Biologia molecolare di base, Dispense di Biologia Molecolare

Scarica Biologia molecolare di base e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! 1 Il fago lambda: un altro racconto Il fago lambda è una particella virale contenente DNA lineare a doppia elica come materiale genetico. Questa particella riconosce il suo ospite E. coli e vi si lega, facendo sì che il DNA contenuto nel capside del fago sia inserito attraverso la coda nel citoplasma della cellula batterica. Di solito, ne deriva un “ciclo litico”, in cui il DNA di lambda è replicato molte volte ed esprime i geni per le proteine della testa, della coda e per la lisi. Ciò porta al montaggio di molte nuove particelle fagiche nella cellula e alla lisi cellulare successiva, rilasciando nell’ambiente i contenuti cellulari, compresi i virioni che si sono montati. Tuttavia, in certe condizioni il DNA del fago si può integrare nel cromosoma della cellula ospite tramite la via lisogena. In questo stato, il DNA di λè detto profago e rimane residente entro il genoma dell’ospite senza danno apparente per esso; quando in esso è presente un profago, il batterio è detto lisogeno. Il profago è replicato a ogni successiva divisione cellulare dell’ospite. Il solo gene del profago espresso in tale stato silente codifica una proteina che reprime l’espressione degli altri geni fagici (come quelli strutturali e della lisi) in modo da prevenire l’ingresso nel ciclo litico. Tale proteina repressore è degradata quando la cellula ospite è sotto stress, il che fa riprendere l’espressione dei geni fagici repressi. Lo stress può derivare da carenze nutrizionali, sostanze tossiche (come gli antibiotici) o altri fattori che possono danneggiare o distruggere l’ospite. In risposta allo stress, il profago attivato è escisso dal DNA della cellula ospite dal prodotto di uno dei geni ora espressi ed entra nel ciclo litico. Struttura della particella e del genoma di lambda La particella virale consiste di una testa e di una coda che può avere delle fibre. La testa contiene 48.490 pb di DNA lineare a doppia elica fiancheggiato da segmenti a singolo filamento di 12 basi, che costituiscono i due filamenti di un sito detto cos. In forma circolare nel citoplasma dell’ospite, il genoma del fago è quindi lungo 48.502 pb. Il profago si trova invece come un'inserzione lineare di DNA dentro il cromosoma circolare dell’ospite. sequenze cos a singolo filamento nella forma lineare del genoma di lambda: 5’GGGCGGCGACCT––––––––––––––––––………––––––––––––––––3’ 3’––––––––––––––––––………––––––––––––––––CCCGCCGCTGGA-5’ sequenza cos a doppio filamento nella forma circolare del genoma di lambda: Ciclo riproduttivo Infezione 1. Il batteriofago lambda si lega alla cellula bersaglio di E. coli: la proteina J in fondo alla coda interagisce con la proteina lamB di E. coli, una porina che fa parte dell’operon del maltosio. 2. il genoma lineare del fago è iniettato attraverso la membrana esterna del batterio. 3. Il DNA passa attraverso una proteina del trasporto degli zuccheri (ptsM) nella membrana interna, e subito circolarizza sui siti cos, estremità coesive a 12 basi ricche in G-C. I nick presenti agli estremi del sito cos sono saldati dalla DNA ligasi dell’ospite. GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGGA = la DNA ligasi dell’ospite ha saldato i nick in questi punti; negli stessi punti si ha la scissione dei siti cos da parte della terminasi del fago. 2 4. La DNA girasi dell’ospite induce superavvolgimento negativo nella forma circolare del genoma, facendo svolgere le regioni ricche in A-T per trainare la trascrizione. 5. La trascrizione inizia dai promotori costitutivi PL, PR e PR' producendo i trascritti ‘precoci immediati’. Essi esprimono i geni N e cro, producendo N, Cro e una proteina corta inattiva. 6. Cro è un repressore che si lega all’operatore OR3 (senza effetti sulla trascrizione da PR) impedendo l’accesso al promotore PRM e quindi l’espressione del gene cI; si lega anche all’operatore sinistro OL3 ma senza effetti sulla trascrizione da PL. N si lega ai due siti Nut (utilizzo di N), uno nel gene N sul trascritto da PL, l’altro nel gene cro sul trascritto da PR. 7. La proteina N è un antiterminatore, e funziona estendendo il trascritto cui è legata. Quando la RNA polimerasi trascrive queste regioni, recluta N e forma un complesso con alcune proteine Nus dell’ospite. Questo complesso salta la maggior parte dei terminatori. I trascritti estesi (o ‘precoci tardivi’) comprendono i geni N e cro insieme a quelli cII, cIII, xis, int, O, P e Q di cui è detto dopo. 8. La proteina cIII protegge la proteina cII dalla proteolisi da FtsH (una proteasi di membrana, essenziale per E. coli) o da HflB, agendo da inibitore competitivo. L’inibizione induce una condizione batteriostatica, che favorisce la lisogenia. cIII stabilizza anche direttamente la proteina cII. All’inizio dell’infezione, la stabilità di cII determina la scelta di sviluppo del fago; se cII è stabile, porta alla via lisogena, ma se cII è degradata il fago seguirà la via litica. Bassa temperatura, carenza di nutrienti cellulari e alta molteplicità d’infezione (MOI) sono fattori che favoriscono la lisogenia (vedi più avanti “Ciclo lisogeno”). La proteina N non interagisce col DNA, si lega invece all’mRNA appena trascritto. I siti nut contengono tre sequenze conservate (box) delle quali solo boxB è essenziale. 1. Le sequenze di RNA boxB sono situate vicino al 5’ dei trascritti dai promotori PL, PR. Quando sono trascritte, ognuna forma una struttura a forcina cui si può legare la proteina N. 2. La proteina N si lega a boxB in ciascun trascritto e prende contatto con la RNA polimerasi in trascrizione tramite un’ansa di RNA. Il complesso N-RNAP è stabilizzato dal legame successivo di alcune proteine Nus (N utilisation substance) dell’ospite che comprendono fattori di terminazione/antiterminazione della trascrizione e una proteina ribosomale. 3. L’intero complesso (legato al sito Nut sull’mRNA) continua la trascrizione e può saltare le sequenze di terminazione. Ciclo litico Si tratta del ciclo riproduttivo del fago, che si sviluppa a seguito della maggior parte degli eventi infettivi se la proteina cII non raggiunge una concentrazione abbastanza alta, a causa della sua degradazione, cosicché non attiva i promotori a essa deputati. 1. I geni ‘precoci tardivi’, tra cui xis, int, Q e i geni per la replicazione del genoma di lambda (O, P), continuano a essere trascritti. Cro domina il sito di repressione (vedi la sezione “Repressore”), reprimendo la trascrizione dal promotore PRM. 2. Le proteine O e P iniziano la replicazione del genoma fagico (vedi “Replicazione litica”). 3. Q, un altro antiterminatore, si lega ai siti Qut. 4. Per azione della proteina Q (vedi “Antiterminazione Q”) la trascrizione dal promotore PR' può ora estendersi per produrre l’mRNA delle proteine della lisi, della testa e della coda. 5. Le proteine strutturali e i genomi fagici si automontano in nuove particelle fagiche. 6. I prodotti dei geni della lisi S, R, Rz e Rz1 provocano la lisi cellulare. S è una holina, piccola proteina di membrana che, all’istante determinato dalla sequenza della proteina, perfora all’improvviso la membrana. R è un’endolisina, cioè un enzima che fuoriesce dai fori fatti da S e scinde la parete cellulare. Rz e Rz1 sono proteine di membrana che formano un complesso in qualche modo distruttivo per la membrana esterna, dopo che l’endolisina ha degradato la parete cellulare. Per il tipo selvatico di lambda, la lisi avviene a ~50 min dopo l’inizio dell’infezione e libera ~100 virioni. 5 La presenza di cI causa immunità nell’ospite rispetto a un superinfezione da altri fagi lambda, poiché i loro promotori PL e PR saranno inibiti fin dall’inizio del loro ingresso nell’ospite. Induzione del ciclo litico in un ospite lisogeno L’induzione classica di un lisogeno consiste nell’irraggiare le cellule infette con luce UV. Però, qualunque altra situazione in cui l’ospite lisogeno subisce danno al DNA o induzione della risposta SOS in un modo o nell’altro, porta all’induzione del ciclo litico. 1. La cellula ospite, che contiene il profago, subisce un danno al DNA dovuto a un ambiente con forte stress, e dà inizio alla risposta SOS. 2. La proteina batterica RecA rileva il danno al DNA (come presenza di estremità libere di filamenti) ed è attivata. In questa forma (RecA*), agisce non solo nei meccanismi di ricombinazione omologa per riparare il DNA, ma anche da specifica co-proteasi. 3. Infatti, l’azione normale di RecA* è legare LexA (un repressore), attivandone l’azione autoproteolitica, che distrugge questo repressore e consente la produzione delle proteine per la riparazione SOS del DNA. Nei lisogeni, questa risposta è dirottata, e RecA* stimola la autolisi di cI. Infatti, cI ha una regione mimica di LexA che agisce da sito autoproteolitico. 4. La scissione di cI nella regione cerniera impedisce la sua dimerizzazione, per cui esso perde affinità col DNA. 5. I promotori PR e PL non sono più repressi e iniziano a essere trascritti; la cellula va incontro alla sequenza litica degli eventi di espressione del genoma di lambda. Infatti, la proteina cII non è stabile in cellule che subiscono la risposta SOS. C’è però una particolarità in questa induzione del ciclo litico: esso inizia dallo stato di profago; occorre quindi un altro evento. Controllo dell’escissione del genoma fagico nell’induzione 1. Il genoma fagico è ancora inserito in quello dell’ospite e ne deve uscire in forma circolare per far avvenire la replicazione del DNA. La regione sib del suo genoma si trova ora però lontana dal gene int a causa della presenza della sequenza fagica nel sito att, quindi la trascrizione dal promotore PL non produrrà nella regione di terminazione la forcina con bolle, ma il terminatore indipendente da rho che fa dissociare il complesso di allungamento della trascrizione. 2. La fase iniziale di trascrizione da PL ha prodotto la proteina N e il lungo trascritto esprime sia xis sia int, dando concentrazioni più o meno simili di Xis e Int. 3. Questa condizione fa sì che le due proteine catalizzino l’escissione del genoma inserito da quello dell’ospite e che vada incontro alla replicazione e agli stadi finali di produzione delle particelle fagiche. Riassunto delle funzioni delle proteine di lambda Cro (Control of Repressor’s Operator): è un repressore della trascrizione, si lega a OR3, OR2 e OR1 (affinità OR3 > OR2 = OR1, ossia si lega di preferenza a OR3). A basse concentrazioni blocca il promotore PRM (impedendo la produzione di cI). Ad alte concentrazioni autoregola la propria produzione legandosi a OR2 e OR1. Non presenta legame cooperativo (al contrario di cI). cI (clear 1): repressore della trascrizione, si lega a OR1, OR2 e OR3 (affinità OR1 > OR2 = OR3, ossia si lega di preferenza a OR1). A basse concentrazioni blocca il promotore PR (impedendo la produzione di Cro). Ad alte concentrazioni autoregola la propria produzione legandosi a OR3. Il legame di cI a OR1 stimola il legame quasi simultaneo di cI a OR2 tramite interazioni cooperative nel dominio C- terminale); il dominio N-terminale di cI su OR2 rafforza il legame dell’oloenzima RNA polimerasi su PRM e stimola quindi la trascrizione del proprio gene. Il repressore cI inibisce anche la trascrizione dal promotore PL. Suscettibile di scissione da parte di RecA* in cellule che vanno incontro a risposta SOS. cII (clear 2): attivatore trascrizionale. Attiva la trascrizione da Pantiq, PRE e PI. Poco stabile perché suscettibile alle proteasi cellulari HflB e FtsH (soprattutto in cellule che crescono o in quelle che vanno incontro a risposta SOS). 6 cIII (clear 3): proteina che lega HflB/FtsH, impedendo la degradazione di cII da queste proteasi. N (aNtiterminator): proteina che lega RNA e cofattore della RNA polimerasi; si lega all’RNA sui siti nut e si trasferisce sul complesso nascente RNApol che ha appena trascritto il sito nut. Questa modificazione di RNApol impedisce il riconoscimento di terminatori, di modo che la sintesi di RNA continua fino ai geni distali rispetto ai promotori PR e PL. Q: proteina che lega DNA e cofattore di RNApol, si lega al DNA sui siti qut e si trasferisce sulla RNApol che ha appena iniziato la trascrizione da PR’. Questa modificazione della RNApol altera il suo riconoscimento dei terminatori, in modo che quelli consueti sono ignorati; vi sono però sequenza di terminazione specifiche per Q circa 20,000 pb a valle del promotore PR’. Xis (eXcISion): escissionasi e regolatore della proteina Int, attua insieme a questa l’escissione del genoma fagico dal genoma dell’ospite. Int (INTegration): effettua l’inserzione/escissione del genoma fagico in quello dell’ospite. A basse concentrazioni non ha effetto. Se Xis ha concentrazioni basse e Int le ha alte, si attua l’inserzione del fago nel genoma dell’ospite. Se le concentrazioni di Xis e Int sono alte e circa uguali, si attua l’escissione del genoma fagico da quello dell’ospite. A, B, C, D, E, F, Z, U, V, G, T, H, M, L, K, I, J [Nell’ordine in cui si trovano nel genoma, in senso orario]: proteine strutturali, si automontano col genoma lineare nelle particelle fagiche. S, R [Nell’ordine in cui si trovano nel genoma, in senso orario]: causano lisi della cellula ospite quando raggiungono concentrazioni abbastanza alte. O, P: funzionano nella replicazione del DNA, promuovendo la replicazione specifica di un solo genoma del fago. sib [non è una proteina, ma una sequenza di DNA vitale conservata]: forma una forcina stabile nel trascritto da PL oltre il gene int. Attira la degradazione dell’mRNA da parte della RNasi III. attP [non è una proteina, ma una sequenza conservata di DNA]; punto d’azione di Int e Xis nelle operazioni di integrazione ed escissione del genoma fagico in quello dell’ospite. Il sito attB corrispondente si trova nel genoma dell’ospite al sito di inserzione. Repressore Il repressore trovato nel fago lambda è un esempio notevole del livello di controllo possibile sulla espressione genica con un sistema abbastanza semplice. Esso costituisce un “commutatore binario” con due geni in espressione mutualmente esclusiva, scoperto da Barbara J. Meyer. Il sistema di repressione genica di lambda consiste di (da sinistra a destra sul genoma):  gene cI  OR3  OR2  OR1  gene cro Il repressore di lambda è un dimero noto anche come proteina cI. Esso lega il DNA col modulo elica-gomito-elica (HTH) e regola la trascrizione delle proteine cI e Cro. Queste controllano a loro volta il ciclo riproduttivo del fago lambda. Esso resterà nel suo stato lisogeno se predomina la proteina cI, ma attuerà il ciclo litico se predomina la proteina Cro. Il dimero di cI può legarsi a uno dei tre siti dell’operatore destro, OR1, OR2 e OR3, nell’ordine OR1 > OR2 = OR3. Il legame di un dimero a OR1 accresce l’affinità di un secondo dimero per OR2, per effetto cooperativo. Quindi, OR1 e OR2 sono quasi sempre simultaneamente occupati da cI. Invece, questa condizione non aumenta l’affinità tra cI e OR3, che sarà occupato solo quando la concentrazione di cI sarà alta.  In assenza di proteina cI, il gene cro può essere trascritto.  In presenza di proteina cI, sarà trascritto solo il gene cI.  A concentrazione elevata di cI, è repressa la trascrizione di entrambi i geni. 7 Ciclo litico o lisogeno? Il circuito di regolazione genica del fago λ è tra quelli meglio conosciuti a livello di meccanismo. Tale circuito comporta alcuni comportamenti regolatori interessanti. Una cellula infettata va incontro a una decisione tra due vie alternative, quella litica e quella lisogena. Se segue la seconda, s’instaura e si mantiene lo stato lisogeno. Anche se questo stato è piuttosto stabile, esso può passare alla via litica col processo di induzione sul profago, che si verifica quando il sistema di risposta SOS dell’ospite è scatenato da un danno al DNA. Una distinzione importante da fare è quella tra due schemi di decisione: lisogenia o lisi al momento dell’infezione, e il proseguimento della lisogenia o la crescita litica dallo stato di profago. Questa seconda decisione è determinata unicamente dall’attivazione di RecA nella risposta SOS della cellula, come esposto nel paragrafo sull’induzione del ciclo litico in un ospite lisogeno. In queste condizioni, anche la decisione del primo tipo sarà influenzata: in una cellula che sta facendo la risposta SOS ci sarà sempre crescita litica al momento dell’infezione, poiché non sarà possibile far crescere la concentrazione della proteina cI. Invece, la decisione iniziale ciclo litico/ciclo lisogeno al momento dell’infezione dipende anche dalle proteine cII e cIII. Ragionando in termini semplificati, nelle cellule con adeguato apporto di nutrienti (carboniosi), l’attività delle proteasi è elevata (poiché c’è abbondante ricambio delle proteine), e questo porta a una distruzione di cII, quindi alla via litica. In cellule con fonti di carbonio limitanti, l’attività delle proteasi è bassa, facendo sì che cII sia stabile, quindi c’è la tendenza alla via lisogena. Risulta che cIII stabilizza cII, sia direttamente sia agendo da inibitore competitivo delle proteasi rilevanti nel ricambio proteico. Ciò significa che una cellula “in crisi”, che manca cioè di nutrienti e tende a non crescere, è più facile che lisogenizzi: in effetti, la mancanza di glucosio (segnalata da un aumento di cAMP) è un fattore stabilizzante per cII. Il vantaggio di questo meccanismo di scelta sta nel fatto che il fago può restare silente nel batterio finché questo non incontra tempi o luoghi migliori. Allora il (pro)fago può generare molte copie di se stesso con le risorse aggiuntive disponibili e con una maggior probabilità che nei dintorni ci siano altre cellule da infettare. Realisticamente, resta ancora da sviluppare un modello biofisico completo per la decisione di lambda tra lisi e lisogenia. Modelli e simulazioni al computer indicano che variazioni casuali durante l’infezione guidano la scelta tra lisi o lisogenia entro le singole cellule tramite processi stocastici. Tuttavia, recenti esperimenti suggeriscono che differenze fisiche tra le cellule, esistenti prima dell’infezione, predeterminano se una cellula andrà incontro a lisi o diverrà un lisogeno.