Chimica Analitica_Lez20 [modalità compatibilità].p, Appunti di Chimica
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Chimica Analitica_Lez20 [modalità compatibilità].p, Appunti di Chimica

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Cromatografia; coefficienti di distribuzione;separazione cromatografica;meccanismi di separazione cromatografica;cromatografia planare TLC; fattore di ritardo RF; la rivelazione cromatica - con luce UV - con reagenti chi...
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Chimica Analitica_Lez20 [modalità compatibilità]

LA CROMATOGRAFIA

 La cromatografia é una tecnica di separazione di vari componenti di una miscela che consiste nello sfruttare in modo particolarmente efficiente la diversa attitudine che ogni molecola o ione possiede nel distribuirsi tra due differenti fasi (una stazionaria e una mobile)

 I componenti della miscela sono separati in funzione delle diverse velocità con cui sono trasportati attraverso la fase stazionaria dalle fase mobile

LA CROMATOGRAFIA

 La fase stazionaria può essere costituita da:  un solido

 un liquido opportunamente supportato.

 La fase mobile é costituita da un fluido (che si muove sopra la fase stazionaria), cioè da:  un liquido

 un gas.

 I metodi cromatografici si distinguono in:  Cromatografia su colonna in cui la fase stazionaria è

contenuta in una colonna tubolare e la fase mobile passa attraverso di essa

 Cromatografia planare in cui la fase stazionaria e depositata su di una superficie piana e la fase mobile migra su di essa per capillarità

I COEFFICIENTI DI DISTRIBUZIONE  Consideriamo un sistema formato da due fasi in cui viene

introdotta una sostanza: la sostanza si distribuirà fra le due fasi a seconda delle sue particolari proprietà chimico-fisiche

 Indicando con Cm e Cs le sue concentrazioni nella fase mobile e nella fase stazionaria rispettivamente, si istaureranno istantaneamente equilibri di ripartizione del tipo:

 con K la corrispondente costante di equilibrio ( o costante di distribuzione):

K = Cs / Cm

 E’ dal valore di K che dipende il tempo di ritenzione, cioè il tempo che occorre per percorrere l’intera fase stazionaria: un’elevata concentrazione nella fase stazionaria, rispetto a quella nella fase mobile, indica una maggiore affinità per la prima. Altre sostanze, relativamente più affini alla fase mobile e meno verso la fase stazionaria, verranno più facilmente dislocate dalle posizioni che occupano e trasportate cosi verso la fine della colonna, separandosi sempre di più dalle sostanze maggiormente trattenute.

I COEFFICIENTI DI DISTRIBUZIONE

SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

I MECCANISMI DI SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

I MECCANISMI DI SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

LA CROMATOGRAFIA PLANARE : TLC

 La TLC (Thin Layer Chromatography) è una tecnica cromatografica in cui la fase stazionaria è costituita da un solido poroso polare come silice (acida) o allumina (basica) depositata su di uno strato di alluminio o vetro;

 La fase eluente è costituita da una miscela di solventi organici apolari che migrano lungo la lastra cromatografica per capillarità

 La miscela da separare è adsorbita o seminata alla base della lastra ed immersa nella fase mobile in una camera di sviluppo

TLC

Videotlc.mov

 La camera di eluizione è un contenitore ermeticamente chiuso nel quale si crea un equilibrio tra la fase liquida e quella di vapore, da cui la fase mobile trae la spinta per la sua migrazione

 I componenti del campione vengono separati sulla fase stazionaria dipendentemente da quanto fortemente essi vi rimangono assorbiti rispetto a quanto si sciolgono nella fase eluente.

IL FATTORE DI RITARDO RF

Linea di fronte

Linea di semina

a

b RfB =

 Il fattore Rf è tipico di ciascuna sostanza a parità di fase stazionaria ed eluente utilizzata e dunque può essere utilizzato come parametro per l’analisi qualitativa di miscele.

LA RIVELAZIONE

 Rivelazione Cromatica quando le sostanze da separare assorbono nel visibile, la rivelazione è immediatamente osservabile ad occhio nudo

 Rivelazione con luce UV Se le sostanze da rivelare possiedono cromofori derivanti da particolari gruppi funzionali quali doppi legami coniugati, carbonili, carbossili, ecc… è sufficiente illuminare la lastrina con una lampada UV che emetta a 254 e 366 nm; si osservano così delle macchie luminose sul fondo scuro. Se invece le sostanze da rivelare non possiedono cromofori, si può usare una lastra la cui fase stazionaria, prima o dopo l’eluizione, viene impregnate di una sostanza fluorescente ai raggi UV. Illuminando la lastra con le apposite lampade, si osservano delle macchie scure su sfondo fluorescente

 Rivelazione con reagenti chimici Questi reagenti, vaporizzati sulle sostanze eluite, formano con esse composti colorati.

LA CROMATOGRAFIA SU COLONNA

 Nella cromatografia su colonna la fase stazionaria è contenuta in una colonna tubolare. A seconda della natura della fase stazionaria la cromatografia su colonna può sfruttare metodi di adsorbimento, ripartizione, scambio ionico o esclusione per separare i componenti della miscela.

 Si distinguono i seguenti metodi:

 Cromatografia su colonna a bassa pressione (LPC).

La fase mobile è un liquido organico a bassa viscosità mentre le fasi stazionarie, solide, liquide o gel, possono avere caratteristiche chimico- fisiche molto variabili. La tecnica prevede la deposizione in testa ad una colonna (impaccata con un’opportuna fase fissa) di una certa quantità di miscela da separare. Facendo scorrere l’eluente lungo questa colonna si ottiene una certa distribuzione dei componenti della miscela lungo la fase stazionaria

 Cromatografia in fase liquida ad elevate pressioni (HPLC)

che consiste nella versione strumentale della cromatografia su colonna. L'eluente viene fatto fluire ad alta pressione e le sostanze in uscita vengono rilevate strumentalmente con opportuni dispositivi.

 Gas-Cromatografia (GC), in cui la fase mobile è un gas

IL CROMATOGRAMMA

C

t (min)

 Con il procedere della separazione, le sostanze usciranno dalla colonna dopo il passaggio di un certo tempo (tempo di ritenzione) durante il quale è fluito un certo volume di solvente (volume di ritenzione).

 Il soluto migra sulla colonna trascinato dall’eluente. Le differenze di velocità tra le singole molecole dovute a fattori di diffusione fanno sì che tutte le molecole di un certo soluto escano dalla colonna distribuite in un “range” di tempo, registrato come una banda.

 Il cromatogramma riporta le concentrazioni di sostanza in uscita in funzione del tempo o del volume di eluente

I PARAMETRI SPERIMENTALI

 tempo di ritenzione  è il tempo impiegato tra l’iniezione del campione e la registrazione del massimo

del picco;  dipende dalla natura della sostanza, dalla colonna e dalle condizioni operative;  è fondamentale per le analisi qualitative.

 area del picco  è la superficie delimitata dal contorno del picco e la linea di base;  dipende dalla quantità di sostanza in uscita e dalle caratteristiche del rivelatore;  è fondamentale per le analisi quantitative.

 fattore di ritenzione k  E’ il rapporto tra le moli di soluto che rimangono istantaneamente

legate sulla fase stazionaria e quelle istantaneamente disciolte nella fase mobile:

 È legato alla velocità lineare con cui un soluto attraversa la colonna: l’attraversamento del soluto è infatti possibile solo attraverso il

I PARAMETRI SPERIMENTALI

m

s

MM

ss

V

V K

VC

VC k ==

flusso della fase mobile in cui esso si scioglie. La velocità con cui un soluto attraversa la colonna è una frazione della velocità con cui la fase mobile attraversa la colonna (senza essere trattenuta) e questo rallentamento è proporzionale al numero di molecole di soluto che vi si sciolgono, quindi a k

 E’ derivabile sperimentalmente dal cromatogramma come:

dove tM detto tempo morto è il tempo impiegato dal solo eluente ad attraversare la colonna

M

R

t

t k =

 fattore di selettività α  E’ il rapporto tra la costante di distribuzione del soluto più

fortemente trattenuto (B) e la costante di distribuzione del soluto meno fortemente trattenuto (A)

I PARAMETRI SPERIMENTALI

A

B

SMA

SMB

A

B

k

k

VVk

VVk

K

K === )/(

)/(α

 È legato al fattore di ritenzione k e dà una misura di quanto la colonna sia in grado di separare i due analiti.

 E’ un numero sempre maggiore dell’unità

 E’ derivabile sperimentalmente dal cromatogramma come:

AR

BR

t

t

)(

)(=α

CARATTERISTICHE DI UNA SEPARAZIONE SU COLONNA

 Selettività

E’ definita come la capacita di una colonna di fornire picchi distanziati e dipende dalla temperatura e dalla natura della fase stazionaria.

A fianco sono riportati due  cromatogrammi, di una miscela di due composti, ottenuti con due diverse fasi stazionarie: nel secondo caso si ha una maggior selettività.

 La misura sperimentale della selettività è il coefficiente di selettività α

 Efficienza

E' la capacita del sistema cromatografico di mantenere compatta la banda di eluizione di una sostanza lungo tutto il percorso della fase mobile.

Ciò significa ottenere picchi alti e stretti all’uscita della colonna. La

CARATTERISTICHE DI UNA SEPARAZIONE SU COLONNA

cosa è di grande importanza, perché qualora due sostanze avessero tempi di ritenzione molto vicini se ne potrebbe ottenere ugualmente la separazione.

A fianco sono riportati due cromatogrammi di una miscela di due sostanze effettuati con colonne diverse; in ambedue i casi si ha la stessa selettività, ma nel secondo caso si ha una maggior efficienza.

PARAMETRI DELL’EFFICIENZA DI UNA COLONNA

 I Piatti teorici Si definisce Piatto Teorico di una colonna cromatografica quel tratto di colonna nel quale una specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi (stazionaria e mobile) prima che l’eludente la trascini ad uno stadio successivo. Se L è la lunghezza della colonna e H l’altezza di ciascun piatto teorico il numero di piatti teorici N di una colonna è dato da:

H

L N =

L’efficienza di una colonna è associato ai valori N e H  Direttamente proporzionale a N  Inversamente proporzionale a H

Il numero di piatti teorici può essere ricavato sperimentalmente dal cromatogramma come:

Dove tR è il tempo di ritenzione del soluto, e W la larghezza del picco alla sua base.

 L’altezza dei Piatti Teorici L’altezza H è una misura indiretta della larghezza della banda. Se u è la velocità lineare della fase mobile

Essa dipende sperimentalmente da un grande numero di

PARAMETRI DELL’EFFICIENZA DI UNA COLONNA

uCuC u

B H MS ++=

fattori come  Velocità lineare della fase mobile  Coefficiente di diffusione nella fase mobile  Coefficiente di diffusione nella fase stazionaria  Fattore di ritenzione k  Diametro della particella di impaccamento

N.B. u appare sia al numeratore che al denominatore: il suo valore deve essere quindi attentamente bilanciato.

 Fattore B/u detto Fattore di diffusione longitudinale, misura la tendenza del soluto a disperdersi dal centro della banda verso le zone limitrofe. Per ridurlo si può: aumentare il flusso per aumentare la velocità ed al contempo aumentare la viscosità della fase eluente (se è un liquido) o abbassando la temperatura (se è un gas)

Fattore C u

PARAMETRI DELL’EFFICIENZA DI UNA COLONNA

 s

detto fattore di trasferimento di massa nella fase stazionaria, misura la velocità con cui un soluto è adsorbito e desorbito da una fase solida; può essere abbassato migliorando l’impaccamento e diminuendo le dimensioni delle particelle

 Fattore Cmu detto fattore di trasferimento di massa nella fase mobile, misura la diffusione turbolenta del soluto nella fase mobile. Può essere diminuito eliminando i percorsi preferenziali del soluto nella colonna (particelle più piccole e meglio impaccate)

 La risoluzione

Questo fattore tiene conto sia della selettività che dell’efficienza, e indica il grado di effettiva separazione ottenuto per due sostanze in un processo

CARATTERISTICHE DI UNA SEPARAZIONE SU COLONNA

cromatografico.  Dal punto di vista numerico

si ottiene dalla relazione:

 Per avere una buona separazione, dal punto di vista quantitativo, si deve avere risoluzione almeno 0,8

IL PROBLEMA GENERALE DELL’ELUIZIONE

Ottenere una risoluzione più alta possibile nel tempo totale di analisi più corto possibile

 Eluizione isocratica eluizione in condizioni costanti di fase eluente

 Stessa miscela di solventi per tutta la durata della corsa (in cromatografia liquida)

 Stessa temperatura per tutta la durata della corsa (in gas- cromatografia)

 Eluizione in gradiente eluizione in cui si varia la composizione della fase mobile

 Programmata di solvente (in cromatografia liquida)  Programmata di temperatura in (gas-cromatografia)

CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA

La cromatografia su colonna è un sistema analogo alla TLC, ma gravitazionale per cui le sostanze che “corrono”di più si trovano nel basso della colonna e vengono eluite per prime. La fase stazionaria impaccata può essere costituita da solidi porosi, liquidi dispersi su solidi, resine a scambio ionico, resine a esclusione.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA

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