Biologia molecolare di base, Dispense di Biologia Molecolare

Scarica Biologia molecolare di base e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! 1 Tecniche per studiare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Anche se oggi è poco praticata, l’analisi di RFLP fu la prima tecnica di genotipizzazione abbastanza poco costosa da raggiungere un’ampia applicazione (“impronta digitale del DNA”). Oltre alla diagnostica genetica, l’analisi di RFLP è stato uno strumento importante per la mappatura dei genomi, la localizzazione di geni coinvolti in malattie ereditarie, la determinazione del rischio genetico di tali malattie e i test di paternità. In genetica molecolare, il termine restriction fragment length polymorphism (polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione) o RFLP, indica una variante in sequenze omologhe di DNA. Essa rappresenta una differenza tra campioni di molecole omologhe di DNA (ossia dello stesso locus cromosomico nella stessa specie) derivante da assenza/presenza di siti per enzimi di restrizione; con lo stesso termine (RFLP) si indica la tecnica di laboratorio con cui si evidenziano queste varianti per la ricerca di alleli mutati. Nell’analisi di RFLP, il campione di DNA genomico è tagliato in frammenti per digestione con una particolare endonucleasi di restrizione; tali frammenti di restrizione sono separati in base alla loro lunghezza per elettroforesi su gel di agarosio. Si esegue quindi un Southern Blotting, facendo una replica del gel su filtro di nitrocellulosa; questo è poi ibridato con una sonda specifica che si appaia con la regione cromosomica d’interesse. Tecnica di analisi RFLP La tecnica di base per rivelare gli RFLP richiede la frammentazione di un campione di DNA con un enzima di restrizione, che riconosce e taglia il DNA a livello di una breve sequenza specifica, per produrre un digerito per restrizione. I frammenti di DNA ottenuti sono poi separati in base alla loro lunghezza (mobilità) per elettroforesi su gel di agarosio e trasferiti a una membrana di nitrocellulosa (filtro) tramite il procedimento del Southern blot. I frammenti sono moltissimi e in gran parte sovrapposti nel gel e sul filtro (producendo uno “striscio” quasi continuo); tuttavia, quelli derivanti da un locus genico preciso possono essere trovati ibridando la membrana con una sonda marcata di DNA che evidenzia solo i frammenti con sequenza complementare alla sonda; tali frammenti possono contenere tutta la sequenza o una parte di essa (la sonda è studiata in modo da coprire una regione abbastanza ampia del locus). Si osserva un RFLP quando la lunghezza dei frammenti varia tra individui (campioni) diversi. Si considera un allele ciascun frammento (o coppia di frammenti) di lunghezza determinata, che può essere usato per l’analisi genetica. L’analisi di RFLP si può distinguere in due tipi: a sonda singola (single length polymorphism, SLP) e a sonda multipla (multiple length polymorphism, MLP). Di solito, il metodo SLP è preferibile a quello MLP perché più sensibile, facile da interpretare e in grado di analizzare campioni misti di DNA. Si ottengono inoltre risultati anche quando il DNA campione è degradato (ad es., se estratto da reperti scheletrici antichi.) Il meccanismo più comune che varia le dimensioni di un particolare frammento di restrizione è il seguente. Un breve segmento del genoma può essere rilevato da una sonda di DNA: l’allele normale è scisso da un enzima di restrizione su tre siti, producendo due frammenti, uno dei quali è complementare alla sonda e quindi sarà evidenziato; nell’allele mutato, il secondo sito di restrizione è stato perso a causa di una mutazione puntiforme, di modo che la sonda ora rivela un frammento più lungo che si estende tra i siti 1 e 3 (vedi figura alla pagina successiva). L’analisi degli RFLP nei genomi ha rappresentato uno strumento essenziale nella mappatura dei genomi e nell’analisi delle malattie genetiche. Essa è anche stata la base per i primi metodi di tipizzazione genetica, utili per identificare individui sospetti di delitti, per l’accertamento della paternità, e per la caratterizzazione della diversità genetica in popolazioni di animali. La tecnica di analisi degli RFLP è stata però sostituita, più di recente, da procedure più immediate. Infatti, essa richiede buone quantità di DNA, la produzione e marcatura della sonda, la digestione del DNA, l’elettroforesi, il trasferimento su filtro (Southern blotting) e la successiva ibridazione. Con l’accumularsi dei dati sulle sequenze di genomi completi, l’analisi degli RFLP è stata integrata 2 da procedure di PCR con opportuni inneschi, resi fluorescenti con gruppi attaccati al 5’; la sequenza bersaglio contiene siti di restrizione noti nell’allele selvatico. Dopo la PCR, gli amplificati sono digeriti con un enzima di restrizione e separati su un gel di sequenza. In questo schema è rappresentato un esempio di RFLP: nel locus mutato, una sostituzione di basi (mutazione puntiforme o SNP = polimorfismo a singolo nucleotide) ha cambiato la sequenza in modo da abolire il secondo sito di taglio per l’enzima Hha1. Operando col Southern blot e una sonda marcata, si evidenzierà una banda più corta nel campione wt (frammento di DNA compreso tra i primi due siti di restrizione), mentre quella nel campione di DNA mutante sarà più lunga (frammento di DNA compreso tra il primo e il terzo sito di restrizione, essendo il secondo abolito dalla mutazione). Se invece si opera con la PCR, i due campioni sono amplificati con due inneschi specifici che si appaiano esternamente al tratto di locus che contiene i tre siti di restrizione (frecce blu e verde): trattando i due amplificati con Hha1, il wt darà due frammenti e il mutante un solo frammento di lunghezza pari alla somma di quelli ottenuti dal wt. I risultati della PCR si possono anche analizzare confrontando le varie bande o picchi fluorescenti nelle corsie di campioni sicuramente selvatici e mutati, o paragonandoli a quelli di una corsia in cui si fanno correre gli standard da un database della specie in esame. Questa variante è anche detta CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence). Un’alternativa, dopo l’amplificazione con la PCR, consiste nell’analizzare gli amplificati con la tecnica del dot blot usando con sonde oligonucleotidiche specifiche per i vari alleli (Allele Specific Oligonucleotide = ASO). Altre tecniche elettroforetiche per evidenziare polimorfismi. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP: polimorfismo da conformazione del singolo filamento) Molecole di DNA a singolo filamento migrano in un gel di poliacrilammide non denaturante in maniera dipendente dalla struttura tridimensionale e quindi della loro sequenza. Dopo aver amplificato frammenti corti (150-300 pb), questi sono trattati in modo da denaturarli completamente; sono quindi applicati sul gel, la cui composizione, tampone e temperatura di corsa possono variare. I singoli filamenti migrano con velocità diverse nelle varie zone del gel perché ciascuna banda di ssDNA (anche della stessa lunghezza) ha una migrazione dipendente dalla sequenza: anche una singola sostituzione nucleotidica (SNP) può produrre una diversa posizione della banda. Non è possibile predire la mobilità elettroforetica del ssDNA, ma in casi ben determinati si usano controlli per individuare la natura del SNP. Heteroduplex analysis (HDA: analisi dell’eteroduplex) Questa metodica sfrutta la diversa mobilità elettroforetica di molecole di dsDNA contenenti una regione con mismatch. Il DNA a doppia elica non è una molecola diritta completamente rigida. La varietà di sequenza può causare curvature nell’asse della doppia elica, o anche alterare la struttura di