Biologia molecolare di base, Dispense di Biologia Molecolare

Scarica Biologia molecolare di base e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! METODO DI SEQUENZAMENTO DEL DNA PER SINTESI CON TECNOLOGIA PYROSEQUENCING La tecnologia Pyrosequencing® è un metodo di sequenzamento per sintesi del DNA, di uso semplice e automatizzabile, per analisi accurate e quantitative di sequenze di DNA. È usata oggi correntemente nei metodi detti high throughput sequencing o next generation sequencing. Essa si basa sui seguenti principi: a) l’aggiunta di un residuo nucleotidico da parte di una DNA polimerasi, guidata dallo stampo, produce la liberazione di pirofosfato inorganico (PPi); se si aggiunge un solo tipo di dNTP, e questo è complementare al residuo presente sullo stampo a livello del punto di innesco, la DNA polimerasi lo inserisce e libera PPi; b) nel mezzo di reazione, il PPi può servire a generare ATP, in presenza di adenosina 5’- fosfosolfato (APS) e dell’enzima ATP solforilasi, che catalizza la reazione: APS + PPi  ATP + SO4 2– c) l’ATP è il cofattore richiesto dall’enzima luciferasi che ossida il suo substrato luciferina allo stato eccitato di ossiluciferina che decade emettendo un fotone di luce visibile (nel verde); d) l’enzima apirasi è un’idrolasi non specifica che converte ogni dNTP o NTP in dNDP o NDP e questi nei corrispondenti monofosfati. Tappa 1 Si fa ibridare un innesco per sequenzamento a un amplicon (singolo filamento di DNA che serve da stampo), e lo si incuba in una miscela contenente gli enzimi DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi e apirasi, e i substrati adenosina 5’-fosfosolfato (APS) e luciferina. Tappa 2 Si aggiunge alla reazione (in eccesso stechiometrico rispetto all’innesco) il primo dNTP scelto a caso; se esso è complementare a quella del primo nucleotide libero sullo stampo, la DNA polimerasi catalizza l’incorporazione del residuo nel filamento di DNA innesco. Ogni evento d’incorporazione si accompagna al rilascio di PPi in quantità equimolare a quella del nucleotide incorporato.