Biologia molecolare di base, Dispense di Biologia Molecolare

Scarica Biologia molecolare di base e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! Appendice al Capitolo 6 – Possibile struttura in vivo del replisoma di E. coli I replisomi sono macchinari dinamici multiproteici che replicano il DNA copiando lo stampo su un filamento in modo continuo e l’altro filamento stampo in modo discontinuo. In E. coli il replisoma coinvolge le attività di oltre 11 proteine durante la replicazione del genoma. L’elicasi DnaB, caricata sul filamento stampo per la sintesi discontinua, separa i due stampi che sono in seguito copiati dal nucleo catalitico della DNA polimerasi III (). La processività della Pol III dipende dal legame con un morsetto scorrevole (2) che avvolge la doppia elica di DNA; i morsetti scorrevoli sono aggiunti e rimossi da un caricatore di morsetto [()3’] il cui componente oligomerizza la Pol III. Il DNA a singolo filamento nello stampo per la sintesi discontinua è legato da tetrameri della proteina che lega il singolo filamento (Single-strand binding = Ssb) che eliminano la struttura secondaria dal DNA e lo proteggono dall’attacco delle nucleasi. La primasi si lega all’elicasi durante i cicli di innesco e di sintesi discontinua del DNA su questo stampo. Indagini in vitro sul replisoma hanno fornito dettagli sulla sua organizzazione e sul meccanismo di replicazione, ma non hanno rivelato com’è organizzata la replicazione nelle cellule viventi. Più copie dei componenti noti del replisoma potrebbero essere presenti alle forche replicative, mentre altri fattori cellulari, assenti dai saggi in vitro, potrebbero modificare la composizione del replisoma e agire sulla elaborazione del DNA. Inoltre, le tecniche usate per determinare la stechiometria e l’architettura in vitro favoriscono interazioni efficienti, forse influenzando le stime dei numeri e delle interazioni, e sono soggette a complicazioni se un qualunque componente è sensibile alle proteasi. È stata quindi indagata l’architettura del replisoma attivo in cellule viventi mediante un protocollo di microscopia a fluorescenza con sensibilità a singola molecola e risoluzione temporale del millisecondo. Al contrario dei componenti strutturali che formano l’ossatura del replisoma, le Ssb mostrano un’ampia distribuzione di stechiometrie con periodicità di ~4 molecole e media di 32 molecole per sito nelle cellule che ne contengono due, equivalenti a 8 tetrameri di Ssb per forca replicativa. Cellule con un solo sito di Ssb hanno una stechiometria circa doppia, con ~70 molecole per sito. Il numero di Ssb legate alla forca replicativa dovrebbe essere proporzionale alla lunghezza del DNA a singolo filamento (ssDNA). Il ssDNA associato a ciascun tetramero di Ssb è 35 o 65 nucleotidi (nt) in vitro; (Ssb)35 forma filamenti compatti, mentre (Ssb)65 forma dimeri di tetrameri che coprono 170 nt. Il contributo di ciascun modo di legame in vivo è ignoto. Assumendo che il tratto di ssDNA alla forca replicativa sia uguale alla lunghezza del frammento di Okazaki [~650 nt a 22°C], la presenza di (Ssb)65 darebbe una occupazione a ~8 tetrameri, vicino alla stechiometria media stimata per ciascun sito di replisoma. Ci si aspetta che la stechiometria del morsetto scorrevole dimerico 2 sia in parte risultato della sua interazione con Pol III e col caricatore di morsetto, e in parte dovuta all’associazione col DNA alla estremità 3’ dei frammenti di Okazaki. Nondimeno, la sua distribuzione è bimodale a ~3 e ~6 dimeri, sollevando la possibilità che esso possa essere continuamente associato a Pol III. Le analisi indicano due sottopopolazioni con intensità di distribuzioni spaziali differenti. La prima (~27%) ha distribuzione compatibile con uno schema in cui tre dimeri 2 sono associati con la Pol III attiva o col caricatore di morsetto. La seconda ha una distribuzione in accordo con la presenza di uno dei morsetti scorrevoli a una distanza >50 nm dal nucleo del replisoma. Storicamente, si è ritenuto che il replisoma abbia due nuclei catalitici della polimerasi che agiscono in direzioni opposte ma in modo coordinato, connessi al resto del replisoma. Invece, le prove recenti favoriscono una struttura del replisoma in vivo che contiene tre Pol III associate a un caricatore di morsetto le cui tre copie di fanno trimerizzare anche Pol III. In una minoranza di replisomi, tutte e tre le Pol III possono essere associate a morsetti scorrevoli, due dei quali forse attivi simultaneamente sul filamento a sintesi discontinua, a sostegno di osservazioni derivate da studi in vitro dei replisomi di E. coli e del fago T4. Tuttavia, la maggioranza dei replisomi sembrano avere solo due delle polimerasi