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GENETICA MEDICA 1°
Lezione 1, Genetica Medica 1° - 7/11/2018 Prof. Nicoletta Villa La “Genetica” è la scienza che studia: “la variabilità biologica degli organismi viventi. Nel 1903: venne proposto il termine gene. Nel 1906: William Bateson, biologo inglese, introduce il termine genetica: “è la scienza che studia l’ereditarietà e la variazione cercando di scoprire le leggi che governano le somiglianze e le differenze negli individui che sono in rapporto di discendenza”. La genetica si suddivide in tante branche: Genetica umana: variazione ed ereditarietà. Genetica clinica: diagnosi e cura del paziente. Citogenetica: studio dei cromosomi. Genetica medica: studio delle malattie genetiche. Genomica: studio dell’organizzazione e della funzione del genoma. Genetica molecolare: studio della struttura e della funzione dei geni. Genetica di popolazione: studio variazione genica e frequenze alleliche. Genetica dello sviluppo: studio dei geni coinvolti nello sviluppo. Genetica: scienza trasversale, interessa tutte le aree di specializzazione medica. Nel 1900 il lavoro di Mendel non fu compreso in quanto non si comprendeva ancora l’eredità genetica. 1° LEGGE DI MENDEL O DELL’UNIFORMITÀ DEGLI IBRIDI Dall’incrocio di 2 individui che differiscono in un carattere per la presenza di alleli diversi, in condizione omozigote si ottengono individui tutti uguali tra loro. Essi potranno manifestare lo stesso carattere di uno dei due genitori (Dominanza) Es.: se unisco 2 piselli, giallo e verde, un carattere domina sull’altro, è chiamato dominanza e si evidenzia solo quest’ultimo. Un carattere intermedio: Se da bianco e rosso ottengo rosa, vi è una dominanza incompleta La contemporanea presenza di due caratteri parentali. Quando si presentano entrambi i caratteri si chiama codominanza.
2° LEGGE DI MENDEL O DELLA SEGREGAZIONE DA DUE IBRIDI
Nell’incrocio tra due ibridi, i gameti si combinano casualmente producendo individui con fenotipo: Di uno dei due genitori (puro) 1 (AA) Uguale ai genitori (ibrido) 2 (Aa) Dell’altro genitore (puro) 1 (aa) 1a I rapporti fenotipici seguono sempre un rapporto di 3: 3° LEGGE DI MENDEL O DELL’INDIPENDENZA L’incrocio di due individui diversi per più caratteri controllati da più coppie di geni dà origine ad una progenie nella quale i caratteri sono distribuiti indipendentemente l’uno dall’altro.
TERMINOLOGIA
Gene: è un tratto di DNA che codifica per una proteina. Allele (A, a): sono forme diverse dello stesso gene. Omozigote Dominante (AA): Omozigote Recessivo (aa): Eterozigote (Aa): Genotipo (es. AA): sono gli alleli (quando parlo di omozigote ed eterozigote). Fenotipo (es. A-): è la manifestazione del genotipo (es. giallo). Ad uno stesso fenotipo possono corrispondere più genotipi.
GRUPPI SANGUIGNI AB0 NELL’UOMO
Esempio di alleli multipli e codominanza Gene sul chr 9 (chr = cromosoma), codifica per antigeni di superficie del globulo rosso. 3 alleli: I A (antigene A), anticorpi anti-B I B (antigene B), anticorpi anti-A i (nessun antigene), anticorpi anti-A e anti-B È importante conoscere le reazioni antigene-anticorpo per le trasfusioni di sangue. Sono 3 alleli diversi che però danno 4 fenotipi diversi IA^ e IB: codominanza I A , I B dominanti su i (allele recessivo)
3A
Per vedere tutte le combinazioni si costruisce il “QUADRATO DI PUNNETT”. In questo caso la mamma produrrà il 50% di gameti (cellule uovo nella donna e spermatozoi nel maschio) con I A (antigene A) e 50% con i (antigene recessivo). Il padre 50% con I B e 50% con i. Da questi gruppi (quindi da eterozigoti) si possono avere tutti e 4 i gruppi sanguigni. IL FATTORE Rh Il fattore Rhesus, antigene di superficie del globulo rosso (dominanza) è importante FENOTIPO GENOTIPO Rh+ (85%) DD Dd Rh- (15%) dd Il gruppo sanguigno MN nell’uomo (codominanza). FENOTIPO GENOTIPO M MM MN MN N NN PROBLEMA 1. Un uomo chiede il divorzio dalla moglie accusandola d’infedeltà. Il primo e il secondo figlio sono di gruppo 0 e AB rispettivamente. Il terzo figlio, che il marito ritiene non suo è di gruppo B. Questi dati sono sufficienti a dar ragione al marito? Non sono sufficienti, guardiamo quindi il sistema MN. Relativamente al sistema MN, il terzo figlio è di gruppo M, mentre il marito è di gruppo N. Che cosa si può concludere da questa ulteriore informazione? Il figlio non è suo perché il figlio non ha lo zigote N del padre. i A o B i A o B NN 0 AB B Lo zero è recessivo quindi “ii” un “i” deriva dalla mamma e uno dal papà Un figlio di gruppo B è possibile perché sarà Bi O la mamma o il papà sono A o B MM
PROBLEMA 2. La Famiglia 1, Madre gruppo AB, padre gruppo 0, all’ospedale è stato attribuito il bambino Alberto di gruppo A, però sostengono che ci sia stato uno scambio con il bambino Giorgio di gruppo 0, con la Famiglia 2, Madre A, Padre 0. In questo caso nessun bambino è stato scambiato in quanto la madre della famiglia 1 è AB e quindi non ha il gene recessivo (i). PROBLEMA 3. Una madre avverte la polizia che il suo bambino è scomparso da una carrozzina lasciata fuori da un negozio. La polizia più tardi chiede di andare ad identificare un bambino, la donna dice che è suo. La madre è gruppo A MN Rh-; il padre è 0 NN Rh+, il bambino è A MM Rh+. Il bambino non è loro in quanto può essere di gruppo A (in quanto la madre è A e il padre è ii, il bambino è A), può essere Rh+ (anche se fosse Rh- potrebbe essere loro in quanto il padre è DD o Dd, la madre dd, quindi in ogni caso era compatibile) ma il gruppo del sistema MN non è lo stesso in quanto il bambino è MM, quindi potrebbe prendere una M dalla madre, ma il padre essendo NN, non può dare un M.
0 AB 0 A
A 0
0 NN Rh+ A MN Rh- A MM Rh+
contenuto genico, la stessa sequenza (attenzione però che sono diversi, tipo alleli ecc). CROMOSOMI Centromero: importante per il movimento dei cromosomi durante la divisione cellulare, divide i cromosomi nel braccio corto (p)(dal francese petite, piccolo) e braccio lungo (q)(perché viene dopo la p). Telomero: estremità di ciascun cromosoma Mantiene l’integrità del cromosoma Consiste di sequenze ripetute TTAAGGG È mantenuto dall’enzima telomerasi Riduzione dell’attività della telomerasi e del numero di basi ripetute è importante nel processo di invecchiamento e morte cellulare. Centromero centrale: metacentrico Centromero intermedio: submetacentrico Centromero sub-terminale: acrocentrico I cromosomi si duplicano prima di ciascuna divisione cellulare per MITOSI. MEIOSI È riscontrabile esclusivamente negli eucarioti a riproduzione sessuata con numero diploide di cromosomi. Determina un dimezzamento del numero di cromosomi e porta alla formazione dei gameti maschili e femminili. I prodotti della meiosi si differenziano dalle cellule parentali sia per l’informazione contenuta nel DNA sia per la quantità di DNA. Solo le cellule germinali compiono la meiosi (ovaio e testicolo).
OVAIO
La sezione di un ovaio dove vi sono i follicoli e i diversi stadi di maturazione. Le cellule germinali sono gli spermatogoni nel testicolo e gli ovogoni nell’ovaio, gli ovogoni si continuano a riprodurre per divisione mitotica, dopodiché le cellule entrano nel processo meiotico (ovocita primario, ovocita secondario e cellula uovo). Gli ovogoni quando nasciamo non ci sono più, quindi la nostra riserva ovarica è quella che abbiamo alla nascita che però è già diminuita quando arriviamo alla pubertà perché molte cellule vanno in apoptosi. Nel testicolo gli spermatogoni ci sono sempre e continuano a moltiplicarsi, quindi la riserva cellulare da cui parte il processo meiotico, nello spermatozoo rimane. Per questo quando una donna esaurisce la riserva ovarica (le cellule uovo) va in menopausa.
Quando siamo un embrione (circa al 5° mese di gravidanza) abbiamo circa 6 milioni di cellule germinali. La maggior parte degenerano tra il 7° e l’8° mese. Alla nascita abbiamo circa 1 milione di oociti primari fermi dopo lo stadio di diplotene (Profase meiosi 1) circondati da cellule follicolari. Alla pubertà (12-15 anni) vi sono circa 200.000 cellule germinali. Il numero di ovociti che maturano dopo il periodo fertile sono circa 400 – 500. Atresia progressiva di follicoli che non sono maturati che si completa alla menopausa (circa 50anni). Il ciclo ovarico è sotto il controllo degli ormoni ipofisari FSH e LH: FSH stimola la produzione di estrogeni, LH provoca la maturazione del follicolo e l’espulsione dell’ovocita. Dopo la fecondazione il corpo luteo inizia a produrre progesterone sotto stimolo da parte dell’LH e successivamente da parte della gonadotropina corionica (beta HCG) secreta dalle cellule del corion embrionale. Cellula uovo vista al microscopio elettronico. La parte più scura è la membrana, all’esterno vi sono tutte le cellule follicolari attorno alla cellula uovo che prende il nome di corona radiata proprio per la loro posizione, poi vi è il 1° globulo polare che è stato espulso. Granulosa: cellule follicolari formano più strati intorno all’ovocita. Follicolo di Graaf: formazione nella granulosa di cavità con liquido (liquor folliculi) ricco di ormoni steroidi estrogeni (estradiolo). Nella cavità sporge l’ovocita circondato da strati di cellule follicolari che formano la corona radiata (cumulo ooforo).
Prima dell’ovulazione l’oocita (fermo in profase meiotica meiosi I) completa la meiosi e si ferma in metafase meiosi II IL TESTICOLO Sezione trasversale di un testicolo. Il processo meiotico maschile è direzionale perché poi gli spermatozoi devono essere riversati nel lume. Attaccati sotto la membrana esterna vi sono gli spermatogoni, spermatocita primario, spermatocita secondario, spermatide e spermatozoi. Oltre alle cellule germinali vi sono le cellule di Sertoli che fungono da supporto e le cellule di Leydig che producono gli ormoni steroidei, tra cui il testosterone, che è fondamentale per la corretta funzione del testicolo. SPERMATOGENESI
- Prima della pubertà le cellule germinali maschili (spermatogoni) si dividono per mitosi.
- Alla pubertà inizia la spermatogenesi: gli spermatogoni si differenziano in spermatociti primari ed entrano nel processo di meiosi.
- 25 giorni: il tempo necessario per passare da 1 spermatocita primario a 4 spermatidi. Che deve entrare poi in un processo di trasformazione morfologica perché da una cellula rotonda deve assumere la tipica forma dello spermatozoo
- 30 giorni: il processo di spermioistiogenesi. (spermatide spermatozoo)
- Testicolo costituito da lunghissimi condotti (tubuli seminiferi). Il tessuto tra i tubuli (tessuto interstiziale) contiene le:
- Cellule di Leydig: che secernono omoni steroidei (testosterone)
- Cellule del Sertoli: che supportano le cellule germinali nel processo di spermatogenesi. La spermatogenesi è un processo continuo. L’ovogenesi è discontinuo.
Dopo la formazione dello zigote si ha:
- Duplicazione DNA e segmentazione: mitosi senza accrescimento del citoplasma.
- 2, 4, 8, 16, blastomerimorula.
- Blastomero: cellula totipotente (gemelli monozigoti).
- Morulablastocisti: vescichetta con all’interno il nodo embrionale.
- Cellule della blastocisti sono pluripotenti.
- Cellule superficiali formano il trofoblasto.
CITOGENETICA
SCIENZA CHE STUDIA I CROMOSOMI
Scienza che studia il comportamento dei cromosomi (che significa corpo colorato, proprio perché condensandosi assumeva un colore più scuro) durante la mitosi e la meiosi, la loro origine e la loro relazione con la trasmissione e ricombinazione dei geni. In particolare, la citogenetica medica si occupa dell’identificazione di anomalie cromosomiche e la loro relazione eziologica e patogenetica con il fenotipo. Come conseguenza si occupa della prognosi del soggetto portatore e dei rischi di ricorrenza nella prole. I cromosomi si formano solo quando la cellula si divide. Cariotipo: il particolare complemento cromosomico di un soggetto o di un gruppo di soggetti correlati tra di loro (specie). Per cariotipizzazione o analisi cromosomica s’intende l’identificazione di ciascun cromosoma presente nel cariotipo (usando metodi diversi). Ne consegue una descrizione, riassunta in una formula definita a livello internazionale (ISCN), delle osservazioni fatte sia che si tratti di cromosomi normali sia anomali. Come riuscirono a contarli? All’inizio utilizzavano una soluzione isotonica, e per questo essendo sovrapposti uno sull’altro non riuscivano a definirli, poi per un errore di laboratorio nel processare queste cellule in coltura si utilizzò una soluzione ipotonica, quindi per osmosi entra il liquido nella cellula che si rigonfia e dopodichè quando la cellula viene processata per avere un preparato, i cromosomi si disperdono e quindi si riescono a contare. Però dalla prima osservazione del 1882, si aspettò il 1950 per poter avere un assetto cromosomico umano ben definito, dato da 46 cromosomi. Nel 1882 Walther Flemming pubblica la prima illustrazione di cromosomi, introduce il termine cromatina e mitosi. Nel 1888 Waldeyer introduce il termine cromosoma (dal greco corpo colorato) e nasce la teoria cromosomica dell’ereditarietà. Nel 1912 von Winiwarter: 47 cromosomi maschili e 48 cromosomi femminili. Nel 1924 Levitsky usa il termine cariotipo per indicare l’assetto cromosomico.
Portatore di anomalia cromosomica bilanciata Precedente anomalia cromosomica in neonato/gravidanza Malformazione eco-evidenziata Parametri ecografici predittivi Test biochimici predittivi (positivi) Diagnosi di sesso fetale per malattia X-linked (solo nei maschi) Altro QUANDO SI FA LA DIAGNOSI POST-NATALE Sospetto di sindrome cromosomica (s. Down, Turner ecc...) Malformazione maggiore isolata Malformazioni multiple Ritardo psicomotorio o mentale (con o senza malformazioni) Sindrome da microdelezione (PW/AS, Williams, di George ecc…) PROBLEMI RIPRODUTTIVI Amenorrea primaria (assenza del ciclo mestruale) Amenorrea secondaria (il ciclo inizia ma dopo un certo periodo (tot di cicli) si ferma) Ipogonadismo (i tessuti germinali sono piccoli, maggiormente i testicoli piuttosto che le ovaie) valutando le gonadotropine FH e SH può far scattare delle analisi cromosomiche. Es.: un ipogonadismo ipergonadotropo, significa che i testicoli son piccoli ma FH e SH sono molto alti, questa condizione è associata alla Sindrome di Klinefelter che è un’anomalia cromosomica nel maschio (47 cromosomi con un cromosoma X in più). Azoospermia (assenza di spermatozoi), oligospermia (pochi spermatozoi), astenozoospermia (si riferisce alla morfologia dei cromosomi), terato-spermia Criptorchidismo bilaterale (quando il bambino nasce, i testicoli sono ritenuti nel canale inguinale o in sede addominale, sindrome di Klinefelter) Anomalie dei genitali Aborto spontaneo (il 50% degli aborti è dovuto ad un’anomalia cromosomica) Nato morto Coppia con fallimento riproduttivo Coppia con figlio con anomalia cromosomica Sterilità 2 a^ lezione, Genetica Medica 1° - 15/11/2018 Prof. Nicoletta Villa
L’ANALISI CROMOSOMICA PREVEDE
Di solito il cariotipo avviene attraverso il prelievo del sangue perché è il tessuto più semplice da prendere. La coltura cellulare L’allestimento del preparato La colorazione La memorizzazione dell’immagine La conta dei cromosomi La ricostruzione del cariotipo La valutazione finale Le cellule del sangue messe in coltura non proliferano perché non sono in attività mitotica (divisione cellulare) (almenochè non vi sia una leucemia e quindi un tumore al sangue). Per permettere alle cellule nel sangue di proliferare, e quindi creare cromosomi (che si vengono a creare solo nel momento della divisione cellulare) per poter studiare il cariotipo si devono seguire dei passaggi. Essi sono: Si mette il sangue periferico in coltura, si aggiunge uno stimolatore che fa proliferare le cellule (di solito è la fitoemoagglutinina che è di origine vegetale e stimola la proliferazione dei linfociti T), dopo 72h/96h ho il picco massimo di proliferazione, allora blocco la coltura (mentre le cellule sono in metafase) inibendo la formazione del fuso mitotico (di solito si usa la colchicina) e dopo si fa la valutazione finale. COLTURE PIÙ FREQUENTEMENTE ALLESTITE. Diagnosi Post-natale: Sangue periferico, fibroblasti (biopsia su bambini con sospetto di una malattia metabolica, in questo caso si vede un accumulo di una sostanza precedente e una mancanza di un prodotto, perché non vi è l’enzima che catalizza la reazione); Diagnosi Pre-Natale (ed invasive): liquido amniotico (16° settimana, perdita dello 0,5%), villi coriali (12° settimana, perdita dell’1%); Tumori solidi, asciti/versamenti, midollo osseo, linfonodi. I cromosomi umani sono METACENTRICI (cr 1, cr 20), SUBMETACENTRICI (cr 2, cr 8, cr 17) o ACROCENTRICI (cr 13, cr 21) (TELOCENTRICI non sono cromosomi umani).
Quindi oggi i cromosomi umani sono indagati di routine con tecniche di coorazione differenziale che mettono in evidenza lungo l’asse verticale della struttura cromosomica l’alternarsi di zone coorate e zone non-colorate (bande scure e bande chiare). Le tecniche di bandeggio più diffuse e universalmente adottate sono le: Bande GTG: (bande G ottenute dopo trattamento con T ripsina e colorate con G iemsa (visione con luca normale). Bande QFQ: (bande Q ottenute dopo colorazione con mostarda di Q uinacrina e osservate in F luorescenza). DIFFERENZA TRA BANDE SCURE E BANDE CHIARE Bande scure (brillanti) positive alla colorazione: Coloranti che si legano preferenzialmente a regioni ricche in Adenina e Timina (Giemsa e quinacrina); Si condensano precocemente ma replicano tardi; Contengono pochi geni; Ricche in LINE (sequenze ripetute), povere in Alu. Bande chiare (scure) negative alla colorazione: Ricche in Guanina e Citosina; Si condensano tardi ma replicano precocemente; Ricche in geni; Povere in LINE (sequenze ripetute), ricche in Alu. Negli umani i cromosomi acrocentrici sono 13, 14, 15, 21 e 22. Essi hanno il braccio corto diverso (col quale normalmente hanno geni che codificano l’rRNA) ed è utile in quanto prelevando un pezzo di placenta per fare una diagnosi prenatale al feto, a volte, possono capitare cellule materne. Se è un maschio basta vedere l’XY e l’XX, se il feto è femmina allora bisogna vedere saperle distinguere. Come si fa? Studiando queste regioni (bracci corti) dei cromosomi acrocentrici (che sono polimorfiche).
LE ANOMALIE CROMOSOMICHE
Quando hanno iniziato la fecondazione in vitro, hanno iniziato a fare anche tanti studi sulle cellule germinali. Noi non sappiamo cosa vi sia nella cellula uovo o nello spermatozoo, in quanto la mitosi inizia solo nel momento della fecondazione. Quindi per studiare i cromosomi hanno fecondato una cellula uovo con spermatozoi animali (che avendo gli spermatozoi diversi si riconoscevano) e viceversa, cellula uovo di Hamster (criceto) e sperma umano. Oggi per studiare se vi è un’alterazione a carico di un cromosoma specifico (non vedo i cromosomi ma solo il nucleo dello spermatozoo). Utilizzano delle sonde a DNA fluorescenti e vanno a contare il numero di segnali fluorescenti nel nucleo dello spermatozoo. Se il segnale è 1, è tutto a posto, se vi sono 2 segnali, vi è già un’anomalia (perché significa che vi sono 2 cromosomi). Grazie a questi studi si è arrivato a concludere che il 20% delle cellule uovo hanno un’anomalia cromosomica (specialmente con anomalie di numero di cromosomi) e il 10% dei cromosomi hanno un’anomalia (1 – 3% aneuploidi (anomalie di numero) – 5 – 10% anomalie strutturali (pezzi di cromosoma in più o in meno). Partendo dalle fecondazioni assistite, si sono studiati anche gli embrioni donati per la ricerca. 50% 3° giorno embrione anormale
Concepimenti anormali
sperma anormale
ovociti aneuploidi 10% Primo trimestre feto anormale 0,4% neonati sbilanciati cromosomicamente
