Biologia molecolare di base, Dispense di Biologia Molecolare

Scarica Biologia molecolare di base e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! 101 CAPITOLO 8 8.1. Il controllo dell’espressione genica nei Procarioti: uno sguardo d’insieme. Nei Procarioti, poiché la traduzione dell’mRNA nascente inizia non appena su esso si è formata la prima sequenza di legame per la subunità ribosomale 30S (segnale di Shine-Dalgarno), l’inizio della trascrizione rappresenta un punto critico per controllare l’espressione genica. Questo aspetto è ancora più rilevante se si pensa che quasi tutti gli mRNA procariotici hanno vita media assai breve, dai 2-3 minuti dei trascritti di dimensioni medio-basse (2÷10 kb) ai 10 minuti di quelli (rari) più lunghi (26÷30 kb). Questa vita media è in genere di poco superiore al tempo necessario alla RNA polimerasi per sintetizzare il trascritto completo dal sito d’inizio al terminatore. È quindi chiaro che un controllo sulla frequenza di inizio della trascrizione può consentire in generale alla cellula batterica di regolare adeguatamente i livelli dei diversi prodotti proteici. Questo spiega anche perché, nella maggior parte dei casi, i geni procariotici sono riuniti in unità di trascrizione policistroniche, in cui i vari cistroni codificano catene polipeptidiche funzionalmente correlate. Infatti, nei batteri, un unico promotore spesso controlla la trascrizione di più geni raggruppati insieme. Questo gruppo di geni costituisce un’unità trascrizionale, detta operone, che viene trascritta in un solo mRNA; ogni porzione di un operone (e del relativo trascritto) che codifica per una catena polipeptidica viene detta cistrone. Un mRNA trascritto da un operone che contiene più geni viene definito policistronico; questo significa che codifica più di una catena polipeptidica. Un mRNA che codifica per una sola catena polipeptidica è detto invece monocistronico. Peraltro, la trascrizione può andare incontro, in casi particolari, a un processo di terminazione controllata prima che sia stato raggiunto l’ORF del primo cistrone; questa modalità di controllo sarà trattata più avanti. Più generalmente, tuttavia, la trascrizione può terminare tra due cistroni che fanno parte della stessa unità trascrizionale, secondo il meccanismo dipendente da rho. Questo tipo di controllo può avere un ruolo importante, poiché risparmia al batterio la produzione di un mRNA e di proteine di cui non ha bisogno o che sono richiesti in quantità minori. Inoltre, anche a livello della traduzione possono verificarsi eventi differenziali che rendono più veloce o più lenta questa fase dell’espressione genica delle proteine in casi specifici. Infine, anche la velocità di degradazione di specifiche proteine può rappresentare in certi casi un evento regolatorio. Il Riquadro 8.1 riassume i principali fattori che influenzano l’espressione e i livelli di una proteina nei Procarioti. Riquadro 8.1 FATTORI CHE INFLUENZANO SPECIFICAMENTE LE CONCENTRAZIONI DELLE SINGOLE PROTEINE NELLA CELLULA PROCARIOTICA  Efficienza intrinseca dei promotori, congiunta con tutti i meccanismi regolatori connessi con l’inizio della trascrizione (repressione, induzione, attivazione, attenuazione, ecc.);  All’interno di un operone policistronico, il gradiente trascrizionale negativo, detto polarità genica, prodotto dai siti di terminazione dipendenti da rho (in funzione della lunghezza delle regioni intercistroniche);  Legame più o meno efficiente dell’mRNA alla subunità ribosomale 30S (segnale di Shine- Dalgarno = tratto ricco di purine nella sequenza-guida, o 5’-UTR, dell’mRNA); Rallentamento nella traduzione dovuto all’utilizzo di codoni e di tRNA più rari; Velocità di degradazione di specifici mRNA; Velocità di degradazione di specifiche proteine. 102 I cistroni che fanno parte di un dato operone spesso codificano enzimi diversi di un’unica via metabolica o comunque proteine le cui funzioni sono correlate tra di loro: essi vengono controllati in maniera coordinata (l’inizio della trascrizione avviene per tutti o per nessuno), consentendo strategie di controllo integrate ma flessibili, anche coi meccanismi sopra ricordati (terminazione controllata). Tuttavia, gli ORF di un mRNA policistronico vengono tradotti in maniera indipendente. Infatti, certi mRNA possono avere un proprio segnale di attacco al ribosoma tra un cistrone e l’altro (IRES = internal ribosome entry site, più comune nei batteriofagi) e ogni cistrone ha comunque il proprio codon d’inizio e il proprio codon di STOP. Di conseguenza, i singoli segmenti codificanti di un RNA policistronico possono essere tradotti a una velocità diversa, fornendo un ulteriore elemento di controllo fine del prodotto proteico funzionalmente importante; in casi specifici, questo controllo può assumere un rilievo di primo piano, come nella sintesi delle proteine ribosomali (vedi § 8.15). 8.2. Induzione e repressione. Gli operoni che codificano proteine essenziali e continuamente richieste in ogni momento del ciclo cellulare del batterio non mostrano apprezzabili variazioni nel tasso di trascrizione sotto diverse condizioni di coltura. Questi operoni (e i relativi prodotti genici) vengono quindi definiti costitutivi. I promotori di altri operoni, d’altronde, non sono sempre disponibili per essere trascritti: tali promotori sono pertanto soggetti a un controllo della trascrizione. Per alcuni di essi, i tipi di sostanze presenti nel terreno di crescita in cui le cellule batteriche crescono, determinano se il promotore potrà formare un complesso aperto con l’RNA polimerasi. Ad esempio, il promotore di un operone che codifica gli enzimi necessari a metabolizzare una particolare sostanza nutritiva (utilizzabile ai fini energetici e biosintetici) diventa attivo solo quando essa è presente nel terreno di crescita. Si parla allora di promotore, operone o geni inducibili, poiché condizioni specifiche possono indurne l’utilizzo, che altrimenti non avviene o è assai limitato. Grazie a questa risposta specifica, definita induzione enzimatica , i batteri sintetizzano selettivamente quegli enzimi che servono per metabolizzare sostanze nutritive occasionalmente disponibili. Il glucosio non rientra nella categoria di queste sostanze, in quanto gli enzimi richiesti per la sua utilizzazione, come tutti quelli del metabolismo intermedio dei carboidrati, non sono inducibili, ma costitutivi. Tuttavia, cellule di E. coli, trasferite da un terreno contenente solo glucosio come fonte di carbonio a un altro contenente solo lattosio, iniziano a crescere dopo un ritardo di ~20 min, tempo al quale si trova che esse possiedono elevati livelli di enzimi per utilizzare questo disaccaride, mentre quando crescevano su glucosio tali enzimi erano pressoché assenti. A questo punto, il loro trasferimento su terreno fresco contenente lattosio produce una crescita senza ritardi. Se, dopo aver fatto crescere le cellule batteriche su lattosio per diverse generazioni, esse vengono trasferite di nuovo su glucosio, esse crescono senza periodo di ritardo, segno che non richiedono alcun adattamento per utilizzare il glucosio. Gli esempi più comuni di induzione enzimatica nei batteri riguardano proprio gli enzimi che catalizzano la conversione di zuccheri diversi in glucosio o in intermedi del metabolismo glucidico, come la conversione del galattosio a glucosio (sotto forma di fosfoesosi), la scissione del lattosio in glucosio e galattosio, e la trasformazione dell’arabinosio in intermedi del ciclo dei fosfopentosi. Ciascuna di queste conversioni richiede un insieme specifico e mirato di proteine enzimatiche. I geni per questi diversi enzimi risiedono in operoni differenti, gli operoni gal, lac, ara. Quando si aggiunge galattosio, lattosio o arabinosio al terreno di crescita batterico, la sintesi dei corrispondenti enzimi viene indotta rapidamente e specificamente. Quando lo zucchero viene rimosso, la sintesi degli stessi enzimi cessa rapidamente, mentre le molecole enzimatiche già sintetizzate vengono diluite man mano che le cellule crescono e si dividono, oppure vengono degradate dalle proteinasi cellulari. Se cellule batteriche cresciute in un terreno ricco di nutrienti (tra cui tutti gli amminoacidi) vengono poste in un terreno di crescita privo di un determinato amminoacido, esse iniziano a sintetizzare gli enzimi necessari per la produzione di tale amminoacido alla massima velocità; si trova spesso (come per gli enzimi del catabolismo) che proteine enzimatiche, funzionalmente cooperanti in uno stesso ruolo anabolico, sono codificate nello stesso operone. Quando al terreno di crescita si aggiunge di 105 Le mutazioni che insorgono nei geni strutturali dei batteri alterano l’attività di singole proteine; le mutazioni che insorgono nei geni regolatori o in quelli operatori, d’altra parte, alterano la capacità dei batteri di rispondere ai cambiamenti ambientali con una variazione dell’espressione di gruppi di geni strutturali (effetto pleiotropo). È stato proprio attraverso lo studio genetico e biochimico di questi fenomeni che si è giunti a capire i meccanismi con cui agiscono le proteine regolatrici. 8.5. L’operon lac. Storicamente, i più importanti esperimenti sulla regolazione genica in E. coli furono effettuati sulle funzioni connesse col metabolismo del lattosio, un disaccaride composto da glucosio e galattosio. La biochimica e la genetica classica permisero di elaborare in questo ambito il concetto di controllo negativo dell’espressione genica, portando alla formulazione del primo modello di regolazione genica. Se le cellule di E. coli vengono fatte crescere in un terreno di crescita contenente lattosio (o un altro -galattoside, come l’isopropil--tiogalattoside o IPTG), si verifica un aumento delle concentrazioni cellulari di tre proteine:  la -galattoside permeasi, una proteina intrinseca della membrana interna batterica che catalizza la captazione di lattosio e di altri -galattosidi tramite trasporto attivo (simporto con H+); l’enzima -galattosidasi, che idrolizza i -galattosidi, ad es.: il lattosio in glucosio+galattosio;  la tiogalattoside transacetilasi, un enzima che trasferisce un gruppo acetile in posizione 6 alle molecole dei -galattosidi non metabolizzabili dal batterio (come l’IPTG). Insieme, i tre geni (o cistroni) che codificano queste proteine costituiscono la parte strutturale dell’operon del lattosio (operon lac). Essi sono disposti nel genoma batterico nel seguente ordine: il gene lacZ, il gene lacY e il gene lacA, che codificano rispettivamente la -galattosidasi, la permeasi e la transacetilasi. Come già accennato, diversi -galattosidi inducono l’espressione dell’operon lac. Scheda 8.3 La biochimica dell’operon lac. Fu scoperto solo in un secondo tempo che l’effetto induttore del lattosio sulla sintesi di -galattosidasi è dovuto in realtà a un altro composto. Il lattosio non è di per sé un induttore, ma l’enzima -galattosidasi può catalizzare (oltre all’idrolisi di diversi -galattosidi) anche l’isomerizzazione del lattosio in allolattosio, che funge poi da ottimo induttore. Tra i composti naturali ad azione induttrice, vi è anche il -galattosil-glicerolo, derivante da glicolipidi di origine vegetale, forse la fonte di galattosio più importante per gli Enterobatteri dell’intestino dei Mammiferi. La -galattoside permeasi è una proteina intrinseca della membrana interna che consente l’ingresso dei -galattosidi nella cellula tramite il simporto con H+: una molecola di -galattoside è trasferita nel citoplasma insieme a uno ione idrogeno; poiché il gradiente protonico favorisce l’ingresso di questi ioni, il trasporto dei -galattosidi può avvenire anche quando la loro concentrazione intracellulare è maggiore di quella esterna. La tiogalattoside transacetilasi opera il trasferimento di acetile dall’acetil-CoA alla posizione 6 dei tiogalattosidi che, pur essendo captati dalla permeasi e in certi casi agendo da induttori dell’operone lac, non possono essere metabolizzati dalla -galattosidasi; l’acetilazione permette a questi composti di diffondere fuori della membrana, evitando un sovraccarico di pressione osmotica all’interno della cellula batterica. Tra questi vi è l’isopropiltiogalattoside (IPTG) usato comunemente in laboratorio come induttore di lac. 8.6. Mutanti dei geni dell’operon lac. La formula fenotipica dell’operon del lattosio di un batterio di tipo selvatico può essere designata con lacZYA, indicante che il batterio produce le forme attive di tutte e tre le proteine codificate dai tre geni. Una mutazione che insorge in uno dei tre geni può dare, come conseguenza, un batterio che produce una forma alterata o completamente inattiva della proteina corrispondente. Per esempio, un mutante lacZYA, in presenza di lattosio produce una permeasi ed una transacetilasi attive, ma è privo di attività -galattosidasica. 106 Una scoperta decisamente importante è stata che alcuni batteri mutanti hanno una informazione strutturale normale per le tre proteine, ma hanno perduto la capacità di regolare i tre geni. Per esempio, alcuni ceppi mutanti sono chiamati mutanti costitutivi, poiché contrariamente ai ceppi di tipo selvatico, che producono le tre proteine solo in presenza di -galattosidi (ceppi inducibili), mostrano livelli elevati delle tre proteine dell’operone lac anche in assenza di induttori. Con esperimenti di genetica, si dimostrò che le mutazioni che causano una produzione costitutiva di - galattosidasi sono distinguibili in due classi di complementazione. La prima classe comprende le mutazioni che insorgono nel gene detto lacI, ossia “gene dell’inducibilità con lattosio”, localizzato in un locus genico distinto da quello dell’operone lac e in seguito denominato gene regolatore di lac. Il tipo selvatico, inducibile, viene indicato con lacI+ e quello di un mutante costitutivo di questa classe, con lacI. Furono effettuati esperimenti di coniugazione tra batteri di tipo selvatico hfr (che hanno integrato l’episoma F e sono quindi in grado di partecipare come donatori alla coniugazione batterica) e batteri riceventi lacZI. Prima che cominciasse la coniugazione, le cellule hfr non producevano la - galattosidasi in assenza dell’induttore (lattosio), ma solo in presenza di questo; le cellule riceventi, possedendo un gene lacZ difettoso, non producevano una -galattosidasi attiva in alcuna condizione. In assenza di induttori, la -galattosidasi veniva subito prodotta dalle cellule in coniugazione una volta effettuato il trasferimento del DNA; tuttavia, se l’induttore non veniva aggiunto, dopo circa due ore la sintesi dell’enzima si arrestava. Poiché le cellule donatrici erano state uccise non appena era trascorso un tempo sufficiente perché avvenisse il trasferimento dei geni lacI e lacZ, dovevano essere i batteri riceventi ad aver prodotto -galattosidasi per poi cessare di produrla per assenza di induttori. Per spiegare questi risultati, i ricercatori suggerirono che le cellule donatrici contenessero un gene lacI il cui prodotto impediva l’espressione del gene lacZ. Ma quest’ultimo, quando veniva trasferito dalle cellule donatrici a quelle riceventi, trovandosi improvvisamente in un ambiente in cui mancava il prodotto del gene lacI, cominciava a dirigere la produzione della -galattosidasi. Tuttavia, anche il gene lacI selvatico veniva trasferito alle cellule riceventi; trascorso un certo tempo, in queste cellule si accumulava il prodotto del gene lacI selvatico e l’attività del gene lacZ selvatico, in assenza di induttore, veniva di nuovo soppressa. Questo significava che, in questi merozigoti, il carattere lacIera recessivo rispetto a quello selvatico. Altri esperimenti di coniugazione con diversi mutanti permisero di stabilire che il gene lacI, localizzato su una molecola di DNA, poteva controllare l’espressione del gene Z posto su un’altra molecola di DNA, e ciò portò alla definizione del concetto di repressore come prodotto diffusibile del gene dell’inducibilità. Quindi, lacI era un elemento genico trans-attivo. La seconda classe di mutazioni costitutive mappava in loci genici chiamati lacO (operatori di lac) e suggerì che il repressore agisse su un particolare sito del DNA; questo sito, attraverso ulteriori analisi genetiche, si dimostrò essere localizzato nelle strette adiacenze del gene Z, ossia entro l’operone lac. Poiché le mutazioni nelle sequenze lacO portavano i vicini geni strutturali a essere attivi in assenza dell’induttore, queste mutazioni vennero chiamate lacOc (operatore costitutivo). Nei mutanti lacOc la sintesi di -galattosidasi è costitutiva, poiché il legame del repressore all’operatore risulta indebolito. Furono quindi riconosciute due classi di mutazioni che causavano entrambe una produzione costitutiva di -galattosidasi: le mutazioni nel gene lacI e le mutazioni nella sequenza dell’operatore. Le mutazioni nell’operatore erano attive in cis (cioè influenzavano l’espressione del gene lacZ solo se posto sullo stessa molecola di DNA) ed erano dominanti nei coniuganti merozigoti, mentre le mutazioni nel gene lacI erano attive in trans (ossia influenzavano anche gli operatori posti su altre molecole di DNA) ed erano recessive nei coniuganti merozigoti. Nel 1961 Jacob e Monod proposero che la proteina repressore codificata dal gene lacI regolasse in maniera specifica l’espressione delle sequenze di DNA che codificano tutti e tre gli enzimi dell’operon del lattosio, elaborando il primo modello di regolazione genica. Essi inoltre suggerirono che una molecola intermedia instabile (mRNA) trasferisse l’informazione contenuta nel DNA all’apparato deputato alla sintesi proteica e che la funzione del repressore fosse quella di regolare la sintesi 107 dell’mRNA. Successivamente, esperimenti di ibridazione DNA-RNA dimostrarono che cellule di E. coli cresciute in presenza di lattosio contengono grosse quantità di mRNA per la -galattosidasi. In assenza di lattosio, le cellule contengono quantità molto piccole di mRNA complementare al DNA dell’operon del lattosio. Il repressore si lega al DNA in una regione di 25-35 coppie di basi che comprende alcune basi prima e venti basi dopo il sito di inizio per la sintesi dell’mRNA della -galattosidasi. In questa regione si trova anche il sito in cui si lega l’RNA polimerasi; quindi la sequenza del promotore si sovrappone in parte alla sequenza dell’operatore. Questa sovrapposizione spiega perché il legame del repressore all’operatore interferisca con l’inizio della sintesi dell’mRNA di lac. Una recente scoperta ha dimostrato che l’RNA polimerasi può legarsi alla regione promotore anche in presenza del repressore, ma non può dare inizio alla sintesi dell’RNA, ciò indica che il repressore impedisce l’inizio della trascrizione (formazione del complesso aperto) piuttosto che il legame iniziale della polimerasi al promotore (formazione del complesso chiuso). Vedremo più avanti che questa non è l’unica forma di controllo alla quale è sottoposto l’operon lac: esso subisce anche una attivazione trascrizionale che è comune anche ad altri operon e perciò sarà discussa in seguito. Scheda 8.4 Le mutazioni di lacZ nel fenomeno della -complementazione. Le mutazioni che inattivano la -galattosidasi sono facilmente evidenziabili semplicemente piastrando i batteri e ricoprendoli con una soluzione di un substrato cromogeno (X-GAL) per quell’enzima: se questo è attivo, produce una sostanza blu insolubile in acqua che colora le colonie lacZ, mentre quelle lacZ rimangono bianche. Alcuni mutanti privi di -galattosidasi hanno una delezione in lacZ che interessa la porzione ammino-terminale della proteina, che viene sintetizzata ma è completamente inattiva. È possibile ripristinare il fenotipo lacZtrasformando i batteri mutanti con un plasmide che porta la porzione mancante del gene lacZ; questo esprime una proteina troncata (solo l’estremità ammino-terminale), ma l’associazione dei due tronconi porta al ripristino dell’attività -galattosidasica (vedi Fig. 8.1). Questo fenomeno è noto come - complementazione. (N = estremità N-terminale dei polipeptidi; C = estremità C-terminale dei polipeptidi.) Fig. 8.1 Interpretazione molecolare per il fenomeno della -complementazione. (a) Polipeptide wild-type dotato di attività enzimatica; la regione del sito attivo è indicata in grigio. (b) Polipeptide mutante privo di attività enzimatica; la regione del sito attivo è difettiva per una delezione della porzione N-terminale del cistrone. (c) Peptide N-terminale privo di attività enzimatica, prodotto da una mutazione nonsense o da un gene troncato verso il C-terminale. (d) Struttura tridimensionale della proteina prodotta dall’associazione tra (b) e (c) e dotata di attività enzimatica; il peptide N-terminale si associa al polipeptide difettivo completando la struttura del sito attivo. [NB: il modello tridimensionale dell’enzima è schematico.] 8.7. L’operon araBAD. L’arabinosio è un aldopentosio di derivazione vegetale. Le cellule di E. coli, quando vengono fatte crescere su un terreno che contiene questo zucchero come unica fonte di carbonio, producono i tre enzimi che servono a convertire l’arabinosio in xilulosio 5-fosfato; questo composto, poi, entra nel 110 cellule riassumevano la capacità di utilizzare tutti questi zuccheri. In altre parole, la mutazione in un singolo gene sembrava essere la causa dell’incapacità di utilizzare altri zuccheri diversi dal glucosio. Circa la metà delle colonie mutanti originarie era portatrice di mutazioni per le quali le cellule non producevano cAMP in assenza di glucosio. L’altra metà era capace di produrre cAMP in questa condizione, ma non era capace di aumentare la sintesi degli enzimi deputati al metabolismo di uno qualunque degli zuccheri prima menzionati, in presenza dei medesimi. L’insieme di queste osservazioni suggeriva che l’effetto del cAMP fosse mediato da una proteina dotata di azione attivatrice della trascrizione e che nel secondo gruppo di mutanti tale proteina fosse difettosa e quindi incapace di legarsi al cAMP o di trasdurre il suo segnale. TABELLA 8.I CONDIZIONI NUTRIZIONALI CHE DETERMINANO CAMBIAMENTI NELL’ESPRESSIONE DELL’OPERONE lac IN E. coli  Zuccheri nel Livello dell’enzima Attività catabolica Funzioni delle proteine mezzo di coltura -galattosidasi* prevalente espresse dall’operone lac  D-GLUCOSIO 5 Le cellule metabolizzano Le poche molecole di il glucosio permeasi capteranno attraverso la glicolisi , i -galattosidi appena respirando o fermentando, saranno disponibili. secondo le condizioni La -galattosidasi, aerobiche o anaerobiche. quando sarà disponibile lattosio, lo isomerizzerà in allolattosio, ottimo induttore dell’operone lac. LATTOSIO 15.000 Le cellule idrolizzano il La massima espressione lattosio in glucosio e consente la rapida galattosio, che vengono captazione e il metabolizzati attraverso metabolismo del lattosio, la glicolisi. come pure di altri -galattosidi. D-GLUCOSIO 300 Le cellule utilizzano Una bassa attività + LATTOSIO preferenzialmente metabolica nei confronti il glucosio. del lattosio mantiene la cellula pronta ad affrontare l’esaurimento dell’apporto di glucosio.  *È indicato il numero stimato di molecole per cellula batterica; i livelli di permeasi e di transacetilasi sono proporzionali (anche se inferiori) a quelli della -galattosidasi, a causa del fenomeno della polarità genica.  111 glucosio questa reazione è stimolata se manca glucosio lattosio H+ membrana interna periplasma citoplasma GLICOLISI G-6-P P P P fosfoenolpiruvato piruvato II III HPr I Padenilato ciclasi adenilato ciclasi (attivata) PPi cAMP ATP (C) lattosio H+ circuito protonico alimentato dal catabolismo permeasi allolattosio glucosio + galattosio -galattosidasi transacetilasi lacZ lacY lacAPlacZYA lacO mRNA CAPlacIPlacI mRNA repressore di lac (I) proteina attivata da cAMP 2 C CC 4 I II II repressore inattivo repressore attivo (legato sull'operatore) +DNA Fig. 8.2. Una visione d’insieme dei meccanismi di regolazione dell’espressione genica per gli enzimi coinvolti nel catabolismo del lattosio in E. coli. La striscia grigia in alto indica la membrana interna della cellula batterica. La riga con riquadri bianchi e neri in basso è invece il tratto del genoma batterico che contiene l’operon lac e il gene regolatore lacI. L’induttore allolattosio è indicato con I, mentre l’AMP ciclico è indicato con C. L’effetto del complesso cAMP-CAP sulla trascrizione è indicato col segno +, mentre quello del repressore attivo è mostrato dal segno . Il sistema delle fosfotransferasi comprende quattro componenti (I, II, III e Hpr), delle quali la II è una proteina transmembrana che è un traslocatore specifico per il glucosio, la I accetta il gruppo fosforile dal 2- fosfoenolpiruvato (PEP) che passa poi ad HPr e alla III. Questa fosforila il glucosio mentre è impegnato nel traslocatore, ma in assenza di glucosio, fosforila l’adenilato ciclasi attivandola. 8.10. La proteina attivata dall’AMP ciclico (CAP o CRP). Successivamente, da cellule di tipo selvatico fu isolata una proteina capace di legarsi al cAMP, che si trovò essere assente nel secondo gruppo di cellule mutanti. La proteina che lega il cAMP è stata variamente chiamata: cAMP activated protein o catabolism activator protein (CAP) e catabolite repressor protein o cAMP receptor protein (CRP); la si può indicare con l’una o l’altra sigla o col nome italiano di proteina attivata da cAMP. L’ottenimento della proteina purificata permise di effettuare esperimenti di trascrizione in vitro sull’operon lac. In estratti acellulari con RNA polimerasi e DNA purificato contenente l’operone lac (quindi, in un sistema privo del meccanismo di controllo negativo da parte di lacI), in assenza di cAMP e di CAP la trascrizione di lacZ avveniva a un tasso che era solo il 5% di quello registrato in presenza dell’effettore e del regolatore positivo. 112 Si può quindi riassumere la strategia di controllo dell’operon lac dicendo che esso è sia sotto il controllo positivo del complesso CAP-cAMP, sia sotto il controllo negativo del repressore lac (controllo composto della trascrizione). Il controllo negativo ha un effetto prevalente su quello positivo, e solo se il primo è rimosso dall’induttore è possibile osservare gli effetti del cAMP. Il complesso CAP-cAMP si lega subito a monte del sito promotore dell’operone lac, dove esso produce un footprint in corrispondenza di una sequenza palindromica: infatti, la proteina CAP è attiva sotto forma di omodimero. Essa, una volta legata alla sua sequenza bersaglio, induce un forte ripiegamento della doppia elica del DNA; questa azione può portare a un contatto diretto tra CAP e RNA polimerasi, tramite il CTD delle subunità dell’enzima. Si conoscono i dettagli dell’interazione specifica tra CAP e la sequenza bersaglio di DNA: la proteina si lega con due -eliche (una per ogni subunità) nel solco maggiore della doppia elica in forma B, a distanza di un passo di elica (circa 10 pb, pari a 34 Å). Specifici residui amminoacidici prendono contatto con i gruppi accettori e donatori di legami a idrogeno delle basi presenti nella sequenza bersaglio. Il quadro complessivo della regolazione dell’operone lac è mostrato nella Figura 8.2 (vedi pagina precedente). Fig. 8.3. Regolazione composta dell’operon araBAD in E. coli. Le dimensioni relative dei vari cistroni non sono in scala. A: repressione dell’operon da AraC in assenza di arabinosio; l’espressione di araC è modesta per la sua regolazione autogena (segno nel cerchietto rosso) tramite l’operatore araO1. B: parziale attivazione dell’operon da parte del complesso arabinosio-AraC in presenza di arabinosio e glucosio; la diversa configurazione dell’ansa di DNA consente una maggiore espressione di araC. C: attivazione totale dell’operon in presenza di arabinosio ma non di glucosio; l’aumento di cAMP porta all’attivazione da parte del complesso cAMP-CAP (segno + nel cerchietto verde). 115 pppAAGUUCACGU A A GCUAUGGGAAA 5' 10 20 A AC AUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGUUGGUGGCGCACUUCCUGA A A GCGUACCACUUAUGUGACGGGC Shine-Dalgarno fMet Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Trp Trp Arg Thr Ser STOP 30 40 50 60 70 8090U A AAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCC peptide leader 100 110 120 UA A UGAUUAAAACAAGUUUUUUUUCGGGCGA G A G AAUAACAAUGCAAACA . . . . . 3' 130140150 160 170 fMet Gln Thr . . . . . . . polipeptide trpE 1 2 3 4 sito di attenuazione Shine-Dalgarno 4 3 2 1 140 130 UUUUUUUCGGGCGA GU A AU 120110100 AGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCC A A U 90 80 706050 GCGUACCACUUAUGUGACGGGC A AAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGUUGGUGGCGCACUUCCUGA 3'OH .... 4 3 2 1 150 140 130 AUUAAAACAAGUUUUUUUUCGGGCGAG U A A U120110100 AGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCA A U 90 80 706050 GCGUACCACUUAUGUGACGGGC A A AUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGUUGGUGGCGCACUUCCUGA.... .... fMet-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly fMet-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-S er B C A 5' 5' 3' Fig. 8.4. Struttura della sequenza leader dell’mRNA trascritto dall’operon trp . A: sono mostrate le diverse sequenze che intervengono nella traduzione e nell’attenuazione; le frecce con i numeri da 1 a 4 indicano le quattro sequenze che possono appaiarsi in varie combinazioni per formare forcine. B: se il triptofanil-tRNA è in quantità sufficiente, il peptide leader viene sintetizzato fino al suo termine, il ribosoma si dissocia e la trascrizione ha termine al nucleotide 140 a causa della formazione delle forcine 1-2 e 3-4 (attenuatore). C: se il triptofanil-tRNA scarseggia, il ribosoma rimane in stallo sulla sequenza 1 dopo aver incorporato la glicina (o tutt’al più il primo triptofano); la trascrizione intanto ha prodotto le sequenze 2 e 3 che formano una forcina con bolle; quando viene trascritta la sequenza 4, non si forma l’attenuatore e la trascrizione prosegue per l’intero operon. 116 In presenza di scarse quantità di triptofano, circa il 25-50% delle molecole di RNA polimerasi continua a trascrivere oltre il sito attenuatore. Il numero di molecole di RNA polimerasi che si sottrae al controllo negativo da parte dell’attenuatore dipende con precisione dalla concentrazione del triptofano nella cellula e quindi dalla disponibilità di triptofanil-tRNA. In definitiva, l’operon trp è controllato non solo attraverso il meccanismo di repressione, ma anche per attenuazione della sintesi di RNA a livello del 140º nucleotide dal sito d’inizio della trascrizione. Il massimo della attenuazione si ha in presenza di adeguate quantità di triptofanil-tRNA (una condizione che potrebbe derivare da un bilancio “positivo” del turnover del triptofano proteico), mentre essa viene minimizzata in presenza di scarse quantità di triptofanil-tRNA (una condizione che potrebbe derivare da un bilancio “negativo” del turnover del triptofano proteico). Nell’operon his per la biosintesi dell’istidina, mancando un sistema repressore-operatore, il meccanismo dell’attenuazione rappresenta l’unica forma di controllo negativo della trascrizione. Il leader del trascritto his codifica un peptide contenente sette residui consecutivi di istidina, che permettono quindi di raggiungere un’estrema efficienza nell’adeguare l’attenuazione alla disponibilità di questo amminoacido. Le brevi sequenze codificanti che precedono gli attenuatori procariotici sono anche dette upstream open reading frames (uORF), in quanto si trovano a monte dei segnali d’inizio della traduzione per la parte principale del trascritto e dei cistroni compresi nell’operon. Va anche notato che la sequenza di Shine-Dalgarno a valle dell’attenuatore può considerarsi un IRES, in quanto i ribosomi 30S vi si legano mentre uno o due ribosomi sono impegnati sull’uORF. Il Riquadro 8.2 a pag. 117 presenta in forma riassuntiva e schematica i modelli basilari di controllo genico che si attuano all’inizio della trascrizione; ne è quindi esclusa l’attenuazione, che agisce tramite una terminazione precoce del trascritto già iniziato. Essa è però formalmente uguale al controllo negativo di operon reprimibili, anche se realizza una regolazione più fine dell’espressione genica. 8.13. Una diversa strategia per il controllo negativo: il regulon. Il controllo dell’inizio della trascrizione tramite il circuito repressore/operatore si realizza talvolta secondo una strategia basata non sulla presenza di un solo operon, ma sulla regolazione coordinata di diversi geni posti sotto il controllo di promotori separati; queste diverse unità trascrizionali hanno in comune la funzione generale dei vari prodotti genici e la presenza, in ciascuna di esse, di un operatore riconosciuto da un repressore unico. Il caso più semplice viene ancora dall’anabolismo del triptofano: il repressore trp, oltre a reprimere l’operon trp in presenza di triptofano, è in grado di legarsi a un operatore localizzato intorno alla regione “35” del promotore dell’operone aroH. Questo codifica gli enzimi per la sintesi dell’acido corismico, che servono anche per la sintesi degli altri amminoacidi aromatici (fenilalanina e tirosina) oltre che del triptofano. Tale repressione è solo parziale e porta a una minore espressione degli enzimi in questione, commisurata alla necessità di produrre meno acido corismico in presenza di triptofano abbondante. Lo stesso repressore trp, inoltre, sempre in complesso col corepressore triptofano, blocca la propria sintesi legandosi a un operatore a cavallo del sito d’inizio del proprio gene regolatore (trpR). Questo è un esempio di regolazione autogena della trascrizione. In alcuni casi, tuttavia, i vari cistroni che codificano gli enzimi di una via metabolica possono trovarsi dispersi nel genoma batterico ed essere regolati negativamente da un unico gene regolatore. Questo si riscontra per la biosintesi dell’arginina in E. coli. Mutazioni singole in determinati loci (detti arg e indicati con le lettere da A a I e P) possono inattivare l’uno o l’altro enzima di questa via metabolica, come avviene anche per gli operoni come lac; si osservano però anche mutazioni distinte, in geni promotori od operatori, che alterano il controllo trascrizionale di un solo enzima (unità trascrizionali argA, D, G, H, I, P) o al massimo di un paio di essi (unità trascrizionali argBH e argCE). Viceversa, vi sono mutazioni singole, localizzate tutte nel gene argR, che producono un fenotipo non reprimibile, in presenza del corepressore arginina, per tutti gli enzimi della via metabolica. Devono quindi esistere sette promotori distinti, ciascuno dotato di un proprio operatore che si può combinare 117 col complesso repressore-arginina per il controllo negativo della trascrizione. Questo modello di regolazione genica è detto regulon. Riquadro 8.2. SCHEMA RIASSUNTIVO DELLE FORME DI CONTROLLO SULL’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI II R P O X I O R P O cR O X R A P I I I R A P A P A P geni strutturali repressore attivo induttore repressore inattivo blocco della trascrizione Controllo negativo dell'espressione di un operone inducibile (ad es.: lac). Controllo positivo dell'espressione di un operone inducibile (ad es.: attivazione da cAMP). geni strutturali trascrizione scarsa trascrizione copiosainduttore attivatore inattivo attivatore attivo + I I geni strutturali geni strutturali aporepressore (inattivo) corepressore cR cRcR cR repressore attivo blocco della trascrizione Controllo negativo dell'espressione di un operone reprimibile (ad es.: trp). Controllo positivo dell'espressione di un operone reprimibile (non sono noti esempi nei batteri). + cR cR cR "corepressore" (inibitore dell'attivatore) attivatore attivo attivatore inibito trascrizione scarsa trascrizione copiosa R = geni regolatori; P = promotori; O = operatori (elementi di sequenza a effetto negativo); A = elementi di sequenza a effetto positivo; le frecce verticali indicano la trascrizione o la traduzione dei geni; le frecce singole orizzontali indicano l’orientamento dei promotori; le doppie frecce sono gli equilibri di associazione tra i vari componenti dell’apparato di controllo; le linee ondulate o tratteggiate indicano i trascritti delle varie unità. Induzione e repressione possono, in linea di principio, essere effettuate entrambe tramite controllo positivo o negativo. Le quattro possibili combinazioni sono illustrate in questo riquadro. Va notato che, nella realtà del mondo batterico, i meccanismi di induzione degli operon catabolici sono spesso di tipo composto (controllo negativo + controllo positivo), mentre i meccanismi di repressione degli operon biosintetici si attuano tramite il controllo negativo (in quelli per gli amminoacidi anche attraverso il meccanismo di attenuazione). Non sono finora noti esempi di controllo positivo in operon reprimibili. L’adiacenza e il reciproco orientamento dei geni regolatori e degli operon da essi controllati possono variare nella realtà rispetto a quelli qui indicati; lo stesso dicasi della posizione reciproca tra promotori e sequenze di controllo ad essi associate (operatori, elementi attivatori) che qui sono mostrati in una sola disposizione per ciascuna forma di controllo (negativa: O al 3’ o a valle di P; positiva: A al 5’ o a monte di P), desunta dal paradigma dell’operon lac. Quindi, tutti questi elementi di sequenza si possono trovare in varie collocazioni, sia come disposizione che come distanza lungo il DNA (vi può essere anche sovrapposizione tra promotore e sequenza di controllo).