dispensa / sbobina del corso di chimica biologica UNIMI, Sbobinature di Biochimica

Scarica dispensa / sbobina del corso di chimica biologica UNIMI e più Sbobinature in PDF di Biochimica solo su Docsity! CORSO DI CHIMICA BIOLOGICA 2 5 INTRODUZIONE Albero filogenetico degli organismi viventi: fondamentale divisione nei Domini: Eubatteri Archibatteri Procarioti: sono privi di nucleo Eucarioti → hanno il nucleo anche più di uno, sono divisi in Regni: • Protisti • Piante • Funghi • Animali Le caratteristiche della materia vivente sono: la capacità di Autoreplicazione e di autoorganizzazione, Caratteristica di essere soggetta a modificazione delle proprie caratteristiche ereditarie nel lungo periodo → evoluzione. Capacità di Ottenere energia dall’ambiente e utilizzarla, Complessità ed elevato grado di organizzazione anatomica e strutturale a livello microscopico. La materia vivente ha una struttura gerarchica: Organismo, organo, tessuto, cellula, organulo, complesso sovramolecolare, macromolecola, dominio, motivo strutturale, residuo monomerico. Le macromolecole hanno una struttura modulare →Polimerica ES: (proteine→ amminoacidi. Acidi nucleici → nucleotidi) Metabolismo: insieme delle trasformazioni chimiche che avvengono nella materia vivente. Scopo fondamentale quello di fornire energia di cui l’organismo ha bisogno per vivere e per svolgere tutte le funzioni vitali. Fondamentali funzioni del metabolismo: • Funzione energetica: fornire energia per le funzioni vitali • Funzione plastica: produrre biomolecole di cui l’organismo è costituito ATP: adenosina trifosfato è il trasportatore di energia per eccellenza, il gruppo fosfato è fondamentale per il trasporto di energia nei sistemi biologici. Le reazioni biologiche sono caratterizzate da una bassa variazione di Energia libera G ma un elevata E. di attivazione, per questo è indispensabile la catalisi, i catalizzatori biologici sono gli Enzimi. BIOELEMENTI E BIOMOLECOLE La materia vivente è costituita da sostanze inorganiche e organiche, di per sé inanimate. Sono sostanze peculiari della MV. composti caratterizzati da: altissimo peso molecolare, le macromolecole dotate di struttura polimerica. Molti bioelementi rappresentano micronutrienti essenziali che devono essere necessariamente acquisiti attraverso l’alimentazione. La composizione elementare degli organismi viventi rappresenta, in modo proporzionale quella della crosta terrestre. I più abbonanti elementi sono ossigeno, carbonio, idrogeno, azoto (dovuto alle proteine), fosforo zolfo e potassio. Proprio il carbonio si distingue dagli altri elementi per maggior abbondanza negli organismi viventi rispetto alla crosta terrestre. Gli atomi dei principali bioelementi sono in grado di stabilire legami covalenti forti. Costituzione della materia vivente: • Sostanze inorganiche: acqua e Sali minerali • Sostanze organiche: comporsti carboniosi 6 Il carbonio: le proprietà fisiche dell’atomo di carbonio ne fanno l’elemento ideale per costruire grandi molecole che costituiscono macromolecole. Numero atomico Z= 6, l’isotopo principale è il carbonio “12”, rappresenta infatti più del 50% del peso secco della MV. esso può formare catene lineari o ramificate con diversi atomi esempio: H, O,N,C. il carbonio ha diverse ibridazioni sp, sp2 e sp3 che li permettono di poter formare una grande varietà di legami con rispettive caratteristiche e funzioni. Molte biomolecole sono polifunzionali, ovvero possiedono più gruppi funzionali. Es. amminoacidi, ormoni o i coenzimi. Isomeri strutturali: composti con medesima composizione ma diversa struttura, ovvero hanno legami diversi e sono chimicamente diversi. Stereoisomeri: composti con stessa formula bruta ma una diversa orientazione nello spazio, seppur i legami siano uguali. Essi hanno molecole dotate di diversa configurazione (è l’orientamento spaziale dettato rigidamente dai legami). Molto importanti sono gli stereoisomeri ottici, i composti aventi un centro chirale ossia enantiomeri ammettono due diverse configurazioni che definiscono proprietà differenti. I Conformeri: sono forme della medesima sostanza le cui molecole differiscono solo per diversa conformazione, ovvero per l’orientamento modificabile di gruppi uniti da legami che ammettono libera rotazione e quindi differenti angoli di torsione. La conformazione è una caratteristica fondamentale per le biomolecole. L’alto numero di legami che permettono loro la rotazione nelle macromolecole biologiche conferisce loro grande potenziale conformazionale. Anche se normalmente nelle condizioni fisiologiche di una macromolecola essa assume 1 conformazione detta conformazione nativa. Sostanze macromolecolari: Sostanze polimeriche di elevato peso molecolare costituite da vari precursori, i monomeri, di struttura semplice con peso molecolare di 500 o inferiore. Il numero di unità monomeriche per macromolecole varia da alcune decine ad alcuni miliardi. Le macromolecole possono organizzarsi in complessi sovramolecolari, la sintesi di macromolecole è una delle attività cellulari con maggior dispendio energetico e sono i maggiori componenti di una cellula. La materia vivente comprende 3 principali classi di sostanze macromolecolari: • Acidi nucleici • Proteine • Polisaccaridi I polimeri le macromolecole biologiche sono polimeri: • Omopolimeri: medesima unità monomerica • Eteropolimeri: diverse unità monomeriche La natura polimerica delle macromolecole permette alla cellula di adottare modalità modulari di sintesi e degradazione, più semplici e meno soggette ad errore. Acidi nucleici: il DNA Funzioni: immagazzinamento e trasferimento dell’informazione genetica Hanno pesi molecolari che variano dalle migliaia ai miliardi. I monomeri sono 4 i nucleotidi. 7 Polipeptidi e proteine Esse hanno funzioni molto diversificate, ma sono le tipiche macromolecole effettrici della materia vivente, ovvero mettono in atto l’informazione genetica del DNA. Sono proteine: elementi strutturali, enzimi, recettori, trasportatori, ormoni ecc… I monomeri sono gli amminoacidi e sono 20. I pesi molecolari variano e possono raggiungere più di 1 milione Le proteine, acidi nucleici (DNA e RNA) → sono macromolecole informazionali, riflettono direttamente l’informazione genetica. I polisaccaridi: funzioni: riserva energetica e sostegno meccanico extracellulare. In determinati casi alcuni di essi, contribuiscono al riconoscimento cellulare. I monomeri sono i monosaccaridi come glucosio e galattosio. Essi NON sono macromolecole informazionali. I lipidi Sono molecole poco solubili perché sono apolari, esempio i grassi. Funzioni: Rappresentano la componente strutturale delle membrane biologiche ma sono anche importanti riserve energetiche ( rigliceridi) e possono fungere da mediatori di segnali extra e intra cellulari. Essi non sono macromolecole, hanno un peso compreso tra 750 e 1500 I fosfolipidi formano le membrane della cellula La conversione dell’informazione monodimensionale contenuta nel genoma nella organizzazione tridimensionale dell’organismo ha una base chimica precisa: il ripiegamento tridimensionale delle proteine nella loro conformazione nativa, dettato dalla loro sequenza amminoacidica. Se la proteina dovesse perdere la conformazione nativa essa perderebbe la capacità di svolgere le proprie funzioni. INTERAZIONI DEBOLI 1. Legami ionici 2. Forze di van der Waals (dipoli fissi e indotti) 3. Legami H Il ruolo delle interazioni deboli in ambiente acquoso nella struttura e funzione delle biomolecole: le interazioni deboli sono alla base delle capacità di auto-organizzazione della MV. e delle trasformazioni che la riguardano. Le macromolecole biologiche hanno un enorme potenziale libertà conformazionale. Le macromolecole possiedono, quasi tutte, una specifica conformazione nativa che assumo spontaneamente. Ed inoltre interagiscono spontaneamente in modo specifico con altre molecole. I legami non covalenti o deboli che si stabiliscono tra gruppi funzionali determinano: • L’adozione della conformazione nativa (ripiegamento o folding) • La formazione di complessi tra biomolecole Le interazioni non covalenti sono tutte di natura elettrostatica, pur differendo tra loro per importanti dettagli. Classificazione delle interazioni deboli tra atomi o gruppi atomici: • Carica-carica: forza non direzionale a lungo raggio, Energia= 1/r • Carica-dipolo: dipende dall’orientamento del dipolo: Energia= 1/r2 • Dipolo-dipolo: dipende dai reciproci orientamenti dei dipoli, Energia =1/r3 10 L’agitazione termica nello stato solido, fa variar le lunghezze dei legami H senza però mai romperli, al contrario allo stato liquido le molecole possono stare più vicine tra loro e l’agitazione termica rompe i legami. Il ghiaccio galleggia perché la sua densità, d, è pari a 0,9 mentre quella dell’acqua è pari a 1, nel ghiaccio la d è minore del 10% perché le molecole sono tra loro più lontane. Oltre al comune ghiaccio (Ih) esistono molte altre forme con diversi reticoli cristallini in cui l’acqua può solidificare a temperature e pressioni più estreme. H20 come solvente Le biomolecole possono essere classificate in base alle caratteristiche di polarità dei loro gruppi funzionali: • Polari: o idrofiliche vengono sciolte bene in acqua • Apolari: o idrofobiche non vengono sciolte in acqua • Anfipatiche: sono molecole formate da una porzione idrofilica e una porzione idrofobica dove esse sono ben distinte. (es fosfolipidi). L’acqua è un ottimo solvente per le sostanze ioniche per la sua alta costante dielettrica (80), dovuta alla sua forte polarità. Anche gas e liquidi possono essere solvatati dall’acqua tutto in base al loro grado di polarità, e alla loro capacità di formare legami H. Sostanze apolari o non polari in acqua La struttura a clatrato che assume il guscio di idratazione attorno a molecole apolari è molto ordinata: ha una bassa entropia. Effetto idrofobico: le molecole non polari in ambiente acquoso tendono ad associarsi tra loro in modo da ridurre l’estensione dei gusci acquosi dei clatrati. Le molecole di acqua appartenenti al primo strato delle molecole adiacenti alle molecole apolari si legano tra loro, formando un reticolo quasi cristallino isolando così le molecole apolari. La formazione di clatrati comporta una diminuzione dell’entropia che è sfavorevole da punto di vista entropico per questo i clatrati tendono a diminuire il più possibile la loro estensione. le molecole apolari si ammassano tra loro così che si formi 1 solo guscio che le circondi. I clatrati idrati degli idrocarburi possono essere piuttosto stabili e assumere stato solido anche quando costituiti a base di sostanze gassose. La componente acquosa è molto ordinata: ha una struttura simile a quella del ghiaccio. I clatrati idrati gassosi sono rinchiusi nel permafrost L’effetto idrofobico è promosso dall’aumento di entropia che ne deriva. L’effetto idrofobico è spesso erroneamente definito e/o chiamato interazione tra molecole non polari. Il mescolamento di sostanze apolari in acqua comporta la formazione di due distinte fasi. Sostanze anfipatiche Sono sostanze che possiedono due porzioni distinte, una porzione polare e una apolare. In soluzione acquosa le porzioni idrofobiche delle molecole antipatiche si associano in massa per lasciare esternamente a contatto con il solvente solamente la loro porzione polare. In soluzione acquosa solitamente si possono formare: • Monostrati molecolari: solitamente si formano sulla superficie del solvente → aiutano la solvatazione di molecole polari. • Micelle: vere e proprie sfere dove la superficie esterna è composta solamente da parte polare 11 • Vescicole a doppio strato molecolare: sfere costituite da due strati di molecole anfipatiche, infatti all’interno c’è acqua. Es. i Liposomi, il doppio strato fosfolipidico sta alla base di tutte le membrane cellulari perché isola interno ed esterno delle cellule. Dunque, le molecole anfipatiche, in ambiente acquoso tendono ad associarsi spontaneamente tra loro secondo un orientamento preciso a dare strutture sovramolecolari ordinate. L’effetto idrofobico governa l’associazione delle molecole delle sostanze macromolecolari. Il ripiegamento di una molecola di proteina globulare è dettato dall’effetto idrofobico. In generale l’effetto idrofobico è il principale fattore che stabilizza la configurazione nativa di una proteina ( altri fattori sono le interazioni deboli). Autoionizzazione dell’acqua 2H2O  H3O+ + OH- Keq= 1.8* 10-16 KW= 10-14 Pka = 15.74 L’acqua ha una bassa tendenza a ionizzarsi ACIDI E BASI La maggior parte delle biomolecole contengono gruppi acidi e/o basici deboli. Equazione di Henderson-Hasselbalch Più il pH è alto più la concentrazione di A- è elevata, più il pH è basso più la concentrazione di HA è elevata. Sistema tampone: la copresenza in una soluziomne di un acido/base debole insieme alla sua base/acido coniugata. Le soluzioni tampone si oppongono efficaemente alle variazioni di pH della soluzione. Un sistema tampone è efficace nell’ambito di pH compreso tra 1 unità in meno e 1 unità in più del valore di pKa della coppia acido-base. Tale ambito di pH è la regione tamponante. Good’s Buffers sono una ventina di sostanze tamponanti selezionate da Norman Good e collaboratori, molte delle quali anfolitiche, dotate di un gruppo acido forte oltre a un gruppo aminico tamponante, che complessivamente coprono un intervallo di pKa molto ampio, e hanno una bassa tossicità per la materia vivente. Anfoliti→ sostanze con molecole sia acide sia basiche esempio gli amminoacidi. La forma NH3+-CH2-COO-, della Glicina, predominante a pH neutro, ha carica netta nulla, presentando due cariche unitarie di segno opposto: questa specie è detta zwitterione. Punto isoelettrico ( pI): di un anfolita è il valore di pH a cui la sua carica netta è esattamente zero. Per un anfolita dotato di 2 gruppi ionizzabili, uno acido uno basico, con valori di pK pari a pK1 e pK2 si ha che:    HA A pKpH a − += log 2 pp pI 21 KK + = 12 Polianfoliti e polielettroliti: Polielettroliti: sostanze le cui molecole presentano cariche multiple dello stesso segno (p. es. acidi nucleici). Polianfoliti: sostanze le cui molecole presentano cariche multiple di segno opposto (p. es. proteine). Per i polianfoliti esiste sempre un pI, anche se può essere difficile da calcolare. Il pI di una proteina può essere determinato sperimentalmente mediante una tecnica elettroforetica detta isoelettrofocalizzazione Macroioni: le forme ionizzate di macromolecole aventi molti gruppi acidi e/o basici. Essi hanno una carica netta che: • Dipende dal pH della soluzione • Può essere anche molto intensa Le molecole degli acidi nucleici (carica netta negativa) tendono a rimanere separate in soluzione per effetto della repulsione tra cariche dello stesso segno. Nei cromosomi il DNA è associato a proteine basiche dette istoni (carica netta positiva) La solubilità di una proteina è minima al suo punto isoelettrico, a pH dove ha cariche nette non nulle la sua solubilità è elevata mentre in un arco di pH vicino al suo pI è poco solubile perché la sua carica netta →0 ACIDI NUCLEICI: DNA E RNA Struttura covalente e conformazione Le macromolecole biologiche presentano una struttura modulare e organizzata gerarchicamente, ovvero organizzata in livelli di complessità crescente. In esse si possono distinguere: • Struttura primaria → corrispondete alla struttura covalente • Struttura secondaria • Struttura terziaria riferite alla conformazione. • Struttura quaternaria (eventualmente) La conformazione nativa delle macromolecole biologiche ha un ruolo chiave nel determinarne proprietà e funzioni. Classificazione degli acidi nucleici: • Acido RiboNucleico o RNA → unità monomeriche i ribonucleotidi • Acido DeossiriboNucleico o DNA → unità monomeriche deossiribonucleotidi Entrambi sono eterpolimeri, gli acidi nucleici sono i depositari dell’informazione genetica. La loro struttura è alla base della loro funzione biologica di custodire e trasmettere l’informazione genetica. (alle proteine) DNA Una o più specie di DNA (in genere, ciascuna presente come singola molecola o due copie della stessa, quasi identiche) conservano l'informazione genetica di ogni cellula, in modo che sia utilizzata nel corso della sua vita per: • dirigere la sintesi delle altre macromolecole informazionali (RNA e proteine) 15 Nomenclatura di basi, nucleosidi e nucleotidi Base Ribonucleoside Ribonucleotide Adenina Adenosina Adenosina 5’-monofosfato o Adenilato Guanina Guanosina Guanosina 5’-monofosfato o Guanilato Citosina Citidina Citidina 5’-monofosfato o Citidilato Timina Timidina Timidina 5’-monofosfato o Timidilato Uracile Uridina Uridina 5’-monofosfato o Uridilato Gli acidi nucleici sono costituiti da catene polinucleotidiche dove ciascun nucleoside 5’-monofosfato è legato, attraverso il proprio 3’-OH, al gruppo fosforico del residuo successivo. Ogni gruppo fosfato di un polinucleotide stabilisce quindi 2 legami fosfoestere: sono dunque detti gruppi fosfodiestere. L’idrolisi dei polinucleotidi è termodinamicamente favorevole (esoergonica in condizioni standard) ha infatti un G’° idrolisi = -25 kJ/mol, ma estremamente lenta in assenza di catalizzatori. La mancanza del gruppo OH dell’DNA lo rende assai meno idrolizzabile dell’RNA, quest’ultimo infatti in condizioni basiche si idrolizza molto più velocemente. Il gruppo 2’OH funge da catalizzatore dell’idrolisi del residuo nucleotidico cui appartiene. Biosintesi dei polinucleotidi: Fisiologicamente, la sintesi dei polinucleotidi avviene a partire da nucleosidi 5’- trifosfato (precursori ad alto contenuto energetico) e non da nucleosidi 5’-monofosfato.--> poco energetico Il pirofosfato prodotto dalla reazione di polimerizzazione viene rimosso dall’ambiente di reazione per idrolisi a ortofosfato. L'energia libera resa disponibile dall'idrolisi di due legami fosfoanidridici è usata per formare un legame fosfoestere. Struttura tridimensionale degli acidi nucleici (struttura primaria → struttura covalente, descritta dalla sequenza nucleotidica). Le catene polinucleotidiche hanno una polarità: le due estremità sono distinguibili: estremità 5’, estremità 3’. La sequenza è scritta convenzionalmente in direzione 5’ → 3’. Sequenza: ACCTTG. La conformazione: L’informazione genetica contenuta negli acidi nucleici è codificata dalla loro struttura primaria. Lo scheletro (backbone) di una catena polinucleotidica è altamente flessibile: 6 dei 7 legami covalenti che si susseguono lungo la catena principale della molecola possono ruotare liberamente. Una molecola di polinucleotide ammette un numero teorico praticamente infinito di potenziali conformazioni diverse. I diffrattogrammi indicano che il DNA presente nella maggior parte degli organismi ha un’organizzazione tridimensionale elicoidale con 10 residui per giro d’elica. 16 Il modello di Watson e Crick 25 aprile 1953 pubblicano il loro articolo sulla rivista scientifica Nature, dove danno la prima vera spiegazione della struttura del DNA e della particolare sequenza delle basi azotate. Importante è il ruolo dei legami idrogeno interfilamento, infatti i legami a H stabilizzano il filamento di DNA. Esso mostra una struttura regolare e l’appaiamento tra basi secondo <<Watson e Crick>> è imposto dai vincoli dei legami H. Adenina=Timina (doppio legame idrogeno) Guanina≡Citosina (triplo legame H). il che implica anche che la quantità in moli di Guanina = alla quantità in moli di Citosina, lo stesso vale per A e T. Il DNA è costituito da 2 catene antiparallele, dove al centro rimane la parte idrofobica “limitando” il contatto con l’acqua, mentre i gruppi fosfato sono esterni. Le basi riducono l’acqua di solvatazione e in aggiunta anche l’effetto idrofobico stabilizza la struttura del DNA. Lo specifico appaiamento tra le basi secondo Watson-Crick spiega il meccanismo della replicazione del DNA. Il processo di replicazione semiconservativa del DNA avviene grazie alla catalisi dell'enzima DNA polimerasi e altri enzimi ausiliari, ma alla base della specificità del processo c'è l'appaiamento tra basi determinato dalla stabilità dell'interazione basata sui legami H tra basi complementari. Si dice semiconservativo perché ogni cellula figlia presenta metà filamento della cellula madre. La struttura secondaria degli acidi nucleici La st. secondaria è la conformazione locale assunta dallo scheletro ( catena principale) di una macromolecola polimerica (ovvero la geometria della catena principale di un residuo rispetto a quello immediatamente successivo). Gli acidi nucleici possono assumere diversi tipi di struttura secondaria. Gli acidi nucleici adottano 3 principali strutture secondarie: • Struttura ad avvolgimento casuale (acido nucleico a singolo filamento: struttura secondaria disordinata, irregolare) • strutture secondarie, regolari e ripetitive, a doppia elica destrorsa: ❖ Forma B ❖ Forma A Esistono inoltre strutture secondarie regolari e ripetitive meno comini: DNA Z ( DNA sinistrorso), DNA H (DNA a triplica elica), RNA a singola elica destrorsa. Strutture a doppio filamento più diffuse: La forma B: è assunta in vivo (nelle cellule vive) dal DNA e in vitro (in provetta, sintetizzato) in ambiente acquoso. → è la più comunemente assunta. La forma A: è assunta in vitro dal DNA disidratato. Inoltre, la forma A è assunta dall’RNA a doppio filamento e negli ibridi DNA-RNA. 17 Principali proprietà e differenze delle strutture secondarie a doppia elica: • Eliche destrorse A e B: Le strutture a elica degli acidi nucleici presentano 2 solchi: maggiore e minore, dove le basi azotate sono parzialmente esposte al solvente. • Elica sinistrorsa, DNA Z: il solco minore è molto stretto. Generalmente elica con FORMA B è più stirata in lunghezza e stretta. Eliche a FORMA A sono più compatte con elica più larga e, i piani su cui poggiano le basi sono più inclinati rispetto a quelle delle eliche di Forma B. RNA a singolo filamento: hanno un’elica destrorsa, generalmente tratti di catena di RNA a singolo filamento tendono ad assumere una struttura secondaria a singola elica destrorsa, in cui le basi tendono a impilarsi. La struttura terziaria degli acidi nucleici: essa rappresenta la disposizione nello spazio della catena polimerica dell’intera macromolecola. Ovvero il modo in cui la struttura secondaria della macromolecola di organizza ulteriormente nello spazio. (come le varie regioni della struttura secondaria si dispongono tra di loro nello spazio) Acidi nucleici a singolo filamento: Molte molecole di RNA a singolo filamento presentano una successione di regioni ad avvolgimento casuale irregolare e regioni con struttura secondaria a doppia elica solitamente di Forma A (organizzate a forcina, hairpin). Esempio→ molecole di RNA ribosomale (rRNA) parzialmente denaturata come in foto. Regioni appaiate di molecole di RNA, che quindi presentano tratti di sequenza nucleotidica complementare, tendono ad assumere una struttura secondaria a doppia elica di forma A. Struttura terziaria di un tRNA: I tRNA sono costituiti da molecole di RNA a singolo filamento la cui conformazione nativa è basata due regioni con struttura secondaria a doppia elica di forma A. Gli elementi a doppia elica sono disposti tra loro in modo quasi perfettamente ortogonale. 20 C’è un codice identificativo a tre lettere per ogni amminoacido: Gly: glicina Ala: alanina Sec: Selenocisteina → U Ply: Pirrolisina → O È inoltre utilizzata anche una codifica con singola lettera per ogni amminoacido. Il carbonio  di tutti gli amminoacidi incorporati nelle proteine (esclusa la glicina) è chirale. Ciascun amminoacido (glicina esclusa) ammette due forme enantiomeriche, caratterizzate da opposta configurazione del C. quindi ammettono enantiomeri L e D. Nelle proteine vengono incorporati solo gli enantiomeri L, levogiri. Gli amminoacidi vengono classificati in base alla natura della catena laterale R: • Gruppo R alifatico • Gruppo R aromatico • Gruppo R contenente zolfo o ossidrili • Gruppo R basico • Gruppo R acido o contenente un gruppo ammidico Catene laterali alifatiche: sono: alanina, valina, leucina, isoleucina e glicina. Hanno catene laterali idrofobiche, in alcuni casi ramificate e molto ingombranti. La Glicina è per comodità inclusa in questo gruppo anche se non ha una catena laterale alifatica. Il residuo di Gly è piuttosto polare. Dato il minimo ingombro della sua catena laterale (-H), i residui di Gly incorporati nelle proteine hanno una elevata libertà conformazionale. Gli amminoacidi a catena ramificata (Val, Leu e Ile) sono diffusi come integratore alimentare per sportivi. Le proteine contrattili muscolari ne sono ricche. La Prolina: è un amminoacido protogenico anomalo, è dotata di un gruppo -amminico secondario. Avendo struttura ciclica la sua catena laterale ha scarsa libertà conformazionale. Introduce vincoli conformazionali anche nella catena principale delle proteine nel punto in cui è inserita. Catena laterale contenente zolfo o gruppi ossidrilici: Sono: Serina, Cisteina, Treonina e Metionina. Si tratta in genere catene laterali polari. Quella della Met (gruppo tioetere) è la più idrofobica. Catene laterali di Ser e Thr possono formare legami-H. 21 Importante: i gruppi funzionali delle catene laterali non sono mai direttamente legati al carbonio alpha. La cisteina: ha due particolarità: • Ha una catena laterale dissociabile debolmente acida ( pKa = 8.3) • Può ossidarsi a dare cistina, con la formazione di un gruppo disolfuro o anche detto ponte disolfuro→che si insatura tra due molecole di cistina. Amminoacidi con catena laterale aromatica Ar: Sono: Fenilanilina, Tirosina e Triptofano. Questi amminoacidi hanno catene laterali idrofobiche. La Phe, Fenilalanina è, insieme ad alcuni amminoacidi alifatici, uno degli amminoacidi più idrofobici. Gli amminoacidi aromatici conferiscono alle proteine la proprietà di assorbire la luce ultravioletta alla lunghezza d’onda 260-280 nm (soprattutto il Trp). Il Triptofano è anche fluorescente. Infatti, se una proteina contiene solamente amminoacidi non è colorata perché assorbe solamente raggi UV se contiene catene laterali aromatiche. Oss. La tirosina ha una catena laterale debolmente acida con pKa di 10.1 e si ionizza in ambiente basico a dare un gruppo fenolato. Inoltre, la catena laterale della tirosina può formare legami-H. Amminoacidi con catena laterale basica: In ordine di basicità crescente sono: Istidina, Lisina e Arginina, rispettivamente con catena laterale di pKa 6, 10, 12. Residui di Lys e Arg nelle proteine sono ionizzati a pH fisiologico. Le catena laterali degli amminoacidi basici possono formare legami-H. La catena laterale della His ha carattere aromatico (anello imidazolico). Inoltre, i residui di His negli enzimi sono spesso implicati in catalisi acido-base (dato che possono scambiare protoni a pH fisiologico). Amminoacidi acidi e loro ammidi: Sono Acido aspartico e Acido glutammico e le loro corrispondenti ammidi Asparagina e Glutammina. 22 I due Acidi sono relativamente forti, i loro residui presenti nelle proteine sono ionizzati a pH fisiologico. Le corrispondenti ammidi non sono invece ionizzabili ma sono fortemente polari. Le catene laterali di tutti questi amminoacidi possono formare legami-H. Amminoacidi modificati presenti nelle proteine: sono generati dopo l’incorporazione dei rispettivi normali amminoacidi precursori nelle proteine, attraverso modificazioni post-traduzionali. Queste modificazioni possono essere irreversibili come ossidrillazioni, carbossilazioni o metilazioni ma, possono anche essere reversibili o transitorie come fosforilazioni e acetilazioni. Le modificazioni transitorie hanno l’obiettivo di regolare le proprietà delle proteine che le possono presentare e dunque la loro attività. La Selenocisteina (Sec, o Se-Cys) è un caso particolare di amminoacido modificato. Essa è formalmente derivata dalla cisteina, in cui l’atomo di S è sostituito da uno di selenio Se. Ha proprietà simili a quelle della cisteina, compresa la capacità di formare legami diseleniuro. È un amminoacido estremamente raro, presente in poche selenoproteine→ sono tutte enzimi. La Sec è introdotta nelle proteine nel corso della loro sintesi, ed è codificata da uno speciale codone UGA, che normalmente è un codone di stop, associato a uno speciale elemento di struttura secondaria dell’mRNA, in particolare si tratta di una struttura a forcina. La Pirrolisina è un altro caso speciale di amminoacido modificato. Scoperta in una proteina dell’archibatterio Methanosarcina barkeri, la pirrolisina viene incorporata durante la sintesi proteica in alcuni enzimi con attività metil-transferasica di alcuni procarioti produttori di metano. E’ codificata dal codone UAG (normalmente di stop), seguito da una speciale sequenza che forma nell’mRNA una struttura a forcina (stem-loop). Amminoacidi biologicamente importanti non presenti nelle proteine: In natura esistono amminoacidi con gruppo amminico in posizione diversa dalla , ed esistono anche D- amminoacidi. Esempi sono: Acido D- Glutammico, Ormone Tiroideo, Sarcosina.. Legame peptidico e peptidi Due o più amminoacidi possono essere legati tra loro attraverso una reazione formale di condensazione a dare peptidi. Nei peptidi gli amminoacidi sono legati attraverso un legame ammidico che coinvolge i gruppi -carbossilico e -amminico di due residui legati tra loro. Il legame ammidico che unisce 2 residui amminoacidici è detto legame peptidico. Più precisamente i 4 atomi che formano l’ammide costituiscono il gruppo peptidico. A seconda del numero di residui amminoacidici coinvolti si dice: • Dipeptidi (2 aa) • Tripeptidi (3 aa) • Tetrapeptidi (4 aa) 25 La struttura elicoidale è molto comune tra le proteine ed è potenzialmente indipendente dalla sequenza amminoacidica. Le strutture laterali sporgono all’esterno dell’elica e a volte i gruppi R di residui differenti interagiscono tra di loro, stabilizzando ulteriormente la struttura. I principali tipi di struttura secondaria regolare (ripetitiva): La catena principale di un polipeptide può assumere delle conformazioni periodiche regolari, ovvero dove tutti i residui adottano la stessa struttura secondaria. Regole teoriche generali da rispettare, secondo Pauling e Corey: • Rispetto dell’ingombro sterico (raggio di van der Waals) degli atomi. • Gruppo peptidico planare e in configurazione trans. • Pieno soddisfacimento del potenziale di formazione di legami-H della catena principale. Vincoli e gradi di libertà della conformazione della catena principale di un amminoacido Angoli di torsione della catena principale:  → phi  → psi Obiettivo delle strutture secondarie è massimizzare la formazione di legami-H che stabilizzano le varie strutture. Strutture secondarie più importanti: •  elica destrorsa: struttura regolare, periodica, legami H tra i residui della catena abbastanza vicini tra loro ma non adiacenti. • Foglietto β o foglietto pieghettato: struttura regolare In entrambe i legami H si stabiliscono tra i gruppi peptidici, quindi entro la catena principale. altre strutture regolari: • Elica 310 effettivamente presente in molte proteine. • Elica : mai stata osservata sperimentalmente, probabilmente perché è troppo larga e lascia spazi vuoti all’interno. 26 I parametri geometrici delle strutture secondarie periodiche regolari: i parametri per la descrizione di un polimero elicoidale sono: • Segno di n → verso dell’elica ( + destrorsa, - sinistrorsa) • n →numero di residui per giro d’elica (può anche essere un numero razionale tipo 2,4 e ecc..) • p → passo dell’elica • h → passo per residuo ℎ = 𝑝 𝑛 rappresenta la distanza tra i residui per giro d’elica Ansa-H : topologia dei legami idrogeno nella catena principale N: numero di atomi compresi dall’ansa-H → catena di atomi chiusa da un legame idrogeno La notazione «nN» è un ulteriore sistema per la descrizione delle strutture secondarie elicoidali delle proteine. Nell’ elica si stabilisce un legame H tra il C=O di un residuo e l’N-H del 4° residuo (3° gruppo peptidico) successivo (procedendo in direzione C-terminale). Esempi:  elica → ansa H = 13 atomi → 3,6 residui (ha un passo di 0,54 nm) Elica  → ansa H = 16 atomi Tipologie di strutture secondarie realmente osservate nelle proteine  elica È una struttura compatta, dove sono massimizzate le interazioni di Van der Waals tra gli atomi della catena principale. Ogni gruppo peptidico è impegnato in 2 legami H. Non ha spazi vuoti interni per questo è stabile. Le catene laterali sono rivolte all’esterno dell’elica in modo quasi ortogonale rispetto all’asse dell’elica; necessario per stabilizzare la struttura terziaria perché i gruppi R di residui diversi interagiscono tra loro. 27 Il gruppo peptidico possiede un momento dipolare, In un’ elica tutti i dipoli dei gruppi peptidici sono orientati in modo simile e si sommano a dare un momento dipolare complessivo consistente. I foglietti  Sono costituiti dall’associazione di 2 o più filamenti in conformazione . I filamenti  adiacenti di un foglietto possono essere paralleli o antiparalleli. Nei foglietti  ogni gruppo peptidico (dei filamenti interni) è impegnato in 2 legami H con i filamenti adiacenti. I foglietti antiparalleli sono più stabili perché i legami H hanno una geometria più favorevole. Tutti i filamenti sono tra loro in fase. Definizione rigorosa di struttura secondaria: La struttura secondaria di un polipeptide è la conformazione della sua catena principale, che è univocamente descritta dal valore degli angoli di torsione  e  di ogni suo residuo amminoacidico. Data una certa conformazione elicoidale della catena principale si stabiliscono legami H tra determinati gruppi peptidici secondo una topologia specifica. Nella struttura secondaria periodica di un peptide tutti i residui amminoacidici adottano la stessa conformazione. Angoli phi e psi di strutture secondarie periodiche → IL Grafico di Ramachandran Le zone gialle sono zone “non permesse” perché i gruppi funzionali delle catene laterali colliderebbero tra loro mentre, le zone blu o azzurre è dove possono esserci amminoacidi. I puntini indicano i vari amminoacidi. 30 Motivi strutturali tra due eliche: -eliche Coiled Coil (-cheratina): doppio avvolgimento tra 2 eliche associate  longitudinalmente (legate dai vari gruppi R) →Leucine zipper (nell’interazione proteina proteina): 2 eliche associate sempre longitudinalmente ma legate tra loro unicamente da interazioni deboli idrofobiche dei gruppi R. Le eliche di un fascio solitamente decorrono tra loro in modo antiparallelo topologia dei foglietti  antiparalleli Motivo a forcina: due filamenti  antiparalleli uniti da una ripiegatura  è il motivo tipicamente assunto. Se invece ci sono più filamenti a foglietti antiparalleli si formano differenti motivi: 4 → Greek key 6 → Jellyroll topologia dei foglietti  paralleli: Foglietti  paralleli possono essere generali connettendo due filamenti  con un  elica: motivo --. Il verso del motivo è solitamente destrorso. I foglietti  reali non giacciono mai su un piano, ma presentano sempre un certo grado di torsione. L’estensione di un foglietto genera di conseguenza una struttura cilindrica: il barile  ( barrel). → antiparallelo Il Barile  parallelo è invece, dato dalla ripetizione del motivo --. Domini strutturali e proteine multidominio: Molte proteine, specie con alto peso molecolare, possiedono regioni strutturate in modo parzialmente autonomo, i domini. Si possono differenziare: • Domini di legame del substrato • Dominio di legame del NAD, un enzima NAD- dipendente ad esempio. 31 Struttura tutta : Struttura tuta  Strutture /, elementi  ed elementi  variamente alternati nello spazio tridimensionale. 32 Struttura + : elementi  ed elementi  segregati in porzioni distinte della molecola. Famiglie di proteine: le proteine possono essere classificate in famiglie, le proteine di una stessa famiglia presentano una struttura tridimensionale molto simile e spesso una st. primaria simile. Le proteine di una famiglia sono tra loro omologhe → hanno una comune origine evolutiva Aspetti generali della struttura terziaria e delle forze che la stabilizzano • La struttura terziaria delle proteine è estremamente compatta. • Questo impaccamento dei residui massimizza le interazioni di van der Waals. • In generale, i residui idrofobici sono all’interno della molecola e quelli idrofilici all’esterno. Le molecole proteiche hanno uno o più nuclei idrofobici (hydrophobic cores). • All’interno, tutte le eventuali cariche sono accoppiate (legami ionici). • All’interno, tutti i gruppi capaci di formare legami-H li formano. • Gli eventuali ponti disolfuro (tipici delle proteine extracellulari) conferiscono un ulteriore effetto stabilizzante sulla struttura terziaria). I fattori termodinamici governano la struttura terziaria delle proteine: ogni proteina possiede una caratteristica struttura tridimensionale definita conformazione nativa. In condizioni fisiologiche, la conformazione nativa corrisponde alla conformazione termodinamicamente più stabile della molecola proteica. La configurazione nativa è determinata dalla struttura primaria. 35 RAPPORTO STRUTTURA-FUNZIONE DELLE PROTEINE- APPROFONDIMENTO SU Hb e Mb L’attività biologica della maggior parte di proteine può essere ricondotta alla capacità di formare complessi molecolari reversibili per determinate sostanze. La proteina può formare un complesso con il suo ligando, (substrato per gli enzimi) interagendo con esso a livello di uno specifico sito di legame. Generalmente la formazione del complesso tra proteina e ligando è governata da un equilibrio chimico. P + L = PL Definiamo così vari tipi di costanti di equilibrio: Ka: costante di associazione Kd: costante di dissociazione La Kd è detta anche costante di semisaturazione di L La frazione di saturazione θ della proteina in funzione della concentrazione del ligando libero, con ligando in eccesso rispetto alla proteina è definita dalla seguente equazione: La frazione di saturazione di P, varia ala variare della concentrazione di L, [L], per effetto della legge dell’azione di massa. La curva di saturazione di una proteina P e il suo legando è una curva iperbolica, iperbole equiliatera.      eq d PL LP K       =      eq a LP PL K       = a d K K 1 =         eqdTot LK L P PL       + == Curva saturazione di una proteina (P) con il suo ligando (L) 0 0.25 0.5 0.75 1 0 100 200 300 400 500 [Ligando] (M) F ra z io n e d i s a tu ra z io n e , [P L ]/ [P ] T o t P + L = PL Kd 36 Se Kd = L→ θ = 1 2 ovvero metà proteina libera e metà complessata. Più la Kd è bassa più l’interazione Ligando-Proteina è forte. STRUTTURA, FUNZIONE E REGOLAZIONE DI MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA Entrambe fanno parte della famiglia delle globine, esse sono i più importanti membri della famiglia strutturale di proteine omologhe. Entrambe svolgono la funzione di trasportatori di ossigeno. • Mioglobina Mb: trasportatore di O2 nel citoplasma delle cellule muscolari, infatti essa è localizzata nei miociti dei vertebrati. • Emoglobina Hb: trasportatore di O2 nei globuli rossi del sangue dei vertebrati, localizzata negli eritrociti. Il metabolismo aerobico richiede l’apporto di O2 ai tessuti. Organismi complessi hanno un sistema circolatorio. Le principali problematiche dell’ossigeno sono: • Bassa solubilità in acqua. Le proteine trasportatrici hanno il compito di aumentarne la solubilità → Hb • Le cellulle richiedono grossi apporti di ossigeno come i miociti, contengono dunque Mg, che ha il compito di favorirne la diffusione intracellulare. Hb: essa è presente nel sangue in elevate concentrazioni. Quantità presente nel sangue umano intero è di 130-180 g/L. Mentre all’interno dei globuli rossi la sua concentrazione raggiunge i 310-350 g/L. L’ematocrito che è la frazione di volume del sangue occupata dagli eritrociti è del 40-50%. Schema del sistema circolatorio di un vertebrato Il trasporto di ossigeno avviene in modo passivo, ovvero avviene per effetto di un gradiente di concentrazione. Hb ha anche un importante ruolo nel trasporto di CO2. PO2 rappresenta la pressione parziale di O2 Una sostanza deputata al trasporto di O2 deve legarlo e rilasciarlo in modo opportuno e deve impedire che reagisca con altre sostanze. Le proteine non hanno gruppi funzionali adatti a fungere da siti di legame per l’O2. Alcuni ioni di metalli di transizione nei loro stati di ossidazione più bassi (Cu+, Fe++) legano fortemente l’O2. Mb e Hb sono proteine coniugate contenenti Fe eminico (eme). Lo ione ferroso (Fe++) dell’eme lega una molecola di O2. Le proteine che contengono una parte non peptidica si dicono proteine coniugate. Quando la porzione non peptidica è una sostanza organica stabilmente legata alla componente proteica viene detta gruppo prostetico. Sono così dette oloproteine. PO2= 100 torr PO2= 30 torr PO2= < 4 torr L’ossigeno viene utilizzato come ossidante nei mitocondri per la respirazione cellulare. 37 Nomenclatura delle Globine: Nelle globine (struttura tutta ), gli elementi successivi a elica sono indicati con lettere dalla A alla H. I tratti di connessione (anse) tra eliche adiacenti sono indicati con le due lettere identificative di ciascuna delle due eliche: p. es. AB, BC, ecc. Esempio: E7 è il settimo residuo dell’elica E, FG5 è il quinto residuo dell’ansa che connette le eliche F e G. (è la struttura terziaria della Mb) Sia Mb che Hb hanno un gruppo prostetico che è l’eme. Eme: Fe(II) coordinato da un anello tetrapirrolico. La componente organica dell’eme è la protoporfirina IX, composto appartenente alla classe delle porfirine. Lo ione Fe2+ accetta 6 legami di coordinazione ordinati secondo i vertici di un ottaedro, 4 legami sono forniti dagli atomi di N dell’eme. Un quinto legame di coordinazione è invece, fornito dall’N della catena laterale His93,(F8) residuo amminoacidico detto His prossimale. Il legame rimasto, quindi l’unico sito di coordinazione rimasto libero, lega l’ossigeno molecolare sulla faccia opposta dell’N dell’His prossimale. His distale: è invece, sopra il gruppo eme e l’ossigeno si trova dunque tra il fe2+ e l’His distale con cui interagisce. L’eme è legato stabilmente a Mb e Hb all’interno di una tasca idrofobica. His → istidina L’eme libero in soluzione viene rapidamente ossidato dall’O2: Fe(II)→Fe(III). L’ambiente idrofobico fornito dalla proteina protegge il ferro dell’eme da questa ossidazione. Al di fuori della cellula, Mb e Hb (colore rosso) si ossidano lentamente a dare metamioglobina e metaemoglobina (colore bruno). Il test del luminolo si basa sulla ossidazione dell’Hb e si usa per la rivelazione di tracce di sangue latenti. Mb e Hb possono legare anche altre piccole molecole: CO, H2S e NO Proprio l’alta affinità per il CO determina la sua tossicità. Le componenti proteiche di Mb e Hb modulano l’affinità dell’eme per i diversi ligandi. L’affinità dell’eme libero per la CO è 20,000 volte maggiore di quella per l’O2. L’eme legato alla Mb ha un’affinità per la CO solo 200 volte maggiore di quella per l’O2. (questo discorso è valido anche per il cianuro) I leganti al Fe ne proibiscono l’ossidazione a Fe3+. I movimenti molecolari della macromolecola proteica permettono il legame e il rilascio dell’O2 da parte di Mb e Hb. L’eme è immerso all’interno della componente peptidica di Mb e Hb. L’unica parte polare e carica è esposta verso il solvente. Le fluttuazioni casuali (agitazione termica) della struttura terziaria di Mb e Hb producono cavità transitorie nella struttura molecolare di queste proteine, permettendo all’O2 di raggiungere il suo sito di legame. Proprio le torsioni e i movimenti permettono ai ligandi di uscire dal loro sito di legame pur trovandosi all’interno. I saturimetri sfruttano il diverso spettro di asorbimento dell’emoglobina e ossiemoglobina per stimare la saturazione della Hb nel sangue arterioso. 40 insieme di essi. La struttura terziaria di ciascuna subunità influisce sulla struttura quaternaria del tetramero e viceversa. Ciò accoppia la struttura terziaria a quella quaternaria e fa sì che ciascuna subunità della molecola tetramerica di Hb tenda ad assumere la stessa struttura terziaria delle altre. Modelli di cooperatività • modelli sequenziali: modello KNF (Koshland, Nemethy, Filmer). → ci possono essere vie di mezzo, intermedie tra T e R • Modelli concentrati: modello MWC (Monod, Wyman, Changeux) → sono o tutte Tese T oppure rilassate R • Modelli multistato: modelli misti In generale: Il legame di una molecola di O2 ad una subunità spinge la struttura terziaria di quella subunità ad assumere lo stato ad alta affinità. Ciò favorisce il cambiamento della struttura quaternaria della molecola tetramerica di Hb dalla forma T a quella R. L’adozione della forma R da parte della struttura quaternaria a sua volta favorisce l’assunzione dello stato ad alta affinità da parte delle altre subunità della molecola. Mod. sequenziale Mod. concentrato (nel modello concentrato i cambiamenti delle st. terziarie e quaternarie sono strettamente accoppiati) Meccanismo di Petrutz per la transizione T → R Il legame dell’O2 comporta uno spostamento dell’elica F (di circa 1 Å) e dell’angolo FG. Ciò induce il cambiamento nella struttura terziaria della subunità con l’assunzione dello stato ad alta affinità e ciò favorisce la transizione T→R della struttura quaternaria. Effetto allosterico e proteine allosteriche: Le proteine allosteriche possiedono più siti di legame per molecola proteica, uguali o diversi tra loro. Il legame di una molecola di ligando in un sito può alterare l’affinità degli altri siti della molecola. Questo fenomeno è detto effetto allosterico. Le proteine che manifestano questo effetto sono dette proteine allosteriche. In una proteina allosterica esistono più siti di legame per lo stesso o diversi ligandi. L’occupazione di un sito modifica lo “stato” della proteina influenzando l’affinità degli altri siti. I ligandi capaci di indurre l’effetto allosterico sono detti effettori allosterici. Effettori allosterici: • Effettori Omotropici • Effettori Eterotropici • Effettori Positivi • Effettori Negativi 41 Il legame dell’O2 all’Hb avviene con un meccanismo allosterico che spiega la cooperatività del legame di questo ligando, che si composta quindi da effettore omotropico positivo. Meccanismi allosterici spiegano anche la regolazione dell’Hb da parte di H+, CO2, e 2,3-BPG, che si comportano tutti da effettori eteropropici negativi. Effetto Bohr il pH modifica la curva di dissociazione dell’ Hb. Un aumento di [H+] promuove la protonazione dell’Hb e favorisce la forma T. Quindi l’abbassamento di pH riduce l’affinità dell’Hb per l’O2. Nei tessuti, il metabolismo aerobico produce CO2 che, trasformandosi in H2CO3, abbassa il pH del plasma sanguigno. Nei muscoli in debito di ossigeno si ha anche la produzione dell’acido lattico che abbassa ulteriormente il pH. La produzione di CO2 diminuisce il pH. Ciò promuove un maggior rilascio di O2 dall’Hb nei tessuti che ne hanno bisogno. Trasporto di CO2 da parte del sangue: Hb-NH3 + + HCO3 -  Hb-NH-COO- + H+ + H2O Parte del bicarbonato si lega all’Hb come carbammato (ai gruppi amminici N-terminali) favorendo la forma T e quindi riducendone l’affinità per l’O2. 2,3-Bisfosfoglicerato, BPG Il BPG si lega nella cavità centrale della molecola tetramerica di Hb. Una molecola di tetramero Hb lega una sola molecola di BPG. BPG → regola la pressione ed è il principale modulatore fisiologico dell’ Hb, cambia la sua curva di saturazione. Il 2,3-BPG si lega alla sola forma T della Hb. Il sito di legame non è disponibile nella forma R. Il BPG presente negli eritrociti regola l'affinità dell'Hb per l'O2 in funzione della disponibilità di O2 nell'ambiente. Ciò garantisce che l'O2 rilasciato ai tessuti si mantenga al valore fisiologico di circa il 40% della capacità massima di trasporto dell'O2 dell'Hb. Varianti alleliche dell’Hb umana: varianti alleliche delle proteine possono o nom farle funzionare oppure provocare malattie → varianti alleliche patologiche. Variante S: provoca la falcizzazione → anemia falciforme Si ha una valina al posto di una glicina in posizione A3, ciò è dannoso perché la valina è una catena laterale idrofobica che è in grado do dimerizzare con un’altra emoglobina entrando nella fessura del sito attivo di quest’ultima → formano così lunghe catene che portano alla formazione di fibrille che si aggregano tra loro. Dunque Hb nei 42 globuli rossi precipita piuttosto che stare in soluzione. I soggetti portatori di una sola copia dell’allele S della Hb presentano lievi sintomi della malattia, ma sono resistenti nei confronti della malaria. CINETICA ENZIMATICA La legge di velocità è l’equazione che esprime la velocità della reazione in funzione della concentrazione delle sostanze che la influenzano. Molecolarità di una reazione: numero di molecole che devono interagire tra loro per generare lo stato di transizione. Le reazioni elementari possono essere unimolecolari o bimolecolari. L’ordine di reazione: il grado algebrico della equazione di velocita di tale reazione. Si definiscono elementari le reazioni aventi 1 solo stato di transizione, altrimenti son dette complesse. La velocità di una reazione enzimatica: Essa dipende in modo lineare dalla concentrazione dell’enzima e iperbolicamente dalla concentrazione del substrato. Ha un andamento a saturazione. Si considera velocità iniziale V0 di una reazione, la velocità misurata in assenza di prodotti. Perché in queste condizioni la reazione è irreversibile, la velocità della reazione inversa è pari a zero. (I protagonisti delle prime fondamentali scoperte sulla cinetica delle reazioni enzimatiche sono stati Victor Henri, Leonor Michaelis e Maud L. Menten.) Equazione di Michaelis e Menten L’enzima agisce formando un complesso con il substrato: complesso enzima-substrato (ES) Per ottenere un’equazione che descrive i dati sperimentali non è necessario assumere che ES sia in equilibrio con E e S liberi (condizione che richiede k-1 >> k2). E’ sufficiente assumere lo stato stazionario per [ES]. Reazione elem. Molecolarità Ordine A → B 1 1 A → B + C 1 1 A + B → C 2 2 A + B → C + D 2 2 2A → B 2 2     ES SE 1 1 S == − k k K 45 Equazione di Michaelis-Menten reversibile:            PKSKKK PEKkSEKk v S m P m P m S m T S m P catT P m S cat ++ − = (È la velocità netta in termini di Km) Valori negativi di Vnetta indicano che la reazione procede verso sinistra, quindi verso i reagenti. La vnetta è proporzionale alla [E]T. Bisogna notare che più la reazione avviene in condizioni prossime all’equilibrio tra S e P, più tende a essere lenta, ed è quindi necessario avere una [E]T elevata per farla procedere con una certa vnetta. Equazione di Lineweaver-Burk m (coeff. angolare) = 𝐾𝑀 𝑉𝑚𝑎𝑥 maggiore è la pendenza minore è l’efficienza catalitica Inibizione enzimatica: • Irreversibili: detti inattivatori, si legano irreversibilmente all’enzima. • Reversibili, formano complessi stabilizzati da interazioni deboli con l’enzima, si legano reversibilmente con esso. Ci sono tre tipi di inibizione reversibile: 1. Competitiva 2. Incompetitiva 3. Mista o anche detta non competitiva, come caso particolare. Inibizione competitiva In presenza di inibitore competitivo, l’enzima mostra la stessa Vmax e una Km apparente più alta. 𝐾𝐼 = [𝐸][𝐼] [𝐸𝐼] 𝑉𝐼ù0 = 𝑉𝑀𝑎𝑥[𝑆] 𝛼𝐾𝑀 + [𝑆] 𝛼 = 1 + [𝐼] 𝐾𝐼 Ki è la costante di inibizione del complesso enzima-inibitore             P m S m TP m P cat TS m S cat K P K S PE K k SE K k v ++ − = 1   maxmax M 0 1 S 11 VV K v += 46 Se l’enzima lega l’inibitore non lega più il substrato, o meglio l’inibitore e il substrato competono tra loro per legarsi all’enzima. L’inibitore legandosi sottrae l’enzima al ciclo catalitico rallentando la normale reazione. Dunque, aumentando la concentrazione di inibitore, maggior quantità di enzima complesserà con esso e minore sarà la velocità della reazione con il substrato. Più aumenta la pendenza della retta più diminuisce l’efficienza catalitica; quindi, sempre maggiore è la concentrazione di inibitore, più aumenta  e quindi la Km aumenta, e aumenta proprio del fattore . Inibizione incompetitiva: In presenza di un inibitore incompetitivo l’enzima mostra Km e Vmax apparenti entrambe più basse. Il rapporto Vmax/Km rimane invariato. 𝐾𝐼′ = [𝐸𝑆][𝐼] [𝐸𝑆𝐼] L’inibitore si lega al complesso enzima-substrato, non direttamente all’enzima libero. Solitamente questo tipo di inibizione è frequente nelle reazioni che prevedono l’utilizzo di enzimi aventi più siti attivi per differenti substrati. sono rette parallele che aumentano la loro pendenza all’aumentare della concentrazione di inibitore., quindi, più è bassa la Vmax. 47 Inibizione mista: L’inibitore misto determina l’abbassamento del valore sia di Vmax, sia di Vmax/Km apparenti. 𝐾𝐼 = [𝐸][𝐼] [𝐸𝐼] 𝐾𝐼′ = [𝐸𝑆][𝐼] [𝐸𝑆𝐼] Inibitore si lega sia all’enzima libero sia al complesso enzima-substrato, non è detto che l’inibitore abbia la stessa affinità per entrambi. Le rette presentano un fuoco ma intercette diverse Viene definito Non competitivo, se i valori delle due costanti di inibizione 𝐾𝐼 e 𝐾𝐼′ sono uguali. Sommario degli effetti vari tipi di inibizione sui parametri cinetici Inibizione Vmax Vmax/KM Competitiva nessun effetto diminuisce Incompetitiva diminuisce nessun effetto Mista diminuisce diminuisce Esempi di inibitori enzimatici: I farmaci peptidomimetici anti-AIDS sono inibitori competitivi della proteasi di HIV: sono analoghi degli intermedi e stati di transizione tetraedrici. Sono stati progettati sulla base della struttura tridimensionale della proteasi (rational drug design). Effetto del pH sulle reazioni catalizzate da enzimi Molto spesso, gruppi dell’enzima che partecipano alla catalisi sono gruppi ionizzabili, che devono essere in uno specifico stato (ionizzato o non ionizzato) per agire come gruppi catalitici. Ogni enzima ha un valore di pH specifico. 50 Struttura tridimensionale della chimotripsina: la struttura secondaria è prevalentemente  la struttura terziaria è formata da 2 domini a barile  antiparallelo e il sito attivo è un solco all’interfaccia tra i due domini. In tutte le serine idrolasi c’è la triade catalitica (His, Asp Ser) La triade catalitica è costituita dai tre residui più direttamente implicati nella catalisi dell’idrolisi del legame peptidico del substrato. I tre residui sono distanti nella catena (come si vede da immagine) ma sono vicini nello spazio nella struttura terziaria, tridimensionale, e formano tra di loro 2 legami H. La rete di legami idrogeno rende il gruppo ossidrilico della Ser particolarmente reattivo come nucleofilo. Nella chimotripsina la catena è divisa in due parti e ci sono molti legami di solfuro, ponti di solfuro. La tasca di specificità: Cavità del sito attivo che accoglie la catena laterale del residuo Rn-1 del substrato. Determina la specificità della proteasi, la selettività dell’enzima. Nella chimotripsina la tasca è idrofobica, per via dell’effetto idrofobico favorisce il mantenimento del residuo Rn-1. Nelle proteasi a serina: controlla quale porzione di catena polipeptidica substrato viene legata nel sito attivo della proteasi e quindi quale legame peptidico può essere idrolizzato. La tripsina: ha una carica negativa sul carbossilato La tasca dell’elastasi è invece, una piccola cavità polare. 51 Meccanismo catalitico dell’idrolisi del legame peptidico: meccanismi elementari di catalisi: acido-base e covalente. Il meccanismo prevede un intermedio acil- enzima relativamente stabile. 52 Ruolo del legame preferenziale dello stato di transizione nel meccanismo catalitico della chimotripsina: cavità dell’ossianione Gruppi funzionali (gruppi peptidici) rivolti verso la cavità dell’ossianione legano in modo selettivo gli stati di transizione tetraedrici (che presentano il gruppo ossianionico). 55 Se viene utilizzata la tecnica dell’accoppiamento c’è bisogno di speciali biomolecole chiamate: Trasportatori di energia. Tipicamente, nelle reazioni metaboliche i trasferimenti di energia sono realizzati attraverso il trasferimento di gruppi fosforici (o, più propriamente, gruppi fosfato). Molti composti fosforici hanno elevate energie libere di idrolisi. Esempi di composti fosforici ad alto contenuto di energia libera: • Fosfoenolpiruvato (PEP) • Fosfocreatina (CP) • Adenosina trifosfato (ATP) I composti fosforici hanno G di idrolisi fortemente negative, i legami che vengono scissi di questi composti sono legami fosfoestere o fosfoanidride. Idrolisi dell’ATP Legami fosfoanidridici dell’ATP (gruppi fosfato  e ): sono quelli che vengono scissi nelle normali reazioni metaboliche. L’elevata energia libera di idrolisi è determinata dai seguenti fattori: • Stabilità per risonanza del fosfato liberato • Maggior idratazione dei prodotti di idrolisi • Viene meno la repulsione elettrostatica trai gruppi fosfato legati • Rilascio di protoni in soluzione tampone, in prossimità della neutralità 56 Il fosfato libero (fosfato inorganico), detto anche ortofosfato HPO4 2- (Pi, fosfato inorganico), è un ibrido di risonanza tra diverse strutture limite. Gli elettroni del legame  sono delocalizzati. La stabilizzazione per risonanza è meno marcata quando il gruppo fosfato è legato ad altri gruppi. di seguito anche altre strutture di risonanza di altri prodotti di idrolisi di composti fosforici ad alta energia libera. Piruvato Creatina La defosforilazione di alcuni composti fosforici ad alta energia (nell’esempio fosfoenolpiruvato e fosfocreatina) è resa fortemente esoergonica anche dalla stabilizzazione per risonanza dell’altro prodotto. Fosforilazione: reazione trasferimento di un gruppo fosforico da un composto a un altro. Il potenziale di trasferimento del gruppo fosfato di un composto fosforico è definito come il -∆G’° della sua idrolisi. Esso indica se un certo composto piò fosforilarne un certo altro in condizioni standard. Esempio di fosforilazione ATP  ADP + Pi G’°= -31 kJ/mol Glucosio + Pi  Glucosio-6-fosfato G’°= +14 kJ/mol Glucosio + ATP  Glucosio-6-fosfato +ADP G’°= -17 kJ/mol Gli enzimi che catalizzano reazioni di fosforilazione (classe delle transferasi) in cui l’ATP funge da donatore di gruppo fosforico sono detti chinasi. 57 L’ATP è il mezzo di scambio tra processi che liberano e processi che richiedono energia, esso ha un potenziale di trasferimento del fosfato intermedio tra i composti fosforici ad alta energia. Esistono composti fosforici che possono trasferire il proprio gruppo fosfato all’ADP formando ATP. Modalità fisiologiche di idrolisi dell’ATP L’ATP può anche essere scisso a dare AMP con la scissione complessiva di 2 legami fosfoanidridici “ad alta energia”: ATP  ADP + Pi ATP  AMP + PPi ATP  AMP + PPi G’° = -31 kJ/mol PPi  2Pi G’° = -31 kJ/mol ATP  AMP + 2Pi G’° = -62 kJ/mol L’idrolisi del PPi è catalizzata dall’enzima pirofosfatasi, mentre l’enzima adenilato chinasi permette poi la conversione dell’AMP in ADP. ATP + AMP  2ADP Quindi: ATP  AMP + 2Pi equivale a 2ATP  2ADP + 2Pi. Così facendo si utilizza AMP prodotto per sintetizzare ADP che successivamente verrà riconvertito in ATP. In particolare, ATP viene rigenerato dal metabolismo energetico attraverso la fosforilazione dell’ADP catalizzata dall’enzima ATP sintasi. In condizioni fisiologiche il ∆𝐺 di idrolisi dell’ATP può essere molto differente dal suo ∆𝐺°. • Temperatura differente dai 25°C • pH non neutro, differente da pH = 7 • presenza di Mg++ → che interagisce con i gruppi fosfato • concentrazioni di ATP, ADP, Pi diverse da quelle standard. Le concentrazioni fisiologiche di ATP, ADP e Pi sono circa 8, 1, e 8 mM. In queste condizioni, e a 37 °C il G’ di idrolisi dell’ATP a ADP e Pi è pari a –49 kJ/mol. Alcuni processi biosintetici utilizzano come fonte di energia libera nucleotidi trifosfati (NTP) diversi dall’ATP, come per esempio il GTP o l’UTP. La nucleoside difosfato chinasi (aspecifica, cioè attiva sui vari nucleosidi difosfato) catalizza la rigenerazione di questi nucleosidi trifosfati: ATP + NDP  ADP + NTP Come visto prima, l’adenilato chinasi permette la conversione dell’AMP in ADP: ATP + AMP  2ADP Esistono analoghe chinasi ATP-dipendenti (nucleoside monofosfato chinasi) specifiche per ciascuno degli altri NMP: ATP + NMP  ADP + NDP La carica energetica degli adenilati: detta anche carica energetica essa misura il contenuto in legami fosfoanidridici ad alta energia del sistema ATP/ADP/AMP, è un valore che è sempre compreso tra 0 e 1.          AMPADPATP ADP 2 1 ATP _ ++ + =energeticacarica [ATP] + [ADP] + [AMP] = adenilati totali 60 Ruolo del gruppo carbonilico nella formazione e nella rottura del legame C-C Il gruppo carbonilico è: (a) polarizzato: contiene un C povero di elettroni e quindi elettrofilo; (b) è in grado di stabilizzare una carica negativa (carbanione) in posizione . (c) Esempi: i) condensazione aldolica, ii) condensazione di Claisen, iii) decarbossilazione di un -cheto acido. Nel metabolismo, è frequente il coinvolgimento di un gruppo elettrofilo come carbonile o doppio legame C=C in questo tipo di reazioni. Gli stati di ossidazione del carbonio Molte reazioni metaboliche sono reazioni di ossidoriduzione. Le più comuni di esse comportano il cambiamento dello stato di ossidazione del carbonio. Nei metaboliti gli atomi di carbonio possono assumere molti possibili stati di ossidazione (qualsiasi numero di ossidazione compreso tra +4 e -4). Le più comuni ossidazioni biologiche comportano un aumento del numero dei legami che gli atomi di C formano con quelli di O. Le vie metaboliche Esse sono: serie di reazioni successive, tutte catalizzate da enzimi, che a partire da specifici reagenti producono specifici prodotti. I reagenti intermedi prodotti nelle vie metaboliche sono detti metaboliti. Possono essere: • Lineari • Ramificate • Cicliche Le vie metaboliche sono tra loro interconnesse. Nel corso di una via metabolica, in ogni passaggio avviene una piccola modificazione chimica del metabolita. 61 Le reazioni metaboliche sono caratterizzate da piccole variazioni di energia libera, ∆𝐺′° ma elevate energie di attivazione ∆𝐺 + +:richiedono quindi la catalisi da parte di enzimi per poter avvenire ad una velocità adeguata a basse temperature. Ciò garantisce che nel metabolismo avvengono esclusivamente determinate reazioni, quelle catalizzate da enzimi. Inoltre, gli enzimi per mettono la regolazione, fornendo punti di controllo metabolico e l’accoppiamento tra reazioni. Le vie cataboliche e anaboliche sono tra loro in relazione. ATP e NAD(P)H sono generati dal catabolismo e consumati dall’anabolismo. • Vie cataboliche: sono convergenti, partono da un gran numero di sostanze complesse differenti (carboidrati, lipidi, proteine) e portano alla formazione di pochi prodotti semplici. • Vie anaboliche: sono divergenti, i prodotti del catabolismo sono usati come materiali di partenza per generare molti prodotti complessi. Intermedio comune centrale tra catabolismo e anabolismo è la forma attivata dell’acetato, l’acetil-CoA. Catabolismo: quadro generale Nel catabolismo aerobico la degradazione di molti composti fornisce acetil-CoA, che viene ossidato in una via ossidativa centrale, il ciclo dell’acido citrico. I trasportatori di elettroni ridotti nel processo (NADH, FADH2) sono riossidati dall’ossigeno nel processo della fosforilazione ossidativa, con sintesi di ATP. Negli eucarioti le vie metaboliche hanno in genere una localizzazione subcellulare specifica. La compartimentazione implica l’esistenza di sistemi di trasporto di metaboliti. Ad esempio: Fegato: sintesi del glucosio, sintesi dei triacilgliceroli, sintesi, immagazzinamento, e mobilizzazione del glicogeno; Tessuto adiposo: immagazzinamento e idrolisi dei triacilgliceroli. 62 Nelle vie metaboliche i vari metaboliti si trovano in genere in condizioni di stato stazionario: la velocità netta delle varie reazioni successive di una via è la stessa, e quindi la concentrazione dei vari metaboliti si mantiene costante nel tempo. Nelle vie metaboliche ci sono due tipi di passaggio: in una via metabolica ci sono 2 tipi di reazioni: • Passaggi nei quali l’enzima è presente in eccesso, che avvengono in condizioni vicine all’equilibrio → reversibili • Passaggi per i quali l’enzima è limitante che avvengono in condizioni lontane dall’equilibrio → passaggi irreversibili. Ogni via metabolica possiede una o più reazioni che avvengono in condizioni lontane dall’equilibrio (con G’ molto negativo). Questi passaggi sono dette tappe di comando della via. Le tappe di comando sono i passaggi limitanti della via metabolica, che la rendono irreversibile. Proprio quest’ultime sono sottoposte a regolazione. Nelle tappe di comando l’attività enzimatica (catalitica) è il fattore limitante della velocità della reazione. Di solito una tappa di comando è posta all’inizio della via metabolica. Questo rende il primo passaggio irreversibile. La regolazione delle vie metaboliche avviene in gran parte nei punti di controllo, ovvero regolando le tappe di comando, regolando gli enzimi che le catalizzano. 2 principali tipi di regolazione: • Regolazione allosterica: enzimi allosterici, inibizione e attivazione allosterica → risponde allo stato della singola cellula. • Regolazione mediante modificazione covalente dell’enzima: come fosforilazione o proteolisi (reversibile e irreversibile) → risponde alle esigenze dell’intero organismo ed è mediata da ormoni. I CARBOIDRATI Detti: zuccheri, Saccaridi o Glicidi Sono la classe di biomolecole più abbondanti in natura. Il glucosio, un monosaccaride, ha un ruolo centrale nel metabolismo intermedio di tutti gli organismi. La formula bruta di un monosaccaride: (C·H2O)n n  3 • Monosaccaridi: zuccheri monomerici • Polisaccaridi: polimeri di unità monosaccaridiche → non sono macromolecole informazionali poiché la loro sequenza non è specificata direttamente dai geni. Funzioni biologiche: • Metaboliti di processi catabolici e anabolici • Riserva energetica → sotto forma di glicogeno (animali), amido (piante) • Supporto strutturale → cellulosa e chitina • Componenti di biomolecole fondamentali (p. es. glicoproteine) • Riconoscimento molecolare e cellulare (p. es. glicolipidi e glicoproteine) Nel linguaggio comune si distinguono: • Zuccheri semplici: monosaccaridi e disaccaridi • Carboidrati complessi: amido, glicogeno.. • Fibra vegetale: cellulosa pectina.. → sono i carboidrati non digeribili 65 Gli anelli più stabili formati dai monosaccaridi sono a 5 e 6 atomi. Anelli più grandi si osservano di rado. Negli anelli più piccoli i legami sono sottoposti a tensione. Un monosaccaride a struttura ciclica con anello a 6 atomi è detto piranosio. Un monosaccaride a struttura ciclica con anello a 5 atomi è detto furanosio Proiezioni di Haworth Nella proiezione di Haworth, si immagina di vedere l’anello in prospettiva, con i gruppi legati agli atomi di carbonio dell’anello disposti sopra e sotto il piano dell’anello. Relazione tra proiezioni di Fischer e Haworth: Pr. di Fischer: -OH a destra → Pr. di Haworth: -OH sotto Anomeri Per effetto della ciclizzazione, anche il carbonio carbonilico, detto carbonio anomerico, diventa chirale, ammettendo due possibili configurazioni. I due stereoisomeri che differiscono per la configurazione del C anomerico sono detti anomeri. Anomero : -OH sul lato opposto a quello su cui si trova il gruppo –CH2OH legato al centro chirale a lui più lontano. P. di Haworth: -OH sotto nella serie D. P. di Fischer: -OH a destra nella serie D. Anomero : -OH sullo stesso lato di quello su cui si trova il gruppo –CH2OH legato al centro chirale a lui più lontano. P. di Haworth: -OH sopra nella serie D. P. di Fischer: -OH a sinistra nella serie D. (il carbonio anomerico in un monosaccaride è l’unico a cui sono legati di O) I conformeri: interconversione che non comporta la rottura o formazione di legami. Conformeri differenti non sono sostanze differenti. 66 Vari tipi di stereoisomeria presente nei monosaccaridi I derivati dei monosaccaridi • Esteri fosforici di zuccheri • Acidi aldonici • Acidi uronici • Alditoli • Deossizuccheri • Aminozuccheri • Glicosidi 67 Esteri fosforici di monosaccaridi Prodotti di esterificazione tra acido fosforico (gruppo fosfato) e uno o più gruppi ossidrilici del monosaccaride. Sono acidi piuttosto forti, ionizzati a pH fisiologico. Hanno alte energie libere di idrolisi: sono forme attivate di monosaccaridi Acidi aldonici e loro lattoni Gli acidi aldonici sono prodotti di ossidazione di aldosi, il cui gruppo aldeidico è ossidato a gruppo carbossilico. I chetosi non possono dare derivati aldonici diretti. Il loro nome deriva da quello dell’aldoso, aggiungendo alla radice il suffisso –onico (Es. glucosio, acido gluconico). Gli acidi aldonici, come i corrispondenti aldosi, possono esistere in forma ciclica. La ciclizzazione di un acido aldonico genera un lattone (estere ciclico). (Es. acido gluconico, -gluconolattone.) Deossizuccheri: essi derivano dai corrispondenti monosaccaridi per sostituzione di un gruppo ossidrilico con un atomo di idrogeno. Il più importante è il -2-deossiribosio. 70 Polisaccaridi: essi possono essere sia a catena lineare che ramificata la polarità dei polisaccaridi: Gli zuccheri con atomi di carbonio anomerici non coinvolti in legami glicosidici sono detti zuccheri riducenti. Le catene polisaccaridiche lineari possono avere una polarità conferita dalla polarità del legame glicosidico (che in un polisaccaride regolare con n>2 unisce un C anomerico con l’O di un C non anomerico). Le catene polisaccaridiche hanno estremità riducenti (gruppo carbonilico libero, perché non impegnato in un legame glicosidico) e estremità non-riducenti. La sequenza dei polisaccaridi (struttura primaria) viene indicata a partire dall’estremità non-riducente. Polisaccaridi di riserva • Amido: polisaccaride di riserva delle piante. È costituito da amilosio (polimero lineare) e amilopectina (polimero ramificato) • Glicogeno: polisaccaride di riserva di animali e microorganismi, è un polimero ramificato Entrambi sono presenti nelle cellule sotto forma di granuli insolubili Amilosio, amilopectina e glicogeno sono tutti omopolimeri di -glucopiranosio. I polimeri del glucosio sono detti Glucani. Amilosio: polimero lineare (1→4) di Glc L’amilosio tende ad assume una struttura secondaria regolare ad elica sinistrorsa con 6 residui per giro. La geometria del legame (1→4) glicosidico tende a far assumere alle catene polisaccaridiche una conformazione elicoidale. Glucani ramificati: amilopectina e glicogeno: Amilopectina e glicogeno, oltre a legami (1→4) glicosidici, presentano anche alcuni legami (1→6) glicosidici che costituiscono punti di ramificazione. • Glicogeno: 1 punto di ramificazione ogni 8 residui. • Amilopectina: 1 punto di ramificazione ogni 10-20 residui. 71 La cellulosa: è un omopolimero lineare costituito da unità glucosio (β-glucopiranosio) (è anch’essa un glucano) unite da legami (1→4) glicosidici. Il legame (1→4) glicosidico tende a far assumere alle molecole polisaccaridiche una conformazione estesa. L’immagine riporta catene estese di cellulosa, dove si associano lateralmente a dare foglietti che si impilano tra loro. Le molecole di cellulosa tendono quindi a avere una conformazione a nastro piatto → fibre naturali Legami (1→4) e (1→4) glicosidici Cellulosa e amilosio: una piccola differenza strutturale del residuo di glucosio comporta una grande differenze nelle proprietà dei polimeri risultanti. LA GLICOLISI Via catabolica che degrada il glucosio a piruvato con la produzione di ATP a partire da ADP e Pi e riduzione di NAD+ a NADH. La principale funzione fisiologica della glicolisi è la produzione di ATP. Nelle cellule eucariotiche essa è localizzata nel citosol. E’ la via catabolica in cui zuccheri a 6 atomi di C sono scissi (glico-lisi) a dare composti a 3 atomi di C con concomitante produzione di ATP e NADH. E’ una via ubiquitaria, e quindi evolutivamente antichissima. E’ comparsa precocemente nell’evoluzione: esisteva probabilmente già 3.5 miliardi di anni fa. Negli anaerobi la glicolisi avviene senza ossidazione netta del substrato (è cioè una fermentazione). Molti anaerobi dipendono esclusivamente da essa per il loro fabbisogno energetico (ATP). 72 Negli aerobi la glicolisi è solo la parte iniziale di un processo degradativo più ampio per la produzione di ATP, che alla fine porta alla completa ossidazione del substrato con l’impiego di O2 come ossidante. Negli animali il substrato diretto per la glicolisi è il glucosio, che può provenire da: • Idrolisi di carboidrati assunti mediante l’alimentazione • Degradazione dei polisaccaridi di riserva, come glicogeno. • Prodotto da metaboliti non glicidici attraverso gluconeogenesi. Possono però essere utilizzati, degradati nella glicolisi anche altri monosaccaridi differenti dal glucosio, questo viene fatto trasformandoli o in glucosio o in intermedi della glicolisi. La glicolisi produce infatti intermedi utilizzati da vie biosintetiche. Ha quindi una valenza anabolica. È infatti, la via centrale nel metabolismo di tutti gli organismi viventi. La glicolisi converte una molecola di glucosio in due molecole di piruvato in 10 passaggi. Glicolisi negli anaerobi Il bilancio netto: Glucosio → 2 Piruvato 2 ADP + 2Pi → 2 ATP 2 NAD+ → 2 NADH Affinché la glicolisi possa procedere è necessario riconvertire il NADH in NAD+. • Gli aerobi riossidano il NADH nel processo della fosforilazione ossidativa con produzione di ulteriore ATP. • Gli anaerobi possono ossidare il NADH riducendo vari substrati ottenuti dall’ambiente. Il modo più semplice per rigenerare il NAD+ è di ridurre il piruvato prodotto dalla glicolisi a lattato (batteri lattici e glicolisi anaerobica nei vertebrati). 75 Reazione numero 2: isomerizzazione dello zucchero-fosfato. Isomerizzazione del glucosio-6-fosfato (aldopiranoso) → a fruttosio-6-fosfato (chetopiranoso) Catalizzatore: fosfoglucoisomerasi o fosfoesoso isomerasi (EC 5.3.1.9) appartiene alle isomerasi. Reazione reversibile, avviene vicino all’equilibrio ∆𝐺′° = 1.7 kJ/mol L’isomerizzazione è indispensabile perché è necessario che alla fine di tutti il processo si formino due molecole da 3 atomi di carbonio. Nel fruttosio si riesce a formare il gruppo carbonilico nella corretta posizione affinché venga scisso successivamente il legame 3-4 carbonilico. Reazione 3: fosforilazione ATP dipendente Fosforilaione ATP dipendente del fruttosio-6-fosfato → a dare fruttosio-1,6-bisfosfato Catalizzatore: fosfofruttochinasi (PKF) (EC 2.7.1.11) classe delle transferasi, è un enzima allosterico risponde quindi a effettori eterotropici. Reazione irreversibile, avviene in condizioni lontane dall’equilibrio ∆𝐺′° = -14.2 kJ/mol Reazione 4: scissione dell’esoso in due triosi Scissione dell’fruttosio1,6-bisfosfato (chetoesoso) → in diidrossiacetone fosfato (chetotrioso) e gliceraldeide-3-fosfato. Catalizzatore: aldolasi (EC 4.1.2.13) classe delle liasi. Reazione reversibile, avviene in condizioni vicine all’equilibrio ∆𝐺′° = 23.8 kJ/mol La reazione è l’inverso della reazione di condensazione aldolica, da notare è la forte endoergonicità della reazione in condizione standard, che però viene trascinata dai passaggi fortemente esoergonici della via. 76 Il meccanismo catalitico dell’aldolasi: la scissione avviene sulla forma aperta del substrato mediante catalisi covalente (basi di Schiff) e catalisi acido base. La base di Schiff protonata agisce da contenitore (sink) di elettroni, stabilizzando stati di transizione altrimenti fortemente destabilizzati dall'accumulo di carica negativa. Reazione 5: isomerizzazione del chetorioso in aldotrioso Isomerizzazione del diidrossiacetone fosfato→ in gliceraldeide-3-fosfato Catalizzatore: trioso fosfato isomerasi (TIM) (EC 5.3.1.1) Reazione reversibile, avviene in condizioni vicine all’equilibrio ∆𝐺′° = 7.5 kJ/mol 77 Seconda fase: essa è costituita da 5 reazioni e partendo da gliceraldeide 3-fosfato arriva a dare piruvato. I 2 gruppi fosfato provenienti dall’ATP introdotti nell’esoso nella prima fase vengono entrambi recuperati nella seconda, sotto forma di ATP, nell’ultimo passaggio della glicolisi. Nella seconda fase, un gruppo fosfato viene introdotto in un intermedio 3 atomi di carbonio (a dare bisfosfoglicerato) a partire da fosfato inorganico (ortofosfato). Anche questi 2 ulteriori gruppi fosfato (2 mol per 1 mol di glucosio) vengono trasferiti all’ADP a dare ATP. Reazione 6: produzione del primo composto ad alto potenziale di trasferimento del fosfato Ossidazione da gliceraldeide-3-fosfato → in 1,3-bisfosfato da parte del NAD+ Catalizzatore: gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12) classe delle ossidoriduttasi. Reazione reversibile, avviene in condizioni vicine all’equilibrio ∆𝐺′° = 6.3 kJ/mol L’acido glicerico è un acido aldonico: prodotti di ossidazione di un aldoso. Si forma un legame fosfoandiridico che ha un elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosfato, in quanto ha un’energia libera di idrolisi molto negativa. L’accoppiamento tra ossidazione e fosforilazione Gliceraldeide-3-fosfato → 3-fosfoglicerato G’° << 0 3-fosfoglicerato + Pi → 1,3-bisfosfoglicerato G’° >> 0 La reazione consiste in una ossidazione e in una fosforilazione tra loro accoppiate. L’ossidazione del gruppo aldeidico (esoergonica) è accoppiata alla formazione del legame fosfoanidridico (endoergonica). In altre parole, parte dell’energia libera resa disponibile dalla ossidazione del gruppo aldeidico a viene conservata sotto forma di anidride mista. Nell’insieme, la reazione è leggermente endoergonica in condizioni standard: G’° +6.3 kJ/mol. 80 Scomposizione della reazione di idrolisi del PEP in due semireazioni La maggior parte dell’alto potenziale di trasferimento del fosfato del PEP deriva dalla tautomerizzazione del piruvato dalla forma enolica a quella chetonica, che può avvenire solo dopo il rilascio del gruppo fosfato che libera il gruppo ossidrilico. Somma delle 10 reazioni della glicolisi 81 Bilancio della glicolisi Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi → 2Piruvato + 2NADH + 2H+ + 2 ATP + 2H2O ATP: per ogni mole di glucosio vengono consumate 2 mol di ATP nella prima fase e vengono prodotte 4 mol ATP nella seconda fase. Bilancio netto: 2 mol ATP. NADH: l’ossidazione di 1 mol glucosio a 2 mol piruvato (4 e-) è accompagnata dalla riduzione di 2 mol di NAD+. In cellule aerobiche, il NADH (E0’ = -0.32 V) può essere riossidato dall’O2 nella fosforilazione ossidativa con produzione di 2.5 mol ATP per mole di NADH. In cellule anaerobiche il NADH deve essere riossidato da altri ossidanti. Piruvato: In cellule aerobiche, il piruvato può essere ossidato a CO2 e H2O nel ciclo dell’acido citrico con produzione di ulteriore ATP. In cellule anaerobiche, il piruvato può essere ridotto per rigenerare NAD+. Destini metabolici del piruvato • Condizioni aerobiche: conversione in acetil-CoA e quindi in CO2 e H2O • Condizioni anaboliche: fermentazioni per riossidare il NADH per poter rifare la glicolisi. o Conversione in lattato o Conversione in etanolo Scopo principale delle fermentazioni è quindi quello di rigenerare il NAD+. Fermentazione lattica e alcolica: i destini del piruvato La conversione del piruvato in lattato avviene in un solo passaggio. La conversione del piruvato in etanolo avviene in due passaggi. 82 Fermentazione omolattica: Nei batteri lattici e nel muscolo dei vertebrati esiste l’enzima lattato deidrogenasi. La reazione catalizzata avviene in condizioni vicine all’equilibrio. È detta omolattica per distinguerla dalla eterolattica. La reazione catalizzata dalla lattato deidrogenasi consiste nel trasferimento di uno ione idruro (H-) dal NADH al C2 (carbonile) del piruvato. NAD e NADP scambiano sempre coppie di elettroni associate a un protone nella forma di ione idruro (H-). Fermentazione alcoolica in lievito La conversione del piruvato in etanolo e CO2 in lievito avviene in due passaggi, catalizzati da piruvato decarbossilasi e alcol deidrogenasi. Meccanismo catalitico della piruvato decarbossilasi Esso catalizza una reazione di decarbossilazione di un -chetoacido. Lo stato di transizione è instabile per l’accumulo di carica negativa sul carbonio carbonilico. L’enzima utilizza tiamina pirofosfato (TPP) come cofattore (gruppo prostetico), che stabilizza lo stato di transizione (attraverso un meccanismo di catalisi covalente) fungendo da contenitore di elettroni. La TPP è il coenzima più usato nella decarbossilazione di -chetoacidi. 85 Quadro di ingresso nella glicolisi di vari carboidrati Nel fegato, il fruttosio è convertito rapidamente in GAP attraverso una via speciale, che non subisce regolazione a livello dei primi passaggi come la glicolisi → PFK Catabolismo dei polisaccaridi: amido e glicogeno • Amido: idrolisi • Glicogeno: riserva energetica localizzata nel fegato e nei muscoli, mobilitazione delle riserve energetiche mediante fosforolisi. Ci sono 2 tipi di reazione di degradazione dei polisaccaridi: 1. Idrolisi → enzima idrolasi 2. Fosforolisi → enzima fosforoliasi I due meccanismi sono differenti anche da un punto di vista bioenergetico. Nella fosforolisi l’energia libera del legame glicosidico viene conservata sotto forma di estere fosforico. - La digestione (extracellulare) dei polisaccaridi avviene mediante idrolisi catalizzata da alcune endoglicosidasi. - La mobilitazione (intracellulare) del glicogeno avviene mediante fosforolisi. 86 La mobilitazione del glicogeno: Le principali riserve di glicogeno sono localizzate prevalentemente in: • Fegato: che fornisce glucosio agli altri tessuti. • Muscolo: che utilizza glucosio per le proprie esigenze. La mobilizzazione del glicogeno avviene per scissione fosforolitica sequenziale, a partire dalle estremità non riducenti delle catene, dei legami (1→4) glicosidici catalizzata dalla glicogeno fosforilasi, una esoglicosidasi (e da un enzima deramificante). La fosfoglucomutasi: isomerizzazione del glucosio-1-fosfato in → glucosio-6-fosfato Il meccanismo è molto simile a quello catalizzato dalla fosfoglicerato mutasi. Gli zuccheri fosfati non possono attraversare la membrana. Nel fegato esiste anche una glucosio-6-fosfatasi che idrolizza il G6P a dare glucosio che, a differenza degli zuccheri fosforilati, può uscire dalla cellula (grazie ad uno specifico trasportatore) ed essere immesso nella circolazione sanguigna. G’= +  kJmol 87 DECARBOSSILAZIONE OSSIDATIVA DEL PIRUVATO E CICLO DELL’ACIDO CITRICO (CICLO DI KREBS) Rappresenta una via catabolica centrale nel metabolismo aerobico. Di fatti nelle cellule aerobiche, il ciclo dell’acido citrico rappresenta la via centrale comune per la degradazione ossidativa di tutti i nutrienti energetici (carboidrati, lipidi e proteine). Il catabolismo aerobico: Dal punto di vista biochimico, la respirazione è, per gli organismi organotrofi, l’ossidazione da parte dell’O2 di nutrienti organici (i combusibili metabolici). Negli eucarioti, la respirazione cellulare ha sede nel mitocondrio. Il processo di respirazione cellulare può essere diviso in 3 stadi: 1. Generazione di acetil-CoA→ forma attivata del gruppo acetile, composto da 2 atomi di C 2. Ossidazione del gruppo acetile dell’acetil-CoA nel ciclo dell’acido citrico. In questa fase si ha produzione di CO2 e di trasportatori ridotti di elettroni (NADH, FADH2). 3. Ossidazione da parte dell’O2 dei trasportatori ridotti di elettroni nel processo di trasporto elettronico accoppiato alla sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa) Il piruvato prodotto dalla glicolisi viene convertito in CO2 attraverso 3 decarbossilazioni ossidative. 90 Gruppo nicotinamidico ossidato e ridotto La tiamina pirofosfato → TPP L’anello tiazolico è la porzione del cofattore coinvolta nella catalisi. Il C in posizione 2 – tra gli atomi elettronegativi di N e S – è acido (tende a cedere H+): il C2 si comporta quindi da nucleofilo. La TPP è il coenzima anche della piruvato decarbossilasi di lievito, che partecipa alla fermentazione alcoolica. Il TPP è un trasportatore di gruppi aldeidici attivati. 91 Acido lipoico e lipoammide La lipoammide (che esiste in 2 forme, ossidata e ridotta) è un trasportatore sia di gruppi acile (come tioestere) sia di elettroni (una coppia di elettroni). Ossidazione concomitante al trasferimento del gruppo idrossietile Il gruppo idrossietilico (forma attivata di acetaldeide), nel trasferimento al gruppo disolfuro della lipoammide (forma ossidata), viene contemporaneamente ossidato (2e-) a gruppo acetile (formando un gruppo tioestere: forma attivata di acetato). L’ossidazione del gruppo aldeidico è accompagnata alla riduzione della lipoammide da disolfuro a ditiolo. Nucleotidi flavinici: FMN e FAD Sono trasportatori bielettronici, ma possono scambiare anche singoli elettroni. 92 Coenzima A Il coenzima A è un derivato dell’ADP: è un trasportatore di gruppi acile attivati. La porzione attiva del CoA è il gruppo tiolico. L’acetil-CoA contiene un gruppo tioestere. L’idrolisi di un tioestere è fortemente esoergonica. L’acil-CoA ha un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acile. I tioesteri sono meno stabili degli esteri perché non sono stabilizzati per risonanza (l’ossigeno è più elettronegativo dello zolfo). Il meccanismo di reazione del complesso della piruvato deidrogenasi 95 Il gruppo –OH è ossidato a gruppo chetonico, a cui segue la decarbossilazione del gruppo carbossilico centrale. Il gruppo carbonilico in posizione  facilita la decarbossilazione. Reazione 4: seconda decarbossilazione Decarbossilazione ossidativa dell’-chetoglutarato → succinil-CoA Catalizzatore: complesso della -chetoglutarato deidrogenasi, complesso multienzimatico simile allla piruvato deidrogenasi. Coenzimi coinvolti: TPP, NAD, lipoammide, FAD, CoA. Reazione fortemente esoergonica: ∆𝐺′° = -33.5 kJ/mol Parte dell’energia libera resa disponibile della decarbossilazione ossidativa è «conservata» sotto forma di gruppo tioestere del succinil-CoA. Reazione 5: fosforilazione a livello del substrato Idrolisi del succinil-CoA → succinato accoppiata alla sintesi di GTP (fosforilazione a livello del substrato) Catalizzatore: succinil-CoA sintetasi Nel fegato e nel rene, la reazione è GDP-dipendente, mentre nel muscolo e nel cervello è ADP-dipendente. In ogni caso, il GTP può trasferire il gruppo -fosforico all’ADP generando ATP (enzima: nucleoside difosfato chinasi): la sintesi di GTP è quindi metabolicamente equivalente alla sintesi di ATP, come indicato dal nome dell’enzima, una sintetasi. Meccanismo catalitico della succinil-CoA sintetasi L’enzima accoppia l’idrolisi del gruppo tioestere alla fosforilazione del nucleoside difosfato grazie al meccanismo di catalisi covalente, che prevede la formazione di un residuo fosfo-istidina nel sito attivo. 96 Reazione 6: deidrogenazione flavina dipendente Prima delle tre tappe che rigenerano l’ossalacetato. Deidrogenazione FAD-dipendente succinato → fumarato Catalizzatore: complesso della succinato deidrogenasi L’ossidante (gruppo prostetico) per introdurre il doppio legame è il FAD, che ha (in genere) un E0’ più alto di quello del NAD+. La reazione è stereospecifica. Si forma fumarato (configurazione trans, e non il suo stereoisomero cis, il maleato). Essendo la succinato deidrogenasi un enzima di membrana non fa uso del NAD+. Reazione 7: idratazione di un doppio legame C=C Trasformazione del fumarato → L-malato (idratazione) Catalizzatore: fumarato idratasi detta fumarasi appartenente alla classe delle liasi Reazione 8: deidrogenazione che rigenera l’ossalacetato Deidrogenazione dell’L-malato → ossalacetato Catalizzatore malato deidrogenasi L’ossidante è NAD+. Reazione fortemente endoergonica ∆𝐺′° = +29.7 kJ/mol Può procede a destra perché è trascinata dalla successiva reazione catalizzata dalla citrato sintasi. 97 Stechiometria ed energetica del ciclo dell’acido citrico Reazione bilanciata del ciclo Acetil-CoA + 3H2O +3NAD+ + FAD + GDP + Pi → 2CO2 + 3NADH + FADH2 + CoA-SH + GTP Va ricordato che il GTP è energeticamente equivalente all’ATP. La reazione bilanciata complessiva del catabolismo del glucosio attraverso glicolisi + ciclo dell’acido citrico è quindi: Glucosio + 2H2O + 10NAD+ + 2FAD + 4ADP + 4Pi → 6CO2 + 10NADH + 6H+ + 2FADH2 + 4ATP Nello stadio 3 della respirazione cellulare (fosforilazione ossidativa), l’ossidazione di: • 1 mol NADH fornisce 2.5 mol ATP, • 1 mol FADH2 fornisce 1.5 mol ATP. Per 1 mol glucosio ossidato a CO2 si generano quindi complessivamente 32 mol ATP.