Þ L’apoptosi viene innescata da caspasi (“c” da cisteina e “asp” da acido aspartico): proteasi intracellulari specializzate con cisteine nel loro sito attivo e tagliano la proteina in siti dove vi sono residui di acido aspartico determinando cambiamenti drastici che portano alla morte della cellula e alla fagocitazione. Þ In questo caso la cellula subisce molteplici cambiamenti morfologici: si riduce e si condensa, il citoscheletro collassa, l’involucro nucleare si dissolve e la cromatina nucleare si condensa e si divide in frammenti. Þ Se la cellula è grande si divide in corpi apoptotici (frammenti racchiusi da membrana) e la superficie della cellula o di questi corpi diventa chimicamente alterata così che una cellula adiacente o un macrofago lo fagociti rapidamente prima che ne esca il contenuto. Le caspasi hanno delle cisteine nel loro sito attivo e tagliano le proteine bersaglio in corrispondenza di specifici residui di acido aspartico, inoltre sono sintetizzati nella cellula come precursori inattivi e vengono attivate solo durante l’apoptosi. Abbiamo due classi di caspasi apoptotiche: caspasi iniziatrici e caspasi esecutrici. CASPASI INIZIATRICE Þ Sono monomeri inattivi solubili nel citosol. Þ Dominio proteasico (carbossilico terminale) Þ Dominio di interazione proteica (amminico terminale) Le caspasi sono prodotte in forma inattiva. I segnali apoptotici attivano l’assemblaggio di proteine adattatrici che si legano all’amo terminale delle caspasi. Il legame porta le caspasi a dimerizzare e così si attivano, portando ad un taglio di un sito specifico nel dominio proteasico. CASPASI ESECUTRICE Þ Sono dimeri inattivi Þ Vengono attivate dalle caspasi iniziatrici e a questo punto catalizzano diffusi eventi di taglio proteolitico che uccidono la cellula. Attraverso due meccanismi viene attivata la prima caspasi iniziatrice in risposta ad un segnale apoptotico, la via estrinseca e la via intrinseca. VIA ESTRINSECA Si ha quando le proteine segnale extracellulari si legano ai recettori di morte. Recettori di morte: proteine transmembrana che presentano un dominio di morte necessario ai recettori per attivare il processo apoptotico. Þ Questi recettori sono eterodimeri e appartengono alla famiglia dei TNF (recettori del fattore di necrosi tumorale) che comprendono un recettore per lo stesso TNF il recettore di morte Fas Un esempio del modo in cui i recettori attivano la via estrinseca è Fas: Þ L’attivazione di Fas avviene mediante il legame con il ligando di Fas sulla superficie di un linfocita killer Þ I domini di morte sulle code citosoliche dei recettori di morte di Fas reclutano proteine adattatrici intracellulari, che a loro volta reclutano procaspasi iniziatrici (principalmente caspasi 8) Þ Formazione del complesso di segnalazione che induce la morte (DISC) Þ Una volta dimerizzate e attivate nel DISC, le caspasi iniziatrici tagliano il loro partner a attivano le procaspasi esecutrici a valle per indurre l’apoptosi