Biologia e Genetica Sintesi principali argomenti, Sintesi del corso di Biologia

Scarica Biologia e Genetica Sintesi principali argomenti e più Sintesi del corso in PDF di Biologia solo su Docsity! BIOLOGIA Carbonio: può formare legami covalenti che sono i più forti, per questo è alla base della struttura delle cellule e di tutti gli elementi organici. Oltre al fatto che più instaurare fino a 4 legami con vari atomi e presenta una bassa elettronegativi che gli consente di fare legami anche con Ossigeno e Idrogeno. Calassi di macromolecole: - Carboidrati: I glucidi hanno numerose funzioni biologiche, tra cui quella di fonte energetica e trasporto dell'energia (esempio: amido, glicogeti come componenti strutturali della cellulosa nelle piante e della cartilagine negli animali). Inoltre giocano un ruolo fondamentale nel sistema immunitario, nella fertilità e nello sviluppo biologico. - Proteine: sono macromolecole biologiche costituite da catene di amminoacidi legati uno all'altro da un legame peptidico (ovvero un legame tra il gruppo amminico di un amminoacido e il gruppo carbossilico dell'altro amminoacido, creato attraverso una reazione di condensazione con perdita di una molecola d’acqua). Le proteine svolgono una vasta gamma di funzioni all'interno degli organismi viventi, tra cui la catalisi delle reazioni metaboliche, funzione di sintesi come replicazione del DNA, la risposta agli stimoli e il trasporto di molecole da un luogo ad un altro. Le proteine differiscono l'una dall'altra soprattutto nella loro sequenza di amminoacidi, la quale è dettata dalla sequenza nucleotidica conservata nei geni e che di solito si traduce in un ripiegamento proteico in una struttura tridimensionale specifica che determina la sua attività. - Acidi nucleici: sono macromolecole aperiodiche a debole reazione acida deputate alla conservazione e al trasporto dell'informazione genetica. Gli acidi nucleici sono macromolecole polimeriche lineari le cui unità ripetitive sono i nucleotidi.[1] Questi ultimi sono formati da uno zucchero, una base azotata e alcuni gruppi fosfati. Gli acidi nucleici vengono prodotti a partire dai nucleotidi per disidratazione (cioè attraverso polimerizzazione per condensazione). I legami tra i tre gruppi che formano un nucleotide sono un legame fosfoestereo tra il carbonio 3' e il gruppo fosfato, un legame tra il gruppo fosfato e il carbonio 5' del nucleotide seguente. La base azotata è esterna allo scheletro formato dagli altri due gruppi e si dice che "si affacci" all'interno della catena. - Lipidi: sono composti organici largamente diffusi in natura, e rappresentano una delle quattro principali classi di composti organici di interesse biologico, insieme a glucidi, protidi ed acidi nucleici. - I lipidi vengono identificati sulla base delle loro proprietà comuni di solubilità:[2] sono insolubili in acqua (definiti per questo idrofobici), mentre sono solubili in solventi organici come etere dietilico o acetone, alcoli e idrocarburi. L'insolubilità in acqua è la proprietà analitica che viene usata come base per la separazione dai carboidrati e dalle proteine. Dal punto di vista strutturale, i lipidi sono costituiti prevalentemente da atomi di carbonio e di idrogeno uniti tra loro con legami covalenti scarsamente polari (caratteristica che conferisce il comportamento idrofobico) e disposti simmetricamente. Tuttavia, alcuni lipidi presentano, in una regione ristretta della loro molecola, gruppi polari (ad esempio fosfolipidi). I lipidi polari presentano caratteristiche fisico-chimiche peculiari rispetto ai lipidi neutri (apolari). In particolare, i lipidi polari mostrano caratteristiche anfipatiche (solubilità sia in acqua che in solventi apolari) o addirittura risultano talora insolubili in solventi organici e solubili in acqua. Basi molecolari dell’informazione ereditaria: Un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi. Un polimero organico costituito da monomeri chiamati nucleotidi (deossiribonucleotidi). Tutti i nucleotidi sono costituiti da tre componenti fondamentali: un gruppo fosfato, il deossiribosio (zucchero pentoso) e una base azotata che si lega al deossiribosio con legame N-glicosidico. Le basi azotate che possono essere utilizzate nella formazione dei nucleotidi da incorporare nella molecola di DNA sono quattro: adenina, guanina, citosina e timina mentre nell'RNA, al posto della timina, è presente l'uracile. Il DNA può essere più correttamente definito come una doppia catena polinucleotidica (A,T,C,G), antiparallela, orientata, complementare, spiralizzata, informazionale. L'ordine nella disposizione sequenziale dei nucleotidi costituisce l'informazione genetica, la quale è tradotta con il codice genetico negli amminoacidi corrispondenti. La sequenza amminoacidica prodotta, detta polipeptide, forma le proteine. Il processo di traduzione genetica (comunemente chiamata sintesi proteica) è possibile solo in presenza di una molecola intermedia di RNA, che è generata per complementarità con le Pagina di 1 43 DNA quattro basi dei nucleotidi del DNA in un processo noto come trascrizione. Tale processo non genera solo filamenti di RNA destinati alla traduzione, ma anche frammenti già in grado di svolgere svariate funzioni biologiche (ad esempio all'interno dei ribosomi, dove l'RNA ha una funzione strutturale). L'informazione genetica è duplicata prima della divisione cellulare, attraverso un processo noto come replicazione del DNA, che evita la perdita di informazione nel passaggio tra diverse generazioni cellulari. Negli eucarioti, il DNA si complessa all'interno del nucleo in strutture chiamate cromosomi. Negli altri organismi, privi di nucleo, esso può essere organizzato in cromosomi o meno (nei batteri è presente un'unica molecola di DNA circolare a doppia catena, mentre i virus possono avere genomi a DNA oppure ad RNA). All'interno dei cromosomi, le proteine della cromatina come gli istoni, le coesine e le condensine, organizzano il DNA e lo avvolgono in strutture ordinate. Queste strutture guidano l'interazione tra il codice genetico e le proteine responsabili della trascrizione, contribuendo al controllo della trascrizione genica. STRUTTURA DNA genomico è localizzato all'interno del nucleo cellulare, nonché in piccole quantità all'interno di mitocondri e cloroplasti. Nei procarioti, il DNA è invece racchiuso in un organello irregolare, privo di membrana, contenuto nel citoplasma, chiamato nucleoide. L'informazione è contenuta all'interno dei geni, unità ereditarie in grado di influire sul fenotipo dell'organismo. Ogni gene contiene un open reading frame (regione in grado di essere trascritta a RNA) ed una regione regolatoria, costituita sia da un promotore che da enhancers. In molte specie, solo una piccola frazione della sequenza totale di un genoma può essere trascritta e tradotta. Ad esempio, solo l'1,5% del genoma umano è costituito da esoni codificanti una proteina, mentre più del 50% consiste di sequenze ripetute di DNA non codificante. La ragione per cui ci sia una tale quantità di DNA non codificante non è tuttora completamente chiara ed è stata definita come enigma del C- value. In ogni caso, le sequenze di DNA che non codificano una proteina possono essere trascritte in RNA non codificante, coinvolto nella regolazione dell'espressione genica. Alcune sequenze non codificanti ricoprono un ruolo strutturale per i cromosomi. Le regioni telomeriche e centromeriche contengono solitamente pochissimi geni, ma sono necessarie per la funzione e la stabilità dei cromosomi ENZIMI che modificano il DNA Le topoisomerasi sono enzimi che presentano sia un'attività nucleasica che una ligasica. Queste proteine sono in grado di modificare le proprietà topologiche del DNA. Alcune di esse svolgono tale funzione tagliando l'elica di DNA e permettendole di ruotare, riducendo il suo grado di superavvolgimento, per poi procedere alla ligazione delle due estremità.[47] Altre topoisomerasi sono invece in grado di tagliare l'elica e far passare attraverso il sito di rottura una seconda elica, prima di ligare il filamento spezzato.[108] Le topoisomerasi sono necessarie per molti processi che coinvolgono il DNA, come ad esempio la replicazione del DNA e la trascrizione. Le elicasi sono proteine in grado di utilizzare l'energia chimica presente nei nucleosidi trifosfato, soprattutto ATP, per rompere i legami idrogeno che si instaurano tra le basi azotate, permettendo l'apertura della doppia elica di DNA in singoli filamenti. Questi enzimi sono essenziali per la maggior parte dei processi biologici che coinvolgono enzimi che richiedono un diretto contatto con le basi del DNA. TELOMERI Il telomero è la regione terminale di un cromosoma composta di DNA altamente ripetuto che protegge l'estremità del cromosoma stesso dal deterioramento o dalla fusione con cromosomi confinanti. Il suo nome deriva dal nome greco telos (τέλος) 'fine' e da merοs (μέρος, radice: μερ-) 'parte.' Nei vertebrati la sequenza di nucleotidi nei telomeri è TTAGGG. Questa sequenza TTAGGG si ripete circa 2,500 volte negli umani.[1]. Si pensava fosse una regione non codificante, ma recenti scoperte hanno dimostrato che produce trascritti detti TERRA, che si ipotizza siano implicati nella regolazione della telomerasi. Il telomero ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi, poiché la DNA polimerasi non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione. Se non vi fossero i telomeri la replicazione del DNA comporterebbe il rischio di una significativa perdita di informazione genetica ad ogni replicazione. Ad ogni replicazione i telomeri vengono tagliati, o accorciano. Diversi studi ipotizzano che il progressivo accorciamento dei telomeri ad ogni ciclo replicativo sia associato all'invecchiamento cellulare (fase di senescenza). Pagina di 2 43 Il Non-Homologous End-Joining (NHEJ) riunisce le due estremità della rottura in assenza di una sequenza che possa fungere da stampo. Tuttavia può esserci una perdita di sequenza durante questo processo e quindi tale riparo può essere mutagenico. Nel NHEJ intervengono il complesso Ku70/Ku80 e l a p r o t e i n c h i n a s i D N A - P K c h e interagiscono tra loro e riconoscono le estremità della rottura a doppio filamento. Le estremità possono essere processate, seppur in maniera limitata, dal complesso MRN che ha attività esonucleasica. Sono infine reclutate le proteine XRCC4 e la DNA ligasi 4 che ricongiungono le due estremità rotte. Il NHEJ può verificarsi a tutti gli stadi del ciclo cellulare, ma nelle cellule di mammifero è il principale meccanismo fino a quando la replicazione del DNA non rende possibile la riparazione per ricombinazione con impiego del cromatide fratello come stampo. Dal momento che la grande maggioranza del genoma negli umani e negli altri organismi pluricellulari è fatta di DNA che non contiene geni, il cosiddetto "junk DNA" o "DNA spazzatura", un NHEJ mutagenico è probabilmente meno pericoloso di una riparazione assistita da stampo costituito da sequenze presenti in copia multipla, dato che in quest'ultimo caso si produrrebbero riarrangiamenti cromosomici indesiderati. Il macchinario enzimatico usato per il NHEJ è anche utilizzato nelle cellule B per riunire rotture generate dalle proteine RAG durante la ricombinazione VDJ, passo cruciale nella produzione della diversità degli anticorpi da parte del sistema immunitario. La metilazione del DNA è una modificazione epigenetica del DNA. Il processo consiste nel legame di un gruppo metile (-CH3) ad una base azotata. Differenti basi azotate possono subire questo tipo di modificazione per diverse funzioni. L'adenina può essere metilata a livello delle sequenze GmeATC del genoma di alcuni batteri come Escherichia coli dall'enzima dam (DNA adenina metilasi). La funzione di questa metilazione è quella di proteggere il genoma della cellula dall'attacco delle endonucleasi di restrizione da lei stessa prodotte, come mezzo di resistenza all'attacco di fagi. Un altro esempio di metilazione del DNA è la metilazione della citosina, che costituisce la quasi totalità della metilazione di DNA eucariotico. Nei mammiferi, la 5-metil-citosina (5meC o 5mC) si trova quasi esclusivamente nel dinucleotide CpG (citosina seguita da una guanina) nella regione codificante dei geni. Il dinucleotide CpG è poco rappresentato nel DNA degli eucarioti poiché soggetto a mutazione secondaria a metilazione. Il genoma dei mammiferi è quasi del tutto metilato, a eccezione di alcune zone ricche del dinucleotide CpG che per questo vengono chiamate isole CpG, solitamente abbondanti in regioni regolative e promotori dei geni eucariotici; la metilazione di queste sequenze aumenta in particolari patologie come la sindrome di Prader- Willi[2]. La metilazione fisiologica del DNA in queste regioni dipende da proteine chiamate DNA-metil- transferasi o DNMTs (es. 1, 3a 3b) ed è un fenomeno che interviene nel controllo dell'espressione genica, nell'inattivazione del cromosoma X, nella struttura cromatinica e nell'imprinting genomico. La metilazione della citosina è anche un importante fattore di mutazione[1]. Infatti mentre la deaminazione della citosina produce uracile -una base azotata che non appartiene al DNA (bensì all'RNA) ed è immediatamente riconosciuta come estranea- la deaminazione della 5-metil citosina (5meC) la trasforma in timina, generando un mismatch, nel quale il sistema di riparazione dei mismatch (mismatch repair) non sempre preserva la corretta base azotata. Si sospetta che sia implicata anche nel taglio degli introni, e nella modifica degli esoni. NB: La metilazione del DNA è essenziale per il normale sviluppo e questa è associata con alcuni processi chiave, tra cui l'imprinting genomico (La metilazione del DNA è essenziale durante lo sviluppo embrionale, e nelle cellule somatiche, i pattern di metilazione del DNA sono generalmente trasmessi alle cellule figlie con un'alta fedeltà. I pattern anormali di metilazione del DNA sono stati associati ad un gran numero di neoplasie umane e si trovano in due forme distinte: ipermetilazione e ipometilazione rispetto al tessuto normale - L'ipometilazione globale è stata anche coinvolta nello sviluppo e nella progressione del cancro attraverso meccanismi diversi.), l'inattivazione del cromosoma X, la soppressione di elementi ripetitivi e la carcinogenesi. Tale metilazione è una modificazione biochimica e coinvolge l'aggiunta di un gruppo metile al livello del carbonio-5 della citosina, quasi esclusivamente nel contesto del dinucleotide CpG. Effettuata da una famiglia di enzimi chiamata DNMT (DNA-metil-transferasi). In particolar modo DNMT1 è responsabile del mantenimento del pattern di metilazione sui filamenti sintetizzati ad ogni ciclo di replicazione. MUTAZIONI Pagina di 5 43 I procarioti possiedono cinque tipi di DNA polimerasi: - DNA polimerasi 1: coinvolta nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5'. Quest'ultima attività permette la lettura delle basi precedentemente unite (proofreading o "lettura delle bozze") e l'eventuale correzione in caso di errore. La velocità di polimerizzazione è di circa 14-20 nucleotidi/secondo. - DNA polimerasi 2: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5'. Velocità di polimerizzazione di circa 40 nucleotidi/secondo. - DNA polimerasi 3: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' (proofreading). È attiva sia nella sintesi del filamento guida, sia in quella dei frammenti di Okazaki. Ha una struttura particolarmente più complessa delle due precedenti, risulta costituito da due nuclei, a loro volta formati da subunità α ε θ (subunità alpha, epsilon e theta), i due nuclei sono uniti da una subunità τ (tau); sono inoltre presenti strutture addizionali dette subunità χ e ψ (chi e psi), che vanno a costituire i complessi γ o di pinza, che permettono un incremento esponenziale del processo duplicativo. Velocità di polimerizzazione di circa 250-1000 nucleotidi/secondo. - DNA polimerasi 4 e DNA polimerasi 5: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all’errore. Le polimerasi degli eucarioti sono invece: DNA polimerasi α (alfa): è associata a una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede all'allungamento degli RNA-primer con alcune decine di deossiribonucleotidi (circa 50-100). DNA polimerasi β (beta): coinvolta nella riparazione del DNA, in particolare nei processi di riparazione per escissione delle basi DNA polimerasi γ (gamma): replica il DNA mitocondriale DNA polimerasi δ (delta): è uno degli enzimi principale della replicazione eucariotica. Sintetizza il filamento lagging. Quando la polimerasi raggiunge il frammento di Okazaki precedentemente sintetizzato, continua a muoversi lungo il filamento stampo lagging, spostando il primer a RNA che verrà poi rimosso da una endonucleasi (FEN-1). L'interruzione tra i desossiribonucleotidi è poi saldata da una ligasi. DNA polimerasi ε (epsilon): è l'altro enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza il filamento leading in modo molto processivo e interviene nei meccanismi di riparazione del DNA in seguito ai processi di riparazione per escissione dei nucleotidi. La replicazione del DNA inizia su specifiche sequenze dette origini di replicazione, in numero di circa 10.000 nel genoma umano e della lunghezza di migliaia di nucleotidi. Tali sequenze sono particolarmente ricche di A e T, dal momento che queste due basi si legano con soli due legami a idrogeno al posto dei tre tra G e C, e sono quindi più facilmente scindibili. Nell'uomo vi è un numero variabile di origini di replicazione su ciascuno dei cromosomi, distanziate da poche decine di migliaia sino a centinaia di migliaia di nucleotidi e durante il processo non si attiva una sola origine di replicazione per volta (occorrerebbero 800 ore per completare la replicazione), ma batterie di 20-80 origini di replicazione dette unità di replicazione. Ciascuna unità di replicazione è attivata in un momento diverso della fase S o il processo richiederebbe circa 1 ora a fronte di una media reale di 8 ore. Sembra che l'attivazione immediata o tardiva delle unità di replicazione dipenda dallo stato della cromatina in cui sono immerse e non dalla velocità della DNA polimerasi che è più o meno costante. L'eucromatina è replicata all'inizio della fase S, perché più prontamente raggiungibile e meno condensata, mentre l'eterocromatina è replicata tardivamente perché più condensata ed inaccessibile. Complessi proteici chiamati ORC (origin recognition complex) si legano alle origini di replicazione durante la fase G1 del ciclo cellulare, assieme ai caricatori Cdc6 e Cdt1 della DNA elicasi MCM. Tale aggregazione è chiamata complesso prereplicativo. L'attivazione di specifiche proteine chinasi dipendenti da ciclina (CDK) nella fase S promuove il distacco di Cdc6 e Cdt1 da ORC e dalle origini di replicazione in seguito alla loro fosforilazione, che le inattiva, segnalando che la cellula sta per effettuare sintesi di DNA. Attivano inoltre MCM e il complesso ORC fosforilandolo. Nuovi complessi prereplicativi non vengono più assemblati sino alla fase M che resetterà le fluttuazioni di Cdk che così non potranno più fosforilare le loro proteine bersaglio e quindi non potranno attivare nuove origini di replicazione. A livello di ciascuna origine di replicazione, la doppia elica si apre grazie ad MCM e all'idrolisi di ATP in ADP+P alla velocità di circa 1.000 nucleotidi al secondo. Ciascuna MCM continua a dividere le due eliche di DNA, ma ciascun filamento singolo tenderebbe naturalmente a formare cappi che bloccherebbero la sintesi di DNA da parte della DNA polimerasi, per questo in attesa della nuova sintesi alcune proteine (come RPA) dette single-strand binding proteins (SSBP) vi si legano e contribuiscono a tenerlo in una conformazione "tesa", lasciando esposte alla DNA polimerasi le basi. Subito dietro l'elicasi MCM la proteina PCNA, dalla caratteristica forma ad anello (la cosiddetta "pinza scorrevole") ed un suo caricatore con legato ATP sono caricati sul DNA. Quando la DNA polimerasi è a sua volta caricata davanti alla pinza, l'ATP viene idrolizzato ad ADP+P e il caricatore si stacca, mentre PCNA rimane adesa alla DNA polimerasi. PCNA è utile alla replicazione in quanto evita il distacco prematuro della DNA polimerasi senza però interferire con la sintesi REPLICAZIONE DEL DNA Pagina di 6 43 di DNA grazie alla sua conformazione anulare. Sul filamento ritardato, a differenza del filamento leader, il complesso PCNA+DNA polimerasi si stacca dal DNA ogni qualvolta incontra l'estremità 5' del frammento di Okazaki sintetizzato in precedenza, la DNA polimerasi infatti si stacca ogniqualvolta incontri DNA a doppio filamento. La DNA polimerasi non può iniziare a sintetizzare DNA immediatamente, perché ha bisogno di riconoscere un'estremità 3'-OH integra e normalmente questa non esiste sul singolo filamento. Per cui, prima della sintesi da parte di questo enzima, negli eucarioti interviene la DNA polimerasi α/primasi (che è un complesso proteico composto da 4 subunuità proteiche: 2 con attività polimerasica e 2 con attività primasica). La DNA polimerasi α/primasi procede in direzione 5'-3' sintetizzando brevi tratti di RNA di una decina di nucleotidi, in seguito le subunità con attività DNA polimerasica sintetizzano un frammento di 50-100 bp di DNA formando quindi brevi tratti ibridi DNA\RNA. Negli eucarioti i primer vengono sintetizzati ogni 100 - 400 nucleotidi. A questo punto la DNA polimerasi ε ha a disposizione estremità 3'-OH a partire dalle quali sintetizzare il nuovo filamento. Sul filamento leader, in direzione 5'-3' il filamento "figlio" è sintetizzato in modo continuo, ma sul filamento ritardato non può esserlo, dal momento che le DNA polimerasi sintetizzano solo in direzione 5'-3'. Per questo motivo la sintesi è spezzata e procede in direzione 5'-3' formando a partire dai primer tratti di 100-400 bp (1000-2000 bp nei batteri) detti frammenti di Okazaki, intervallati da nick. Il filamento ritardato è piegato all'indietro nella forcella della replicazione. Quando una DNA polimerasi incontra il 5' del frammento di Okazaki sintetizzato precedentemente si stacca e ricomincia a sintetizzare più a valle. Successivamente l'RNA primer viene degradato da diversi enzimi (endonucleasi FLAP, enzima FEN1) e sostituito da DNA da parte della DNA Pol δ, i nick creatisi sul filamento ritardato sono uniti dalla DNA ligasi. Tali nick sono sfruttati nella correzione degli appaiamenti sbagliati diretta dal filamento. In realtà quasi tutti i passaggi sono svolti da un unico ed enorme complesso proteico di più di 1.000 kDa che si associa al DNA e lo fa scorrere sintetizzandolo, esso comprende le elicasi, le polimerasi e così via. Inoltre, siccome un giro di un'elica di DNA è costituito da 10 coppie di nucleotidi è pressoché impossibile immaginare che la forcella replicativa generata dalle elicasi giri altrettanto velocemente, per cui in realtà la topoisomerasi I interviene attaccandosi al doppio filamento e creando un nick che usa come perno per far ruotare la doppia elica; tale processo non comporta l'utilizzo di ATP a differenza delle elicasi e della DNA ligasi. Il DNA umano si trova però normalmente avvolto a ottameri proteici (formati da istoni) detti nucleosomi per 1,7 giri e 147 coppie di nucleotidi. Ciascun nucleosoma è diviso dal successivo da un tratto di DNA linker di lunghezza variabile tra 7-80 nucleotidi, per un totale di circa 200 nucleotidi tra DNA linker e DNA avvolto sul nucleosoma. Bisogna inoltre tener conto dell'istone H1 che aiuta nel superavvolgimento del DNA e di proteine non istoniche che nel complesso hanno un peso pari agli istoni stessi. Queste formazioni proteiche costituiscono un intralcio alla velocità di replicazione già nell'eucromatina, ancor di più nell'eterocromatina dove il DNA è ulteriormente compattato. Per districare il DNA e renderlo disponibile alla sintesi agiscono dei complessi di rimodellamento della cromatina che idrolizzano ATP in ADP+P prima che intervenga l'elicasi. Tali complessi, costituite da proteine con carica negativa, distaccano il doppio filamento dal nucleosoma e lo mantengono distaccato per 10-50 millisecondi, per farlo si avvalgono dell'aiuto di chaperoni (NAP1 per H2A-H2B, CAF1 per H3-H4) anch'essi con carica negativa che rimuovono dall'ottamero i dimeri istonici H2A-H2B ripartendoli equamente, uno per ciascun nuovo nucleosoma in formazione una volta completata la sintesi di DNA; il tetramero H3-H4 invece non viene sostituito. Ciò significa che nel filamento neosintetizzato le modificazioni degli istoni H3-H4 sono ereditate ma soltanto in metà dei suoi nucleosomi. Il resto verrà coerentemente completato da complessi lettore-scrittore che lo ristabiliranno qual era nel filamento originario. La disposizione dell'istone H1 ristabilisce la conformazione in fibra di 30  nm della cromatina che in seguito può andare incontro ad ulteriore condensazione. la trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA. Concettualmente, si tratta del trasferimento dell'informazione genetica dal DNA all'RNA. Nel caso in cui il DNA codifichi una proteina, la trascrizione è l'inizio del processo che porta, attraverso la produzione intermedia di un mRNA, alla sintesi di peptidi o proteine funzionali. La trascrizione presenta un meccanismo di controllo della fedeltà (o proofreading), ma esso è molto meno efficace di quelli legati alla replicazione del DNA; lo stesso meccanismo di sintesi dell'RNA, nel quale l'enzima RNA polimerasi ha un ruolo centrale, comporta un numero di errori decisamente maggiore. PRIMA FASE: legame con la TBP I complessi di rimodellamento della cromatina agiscono svolgendo la fibra di cromatina da 30 nm costituita da un solenoide di nucleosomi per poi agire sul nucleosoma stesso con l'aiuto di chaperonine degli istoni rimuovendo temporaneamente i due dimeri degli istoni H2A-H2B dall'ottamero e facendovi quindi rimanere solo il tetramero H3-H4. Altri complessi di rimodellamento della cromatina svolgono temporaneamente il TRASCRIZIONE Pagina di 7 43 TIPI DI RNA mRNA contiene l'informazione per la sintesi delle proteine. Trasporta le informazioni dal DNA al ribosoma, i siti della sintesi proteica (traduzione) nella cellula. La sequenza codificante dell'mRNA determina la sequenza aminoacidica della proteina che viene prodotta rRNA entra nella struttura dei ribosomi. Componente catalitico dei ribosomi. Negli eucarioti, i ribosomi contengono quattro diverse molecole di rRNA: 18S, 5.8S, 28S e 5S rRNA; 3 di esse sono sintetizzate nel nucleolo. Nel citoplasma, RNA ribosomiale e le proteine si combinano per formare un nucleoproteina chiamato ribosoma. Il ribosoma lega l'mRNA ed effettua la sintesi proteica. Diversi ribosomi possono essere collegati ad un singolo mRNA in qualsiasi momento. Quasi tutti gli RNA che si trovano in una tipica cellula eucariotica sono rRNA. tRNA per la traduzione nei ribosomi. Piccola catena di RNA composta da circa 80 nucleotidi che trasferisce uno specifico aminoacido ad una catena polipeptidica crescente nel sito ribosomiale della sintesi proteica durante la traduzione. Esso possiede siti per l'attacco di aminoacidi e una regione anticodone per il riconoscimento del codone che si lega ad una sequenza specifica sulla catena dell'RNA messaggero attraverso legami idrogeno. hnRNA tipo di molecole di cui fa parte il pre-mRNA; snRNA necessario per la maturazione dell'HnRna ncRNA RNA non codificanti ("ncRNA") possono essere codificati dai propri geni (geni RNA), ma possono anche derivare da introni di mRNA. Gli esempi più importanti di RNA non codificanti sono l'RNA di trasporto (tRNA) e l'RNA ribosomiale (rRNA), entrambi i quali sono coinvolti nel processo di traduzione. Vi sono anche RNA non codificanti coinvolti nella regolazione genica, nel processo dell'RNA e altri ruoli. Alcuni RNA sono in grado di catalizzare le reazioni chimiche, come il taglio e legatura altre molecole di RNA e la catalisi di formazione del legame peptidico nel ribosoma: questi sono conosciuti come ribozimi. Vari processi cellulari, sintesi dei telomeri, inattivazione X, trasporto proteine in ER. tmRNA L'RNA transfer-messaggero si trova in molti batteri e plastidi. Si occupa di marcare le proteine codificate dall'mRNA che mancano di codoni di stop per la degradazione e impedisce il blocco del ribosoma. RNA regolatori Diversi tipi di RNA sono in grado di sottoregolare l'espressione genica per essere complementari ad una parte di un mRNA o il gene ddl DNA. I microRNA (miRNA; 21-22 nt) si trovano negli eucarioti e agiscono tramite l'RNA interference (RNAi o interferenza dell'RNA), dove un complesso effettore di miRNA e enzimi in grado di scindere l'mRNA complementare, blocca la traduzione dell'mRNA vengano tradotti o accelerara la sua degradazione. Mentre gli short interfering RNA (siRNA, 20-25 nt) vengono spesso prodotti in seguito alla rottura di RNA virale, vi sono anche fonti endogene di siRNA. I siRNA agiscono attraverso l'interferenza dell'RNA in modo simile ai miRNA. Alcuni miRNA e siRNA possono causare la metilazione dei geni target, diminuendo o aumentando in tal modo la trascrizione di questi geni. snRNA Molti RNA sono coinvolti nel modificare altri RNA. Gli introni sono "montati" in pre-mRNA grazie agli spliceosomi che contengono diversi piccoli RNA nucleari (snRNA),[6] o gli introni possono essere ribozimi che vengono collegati da loro stessi. L'RNA può anche essere alterato da avere i suoi nucleotidi modificati con altri nucleotidi di A, C, G e U. Negli eucarioti, le modifiche dei nucleotidi di RNA sono in genere diretti da piccoli RNA nucleolari (snoRNA; 60-300 nt). riscontrati nel nucleolo e nei corpi di Cajal. Gli enzimi quindi eseguono la modifica del nucleotide. rRNA e tRNA sono ampiamente modificati, ma anche gli snRNAs e l'mRNA possono anche essere bersaglio di modifiche di base. L'RNA può anche essere demetilato. dsRNA simile al DNA che può essere trovato in tutte le cellule. Il dsRNA costituisce il materiale genetico di alcuni virus (virus RNA a doppio filamento). L'RNA a doppio filamento, come l'RNA virale o il siRNA possono innescare l'interferenza RNA negli eucarioti, così come risposta dell'interferone nei vertebrati. Pagina di 10 43 La RNA polimerasi non richiede però un innesco. La trascrizione può iniziare solo presso una sequenza detta promotore e termina in presenza di altre sequenze particolari. Pre-mRNA L'elaborazione dell'mRNA differisce molto tra gli eucarioti ed i procarioti. L'mRNA procariotico è già maturo dopo la trascrizione e non richiede di essere controllato, tranne che in alcuni casi. Il pre-RNA eucariotico invece richiede diversi passaggi. Le tappe della maturazione sono: Splicing Inizialmente, il sito di splicing 5' viene riconosciuto dalla snRNP U1. Una delle subunità di U2AF si lega al segmento polipirimidinico, mentre l'altra si lega al sito di splicing 3'. La prima subunità interagisce con BBP e aiuta questa proteina a legarsi al punto di ramificazione. Questo arrangiamento di proteine e RNA è chiamato complesso precoce E. A questo punto, la snRNP U2 si lega al punto di ramificazione, con l'aiuto di U2AF, e spiazza BBP. Questo arrangiamento è chiamato complesso A. L'appaiamento di basi tra l'snRNA U2 e il punto di ramificazione è tale che il residuo A del punto di ramificazione venga spinto fuori dal segmento risultante a doppia elica di RNA e formi una protuberanza a singolo nucleotide. Questa A diventa così non accoppiata e disponibile per la reazione con il sito di splicing 5'. La fase successiva è il riarrangiamento del complesso A per l'avvicinamento di tutti e tre i siti di splicing. Questo avviene in una serie di fasi: le snRNP U4 e U6, assieme alla snRNP U5, si uniscono al complesso. Queste tre snRNP assieme sono dette tripla snRNP U4\U6*U5, in cui le snRNP U4 e U6 sono tenute assieme dall'accoppiamento complementare delle basi dei loro corrispettivi snRNA, mentre la snRNP U5 è legata in maniera più lassa attraverso interazioni proteina-proteina. Con l'ingresso della tripla snRNP U4\U6*U5 il complesso A diventa complesso B. Nel passaggio successivo, U1 lascia il complesso e U6 lo rimpiazza al sito di splicing 5'. Questo richiede che l'appaiamento tra l'snRNP U1 e il pre-mRNA venga rotto per permettere all'RNA U6 di riappaiarsi nella stessa regione. Questi passaggi completano l'assemblaggio. Il riarrangiamento successivo innesca la catalisi ed avviene nel modo che segue: U4 viene rilasciato dal complesso permettendo ad U6 di interagire con U2. Questo arrangiamento, chiamato complesso C, produce il sito attivo. Cioè il riarrangiamento avvicina all'interno dello spliceosoma quei componenti che assieme formano il sito attivo. Questo stesso riarrangiamento assicura che l'RNA substrato sia posizionato correttamente. Il fatto che la formazione del sito attivo sia successiva al completamento dell'assemblaggio dello spliceosoma rende il sito attivo disponibile solo nei siti di splicing corretto. La formazione del sito attivo mette in prossimità il sito di splicing 5' del pre-mRNA e il punto di ramificazione, facilitando la prima reazione di transesterificazione. La seconda reazione, tra i siti di splicing 5' e 3', è supportata dalla snRNP U5, che aiuta ad avvicinare i due esoni. Il passaggio finale implica il rilascio dell'mRNA e delle snRNP. Queste sono prima legate al cappio formatosi, ma vengono rilasciate in seguito alla rapida degradazione di questo frammento di RNA. Mutazioni negli introni o negli esoni possono rendere impossibile la saldatura e ciò comporta un'alterazione nella sintesi proteica. Errori comuni: - Mutazione di un sito di saldatura e conseguente perdita della funzione del sito. Si traduce nella comparsa prematura di un codone di stop sull'esone, nella perdita di un esone, o nell'inclusione di un introne nell'RNA maturo. Pagina di 11 43 - Mutazione di un sito di saldatura che ne riduce la specificità. Può causare lo spostamento del sito di saldatura, e dunque l'inserimento o la delezione di alcuni amminoacidi, o più frequentemente, la perdita del quadro di lettura. - Trasposizione di un sito di saldatura. Verranno incluse nell'RNA maturo più o meno basi rispetto alla norma. Gli esoni risulteranno, dunque, più corti o più lunghi. Splicing alternativo Sono generalmente riconosciute cinque modalità di splicing alternativo. - Salto dell'esone: in questo caso un esone può essere eliminato dal trascritto primario. Questa è la modalità più comune di splicing nel pre-mRNA dei mammiferi. - Esone mutuamente esclusivo: solo uno di due esoni viene mantenuto nell'mRNA maturo, non entrambi. - Sito di taglio alternativo 5': viene usato un sito di taglio al 5' alternativo, cambiando l'estremità 3' dell'esone a monte. - Sito di taglio alternativo 3': viene usato un sito di taglio al 3' alternativo, cambiando l'estremità 5' dell'esone a valle. - Introne trattenuto: i siti di taglio di un introne possono non essere riconosciuti. In questo caso l'introne non viene eliminato dal trascritto di mRNA. La differenza con il salto dell'esone sta nel fatto che la sequenza trattenuta non è fiancheggiata da introni. Se l'introne trattenuto si trova nella regione codificante, esso non deve alterare la cornice di lettura degli esoni. Se avviene il cambiamento di quest'ultima, esso potrebbe generare una proteina tronca o non funzionale. NB: Lo splicing, alternativo e non, è regolato da proteine che riconoscono sequenze specifiche e possono trovarsi sia negli introni che negli esoni. Le sequenze che permettono il riconoscimento dei siti di splicing sono chiamate exonic o intronic splicing enhancers (ESE o ISE) a seconda della loro localizzazione su esoni o introni, mentre le sequenze che mascherano tali siti sono chiamate exonic o intronic splicing silencers (ESS o ISS). Nella maggior parte dei casi le sequenze enhancer sono riconosciute da proteine della famiglia SR, mentre le sequenze silencer vengono riconosciute da proteine hnRNP. Capping una delle tappe di maturazione del pre-mRNA a mRNA che consiste nell'aggiunta di un "cappuccio" di 7- metil guanosina al residuo 5-terminale della catena con un insolito legame 5,5' trifosfato. Il primo passaggio del processo maturativo è effettuato grazie ad un enzima di capping dimerico che si associa al dominio fosforilato presente all'estremità carbossi-terminale (CTD) dell'RNA polimerasi (condensazione di una molecola di GTP con il trifosfato dell'estremità del trascritto e metilazione in posizione 7). Una serie di interazioni sequenziali tra proteine specifiche chiamate "fattori di inizio" (IF, initiation factor) e la subunità ribosomiale minore avviano l'assemblaggio del complesso per la traduzione dell'mRNA. La formazione del complesso di inizio include il riconoscimento per la traduzione del cappuccio in 5' di 7-metil- guanosina-trifosfato (m7G) indirizzato verso il complesso di preinizio da una subunità del complesso multiproteico del ribosoma eIF4, che srotola anche qualsiasi struttura secondaria formata a livello dell'estremità 5'. Questa reazione di metilazione aumenta l'idrofobicità e la basicità dei gruppi N-terminale presenti, aumentando l'affinità per le proteine specifiche di trascrizione (eIF4) e quindi per il riconoscimento e l'aggancio appropriato dell'mRNA al ribosoma. Può essere importante anche per altri processi essenziali, come lo splicing ed il trasporto. Inoltre questa modificazione rende più stabile l'mRNA, in quanto lo protegge dalle ribonucleasi del citoplasma, e ne permette il giusto verso di lettura nella successiva fase di traduzione da parte dei ribosomi. Successivamente segue l'aggiunta di due gruppi metili ai C'2 dei primi due nucleotidi, così da renderlo più stabile. Poliadenilazione Pagina di 12 43 In qualche caso la prima AUG può essere saltata e il ribosoma può iniziare a tradurre dalla seconda o dalla terza; questo permette in certi casi la produzione di proteine alternative a partire da uno stesso mRNA maturo. Tale fenomeno è comunemente noto come leaky scanning. L'attacco del tRNA iniziatore al sito P della subunità minore del ribosoma - in assenza di quella maggiore - è aiutato dal fattore di inizio eIF2 che lega GTP, il quale è idrolizzato quando la subunità maggiore si associa alla minore. Il movimento della subunità minore è ulteriormente facilitato dall'idrolisi di ATP in ADP+P. Il tRNA si lega al sito P del ribosoma, mentre il tRNA con l'anticodone corrispondente al codone successivo nell'mRNA legato al fattore d'allungamento EF1 si attacca nel sito A. EF1 unisce il tRNA al sito A ed effettua un controllo di qualità per non venire aggiunto se la corrispondenza codone-anticodone non è corretta; probabilmente questo avviene per una maggiore affinità tra le molecole, anche se non è stato ancora chiarito precisamente il meccanismo. EF1 inoltre lega il tRNA sull'mRNA in una conformazione curva che impedisce l'immediato legame dell'amminoacido legato al tRNA cui è attaccato al resto del polipeptide in crescita. Una volta riconosciuto un appaiamento corretto, l'rRNA sulla subunità minore idrolizza il GTP legato a EF1 a GDP e si stacca dal tRNA. Sembra che una corrispondenza corretta tra codone ed anticodone sia ulteriormente facilitata dalla formazione di legami idrogeno tra la subunità minore del ribosoma e la stessa coppia codone-anticodone. A questo punto vi sono quindi sul ribosoma due tRNA adiacenti uniti ciascuno al proprio codone sull'mRNA. A questo punto la peptidil transferasi, contenuta nella subunità maggiore del ribosoma, catalizza lo spostamento del legame che unisce l'amminoacido al suo tRNA nel sito P formando un legame peptidico tra l'amminoacido del tRNA presso il sito P e quello presso il sito A. La subunità maggiore si sposta quindi di tre nucleotidi verso l'estremità 3' dell'mRNA e così fa anche la subunità minore così che, alla fine degli spostamenti, il primo tRNA aggiunto si trova nel sito E e il secondo nel sito P mentre nel sito A si lega il fattore di allungamento EF2 con legato GTP. Il primo tRNA ormai privo di amminoacido si stacca dal sito E ed esce dal ribosoma, mentre un nuovo amminoacil-tRNA si attacca al sito A, il GTP di EF2 è idrolizzato a GDP e EF2 si stacca dal sito A. Quindi il legame tra amminoacido e tRNA del sito P è trasferito tra gli amminoacidi dei tRNA tra A e P per formare un nuovo legame peptidico e così la sintesi va avanti sino a che il ribosoma non trova un codone di stop. Quando l'RNA si duplica permette alla cellula di far avvenire un processo di splicing. Quando il codone di stop è raggiunto nella fase di terminazione il ribosoma cattura una molecola d'acqua che idrolizza il polipeptide ormai completo il quale si distacca dal ribosoma. Il processo è coadiuvato da fattori di rilascio (RF1, RF2, RF3 nei batteri, eRF1 ed eRF3 negli eucarioti), proteine che simulano l'azione del tRNA, si legano al sito A e liberano la proteina nel citoplasma (fenomeno conosciuto come mimetismo molecolare). La sintesi delle proteine può avvenire molto rapidamente perché più ribosomi possono legarsi ad uno stesso filamento di mRNA consentendo quindi la costruzione simultanea di più catene proteiche. Un filamento di mRNA con più ribosomi è chiamata polisoma. INIBITORI È possibile bloccare specificamente la sintesi proteica facendo usare inibitori specifici quali l'anisomicina e la cicloesimide. La traduzione può anche essere bloccata per effetto di mutazioni genetiche come ad esempio le mutazioni con slittamento di fase (frame shift) le quali, possono essere ottenute con la delezione (o l'inserzione) di un singolo paio di basi. Un ulteriore sistema di protezione della cellula da mutazioni, in particolare da mutazioni puntiformi in grado di originare un codone di stop prematuro è rappresentato dal cosiddetto complesso di giunzione esonica o EJC. Questo agglomerato di proteine in caso di normale traduzione viene rimosso dal ribosoma nel suo normale avanzamento, ma resta sull'mRNA la cui traduzione sia stata interrotta prematuramente, portandolo alla degradazione grazie al suo marchio. Ammiinoacil—tRNA sintetasi Una amminoacil-tRNA-sintetasi (numero EC 6.1.1) è un enzima che catalizza l'esterificazione di uno specifico amminoacido (o di un suo precursore) ad uno dei possibili tRNA corrispondenti, a formare un amminoacil-tRNA. Ne esistono 20 in ciascun organismo, una per ogni amminoacido codificato. Ciò significa che ogni gruppo di tRNA isoaccettori viene amminoacilato da un singolo enzima. Pagina di 15 43 La ligasi lega inizialmente una molecola di ATP ed il corrispondente amminoacido (o il suo precursore), a formare un amminoacil-adenilato (con il rilascio di una molecola di pirofosfato), che resta adeso all'enzima. Esso lega successivamente la molecola di tRNA appropriata, spostando l'amminoacido dall'adenilato alla coda 3' della molecola del tRNA (in particolare il 2'-OH o il 3'-OH dell'ultima base, A76). amminoacido + ATP → amminoacil-tRNA + AMP (amminoacido + ATP → amminoacil-AMP + PPi e amminoacil-AMP + tRNA → amminoacil-tRNA + AMP) Svolgono un ruolo molto importante, in quanto dotate di un'elevatissima specificità di substrato che consente di legare l'amminoacido appropriato ai relativi tRNA isoaccettori. Si può dire che sono gli enzimi che operano la traduzione dell'informazione genica in quanto assegnano un amminoacido a ciascun anticodone del tRNA. Alcune sintetasi presentano anche attività di proofreading, per garantire il corretto appaiamento amminoacido-tRNA: se il tRNA risulta caricato erroneamente, il legame con l'amminoacido viene idrolizzato. Esistono due classi di amminoacil-tRNA sintetasi: la classe I presenta due motivi di sequenza altamente conservati, e amminoacila il 2'-OH; la classe II presenta tre motivi di sequenza altamente conservati, e amminoacila il 3'-OH. L'unica eccezione è la fenilalanil-tRNA sintetasi (PheRS), enzima di classe II che lega la fenilalanina al 2'-OH del tRNAPhe. Entrambe le classi sono costituite da amminoacil-tRNA sintetasi composte da diversi domini. Tipicamente, esse presentano un dominio catalitico (dove si svolgono entrambe le reazioni sopra descritte) ed un dominio legante l'anticodone (che interagisce con l'anticodone del tRNA per garantire il legame del corretto amminoacido al tRNA stesso). Alcune altre amminoacil-tRNA sintetasi presentano pure alcuni domini leganti RNA, in grado di rompere eventuali legami tra amminoacidi e tRNA non corrispondenti. Tutti i domini catalitici delle amminoacil-tRNA sintetasi appartenenti ad una singola classe presentano una elevata somiglianza tra loro. I domini catalitici degli enzimi di classe I e II sono invece molto differenti: gli enzimi di classe I, infatti, presentano il frequente ripiegamento di Rossmann, con una architettura a foglietto beta parallelo, mentre quelli della classe II presentano un ripiegamento proteico unico, composto da foglietti beta antiparalleli. La decodifica biologica viene effettuata dal un particolare RNA nel ribosoma, il quale assembla una serie di aminoacidi secondo un ordine specificato dall'mRNA. Ciò avviene utilizzando l'RNA transfer (tRNA), che trasporta gli aminoacidi e che legge l'mRNA tre nucleotidi alla volta, più specificamente la loro tripletta di basi, o codone. Un codone corrisponde a un singolo amminoacido. Poiché la maggior parte dei geni si esprime secondo lo stesso codice, questo viene spesso indicato come "codice genetico canonico" o "standard", o semplicemente "il codice genetico", anche se in realtà alcune CODICE GENETICO Pagina di 16 43 versioni si sono con il tempo evolute. Ad esempio, la sintesi proteica che avviene nei mitocondri umani si basa su un codice genetico leggermente diverso da quello standard. La traduzione inizia in corrispondenza di un codone di inizio ma, a differenza del codone di termine, questi non è sufficiente per avviare il processo di sintesi; in prossimità del codone di avvio devono infatti anche trovarsi alcune sequenze tipiche che permettono all'mRNA di legarsi ai ribosomi. A seconda dell'organismo, codoni alternativi di inizio possono essere GUG o UUG; questi codoni normalmente rappresentano, rispettivamente, la valina e la leucina, ma come codoni di inizio sono tradotti in metionina o formilmetionina. Altri codoni di inizio sono CUG, UUG e, nei procarioti, GUG e AUU. Ai tre codoni di stop sono stati assegnati dei nomi: UAG o codone Ambra, UAA o codone Ocra, e UGA o codone Opale. Gli altri due codoni di terminazione sono stati chiamati in modo da rimanere nel tema dei colori (rispettivamente ocra e opale). I codoni di stop vengono anche chiamati codoni di "cessazione" o codoni "nonsense". Il loro scopo è di far sì che vi sia il rilascio del polipeptide nascente dal ribosoma e questo avviene poiché non vi è un tRNA affine che possieda anticodoni complementari a queste sequenze di stop, e quindi nel ribosoma viene a legarsi un fattore di rilascio. Destino post-sintetico: A) Proteine che possiedono le sequenze segnale vengono sintetizzate su RIBOSOMI attaccati a Reticolo Endoplasmatico: 1.La sintesi proteica inizia sui ribosomi liberi 2.La sequenza segnale compare in una fase precoce del processo sintetico 3.La sequenza segnale ed il ribosoma si legano al complesso SRP (Signal Recognition Particle) - sospensione temporanea dell’allungamento 4.SRP dirige il ribosoma e il polipeptide incompleto verso un gruppo di recettori specifici posti sul lato citosolico di ER. Il polipeptide passa al complesso di traslocazione del peptide 5.SRP si dissocia dal ribosoma 6.Riprende l’allungamento del polipeptide che viene introdotto direttamente all’interno di ER 7.La sequenza segnale viene rimossa 8.Il ribosoma si dissocia e viene riciclato Nel lume di ER le proteine neosintetizzate vengono ulteriormente modificate, assumono il corretto ripiegamento, si formano eventuali ponti disolfuro, N-glicosilazioni Le proteine modificate si spostano da ER verso il lato cis del complesso di Golgi all’interno di vescicole di trasporto. Nel complesso di Golgi le proteine possono subire ulteriori modificazioni (O- glicosilazioni), vengono smistate e indirizzate alle rispettive destinazioni finali (lato trans). La segregazione delle proteine destinate all’esterno della cellula rispetto a quelle destinate alla membrana plasmatica o ai lisosomi avviene probabilmente sulla base delle diverse caratteristiche strutturali della sequenza segnale. B) Le sequenze segnale per il trasporto verso il nucleo (NLS) non vengono eliminate: Nella maggior parte degli eucarioti pluricellulari l’involucro nucleare si rompe nel corso di ogni divisione cellulare. Quando la divisione cellulare è completata e l’involucro nucleare riformato, le proteine nucleari disperse devono rientrare nel nucleo. Per permettere l’ingresso ripetuto di queste proteine, la sequenza NLS non viene rimossa dopo che la proteina è arrivata alla sua destinazione. NLS non è localizzata all’estremità N-terminale ma può trovarsi in qualsiasi punto della sequenza primaria della proteina. In genere è costituita da 4-8 aa e include alcuni residui basici consecutivi (Arg o Lys). Il trasporto verso il nucleo viene mediato da proteine che vanno avanti e indietro tra citosol e nucleo (importine α e β ) e da Ran. C) Degradazione delle proteine: Esse vengono continuamente degradate per mediante un processo selettivo che previene l’accumulo di quelle non necessarie o di quelle anormali e per facilitare il riciclaggio degli amminoacidi. Le proteine più rapidamente degradate sono quelle anormali (non funzionanti a causa di errori durante la traduzione o per danneggiamenti post-traduzionali). Pagina di 17 43 1) Controllo delle modificazioni dell’RNA / controllo post-trascrizionale: Vedi maturazione dell’mRNA 1- aggiunta del CAP (m7G) aggiunta in 5' di una 7metil-guanosina: preserva il trascritto dalla degradazione ed è segnale di aggancio per il ribosoma 2- poli-adenilazione in 3'OH aggiunta di una coda di poliA (200-250): aiuta il passaggio al citoplasma, influenza la stabilità dell’mRNA 3- splicing processo di taglia e cuci per eliminare gli introni L’mRNA al termine della maturazione presenta: - Regione non tradotta in 5 ́, 5 ́ UTR o leader -> efficienza della traduzione - Regione codificante, CDS (coding sequence) -> Traduzione - Regione non tradotta in 3 ́, 3 ́ UTR o trailer -> Stabilità (velocità di degradazione; concetto di emivita da pochi minuti a 50-100 ore) 2) Controllo del trasporto e della localizzazione dell’RNA: 3) Controllo della traduzione: Operato da fattori proteici che possono influire sull’inizio della traduzione e quindi modularla. 4) Controllo della degradazione dell’mRNA: - miRNA contribuiscono alla regolazione deòll’apoptosi. 5) Controllo dell’attività della proteina: ◼ Destino post-sintetico delle proteine: I ciceroni interagiscono con la proteina e mascherano le regioni idroponiche per evitare interazioni. L’azione dei cialtroni richiede energia (idrolisi di ATP). Lavorano insieme ad altri fattori (Hsp70 aiutate da Hsp40). Altre tipologie di sono chaperonine (Hsp60, TCP1, GroEL) DIMERI, ognuna delle regioni può accogliere la proteina. Competizione tra chaperonine e PROTEAOMA (= lavora nel nucleo e nel citoplasma e taglia una proteina non correttamente foldada affinché sia digerita). Ripiegamento: - corretto senza aiuto - aiuto di un chaperon molecolare - non corretta Controllo qualità per impedire l’accumulo di proteine sbagliate non funzionali. Proteine non correttamente ripiegate nel REG sono reindirizzare nel citoplasma per essere degradate. Proteine del proteasoma 1% di quelle delle cellule, all’inizio -> siti di protesi = ENZIMI PROTEOLITICI confinati. Le proteine non correttamente ripiegate sono etichettate dalle ubiquitina da ubiquitina-ligasi. L’ubiquitinazione di una proteina può dare varie indicazioni alla cellula a seconda del numero raggiunto. POLIUBIQUITINAZIONE -> degradazione indirizzamento al proteasoma. La cellula può eliminare proteine che non hanno fatto in tempo as assumere il corretto ripiegamento. Come è evidente, per la sintesi proteica, è necessaria molta energia. ◼ Smistamento: Il sistema delle endomembrane dev’essere considerato come un unica struttura. Vedi destino post- sintetico. Pagina di 20 43 Trasduzione del segnale: Le cellule comunicano e interagiscono tra loro tramite il fenomeno della segnalazione cellulare Una cellula segnalatrice produce una molecola segnale, riconosciuta da una cellula bersaglio, per mezzo di una proteina recettore, che a sua volta produce segnali intracellulari L’intero processo che traduce l’informazione portata dal messaggero extracellulare in cambiamenti intracellulari è chiamato trasduzione del segnale. I segnali possono avere efficacia a breve o largo raggio. Cellule differenti possono rispondere in maniera diversa allo stesso segnale Ogni cellula possiede un corredo di recettori diversi. I sistemi di trasmissione interna dei vari segnali interagiscono. I messaggeri extracellulari inducono risposte intracellulari influenzando l’attività di molte proteine cellulari. Sistemi di segnalazione cellulare a cascata (2) Molecole segnale extracellulari: • Piccole molecole come amminoacidi e loro derivati. Costituiscono neurotrasmettitori e ormoni • Gas come NO e CO • Ormoni steroidei, derivati del colesterolo • Ecosanoidi, molecole non polari derivate dall’acido arachidonico • Proteine, transmembrana, della matrice extracellulare o secrete nello spazio extracellulare In generale si possono distinguere in: - Molecole troppo grandi o troppo idrofiliche per attraversare la membrana: la loro azione dipende dalla presenza di recettori di superficie - Molecole piccole idrofobiche che diffondono attraverso la membrana: attivano enzimi interni o legano recettori intracellulari che regolano l’espressione genica. - Per risposte rapide la strategia enzimatica è la più efficace Esempio dell’ossido nitrico (NO) Vedi pazienti con angina trattati con nitroglicerina, che nel corpo si converte in NO e fa rilassare le arterie coronarie Anche terminazioni nervose inducono vasodilatazione tramite NO (vedi erezione) In molte cellule bersaglio NO si lega alla guanilato ciclasi, che catalizza la formazione di GMP ciclico, segnale intracellulare che porta alla risposta finale. Il viagra blocca la degradazione del GMP ciclico. Alcuni ormoni attraversano la membrana cellulare e si legano a recettori intracellulari. Ormoni steroidei e tiroidei. Negli uomini la mancanza di recettore per il testosterone, responsabile nel maschio della formazione dei genitali esterni e dello sviluppo del cervello e dei caratteri sessuali secondari, causa gravi Pagina di 21 43 conseguenze (3). Oltre ai pochi recettori intracellulari si distinguono tre grandi classi di recettori di superficie - I recettori annessi a canali ionici sono importanti per la trasmissione rapida attraverso le sinapsi del sistema nervoso; (4) (gli altri due tipi sono presenti in generale su tutte le cellule) - I recettori di superficie cellulare rappresentano anche un bersaglio per sostanze estranee, quali farmaci, stupefacenti, veleni. (5-6) Interruttori molecolari (img. 7) I segnali extracellulari che arrivano ai recettori accoppiati alle proteine G e ai recettori legati ad enzimi, passano a molecole intracellulari, per lo più proteine ma anche piccole molecole come GMP ciclico, AMP ciclico e Ca2+. Le proteine segnale interne si compor tano i n gene re come i n t e r r u t t o r i m o l e c o l a r i e d appartengono principalmente a due categorie: proteine “accese o spente” da chinasi/fosfatasi e proteine che legano GTP. RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G Costituiscono la più grande famiglia di recettori di superficie. Attivato dal ligando, il recettore interagisce con una proteina G. (8) Pagina di 22 43 Non subiscono cambiamenti conformazionali ma, una volta attivati da un segnale extracellulare, inducono la formazione di dimeri. (11) Per disattivare il sistema entrano in atto protein tirosin fosfatasi o in certi casi i recettori attivati vengono portati per endocitosi ai lisosomi e digeriti. Recettori tirosin chinasici possono attivare la fosfatidil inositol 3-chinasi che catalizza la fosforilazione di inositol fosfolipidi di membrana. I recettori tirosin chinasici attivano la proteina Ras che lega il GTP. Una volta attivata Ras innesca una fosforilazione a cascata, dove una serie di protein chinasi si attivano in sequenza. Questa cascata porta il segnale dalla membrana plasmatica al nucleo ed è chiamata cascata MAP (Mitogen Activated Protein)-chinasica. Forme mutanti di Ras portano ad una proliferazione cellulare incontrollata (cancro) Pagina di 25 43 Altri recettori legati a enzimi mandano il segnale al nucleo in maniera più diretta Ormoni e mediatori locali detti citochine si legano a recettori che attivano regolatori proteici di geni Ad esempio gli interferoni sono citochine che inducono la sintesi di proteine importanti perché la cellula resista a infezioni virali. Trasmissione di segnale ancor più diretta per i recettori serin treonin chinasici: Pagina di 26 43 Fra le vie di segnalazione esiste una densa rete di interconnessioni regolatorie: 
 Pagina di 27 43 si autofosforila su residui di serina e treonina e resta attiva anche quando il Ca2+ è stato sottratto finché non viene spenta da alcune fosfatasi. - I recettori collegati ad enzimi sono proteine transmembrana, generalmente a singolo passaggio, che possiedono un dominio extracellulare per il legame con il ligando e un dominio citosolico che possiede attività enzimatica intrinseca o è associato a diverse proteine, tra cui enzimi. Malgrado la diversità strutturale, molti recettori collegati ad enzimi attivano le stesse vie di segnalazione dei GPCR. Se ne distinguono sei classi. - I recettori tirosina chinasi o RTK sono proteine con un dominio citosolico capace di autofosforilarsi su specifici residui di tirosina, che possono fungere da ancoraggio per altre proteine citosoliche, inoltre possono fosforilare altre specifiche proteine. - I recettori associati a tirosina chinasi sono proteine con dominio citosolico privo di attività autofosforilante, ma attivano le loro vie di segnalazione reclutando tirosina chinasi citoplasmatiche. I recettori serina/treonina chinasi sono proteine con dominio citosolico capace di autofosforilarsi su specifici residui di serina o treonina, ma possono fosforilare gli stessi amminoacidi anche su proteine che sono loro associate. - I recettori associati a istidina chinasi attivano un'istidina chinasi che si autofosforila su residui di istidina e poi trasferisce un gruppo fosfato ad una seconda proteina di segnalazione. I recettori guanilato ciclasi possiedono un'attività enzimatica che permette loro di produrre direttamente cGMP da GTP, agendo quindi come una guanilato ciclasi. - Le tirosina fosfatasi simili a recettori possiedono un'attività fosfatasica che rimuove il fosfato da istidine su alcune proteine di segnalazione. I ligandi di queste proteine non sono conosciuti e sono perciò considerati recettori orfani. Talvolta non vengono neppure considerati recettori. Recettori tirosin-chinasici I recettori tirosin-chinasici (RTK) sono una delle tipologie più comuni di recettori di superficie collegati agli enzimi. I loro ligandi spesso sono fattori di crescita o neurotrofine come VEGF, NGF, EGF, HGF, FGF, MCSF, PDGF, IGF-1 e i recettori assumono spesso il nome dal loro ligando. Una classe di otto proteine extracellulari dette efrine (correlate con la migrazione e la crescita assonica) è strettamente associata ad alcuni RTK chiamati recettori Eph (dall'inglese ephrine), codificati da 13 geni sui 60 geni umani per RTK. Le efrine quando si legano al loro recettore Eph attivano sia se stesse che il recettore, determinando cambiamenti sia nella cellula di segnalazione che nella cellula bersaglio. In generale un recettore RTK in forma inattiva è costituito da due monomeri a singolo passaggio che vengono attivati e dimerizzati una volta che il ligando si lega al dominio extracellulare. La dimerizzazione comporta la transautofosforilazione (un monomero fosforila l'altro e viceversa) su residui specifici di tirosina. Talvolta, come per il recettore dell'insulina, l'RTK in forma attiva è un tetramero. Le tirosina fosforilate aumentano l'attività chinasica dell'RTK e fungono da siti di legame per proteine intracellulari specifiche per ciascuna tirosina. Il legame avviene perché tali proteine sono in grado di riconoscere la tirosina fosforilata e la conformazione dell'RTK attorno ad essa. Queste proteine sono attivate dal legame con la fosfotirosina e talvolta possono a loro volta autofosforilarsi o essere fosforilate su tirosine (questo secondo caso accade a IRS1, proteina associata al recettore per l'insulina). Tre delle più note proteine associate a RTK sono la fosfolipasi C-γ, che attiva la via dell'inositolo trifosfato e quindi PKC, la proteina Src che è a sua volta una tirosina chinasi e la fosfoinositide-3'-chinasi (PI 3-chinasi) che fosforila alcuni lipidi trasformandoli in siti d'attracco per altre proteine di segnalazione. Un dominio comune alle tre proteine elencate e con cui queste si legano alle fosfotirosine di RTK è SH2 (Src homology 2 domain), ma vi si può legare anche il dominio PTB (phosphotyrosine binding domain). Generalmente il legame di proteine alle fosfotirosine attiva una via di segnalazione, ma in alcuni casi la inibisce, come fa la proteina c-Cbl che monoubiquitina alcuni recettori segnalandoli per la degradazione (down-regolazione) che viene effettuata da proteine che contengono UIM (motivi d'interazione con l'ubiquitina) le quali dirigono il recettore verso vescicole rivestite da clatrina che infine si fondono con lisosomi. Fino a quando un recettore non è degradato può potenzialmente attivare ancora vie di segnalazione nell'endosoma. Le proteine associate a RTK sono a loro volta spesso associate ad una proteina adattatrice, Grb2, tramite un dominio SH2. Grb2 possiede inoltre altri due domini SH3 per l'interazione con altre proteine. Uno dei domini SH3 spesso interagisce con Sos, una Ras-GEF (fattore di scambio guanilico per Ras) adesa alla membrana plasmatica tramite un dominio PH (pleckstrin homology domain) che si lega ad un fosfoinositide trifosfato. Sos attiva Ras, una GTPasi monomerica che ha dunque GDP legato quando inattiva, per cui sostituisce GDP con GTP, a sua volta Ras attiva ulteriormente Sos in un circuito a feedback positivo. Successivamente fosfatasi specifiche rimuovono il fosfato da proteine a monte di Ras, inattivandole, mentre Ras stessa è inattivata da una Ras-GAP che idrolizza il GTP in GDP con liberazione di fosfato inorganico. Ras, quando attiva, fosforila il modulo della protein-chinasi attivata da Segnalazione tramite recettori collegati ad enzimi Pagina di 30 43 mitogeni, comunemente noto come modulo della MAP chinasi. Ras attiva Raf (la chinasi MAPKKK), la quale a sua volta, con un meccanismo a cascata, attiva tramite fosforilazione Mek (MAPKK) che a sua volta attiva per fosforilazione Erk (MAPK). Erk entra nel nucleo e fosforila alcune proteine regolatrici di geni oppure attiva altre proteine. Tra i geni attivati ve ne sono alcuni che regolano la proliferazione cellulare, come le cicline, perciò non sorprende che mutazioni iperattivanti di Ras inducano la sovraespressione di queste proteine con conseguente iperproliferazione cellulare e dunque cancro. Ras infatti è mutata nel 30% delle neoplasie umane, il che ne fa uno dei bersagli preferiti delle cellule tumorali dopo p53. Il modulo MAP chinasi viene spesso spento dalla stessa Erk che inattiva Raf tramite feedback negativo, altre volte invece sono delle fosfatasi a doppia specificità (sia per tirosina che per treonina) ad inattivare il complesso rimuovendo i gruppi fosfato. Generalmente la cascata delle MAP chinasi funziona efficientemente grazie a proteine impalcatura che legano tutte le chinasi coinvolte migliorandone l'interazione a causa della prossimità indotta. In un'altra importante via (via PI3-chinasi-Akt) attivata dagli RTK una classe di proteine nota come PI 3 chinasi, attaccata normalmente alla coda di RTK, fosforila alcuni inositolo fosfolipidi (PIP2) in siti multipli generando fosfoinositidi (PIP3). I fosfoinositidi sono siti d'attracco ideali per molte proteine. I GPCR possono attivare la stessa via, tuttavia agiscono sulla classe Ib delle PI 3 chinasi, mentre gli RTK sulla classe Ia. Per far terminale il segnale alcune fosfatasi, in particolare le PTEN, defosforilano i fosfoinositidi determinando il distacco delle proteine che vi si legano. Mutazioni in PTEN aumentano il rischio di sviluppare alcuni tipi di cancro. Ai fosfoinositidi si attaccano due proteine, Akt (detta anche protein-chinasi B, PKB) e la protein-chinasi 1 dipendente da fosfoinositidi (PDK1). Il legame delle due proteine ad un fosfoinositide determina l'attivazione di Akt da parte di PDK1. Akt attiva una GAP chiamata Tsc2 che a sua volta disattiva Rheb. Rheb è una GTPasi attiva con GTP legato che attiva il complesso proteico mTOR. mTOR nei mammiferi è costituita dal complesso mTOR1, con legata la proteina raptor, oppure mTOR2, con legata la proteina rictor. Sono entrambe legate alla crescita e alla sopravvivenza cellulare ed interagiscono con la GTPasi monomerica Rho che a sua volta agisce sul citoscheletro. Akt inoltre, oltre ad attivare Tsc2, viene fosforilata da mTOR. A questo stato d'attivazione Akt è in grado di fosforilare i complessi Bad-proteina antiapoptotica (Bad è una proteina proapoptotica), determinando il distacco di Bad dalla proteina antiapoptotica e la sua inattivazione da parte della proteina 14-3-3. Il risultato netto è un'inibizione dell'apoptosi coerente con la proliferazione e la crescita cellulare. Recettori associati a tirosina chinasi[ I recettori associati a tirosina chinasi non possiedono attività tirosin-chinasica intrinseca ma sono associati covalentemente a tirosine chinasi sul lato citoplasmatico. La classe più comune di tirosin-chinasi associate a questo tipo di recettori è la famiglia delle Src, che comprende Src, Yes, Fgr, Fyn, Lck, Lyn, Hck e Blk. Ciascuna proteina Src contiene un dominio SH2 con cui si lega al recettore e almeno un dominio SH3 con cui interagisce con altre proteine. Proteine della famiglia Src sono attivate anche da proteine G e collegate a recettori GPCR. I recettori associati a tirosina chinasi comprendono alcuni recettori per l'antigene, per le interleuchine, per le integrine e per le citochine. Nel caso dei recettori per le citochine la proteina con attività tirosin-chinasica a cui sono associati è una JAK chinasi o chinasi Janus. Si conoscono quattro JAK chinasi, chiamate JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2. I recettori sono due monomeri separati quando inattivati, ma il legame del ligando li fa dimerizzare ed avvicina le due JAK chinasi che si fosforilano per transautofosforilazione su tirosine. Una volta attivate, fosforilano tirosine anche sul recettore per le citochine. Le fosfotirosine attirano proteine regolatrici di geni della famiglia STAT (signal transducers and activators of transcription) normalmente presenti nel citoplasma. Tali proteine contengono un dominio SH2 che si lega alla fosfotirosina del recettore, dopodiché vengono fosforilate dalle JAK ed attivate. Le STAT che si legano al recettore sono generalmente STAT1, STAT2 o STAT5. Le due STAT fosforilate si staccano dal recettore e formano un omodimero o un eterodimero tramite il dominio SH2, dopodiché migrano nel nucleo e si legano ad elementi di risposta alle citochine, favorendone la trascrizione dei geni corrispondenti. La via viene spenta da tirosina fosfatasi che possono anche essere a doppia specificità (rimuovono cioè gruppi fosfato anche da serina o treonina oltre che da tirosina). Recettori serina/treonina chinasi Sono proteine transmembrana a singolo passaggio con almeno un dominio serina/treonina-chinasi sul lato citoplasmatico della membrana, capaci di autofosforilazione. Si distinguono in recettori serina/treonina chinasi di tipo I e di tipo II, sono entrambi omodimeri e strutturalmente simili. I ligandi principali di questo tipo di recettori sono le BMP (bone morphogenic proteins) e la famiglia del fattore trasformante di crescita β (TGFβ). Quando il ligando si lega al recettore appropriato, questo si autofosforila nel dominio con attività chinasica su serine o treonine specifiche, attirando una classe di proteine nota come Smad ed attivandole. Qualora il ligando sia una proteina della famiglia di TGFβ, sono coinvolte Smad2 e Smad3, qualora invece sia una BMP sono coinvolte Smad1, Smad5 o Smad8. Le cinque Smad nominate sono dette Smad attivate da recettore (R-Smad). Una volta fosforilata, come già visto per le STAT, Smad si dissocia dal recettore e si associa con Smad4 detta anche co-Smad in quanto si lega alle R-Smad per formare un complesso. Il complesso così formato si dirige nel nucleo dove si lega a sequenze specifiche che aiutano ad attivare o Pagina di 31 43 inibire alcuni geni. La via è spenta dall'endocitosi dipendente da caveole dei recettori che legano BMP o proteine della famiglia di TGFβ; successivamente questi sono ubiquitinati e quindi degradati. In realtà, l'endocitosi può anche attivare ulteriormente questi recettori se endocitati in endosomi precoci derivati da vescicole rivestite da clatrina. Una proteina chiamata SARA (Smad anchor for receptor activation) si lega ai recettori migliorando l'efficienza della fosforilazione di Smad. Nel nucleo il complesso Smad è defosforilato e poi trasportato nuovamente nel citoplasma dove può iniziare un nuovo ciclo. I recettori inoltre possono anche essere inibiti da Smad-inibitrici (Smad6 e Smad7) la cui trascrizione è favorita dalle R-Smad, si attua così una regolazione a feedback negativo. Le Smad inibitrici competono con le R-Smad per il legame al recettore, saturandone il dominio di legame e quindi impedendo alle Smad leganti il recettore di intervenire. Possono inoltre attirare Smurf, un'ubiquitina ligasi che marca il recettore per la degradazione, o, ancora, possono reclutare proteine fosfatasi che defosforilano il recettore, inattivandolo e si legano a Smad4 competendo con le R-Smad. Ciclo cellulare: Punti di controllo: Il ciclo cellulare è un processo estremamente importante; errori in questo processo potrebbero compromettere la vitalità cellulare. Per tale motivo, nel ciclo cellulare, sono presenti dei punti di controllo o checkpoints, localizzati a livello delle transizioni G1/S e G2/M. Infatti, tra le fasi S ed M ci sono normalmente due periodi di tempo detti "gap": G1 fra la fine della mitosi e l'inizio della fase S e G2 fra il termine della fase S e l'inizio della fase M. In questi periodi di tempo si ha la maggior parte della sintesi proteica con conseguente aumento della massa cellulare e la realizzazione dei controlli che impediscono l'inizio della fase successiva se non è stata completata quella precedente. Le fasi G1 e G2 sono quelle che possono subire la maggior variabilità di durata e in alcuni casi particolari possono anche essere eliminate, contrariamente alle fasi S e M che sono essenziali e che rappresentano due eventi chiave del ciclo cellulare. L'insieme delle fasi G1, S e G2 è globalmente identificato come interfase. Si dice che le cellule che hanno smesso di dividersi, in modo temporaneo o irreversibile, sono in uno stato di quiescenza (fase G0). Le cellule nervose e quelle striate dei muscoli scheletrici, ad esempio, rimangono in questo stadio per tutta la vita dell'organismo. Le cellule che non vanno più incontro a divisione in seguito ad invecchiamento o a danneggiamento del DNA sono invece chiamate senescenti. È da osservare che la mitosi produce sempre due cellule geneticamente identiche alle cellula madre e che la maggior parte degli organuli citoplasmatici si distribuisce casualmente nelle cellule figlie. Il sistema di controllo del ciclo cellulare è costituito da una famiglia di proteine che regolano l'entrata della cellula nei diversi stadi del ciclo cellulare, fungendo come una sorta di interruttori binari rigidamente programmati che possono essere alternativamente in uno stato "spento" e in uno stato "acceso", senza possibilità intermedie e in modo irreversibile. Sono inoltre in grado di rilevare il comportamento della cellula durante il ciclo cellulare, così da ritardare l'entrata in una determinata fase qualora la cellula non fosse ancora pronta perché, ad esempio, non risponde a requisiti essenziali per il passaggio da una fase all'altra. Una volta che la cellula ha completato tutti i cambiamenti essenziali per passare di fase durante il ritardo concesso dal sistema di controllo, il ciclo può riprendere, a patto che i tempi necessari non siano troppo lunghi. Il sistema di controllo, dal momento che svolge un compito fondamentale per la cellula, è molto affidabile, ma non è identico in tutte le cellule, presenta quindi un certo grado di adattabilità, riesce inoltre a ovviare alla mancanza di suoi componenti non essenziali per la prosecuzione del ciclo. Nella maggior parte delle cellule degli eucarioti superiori, il sistema di controllo possiede tre stazioni regolatrici fondamentali per la prosecuzione del ciclo cellulare dette punti di controllo (checkpoints). Qualora la cellula rilevasse problemi al suo interno o all'esterno può scatenare meccanismi che bloccano il ciclo cellulare in uno di questi tre punti. il punto di restrizione è il primo punto di controllo del ciclo cellulare, collocato alla fine della fase G1. Superandolo, la cellula inizia a duplicare il proprio DNA entrando nella fase S. Ciò che permette il superamento del controllo è essenzialmente un ambiente extracellulare ed intracellulare favorevole. Il punto di controllo G2/M è il secondo, posto alla fine di G2. Il suo superamento permette l'entrata nella fase M e quindi l'inizio del processo della mitosi, a partire dalla profase, fino ad un punto intermedio tra la metafase e l'anafase. Permette il superamento del controllo un ambiente favorevole e l'avvenuta replicazione del DNA. Sistema di controllo del Ciclo cellulare Pagina di 32 43 Transizione G2/M Il fattore di trascrizione E2F, precedentemente rilasciato da pRB, favorisce la formazione del complesso ciclina-A-CDK2 che agisce sia a livello della mitosi che della profase, nella quale il complesso ciclina-B- CDK1 favorisce la degradazione dell'involucro nucleare e consente l'avvio della mitosi. Inoltre questi ultimi due complessi, comportano la separazione dei centromeri e l'addossamento dei cromosomi. Successivamente, la cellula va incontro a divisione. Pagina di 35 43 GENETICA EPIGENETICA: branca della genetica che si occupa dei cambiamenti che influenzano il fenotipo senza alterare il genotipo. Studia tutte le modificazioni ereditabili che variano l'espressione genica pur non alterando la sequenza del DNA (soprattutto con riferimento ai fenomeni ereditari a livello cellulare, meno a quelli trans-generazionali, dal genitore al figlio). Cromosomi: Ereditarietà Mendeliana: La genetica mendeliana descrive le modalità di trasmissione dei caratteri ereditari e deve il suo nome al monaco benedettino che per primo studiò e descrisse questo fenomeno. Intorno alla metà dell’800, Mendel, mediante tecniche di autoimpollinazione incrociata, definì le leggi che governano l’ereditarietà di caratteri semplici quali il colore dei fiori. Egli per primo comprese che i caratteri ereditari sono trasmessi singolarmente come unità (geni) ad ogni generazione. La prima legge di Mendel o legge della dominanza o legge della uniformità degli ibridi di prima generazione dice che incrociando due piante che differiscono per un solo carattere, gli ibridi risultanti nella prima generazione (F1) saranno uniformi rispetto al carattere in questione, avranno cioè tutti lo stesso carattere, che è dominante. Inoltre, nella F1 uno dei caratteri antagonisti scompare completamente, senza lasciare traccia. Quest'ultimo è recessivo. La seconda legge di Mendel o legge della segregazione dichiara che gli individui della seconda generazione F2 (ottenuti incrociando individui F1) non sono uniformi, ma che i caratteri parentali segregano. Secondo un incrocio dominante-recessivo o un incrocio intermedio i rapporti risultanti sono 3:1 o 1:2:1. In quest'ultimo caso, cioè, 1/4 dei discendenti presenta il carattere di un progenitore; 1/4 quello dell'altro, e la restante metà è costituita da ibridi. Secondo questo principio le caratteristiche ereditarie sono determinate dai fattori discreti (ora denominati geni) che si presentano accoppiati, ognuno dei quali è ereditato da ogni genitore. Questo concetto delle caratteristiche indipendenti spiega come un carattere può persistere di generazione in generazione senza mescolarsi con altri caratteri. Spiega, anche, come un carattere (recessivo) può apparentemente sparire in una generazione (F1) e riapparire nella generazione successiva F2. Con il termine ereditarietà mendeliana si fa riferimento a un modello di trasmissione di caratteri genetici semplici, codificati ciascuno da un singolo gene. Tali caratteri sono detti monogenici o monofattoriali o mendeliani. Nel classico incrocio monoibrido mendeliano, la prima generazione filiale consiste di individui eterozigoti tutti uguali fra loro. Il rapporto mendeliano dei fenotipi di seconda generazione è invece: 3 dominanti/1 recessivo. Più spesso, però, diversi geni possono contribuire insieme determinare un unico carattere, un fenomeno noto come ereditarietà poligenica, che si definisce polifattoriale quando vi è anche un forte coinvolgimento ambientale. Questo tipo di eredità riguarda la maggior parte dei nostri tratti fenotipici, compresi quelli comportamentali,e psicopatologie quali la schizofrenia o l’autismo. Un gene può influenzare più caratteri fenotipici, determinando una condizione nota come pleiotropia. - Dominanza: - Completa: - Incompleta: - Recessività: - Codominanza: - Alleli multipli: - Pleiotropia: - Geni essenziali: - Alleli letali: Mutazioni genetiche: - Mutazioni per sostituzione/delezione di nucleotidi: Durante il processo di replicazione del DNA, occasionalmente possono verificarsi degli errori nella polimerizzazione del secondo filamento. Questi errori, chiamati mutazioni, possono avere un impatto sul fenotipo (ovvero le caratteristiche osservabili) di un organismo, specialmente se esse si verificano all'interno della sequenza del gene codificante una proteina. I tassi di errore sono solitamente molto bassi, stimabili i 1 errore ogni 10-100 milioni di basi, grazie alla capacità di "revisione" della DNA polimerasi.[16][17] Le mutazioni missenso e le mutazioni nonsenso sono esempi di mutazioni puntiformi, che possono causare malattie genetiche come l'anemia falciforme e la talassemia, rispettivamente.[18][19][20] Le mutazioni missenso generalmente sono clinicamente importanti poiché comportano la modifica delle proprietà Pagina di 36 43 dell'amminoacido codificato tra cui se è essenziale, acido, polare o non polare, mentre le mutazioni nonsense comportano la formazione di un codone di stop.[11] Le mutazioni frameshift sono dovute a delezione o inserzioni (indel) di un numero di nucleotidi non divisibile per 3, comportando lo spostamento del quadro lettura a valle della mutazione e quindi la codificazione di una sequenza amminoacidica non corrispondente a quella del trascritto originario. La conseguenza è la produzione di proteine anomale o la mancata esportazione o traduzione dell'mRNA mutato.[21] L'ereditarietà delle mutazioni frameshift è rara, poiché la conseguente assenza di una proteina funzionale può causare la prematura morte dell'organismo.[22] Una grave malattia dovuta ad una mutazione di questo tipo è la malattia di Tay-Sachs.[23] Sebbene la maggior parte delle mutazioni che comportano il cambiamento nelle sequenze proteiche sono dannose o, al limite, neutre, alcune possono comportare un effetto benefico su di un organismo[24] consentendogli di resistere a particolari stress ambientali meglio degli organismi wild type (dotati di geni più comuni), o di riprodursi più rapidamente. In questi casi, la mutazione tenderà a diventare sempre più comune nella popolazione attraverso la selezione naturale.[25] I virus che utilizzano l'RNA come materiale genetico, hanno tassi di mutazione molto rapidi,[26] e ciò può essere per loro un vantaggio, dal momento che si evolveranno costantemente e rapidamente e quindi poter eludere le risposte difensive del sistema immunitario umano.[27] Nelle grandi popolazioni composti da organismi a riproduzione asessuata, ad esempio nell'Escherichiacoli coli, possono coesistere molteplici mutazioni benefiche. Questo fenomeno è chiamato interferenza clonale e comporta competizioni tra le mutazioni. - Mutaizoni spontanee e indotte: - Agenti mutageni chimici e fisici: - Sistema di riparo del danno a singolo e doppio filamento di DNA: Ereditarietà mitocondriale: - Caratteristiche di ereditarietà: Le mutazioni del DNA mitocondriale possono portare a un gran numero di malattie, tra le quali l'exercise intolerance e la sindrome di Kearns-Sayre (KISS), che causa la perdita della piena funzionalità nei movimenti di cuore, occhi e muscoli. Studi compiuti su cellule di mammifero hanno mostrato come Parkin, una E3-ubiquitina ligasi, se mutata porta alla comparsa della sindrome di Parkinson, in cui si ha una disfunzione mitocondriale che porta alla promozione di eventi come la degradazione e l’autofagia. I mitocondri contenuti nello sperma dei mammiferi non entrano nella cellula uovo, in quanto le modalità di penetrazione dello spermatozoo e la costituzione anatomica dello stesso consentono l'ingresso della sola testa, pertanto i mitocondri che hanno sede nella coda non vengono inseriti; in alcuni casi alcuni mitocondri paterni possono penetrare, tuttavia vengono distrutti dalla cellula uovo subito dopo la fecondazione. Genetica di popolazione: La genetica delle popolazioni analizza le caratteristiche genetiche delle popolazioni nel loro insieme mediante metodi matematici, ed in particolare afferenti alla teoria delle probabilità e alla statistica. La disciplina studia, in particolare, le distribuzioni e le variazioni nelle frequenze alleliche dei geni sotto l'influsso delle quattro forze che regolano l'evoluzione: la selezione naturale, la deriva genetica, le mutazioni e le migrazioni. Questa branca, dunque, è in grado di spiegare fenomeni come l'adattamento e la speciazione. La genetica delle popolazioni consta di due ulteriori sotto-discipline. - La genetica quantitativa si prefigge di predire la risposta alla selezione in base ad informazioni sul fenotipo e le relazioni tra gli individui. Un recente sviluppo di questa disciplina consiste nell'analisi dei tratti quantitativi. - La genetica ecologica è più focalizzata sui temi ecologici e studia prevalentemente le dinamiche delle popolazioni selvatiche. - Equilibrio di Handy-Weinberg: - Popolazione mendeliana: - Equiibrio genetico e l’evoluzione biologica: Elementi genetici mobili ed evoluzione del genoma: - Elementi trasponibili: In genetica, si definiscono elementi trasponibili (chiamati anche elementi genetici mobili; in inglese MGE - Mobile genetic elements) dei segmenti di DNA capaci di spostarsi e inserirsi in diverse posizioni del genoma, tramite un meccanismo chiamato trasposizione. Scoperti la prima volta negli anni cinquanta, sono oggetto di interesse scientifico per la loro capacità di provocare mutazioni genetiche, a causa dei loro spostamenti casuali nel genoma. Sono presenti nei genomi sia procariotici che eucariotici. Pagina di 37 43 del sesso varia comunque in base alla classe di organismi considerata, negli uccelli è il sesso femminile ad essere eterogametico. I cromosomi sessuali X e Y, a differenza degli autosomi omologhi, confrontati tra loro contengono quasi esclusivamente geni di diverso tipo, ad eccezione di due ridotte porzioni collocate alle estremità e denominate pseudoautosomiche che contengono gli stessi tipi di geni (naturalmente presentando alleli non necessariamente uguali). In particolare il cromosoma Y contiene solo geni indispensabili per il corretto sviluppo di un individuo maschile, mentre il cromosoma sessuale X contiene molti geni indispensabili per lo sviluppo sessuale femminile ed in più una certa quantità di geni relativi a caratteri non sessuali. - Ereditarietà legara all’Y: - Caratteri quantitativi: I caratteri quantitativi presentano gradi di continuità nella variabilità fenotipica all'interno di un gruppo di individui, tali caratteri a distribuzione continua possono essere misurati mediante analisi matematiche basate sul valore medio, varianza, deviazione standard, coefficienti di correlazione. Tale branca della genetica si basa sull'analisi statistica. Ereditarietà semplice non-mendeliana: - Ereditarietà mendeliana con eterogeneità di locus: - Penetranza incompleta: La penetranza incompleta è un caso limite dell'espressività variabile, in cui, anche a causa di fattori esterni, in una generazione di individui eterozigoti, alcuni manifestano il fenotipo recessivo, in quanto l'allele dominante non è abbastanza "forte" da poter mascherare l'omologo. È il caso, ad esempio, di alcune patologie genetiche che insorgono anche negli individui eterozigoti i quali dovrebbero essere fenotipicamente sani. - Fenotipo variabile: es. a parità di genotipo presentano fenotipo variabile ci è fornito dai gatti siamesi che sono omozigoti per un allele tyr∆ Questo allele specifica una variante della tirosinasi che ossida la tirosina a melanina. Questa tirosinasi è attiva solo a temperatura inferiore a 33°C circa, mentre è inattivo a temperature superiori. Per simile funzionamento della fabbrica del pigmento, in questi animali le orecchie e il muso, che di regola sono più freddi, sono anche scuri, e altrettanto vale per la coda, e le zampe. Anche la groppa è più scura del ventre. - Questa variante della tirosinasi fa sì che i giovani gattini tenuti al caldo e ben protetti siano quasi albini, i vecchi maschi che affrontano le fredde notti invernali hanno molto pelo scuro o, se si preferisce, presentano fenotipo bruno scuro. - Epistasi:
 Pagina di 40 43 cappuecio (A elF-4G pro! lega poli-A @1F-4E cappuccio 5° POSSIBILE aborto del ATTENUAZIONE trascritto AGGIUNTA di RNA DEL CAPPUCCIO | soquenze non SPLICING E TAGLIO |> funzionali DELL' ESTREMITÀ 3' di mRNA POSSIBILE EDITING DELL'ANA n ESPORTAZIONE arizona — pet LOCALIZZAZIONE SPAZIALE NEL CITOPLASMA \_—-_ deo | blocco TRADUZIONE della traduzione POSSIBILE RICODIFICA TRADUZIONALE POSSIBILE STABILIZZAZIONE | degradazione DELL'ANA dell'RNA elF-4G-_ IRES altri fattori di traduzione subunità ribosomali maggiore e minore Pagina 41 di 43 dsRNA virale dsRNA prodotto dal ricercatore Complesso RISC attivato CPEB: protei che lega l'elemento di poliadenilazione! citoplasmatico. (A) (CPEB-Maskin Citoplasma ® [ mRNA nonsenso ] [ mRNA nonsenso ] o-Begi Ra a Birtr Pa Primo ciclo di traduzione SE ciclo di traduzione EJC: complessi di e ROIO BC Rimozione incompleta giunzione degli e degli EJC esoni. w @ t ; € 3 EIC = Reclutamento della proteina Upf Traduzione normale Upf Ri Don EIC Turno: ver Traduzione prematura dell'RNA Individuazione degli EJC da parte del “complesso di sorveglianza” Degradazione dell'mRNA nonsenso I Corpi P Deadenilazione e degradazione! esonucieolitica 35° rimozione del cappuccio dell''YANA e digestione esonucleolitica 5-3"