Biologia molecolare di base, Dispense di Biologia Molecolare

Scarica Biologia molecolare di base e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! 1 Metodi per evidenziare e individuare le interazioni tra fattori di trascrizione ed elementi di sequenza regolatori (Analisi del cistroma) EMSA (saggio a spostamento della mobilità elettroforetica) L’EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay, saggio a spostamento della mobilità elettroforetica) è una tecnica assai usata per studiare in vitro le interazioni DNA-proteina. Essa si basa sul fatto che i complessi DNA-proteina, in un gel di poliacrilammide nativo, migrano più lentamente del DNA non legato producendo uno “shift” nella migrazione delle bande di DNA marcato. Se sono disponibili anticorpi contro la proteina che si sospetta interagire con quella sequenza di DNA, è possibile effettuare, come ulteriore prova, un esperimento di “supershift”. Incubando la miscela proteine/DNA con uno specifico anticorpo, questo si legherà alla proteina. Se, a sua volta, questa proteina era legata al DNA, si registrerà un ulteriore ritardo su gel rispetto al campione contenente solo l’estratto proteico+DNA. Occorrente per l’analisi: oligonucleotidi a sequenza specifica di DNA duplex marcato (con radioisotopo o con biotina) oligonucleotidi a sequenza specifica di DNA duplex non marcato (“freddo”) estratti nucleari da cellule di un tipo specifico gel di poliacrilammide nativo (4-8%) Tampone TBE (Tris-Borato-EDTA) Membrane di nylon (cariche positivamente) Lastre fotografiche Apparato per elettroforesi Apparato per elettroblotting Lampada UV per cross-linking Preparazione estratti nucleari Si effettua a partire da cellule in coltura o da un tessuto. Con opportuni tamponi occorre dapprima rompere la membrana cellulare per ottenere il rilascio del contenuto citoplasmatico. Tramite centrifugazione si recuperano i nuclei cellulari intatti; questi vengono poi lisati con un tampone adatto, si centrifuga e, dopo la centrifugazione, si recupera il contenuto nucleare che viene aliquotato e congelato a –80°C fino al momento dell’uso. Preparazione gel nativo Si prepara con TBE (concentrazione finale 0,5X), acrilammide-bisacrilammide alla concentrazione finale del 4-8%, glicerolo, persolfato d’ammonio e TEMED. Il gel, una volta polimerizzato, viene posto nella camera di corsa, preventivamente riempita di tampone TBE 0,5X, e sottoposto ad una pre-corsa per 30-60 minuti (ciò riduce le correnti di elettroendosmosi durante la corsa). Preparazione reazioni di binding Le reazioni si svolgono a temperatura ambiente per 20 minuti. In un tampone adeguato contenente poli(dIdC), glicerolo NP-40 e MgCl2, si aggiungono DNA marcato (20 fmoli), estratti nucleari (2 μg circa per ogni reazione) e DNA non marcato. È necessario, per ogni complesso da esaminare, preparare un campione contenente solo il DNA marcato (controllo); uno contenente il DNA marcato più l’estratto nucleare (saggio di shift) e uno contenente il DNA marcato + estratto nucleare + DNA “freddo” in eccesso (prova di competizione). 2 Corsa elettroforetica Si aggiunge il tampone di caricamento (contenente glicerolo, blu di bromofenolo e xilene cianolo) ai campioni e li si carica sul gel, che è fatto correre a 100 V per il tempo opportuno. Il gel viene poi staccato e posto in contatto con la membrana di nylon, si monta il tutto come per un Western Blotting e si fa avvenire il trasferimento (in tampone TBE) per 1 h a 4°C (380 mA). Dopo la corsa il DNA viene fissato sulla membrana tramite UV cross-linking. Se gli oligonucleotidi sono biotinilati, la membrana è posta a contatto con una soluzione contenente streptavidina coniugata a perossidasi. La streptavidina è una proteina con alta affinità per la biotina. Si fanno poi lavaggi per eliminare l’eccesso non legato e si lascia la membrana a reagire con una soluzione contenente i substrati luminolo e H2O2. Il luminolo e i suoi derivati sono composti chemiluminescenti che hanno trovato ampio utilizzo in campo analitico. La struttura della molecola del luminolo (5-amino-2,3-diidroftalazina-1,4-dione) è costituita da due anelli adiacenti: uno aromatico, che non subisce nessuna variazione nella reazione chemiluminescente, e l’altro eterociclico non aromatico che invece è ossidato durante tale reazione dando origine a ione amminoftalato nello stato eccitato (singoletto) che decadendo allo stato fondamentale (tripletto) restituisce l’energia di eccitazione sotto forma di fotoni. NH NH O O NH 2 O O O O NH2 + H2O2 + OH  catalizzatore (ad es., perossidasi) + N2 + H3O + + hv (425 nm) Per aumentare l’efficienza luminosa di questa reazione, sono state introdotte molecole denominate comunemente intensificatori (enhancer), che si sono dimostrate molto efficienti nel miglioramento dell’emissione luminosa di questa reazione, fino a raggiungere in condizioni ottimali livelli anche 1000 volte superiori rispetto alla reazione chemiluminescente tradizionale ed inoltre, in particolari condizioni di reazione, l’emissione luminosa è prolungata e decade molto lentamente. Esempi di EMSA shift e supershift col fattore c-Myb Il fattore di trascrizione c-Myb è espresso nei precursori ematopoietici, nei quali mantiene lo stato indifferenziato e proliferante; si lega a sequenze 5’CAGTTT3’. Virus leucemici reclutano c-Myb per attivare la propria trascrizione, usando sequenze specifiche nei loro genomi. FeLV, virus della leucemia felina, ne ha tre copie nella sua LTR (Long Terminal Repeat) tra un enhancer e il promotore basale). Qui sotto è riportato lo schema della regione U3 della LTR da FeLV-945, un ceppo del virus; nel rettangolo in alto, lo schema di U3 con in grigio l’enhancer, in bianco le tre ripetizioni a monte del promotore (Pro), dette GS945, la cui sequenza, riportata in basso, contiene due elementi in grado di legare c-Myb (è mostrata anche la sequenza sul filamento complementare). È stato visto che c-Myb, dopo essersi legato su queste sequenze cis-attive, a sua volta recluta il CBP (CREB Binding Protein). CBP è una proteina presente in tutti i tipi cellulari, che interagisce coi fattori basali TFIIB e TBP per stimolare la trascrizione. Il nome di CBP deriva dal fatto che essa è stata scoperta come cofattore di CREB. Questo è un fattore specifico che risponde a cAMP e si lega a una sequenza detta CRE (Cyclic AMP Response Element); quando CREB è fosforilato in seguito all’attivazione di PKA da cAMP, esso si lega a CRE e recluta CBP. Invece c-Myb recluta CBP in maniera indipendente da proteincinasi, ma lo fa solo dove è presente (linee ematopoietiche). Un primo esempio di EMSA mostra perciò, oltre all’effetto di shift, l’uso dei competitori: 5 nucleasi. Frammenti cromatinici di 400500 pb sono molto adatti ai saggi ChIP poiché coprono fino a tre nucleosomi. Dopo aver allontanato per centrifugazione i materiali cellulari grossolani, si aggiunge al materiale frammentato che contiene complessi proteine-DNA l’anticorpo specifico per la proteina d’interesse. Questi anticorpi sono di solito coniugati con sferette di agarosio, di sefarosio o magnetiche, in modo da produrre l’immunoprecipitazione. I complessi immunoprecipitati (sferetta–anticorpo–proteina– sequenza di DNA bersaglio) sono raccolti e lavati per allontanare la cromatina legata non specificamente; in seguito, i legami crociati proteine-DNA sono eliminati e le proteine sono rimosse tramite digestione con proteinasi K. I frammenti di DNA che erano associati ai complessi sono infine purificati e identificati tramite diverse tecniche alternative o complementari: PCR, microarray (ChIP-on-chip), clonazione molecolare e sequenziamento, o sequenziamento diretto ad alta efficienza (ChIP-Seq). ChIP nativa (NChIP) La NChIP è adatta soprattutto per fare mappe sul DNA dei modificatori degli istoni. In genere, il materiale di partenza è la cromatina nativa. Poiché istoni e DNA sono avvolti insieme per formare i nucleosomi, essi sono legati in modo naturale. La cromatina è poi frammentata per digestione con nucleasi di micrococco, che taglia il DNA sul segmento del DNA internucleosomico (linker), lasciando intatti i nucleosomi e fornendo frammenti di DNA con lunghezza da 1 nucleosoma (~200 pb) fino a 5 nucleosomi (~1000 pb). Gli stadi successivi sono simili a quelli della XChIP (allontanamento dei materiali cellulari grossolani, immunoprecipitazione delle proteine d’interesse, rimozione delle proteine dal complesso immunoprecipato, purificazione e analisi del DNA che era associato ai complessi). Confronto tra XChIP e NChIP Il vantaggio principale della NChIP è la specificità degli anticorpi. È importante notare che per lo più gli anticorpi contro gli istoni modificati sono indotti tramite epitopi peptidici sintetici non fissati, mentre gli epitopi che devono riconoscere nella cromatina possono essere alterati o distrutti nella XChIP dai legami crociati prodotti dalla formaldeide, soprattutti perché i legami coinvolgono probabilmente gruppi -amminici di lisine (ad es., nelle code N-terminali degli istoni), distruggendo gli epitopi. È probabile che ciò spieghi l’efficienza sistematicamente bassa dei protocolli XChIP rispetto a quelli NChIP. XChIP e NChIP hanno però scopi differenti e vantaggi in contrasto tra loro: la XChIP serve a fare mappe dei siti bersaglio per i fattori di trascrizione e altre proteine associate alla cromatina, la NChIP serve a mappare i siti dei modificatori degli istoni (vedi Tabella seguente). Alla pagina successiva è rappresentata in forma illustrata e schematica la procedura XChIP. Tabella – Vantaggi e svantaggi di NChIP e XChIP XchIP NchIP Vantaggi Adatta a fattori di trascrizione o altre proteine associate a cromatina. Applicabile a tutti gli organismi nei casi in cui è difficile purificare la proteina nativa Specificità anticorpo saggiabile e migliore perché la proteina è naturale e intatta. Perciò, efficiente recupero di cromatina e di proteina. Svantaggi Recupero inefficiente della cromatina a causa della distruzione dell’epitopo sulla proteina bersaglio. Può causare falsi positivi per la fissazione alla cromatina di proteine accidentalmente presenti su essa. Ampia gamma di lunghezza dei frammenti cromatinici a causa del taglio casuale per sonicazione. Di solito non adatta a proteine non istoniche. I nucleosomi possono spostarsi durante la digestione. cellula forma legami crociati da! tra proteine e DNA frammenta il DNA per sonicazione lisato cellulare + anticorpi legati a sferette per immunoprecipitare i bersagli "8%: À elimina i legami crociati e purifica i frammenti di DNA A É (ae: e PL da î mappa sul genoma sequenziamento ATGCCIGGACCGTG 7 Dopo la frammentazione e prima di aggiungere l’anticorpo, è necessario prelevare un’aliquota di ogni campione da sottoporre a elettroforesi su gel di agarosio all’1,5% per determinare la qualità della frammentazione. Questo campione rappresenta l’INPUT della ChIP, rispetto al quale va standardizzata la quantità di DNA negli immunoprecipitati. L’arricchimento in sequenze cis-attive specifiche è valutato rispetto a una prova “negativa” in cui l’immunoprecipitazione è effettuata con anticorpi diretti contro proteine sicuramente non nucleari (ad es., contro le immunoglobuline). Analisi del DNA frammentato con nucleasi di micrococco (a sinistra) o sonicato (a destra). A sinistra: corsia 1: scaletta di frammenti standard di DNA (ladder) con gradi da 100 pb; corsia 2: DNA estratto dalle HeLa intatto; corsie 3-4-5: lo stesso DNA dopo 5, 10 e 15 minuti di digestione. A destra: prima corsia, frammenti standard di DNA (200-300-400- … -1000-2000 pb), seconda corsia, campione sonicato.