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Biologia molecolaree, Appunti di Biologia Molecolare

Gli appunti contengono i seguenti argomenti: *caratteristiche generali del Dna e dell’Rna *vari esperimenti *Dna polimerasi *purificazione ed analisi qualitativa e quantitativa di acidi nucleici *denaturazione del Dna e temperatura di fusione *organizzazione della cromatina *danni al Dna e meccanismi di riparazione *trascrizione *il codice genetico *mutazioni *PCR (reazione di polimerizzazione a catena) *Rna messaggeri *Rna transfer *Rna ribosomiale *traduzione

Tipologia: Appunti

2023/2024

In vendita dal 07/07/2024

asia-pascucci
asia-pascucci 🇮🇹

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Scarica Biologia molecolaree e più Appunti in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! BIOLOGIA MOLECOLARE I tRNA possiedono una forma a trifoglio di cui due anse fondamentali, ovvero il braccio dell’anticodone e il braccio accettore. Le proteine con le catene laterali R possono legarsi con il solco maggiore del DNA stabilendo interazioni. Gli acidi nucleici sono polimeri lineari ovvero che hanno molte parti, sono costituiti da unità ripetitive (monomeri) e si formano mediante reazioni di polimerizzazione (monomeri aggiunti uno alla volta ed uniti tramite legami covalenti e queste reazioni sono catalizzate dalle polimerasi). Negli acidi nucleici il polimero è il nucleotide, dato da una base azotata (A,T,C,G), zucchero pentoso e gruppo fosfato. Le basi azotate sono divise in due categorie: - Puriniche --> sono due e formate da due anelli aromatici, date da adenina e guanina - Pirimidiniche --> sono tre e formate da un anello aromatico, date dalla citosina, uracile e timina Lo zucchero del DNA, il desossiribosio ha la molecola in direzione 5’-3’ e un gruppo H, mentre il ribosio nell’RNA ha al posto dell’H un gruppo ossidrilico OH che rende l’RNA molto più instabile. I nucleosidi sono composti chimici formati da basi azotate legate al desossiribosio o ribosio, mediante un legame fra il carbonio 1’ dello zucchero e l’azoto 1 nel caso delle basi pirimidiniche oppure l’azoto 9 nel caso delle basi puriniche, formando un legame N-glicosidico. Le polimerasi utilizzano sempre come precursori nucleotidi-trifosfato (NTPs/dNTPs) per sintetizzare DNA/RNA. Negli acidi nucleici i nucleotidi sono uniti a formare una catena polinucleotidica tramite un ponte fosfodiesterico 5’-3’. La catena polinucleotidica ha due estremità libere, un’estremità 5’ -P e un’estremità 3’ - OH. Per convenzione la sequenza di un acido nucleico si scrive sempre in direzione 5’-3’ (TACG --> 5’-TACG- 3'). Negli anni ‘40-’50 furono stati condotti esperimenti --> all’inizio degli anni ‘40 si sapeva che: i geni sono localizzati sui cromosomi e che rappresentano l’unità di base dell’ereditarietà (Thomas Hunt Morgan –1910); i cromosomi sono costituiti da DNA e proteine ma non si sapeva la natura chimica dei geni (si riteneva probabile che il DNA avesse un ruolo solo strutturale e i geni costituiti da proteine). Nel 1928 Griffith stipulò il principio trasformante, ovvero studiò due ceppi di Streptococcus pneumoniae che erano drammaticamente differenti per apparenza, virulenza e capacità di causare la malattia: ceppo R molto virulento e ceppo S non virulento. Nel 1944 Avery, McLeod e McCarty, riformularono l’esperimento di Griffith e scoprirono che il principio trasformante dei ceppi era il DNA. Nel 1949 Chargaff stipulò le regole di Chargaff ovvero sviluppò il primo metodo quantitativo per determinare la composizione in basi del DNA in natura e si accorse che il rapporto tra A/T era uguale ad 1 in qualsiasi organismo e il rapporto tra G/C era uguale a 1 o quasi uguale a 1. Quindi A=T e C=G e A+G = T+C (purine = pirimidine), mentre G+C è diverso da A+T, poichè la guanina e la citosina sono in quantità variabili nelle diverse specie. Nel 1952 Hershey e Chase stipularono che il materiale genetico dei fagi è il DNA, cominciando a marcare le proteine fagiche con 35S (radioattivo) e poi marcarono il DNA fagico con 32P. Nel 1953 Watson e Crick diedero forma al DNA tramite il modello della doppia elica, utilizzando fil di ferro e utilizzando delle informazioni già esistenti quali la diffrazione raggi X, la densità e le regole di Chargaff. La diffrazione a raggi X dava l’informazione che il DNA avesse forma elicoidale, mentre la densità stava ad indicare che l’elica doveva essere costituita da due catene polinucleotidiche. Le coppie di basi sono planari, impilate l’una sull’altra (interazioni idrofobiche), ruotate di circa 36° e perpendicolari rispetto allo scheletro zucchero-fosfato. In condizioni di deidratazione, il DNA assume la forma del tipo A (più larga e corta e il piano delle basi è inclinato) rispetto alla classica forma a B. Gli acidi nucleici a singolo filamento possono formare strutture a forcina, cruciformi, etc.. mentre gli RNA possono assumere strutture secondarie complesse. Nel DNA in forma B, la sequenza viene letta nel solco maggiore superficiale. La duplicazione del DNA ha tre possibili modelli: - Conservativo --> le eliche del DNA vecchio continuano a rimanere unite dopo la replicazione - Semiconservativo --> entrambe le catene fungono da stampo per la sintesi di nuovi filamenti in cui vengono rispettate le regole dell’appaiamento delle basi azotate (Meselson e Stahl); inizia in corrispondenza di siti specifici ed è bidirezionale - Dispersivo --> la sintesi del DNA origina due molecole costituite da segmenti vecchi alternati a quelli nuovi Nel 1958 Meselson e Stahl spiegarono che la replicazione del DNA è semiconservativa tramite lo studio degli isotopi dell’azoto 14N e 15N distinguibili su gradienti di cloruro di cesio (CsCl), andando ad occupare due bande diverse in base ad una densità crescente nella provetta. Per duplicare il DNA ci vuole il DNA stampo (template), i precursori (dNTPs), la DNA polimerasi (enzima) e ioni di magnesio e l’innesco 3’ OH libero, poiché la DNA polimerasi non è in grado di iniziare la sintesi utilizzando un filamento singolo. Le DNA polimerasi, ad ogni ciclo, utilizzano nucleotidi trifosfato (dNTPs) e polimerizzano in direzione 5’-3’, estendono l’innesco di un nucleotide alla volta seguendo le regole della complementarietà delle basi e per poi liberare il pirofosfato. Esistono tre fasi distinte: inizio, allungamento e terminazione. Nell’escherichia coli, la replicazione comincia da oriC e procede bidirezionalmente. Vi è innanzitutto il riconoscimento dell’origine, costituita da specifiche sequenze riconosciute da determinate proteine (DnaA); poi l’inizio, richiede la fusione locale del DNA (elicasi) [avviene l’assemblaggio del replisoma], formazione e stabilizzazione del singolo filamento (SSB –single strand binding), sintesi dell’innesco (primasi) a RNA di 10- 12 nt; l’allungamento è effettuato dalla DNA polimerasi e procede bidirezionalmente e infine la terminazione tramite sequenze Ter e proteine Tus. L’escherichia coli ha tre principali DNA polimerasi: - DNA pol I --> ruolo ausiliario nella replicazione –riparazione frammenti di Okazaki (l’unica pol che ha anche attività esonucleasica 3’-5’); sostituisce l’innesco, per poi staccarsi lasciando un nick (interruzione per mancanza di legame fosfodiesterico) - DNA pol II --> riparazione eucariotica); anche il DNA dell’E.coli è complessato a proteine ma dato da nucleoidi (ancorati alla membrana). Il superavvolgimento indica che la doppia elica del DNA è avvolto intorno al proprio asse e a seconda del lato in cui sono girati possono essere positivi o negativi; il supercoil, quindi, introduce una tensione torsionale e può verificarsi solo in strutture chiuse, poiché una molecola aperta eliminerebbe lo stress torsionale ruotando su sé stessa in senso opposto; diverse forme di supercoil sono interconvertibili perché il numero di avvolgimenti può variare se almeno una delle due catene viene interrotta (le topoisomerasi possono variare il grado di avvolgimento di un DNA). Il cromosoma di E.coli è organizzato in anse o domini, legati alla base ad una impalcatura proteica e all’interno di ciascun dominio, il DNA è o può essere superavvolto. Anche il DNA eucariotico è organizzato in domini legati alla base ad una impalcatura proteica; il DNA contenuto in un dominio è bloccato e quindi come un DNA circolare chiuso può essere superavvolto. Il grado di compattazione della cromatina eucariotica cambia durante il ciclo cellulare. Gli istoni sono piccole proteine basiche (ricche di lisina ed arginina) altamente conservate; sono basiche poiché hanno gruppi amminici nella catena laterale con carica positiva (NH3+); un nucleosoma contiene due coppie di ciascuno dei quattro istoni (H2A, H2B, H3 e H4) che si associano a costruire un ottamero istonico (core); gli istoni hanno code amino-terminali, lunghe circa 25-30 amminoacidi, sono disordinate e sporgono all’esterno del nucleosoma (sono importanti perché compattano ulteriormente la cromatina e regolano anche l’espressione genica) inoltre possono anche subire modificazioni post traduzionali (modifiche chimiche reversibili) tramite l’acetilazione, metilazione e fosforilazione (importanti per la struttura e la funzione della cromatina); in condizioni di bassa forza ionica ed in assenza di H1 si osserva la cromatina nel suo stato di minore condensazione, mentre in condizioni più fisiologiche la cromatina appare come una fibra da 30 nm chiamata solenoide (queste fibre organizzate a rosetta compongono le anse). La cromatina si trova nel nucleo e la sua membrana è composta da pori nucleari che regolano un intenso traffico macromolecolare tra esso e il citoplasma; al livello dei pori vi sono dei sistemi di sorveglianza che controllano che tutto proceda nel modo corretto; nel nucleo sono presenti uno o più nucleoli, sede della sintesi degli rRNA. DANNI AL DNA E MECCANISMI DI RIPARAZIONE = Il DNA è continuamente soggetto a danni, dove cui se non viene riparato può causare una mutazione al livello della sequenza nucleotidica (causa il rischio della sopravvivenza dell’individuo al livello germinale oppure insorgenza di tumori al livello somatico); un’assenza di danni d’altro canto non dà variabilità genetica né vi è l’evoluzione; i sistemi di riparazione sono molto importanti e questi sistemi prevedono molti meccanismi (in parte ridondanti cioè si sovrappongono tra di loro) e molti fattori atti a riparare le diverse forme di danni al DNA. Questi sistemi agiscono in background, quindi non vengono percepiti almeno ché non vi sono patologie gravi (es. carcinoma del colon ereditario o xeroderma pigmentoso). I danni possono essere: - Spontanei --> dati dall’inserzione di basi sbagliate che portano un mismatch (appaiamento errato); in assenza di riparazione, l’incorporazione scorretta viene fissata alla replicazione successiva; perdita di basi attraverso ad esempio il calore, il pH, ogni giorno dalle cellule (porta alla formazione di siti abasici); perdita di gruppi amminici (deaminazione) - Ambientali --> possono essere: - Chimici:  Alchilazioni: metilazione di O6 della guanina  Intercalanti: inserzioni/delezioni  Analoghi di basi: errori replicativi (possono essere usati come antivirali) - Fisici:  Raggi UV: formazione di legami covalenti fra due pirimidine adiacenti  Raggi X e Raggi Gamma: rotture a singolo e doppio filamento difficili da riparare Lo xeroderma pigmentoso è un caso in cui è evidente la connessione tra mutazioni e tumori. E’ una malattia recessiva ereditaria, gli individui sono estremamente sensibili alla luce solare poiché incapaci di riparare i dimeri di Timina. I danni che possono essere riparati piuttosto fedelmente sono dati dall’errato appaiamento, modifiche di una base e dimeri di timina; i danni con perdita di informazione sono difficili da riparare e sono danni dati da sistemi di riparazione che possono introdurre ulteriori alterazioni nel tentativo di riparare i danni. I meccanismi di riparazione possono essere specifici (riparazione di timina) e aspecifici (riparazione per escissione). La riparazione dei dimeri di timina avviene tramite la fotoliasi, che ripara i danni al DNA dati dalla esposizione alla luce ultravioletta, utilizzando la luce visibile si lega al dimero e taglia il legame fra le basi danneggiate. La riparazione per escissione avviene tramite il meccanismo NER (riparo per escissione di nucleotidi) o il meccanismo BER (riparo per escissione di base). Anche nell’RNA i nucleotidi sono legati da legami fosfodiesterici 5’-3’. Generalmente l’RNA è a singolo filamento ma forma tratti a doppia elica. Possiede svariate funzioni: - Trasferimento dell’informazione genetica --> mRNA, tRNA, rRNA - Maturazione di mRNA, tRNA e rRNA ---> snRNA e snoRNA - Regolazione genica post-traduzionale --> miRNA ed altre classi di RNA non codificanti - Materiale genetico di alcuni virus --> HIV, Sars Cov 2, HCV Inoltre, gli RNA possono contenere basi modificate: - Modifiche post-trascrizionali --> sono prodotte dopo l’incorporazione nella catena poliribonucleotidica di una delle quattro basi canoniche (A,C,G,U), con aumento delle possibilità di appaiamenti diversi e grazie a questo, l’RNA può formare corti motivi di struttura secondaria e a loro volta possono poi dare origine a strutture terziarie TRASCRIZIONE = Nella trascrizione entra in gioco la polimerasi, che sintetizza una catena polinucleotidica complementare ad un filamento stampo di DNA. Le RNA pol non necessitano di un innesco, quindi l’inizio della trascrizione avviene in ex novo (5’-3’); più molecole di RNA pol possono trascrivere lo stesso gene contemporaneamente. Durante la trascrizione avviene la copia selettiva di alcune regioni e può produrre molte copie di un trascritto, a differenza della replicazione che copia tutto il genoma una sola volta durante una divisione cellulare. Le RNA polimerasi, a differenza delle DNA polimerasi, non sono così precise ed hanno un tasso di errore di circa 10-5 (l’errore trascrizionale è transiente). Le RNA polimerasi si legano a regioni specifiche dette promotori, situate all’inizio del gene ed iniziano a trascrivere leggermente a valle del promotore (sito di inizio), continuano poi a trascrivere fino ad una sequenza particolare detta terminatore. L’unità trascrizionale è tutto il tratto di DNA compreso tra promotore e terminatore e negli eucarioti le unità trascrizionali sono tipicamente monocistroniche (codifica per un solo peptide), mentre nei procarioti sono policistroniche (codificano per più geni). Le tre fasi della trascrizione sono: - Inizio --> avviene il riconoscimento del promotore, formazione della bolla di trascrizione e inizio della sintesi dell’RNA: Il riconoscimento e legame della RNA pol al promotore avviene tramite un complesso chiuso, dopodiché diventa aperto per fusione locale del DNA (formazione della bolla di replicazione) e inizia la replicazione - Allungamento --> RNApol e la bolla si muovono lungo il filamento stampo e polimerizza in direzione 5’-3’ portando all’allungamento della catena di RNA - Terminazione --> l’RNA pol incontra un terminatore; il trascritto di RNA viene rilasciato; la RNA pol si dissocia e la bolla si chiude La trascrizione produce vari tipi di RNA. Su tutto l’RNA, solo il 4% è codificante (mRNA e pre-mRNA negli eucarioti) mentre il restante 96% non è codificante (rRNA, tRNA). Nei procarioti la trascrizione e la traduzione sono accoppiate. Negli eucarioti la compartimentazione separa trascrizione e maturazione degli RNA (nucleo) dalla traduzione (citoplasma). Negli eucarioti vi sono 3 RNA polimerasi (pol I –catalizza rRNA-, pol II –catalizza mRNA-, pol III –catalizza tRNA e rRNA 5S-) mentre nei procarioti solo una. Le polimerasi si servono del core enzimatico, che catalizza la sintesi di RNA (NTPs) ed è costituito da subunità multiple, però da solo non è in grado di iniziare in punti specifici (promotori) quindi utilizza nei procarioti il fattore sigma e negli eucarioti i fattori basali di trascrizione. I promotori sono regioni localizzate sul DNA a monte dei geni (non vengono trascritti), che vengono riconosciuti dalle RNA pol per poi legarsi ed iniziare la trascrizione ad una certa distanza a valle (+1). La RNA pol procariotica ha un core enzimatico con più subunità (2 alfa, un beta e un beta primo); ha una affinità intrinseca per il DNA, quindi si lega e si dissocia velocemente; il core enzimatico, unito al fattore sigma, costruiscono l’oloenzima, che può riconoscere e legare il promotore. I promotori procariotici contengono corte regioni a distanza specifica dal sito di inizio, precisamente due regioni, la –35 e la –10 e le sequenze in queste regioni prendono il nome di consensus (vengono riconosciute e legate dal fattore sigma). Quindi il fattore sigma ha doppio ruolo: posizionamento, dove il fattore sigma posiziona l’RNA polimerasi nei pressi del punto di inizio trascrizionale e orientamento, dove il fattore sigma orienta l’RNA polimerasi nella direzione corretta. I procarioti posseggono diversi fattori sigma, perciò ciascun fattore sigma ha delle preferenze per quel che riguarda le sequenze di legame e la spaziatura fra gli elementi a –35 ed a –10. Il sigma 70, ad esempio, è responsabile della trascrizione nella maggior parte dei geni di E.Coli in crescita; il sigma 32 è responsabile della trascrizione batterica in risposta a shock termico; il sigma 54 è responsabile della trascrizione batterica in risposta a carenza di azoto. La trascrizione nei procarioti inizia con la formazione del complesso chiuso, dove la subunità sigma dell’oloenzima riconosce e lega le regioni a –35 e –10; poi avviene la transizione a complesso aperto con la denaturazione della regione a –10 con successiva formazione della bolla di trascrizione; la RNA pol inizia a trascrivere (non richiede l’innesco); il fattore sigma abbandona il promotore; la RNA pol entra nella fase di allungamento; infine avviene la terminazione, dove la RNA pol incontra un terminatore, la trascrizione si arresta e l’RNA viene rilasciato. I terminatori possono essere intrinseci (non richiedono fattori ausiliari) o RHO-dipendenti (richiedono il fattore rho –proteina-). La particolare sequenza dei terminatori intrinseci determina la formazione sull’RNA di una struttura a forcina con lo stelo ricco in G-C, seguito da una serie di U a singolo filamento (i terminatori vengono trascritti!). I terminatori estrinseci (RHO-dipendenti): (silenzio genico) o complessi di rimodellamento della cromatina. I complessi di rimodellamento della cromatina utilizzano idrolisi dell’ATP per modificare con diversi meccanismi, la struttura della cromatina rendendo il DNA più accessibile a proteine regolatorie. IL CODICE GENETICO = È un insieme di regole che consente di tradurre l’informazione contenuta nel DNA e di passare da un linguaggio di nucleotidi ad un linguaggio di aminoacidi. Il codice genetico deve consistere di una serie di blocchi di informazioni (codoni) ciascuno corrispondente ad un amminoacido. Nel 1961 Crick e Brenner stabilirono che il codice è a triplette e non ci sono spaziature o sovrapposizioni fra i codoni (ne esistono 64 combinazioni date da 20 amminoacidi diversi ---> decifrazione del codice genetico). I codoni che codificano per un singolo aminoacido sono 61 (codoni di senso), mentre i codoni che non codificano nessun amminoacido sono 3 (codoni non senso --> UAA, UAG, UGA). Il codice genetico inoltre è degenerato poiché molti aminoacidi sono specificati da più di un codone ed è un codice universale poiché è lo stesso nei batteri, nell'archea e negli eucarioti. MUTAZIONI = Sono variazioni ereditarie della struttura del materiale genetico (genotipo), spontanee o indotte da mutageni fisici o chimici. Esistono mutazioni cromosomiche (che alterano la struttura) quali delezioni, duplicazioni, inversioni e traslocazioni; oppure mutazioni geniche (che alterano un singolo gene portando alla formazione di un allele mutato) quali mutazioni silenti (non hanno effetto sulla sequenza amminoacidica), mutazioni con perdita di funzione (cambiamento amminoacidico con danno) e mutazioni con acquisto di funzione (cambiamento amminoacidico con cambiamento di funzione). Un gene può esistere in una popolazione in diverse forme (alleli) che differiscono per la loro sequenza nucleotidica. Le mutazioni puntiformi comportano il cambiamento di una singola base e può avvenire per sostituzione (una base viene sostituita da un’altra -anemia falciforme-), per inserzione (aggiunta di una singola base) o per delezione (perdita di una singola base). PCR (REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENA) = Consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. La PCR ha 3 frasi: - Denaturazione --> dove si utilizza la temperatura di 94-95° per separare i filamenti di DNA - Annealing --> la temperatura si abbassa 48-72° per permettere ai primer di essere complementari alla sequenza del DNA template - Estensione --> la polimerasi estende il primer per formare il filamento di DNA nascente Nella PCR vi è un’amplificazione esponenziale della regione d’interesse (2,4,8,16 copie ...); i primers sono molto importanti nella PCR e devono essere lunghi circa 18 nucleotidi, non vi devono essere ripetizioni di singoli nucleotidi, né sequenze in grado di formare strutture secondarie stabili, né deve esserci complementarietà di sequenza al 3’ dei primers (dimeri di primers). In ordine vi sono 4 fasi: fase lineare, fase esponenziale, fase di transizione e fase di Plateau. Per determinare la quantità di template in un determinato campione, si utilizza la PCR competitiva (es. DNA virale in un fluido biologico). Si miscela una quantità fissa X di template con quantità note e crescenti di un competitore, poi si effettua la PCR e si confronta il risultato. La sequenza bersaglio e quella del competitore, sono nella stessa reazione ed utilizzano gli stessi reagenti. *La real time PCR (o PCR quantitativa, qPCR) consente di monitorare l’amplificazione in tempo reale mentre la reazione procede (non alla fine come nella PCR classica “endpoint”) e la quantificazione avviene mediante fluorescenza, proporzionale alla quantità di prodotto che si accumula durante la reazione, captata dal rilevatore e trasmessa ad un computer. Si utilizza per l’analisi dell’espressione genica, determinazione di patogeni, genotipizzazione SNP, etc. Il ciclo soglia CT è un parametro utilizzato per la quantificazione ed indica il ciclo in cui il prodotto accumulato dà origine ad una fluorescenza misurabile e questo valore deve essere entro la linea soglia. La rivelazione dei prodotti di qPCR può essere effettuata tramite, ad esempio, gli intercalanti fluorescenti (es. SYBR Green), che si intercalano fra le coppie di basi e legano il prodotto di amplificazione indipendentemente dalla sequenza specifica. Nel SYBR Green vi è un'alternanza di fluorescenza (l’intensità del segnale aumenta con i cicli per l’accumulo del prodotto) e verrà misurata ad ogni ciclo al termine della fase di estensione (SYBR Green libero --> no fluorescenza; SYBR Green legato –-> fluorescenza). Successivamente si analizza la curva di fusione. *La curva di fusione di un DNA ci mostra la variazione di assorbimento al variare della temperatura. La temperatura di fusione o di melting (Tm) di un DNA è quella temperatura a cui il 50% del DNA è denaturato (aumento di assorbanza pari al 50% del totale). Un’altra rivelazione dei prodotti di qPCR può essere effettuata tramite sonde fluorescenti, che riconoscono e legano una sequenza specifica del prodotto e si utilizzano sonde di ibridazione (molecular beacons, FRET) oppure sonde di idrolisi (saggio TaqMan). *Le molecular beacons sono sonde che contengono una struttura stem-loop, un fluoroforo ed un quencher al loro 5’ e 3’ rispettivamente. Permettono di rivelare la presenza di specifici acidi nucleici basandosi sulla fluorescenza. *Le sonde TaqMan sfruttano l’attività 5’-3’ esonucleasica della Taq polimerasi o di altre polimerasi termostabili; con esse si ha un aumento progressivo della fluorescenza e non un’alternanza (la sonda viene consumata durante la reazione). La quantificazione mediante real time PCR può essere: - Relativa --> sufficiente in molti casi; consente di determinare le quantità relative di un dato bersaglio in diversi campioni; si confronta il valore del ciclo soglia CT - Assoluta --> necessaria in alcuni casi; consente di determinare l’esatto numero di copie; richiede la costruzione di una curva standard In una curva standard, il valore di CT è inversamente proporzionale al numero iniziale di copie e si costruisce con un differente numero di copie del bersaglio accuratamente quantificato (DNA clonato) e per ciascun punto si calcola la corrispondente ciclo soglia. DNA fingerprinting: Viene analizzata l’informazione genotipica contenuta nel DNA, tramite l’impronta digitale che costituisce un tratto fenotipico dell’individuo. Si basa sul fatto che non ci sono due individui con lo stesso DNA. Il genoma umano è quasi lo stesso in individui diversi e contiene gli stessi geni con lo stesso ordine; tuttavia, contiene polimorfismi, ovvero che la sequenza nucleotidica non è la stessa in tutti i membri della popolazione. Nel DNA fingerprinting, l’identificazione individuale avviene attraverso sequenze ripetute altamente variabili e per farlo si usa un campione di tessuto da cui si può estrarre il DNA e poi avviene l’amplificazione mediante PCR (Southern blot). Questa tecnica si basa sull’analisi di corte sequenze identiche ripetute in tandem (STR o microsatelliti) e vengono utilizzati i loci ipervariabili. La marcatura dei loci STR selezionati si chiama multiplex. RNA MESSAGGERI = Gli mRNA forniscono l’informazione per la sintesi delle proteine e rispetto ai tRNA e rRNA sono: - Meno stabili (con differenze fra procarioti ed eucarioti) - Sono molti di meno a livello quantitativo (circa 2-5%) - Sono più eterogenei (per grandezza e sequenza) RNA TRANSFER = Associano un dato codone sul mRNA ad uno specifico amminoacido sul braccio accettore. Il riconoscimento del codone avviene sul braccio dell’anticodone. Tutti i tRNA possiedono sull’estremità 3’-terminale e una sequenza CCA, che è il sito di legame. RNA RIBOSOMIALE= I ribosomi sono la sede della sintesi proteica [ribosoma eucariotico —> 80s; ribosoma procariotico —> 70s]. I ribosomi eucariotici originano nel nucleolo (nell’uomo ci sono circa 400 rRNA), dove all’interno di esso si ha anche la trascrizione e maturazione degli rRNA nonché dell’assemblaggio delle subunità ribosomiali. I ribosomi sono estremamente conservati e possiedono tre siti: - Sito A (aminoacil) —> l’aminoacili-tRNA porta l’amminoacido da aggiungere alla catena in crescita - Sito P (peptidil) —> il peptidil-tRNA porta la catena polipeptidica in crescita - Sito E (exit) —> il tRNA scarico esce dalla catena Le aminoacil-tRNA-sintetàsi sono enzimi responsabili del caricamento dei tRNA con l’amminoacido appropriato (ne esistono 20 di questi enzimi, ciascuno specifico per ogni amminoacido). Avviene prima l’attivazione dell’amminoacido dove vi è la formazione dell’enzima-aminoacil-AMP dove si va a legare il gruppo -COOH dell’amminoacido; poi avviene la formazione dell’aminoacil-tRNA, dove lo stelo accettore del tRNA viene legato al gruppo -COOH dell’amminoacido e a questo punto l’aminoacil-tRNA viene rilasciato ed è disponibile per il processo di traduzione. TRADUZIONE = Il linguaggio dei nucleotidi è tradotto in linguaggio di amminoacidi; l’informazione codificata nel DNA e trascritta nell’mRNA viene decodificata sul ribosoma a partire dal codone di inizio per terminare al codone di stop. Per iniziare la traduzione nei procarioti serve il complesso d’inizio, formato da mRNA, subunità ribosomiale minore 30s, fattori d’inizio, tRNA iniziatore (caricato con la formil-metionina). Nei procarioti, subito a monte dell’AUG di inizio (6-8 nt) è presente una corta sequenza capace di appaiarsi al 3’-terminale del rRNA 16s (subunità 30s). Nei procarioti, gli mRNA sono spesso policistronici e ciascuna regione è codificante una proteina preceduta da una sua RBS (sito di binding del ribosoma). *La fase di allungamento prevede che sul sito A arriva il tRNA legato al fattore di allungamento EFTu-GTP, il tRNA si lega (se c’è corrispondenza codone-anticodone), avviene l’idrolisi GTP a GDP e dissociazione del complesso EFTu-GDP. Il ribosoma trasloca di un codone. Di conseguenza: 1. Un nuovo codone è esposto nel sito A 2. Il tRNA con la catena in crescita si è spostato dal sito A al sito P 3. Il tRNA scarico si sposta dal sito P al sito E per poi essere espulso Come meccanismo di controllo avviene che se l’appaiamento è scorretto, non avviene l’idrolisi da GTP a GDP e il fattore EFTu-GTP viene rilasciato. *La terminazione avviene con il fattore di rilascio che determina il distacco della catena polipeptidica e la dissociazione delle due subunità ribosomiali. La traduzione negli eucarioti ha un inizio più complicato rispetto ai procarioti poiché ad esempio ha molti più fattori d’inizio. Il primo passaggio è quello della formazione del complesso pre-inizio 43s, che si associa poi all’mRNA (legato al complesso eIF4F) formando il complesso d’inizio 48s; avverrà poi lo scanning, dove il complesso 48s scorre sull’mRNA in cerca dell’AUG di inizio [negli eucarioti, il codone AUG viene riconosciuto tramite una “sequenza di Kozak” che funge da segnale]; una volta che l’AUG è stato individuato e si è appaiato con il tRNA e i fattori di inizio si dissociano, arriva la subunità 60s che si assembla con l’altra subunità formando il complesso di inizio 80s.
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