Biologia molecolare di base, Dispense di Biologia Molecolare

Scarica Biologia molecolare di base e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! 1 Appendice al Capitolo 6 – Strutture/funzioni di proteine della trascrizione nei batteri. Il controllo generale della trascrizione nei batteri, che è svolta da una sola RNA polimerasi, si attua attraverso il cambiamento nell’attività dell’enzima nei confronti di diverse classi di promotori, grazie alla commutazione delle varie subunità sigma () che fungono da fattori d’inizio della trascrizione. Poiché  è quella prevalente, soprattutto rispetto ad alcune delle subunità alternative, la commutazione può essere controllata anche dall’espressione di proteine che fungono da “anti- sigma”. Ad esempio, in E. coli, per il passaggio alla crescita in fase stazionaria, entra in gioco la subunità S; questa è espressa in concentrazioni inferiori a quelle di  e ha un’affinità minore per il core RNAP. Quando la cellula sta per entrare in fase stazionaria, esprime anche una proteina di circa 18 kDa, detta Rsd, che si lega a  inibendone la funzionalità. Nel meccanismo complesso della sporulazione in Bacillus subtilis, la rete di controllo delle diverse subunità  comprende sia una proteina anti-sigma, sia una proteina anti-anti-sigma, il cui gioco reciprocamente antagonista è controllato in modo differenziale nella cellula madre della spora e nella pre-spora, durante il processo di differenziamento che porta alla formazione della spora. Struttura cristallina dell’oloenzima di una RNA polimerasi batterica a risoluzione di 2,6 Å (2002) [D. G. Vassylyev, S. Sekine, O. Laptenko, J. Lee, M. N. Vassylyeva, S. Borukhov & S. Yokoyama: “Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution”. Nature, 417:712-719.] [Traduzione e adattamento di G. Cercignani.] [estratti dall’introduzione] “Nei batteri, il legame di un’unica proteina (fattore d’inizio ) al core enzimatico a più subunità della RNA polimerasi, provoca la formazione dell’oloenzima, la specie attiva di RNA polimerasi essenziale per l’inizio della trascrizione. Qui si riporta la struttura cristallina dell’oloenzima batterico RNA polimerasi da Thermus thermophilus a risoluzione di 2,6 Å. In essa, due domini N- terminali della subunità  formano una struttura a V vicino all’apertura del canale che lega il DNA a monte nella fenditura del sito attivo. Il dominio C-terminale di  è vicino allo sbocco del canale di uscita per l’RNA, a ~57 Å dai domini N-terminali. L’esteso dominio di collegamento forma una forcina che protrude nella fenditura del sito attivo e di lì si estende attraverso il canale di uscita per l’RNA per connettere i domini N- e C-terminali. La struttura dell’oloenzima permette di rendersi conto della organizzazione strutturale dei complessi intermedi della trascrizione e dei meccanismi del suo inizio.” […] “Esistono diversi fattori : 70 è specifico soprattutto per la trascrizione della maggior parte dei geni ‘housekeeping’ cellulari durante la crescita esponenziale. La famiglia di proteine imparentate con 70 condivide quattro regioni a omologia di sequenza, designate coi numeri da 1 a 4, a loro volta suddivise in sottoregioni. È stato dimostrato che le sottoregioni 4.2, 2.3–2.4 e 2.5 riconoscono rispettivamente gli elementi del promotore –35, –10 e il cosiddetto ‘–10 esteso’ (nt da –17 a –13). Inoltre, si sa che le regioni 2.3–2.4 interagiscono specificamente con la regione –10 del filamento senso nel complesso aperto col promotore. Infine, dati genetici e biochimici hanno mostrato che le porzioni di  in contatto col core comprendono la maggior parte di queste regioni conservate.” […] “restavano tuttora oscuri molti aspetti dell’inizio della trascrizione dipendenti da. Essi sono: 1) il riconoscimento del promotore da parte dell’oloenzima; 2) la formazione di un complesso chiuso col promotore e la sua transizione a complesso aperto; 3) l’uscita dal promotore e la dissociazione del fattore  da RNAP. La struttura ad alta risoluzione dell’oloenzima RNAP da T. thermophilus qui riportata fornisce informazioni cruciali per rispondere a tali domande. Essa ci consente d’identificare i cambiamenti strutturali nel core indotti dal legame a , e di correlarli alle proprietà funzionali e biologicamente rilevanti dell’oloenzima. Infine, la struttura dell’oloenzima 2 migliora sostanzialmente il modello atomico precedente del core RNAP, che era a risoluzione modesta.” “Descrizione della struttura complessiva” “L’oloenzima mantiene la forma complessiva simile a una chela di granchio (Fig. 1) osservata nelle strutture del core da T. aquaticus e nella RNA Pol II da S. cerevisiae. Tuttavia, la presenza nel modello della subunità  e la vasta porzione del dominio N-terminale non conservato della subunità ’ prolungano notevolmente la tenaglia di ’, rendendo ancor più calzante l’analogia con una chela di granchio. La subunità  è situata quasi interamente sulla superficie del core, eccetto che per un corto segmento (313–342), nascosto all’interno della molecola del core.” Figura 1. Struttura tridimensionale complessiva dell’oloenzima RNAP da T. thermophilus. I colori delle subunità sono: , viola; ’, grigio (’163–452, arancio; ’ zinc finger, rosa); I, verde chiaro; II, azzurro; , verde mare; , celeste. I due ioni Mg2+ catalitici sono indicati da sferette di colore celeste, quelli di Zn2+ da sferette di colore ocra. “Struttura di 70” “Nel modello atomico della subunità 70 manca il dominio N-terminale non organizzato (1–73), che include la regione conservata 1.1. Si sa che questo dominio autoinibitorio maschera le regioni di  che legano il DNA prima che esso si associ al core. Il suo ruolo preciso nell’inizio della trascrizione non è noto. Il modello strutturale di 70 è formato interamente da -eliche connesse o da gomiti o da anse (Fig. 2). Esso può essere diviso in quattro domini strutturali [vedi schema sotto]: i domini N-terminali 1 (ND1) e 2 (ND2), il dominio ‘linker’ (LD) e il dominio C-terminale (CD).” “ND1 consiste di 8 -eliche (74–254) organizzate in 4 motivi elica–gomito–elica (HtH = Helix- turn-Helix): HtH1 (75–121), HtH2 (94–137), HtH3 (123–147) e HtH4 (152–203). Tale dominio si estende dalla regione 1.2 fino alla metà N-terminale della regione 2.4, incluso il 5 Figura 3. Modello del complesso chiuso oloenzima-promotore: il dsDNA (rosa) contiene le regioni del promotore -35 (arancio), -10 (celeste) e -10 estesa (blu). Figura 4. Modello del complesso oloenzima-promotore in apertura: dal basso, regione -35 in arancio, -10 in celeste e da +1 a +3 in verde; dietro, in grigio-celeste il dsDNA a valle del sito d’inizio che si legherà nel complesso aperto col promotore. In blu è mostrata l’ansa ‘cancello’ del motivo elica-ansa-elica della subunità . 6 “Fusione del DNA da parte dell’oloenzima RNAP” “Dopo aver formato un complesso chiuso sul promotore, l’oloenzima fonde e disavvolge il DNA nei pressi della regione –10 (nucleotidi da –12 a +2) per formare un complesso aperto col promotore. L’analisi della struttura dell’oloenzima e il modello per il complesso chiuso descritto sopra permette di ipotizzare come l’oloenzima possa catalizzare l’apertura del promotore. Una volta formato il complesso chiuso, il DNA a valle si sposterebbe poi verso il suo sito di legame su RNAP, già individuato in una profonda cavità, a circa 30 Å di distanza dal sito di riconoscimento della sequenza –10 (Fig. 4). Per far ciò, il dsDNA probabilmente si piega o si curva vicino alle posizioni –12 e –11 del promotore, nelle immediate vicinanze dell’ingresso alla fenditura del sito attivo (Fig. 4). La separazione tra le coppie di basi nella regione da –12 a –10 e la separazione tra filamenti di DNA (nucleazione della fusione del promotore) dovrebbe seguire il riconoscimento specifico di tale regione da parte di . Si può speculare che la fusione di due o tre coppie di basi nel DNA sia sufficiente ad aumentare la flessibilità del DNA per orientare la doppia elica a valle verso il suo sito di legame su RNAP. Tuttavia, l’accesso del DNA al sito di legame è ancora ostruito dalla presenza dell’elica  conservata di  (74–92, regione 1.2) e dal frammento elica–ansa–elica di  (232– 259) (Fig. 4). La distanza tra questi elementi (~16 Å) è assai inferiore al diametro del dsDNA che è circa 22 Å. Eppure, si osserva nel modello, che l’ansa della subunità  (242–253) che protrude dal motivo elica-ansa-elica si adatta bene entro il solco maggiore del dsDNA, in stretta prossimità alle posizioni da +1 a +3, che sappiamo essere il punto finale della fusione del promotore (Figg. 3 e 4). L’analisi di sequenza mostra un motivo di consenso di sei residui —(L/M)RPGEP— nelle RNAP batteriche (242–247 in T. thermophilus), situati in cima all’ansa di . Essa può servire da ‘cancello’ che consente al DNA a singolo, ma non a doppio, filamento di attraversarlo. Interagendo col DNA, quest’ansa ‘cancello’ può anche stabilizzare l’orientazione del DNA per favorire la fusione, e/o facilitare la rotazione/oscillazione del DNA a valle intorno all’asse dell’elica per svolgere il dsDNA. Notiamo che nel core enzimatico, incapace di fondere il dsDNA, l’assenza di  apre uno spazio sufficiente in questa regione per far sì che il dsDNA la attraversi. Dopo che la fusione del DNA ha raggiunto l’ansa ‘cancello’ (intorno ai nucleotidi +2 o +3), il DNA denaturato e il dsDNA a valle possono continuare il loro movimento verso il sito attivo per completare la formazione della bolla di trascrizione.” “Il meccanismo di fusione del DNA sul promotore è in gran parte ignoto, e l’ansa ‘cancello’ della subunità  descritta qui non è mai stata oggetto di studi genetici o biochimici. Sono richieste analisi future su questa regione per chiarire la sua possibile funzione.” “Uscita dal promotore” “Per comprendere meglio il meccanismo dell’uscita dal promote di RNAP e il rilascio di , è stato costruito un modello ibrido DNA–RNA di 9 pb legato all’oloenzima, basato su una semplice sovrapposizione dei domini catalitici conservati nelle strutture cristalline del complesso di allungamento eucariotico e dell’oloenzima da T. thermophilus. Secondo tale modello, l’ibrido DNA–RNA si colloca probabilmente in uno stretto passaggio (largo ~11 Å) formato dal frammento elica-ansa-elica di  (375–408) e da un’ansa a forcina del LD di 70(318–329) che sporge nel solco maggiore dell’ibrido a doppia elica DNA–RNA. Le interazioni putative dell’ansa a forcina di  coi nucleotidi nell’ibrido possono ulteriormente deformare l’insolita conformazione ‘disavvolta’ dell’ibrido DNA–RNA. Quindi, l’ansa può agire come destabilizzatore per facilitare la separazione tra coppie di basi nell’ibrido DNA–RNA. Al tempo stesso, l’ibrido, competendo con l’ansa destabilizzatrice di  per lo spazio limitato, può spiazzare l’ansa dalla cavità del sito attivo, e iniziare così il rilascio di  dal promotore e/o da RNAP. Questa ipotetica competizione può anche essere la causa del rilascio dei prodotti abortivi di RNA. Dopo la separazione dei filamenti, è probabile che la catena di RNA entri nel canale di uscita dell’RNA in conformazione estesa, e non 7 impilata. Ciò perché il canale è sostanzialmente più stretto nella struttura dell’oloenzima (diametro ~10–12 Å, rispetto ai 16–19 Å nel core da T. aquaticus) per la presenza dell’LD di  e la conformazione più chiusa del dominio a falda di . Quando RNAP sintetizza un RNA di 12-nt, i 3 o 4 nucleotidi del 5’-terminale in conformazione estesa possono facilmente raggiungere l’imbocco del canale di uscita dell’RNA, che nella struttura dell’oloenzima è bloccato dal C-terminale di . La possibile collisione sterica tra il CD di  e l’RNA nascente può facilitare lo spiazzamento del CD di  dalla RNAP e dalla regione –35 del promotore, per indurre la dissociazione di 70 e l’uscita dal promotore. Tale meccanismo è in accordo con dati biochimici recenti.” Modelli schematici più semplici dei complessi d’inizio e di allungamento della trascrizione nei batteri sono offerti dalle immagini seguenti. Schema del riconoscimento tra elementi del promotore per 70 e oloenzima. L’elemento UP indica sequenze a monte del promotore presenti solo in alcuni promotori, legate dal dominio C-terminale delle subunità  (CTD) o da proteine che riconoscono specificamente l’elemento UP e che interagiscono con CTD. 2 e 4 sono le regioni di  che riconoscono gli elementi –10 e –35, indicate dai colori uguali nella sequenze di  rappresentata in basso. Dettaglio delle interazioni tra le basi dell’elemento –10 sul filamento senso e l’elica di riconoscimento della regione 2.3-2.4 di 70.