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Scarica appunti biologia molecolare applicata e più Sbobinature in PDF di Biologia Applicata solo su Docsity! Lezione 4 - lunedì 15 marzo 2010 Nella lezione precedente… Utilizzando due tecniche combinate, l’immunoprecipitazione della cromatina e il saggio di attività su gel, alla fine degli anni ’90 sono state identificate alcune proteine enzimatiche ad attività acetiltransferasica, che furono chiamate HAT (dall’acronimo inglese per Histone Acetyltrasferase); questi enzimi possono essere suddivisi in due categorie: HAT-A (aggiungono gruppi acetilici all’N-termine delle code istoniche presenti nel nucleo) e HAT-B (acetilano gli istoni neo-sintetizzati a livello citoplasmatico). Il processo di acetilazione genera un nuovo epitopo, riconosciuto da domini proteici definiti, come il bromodominio: il suo legame sulle lisine acetilate è di tipo cooperativo, ovvero l’affinità di legame di un singolo bromodominio verso la lisina acetilata è aumentata dal contemporaneo legame di altri bromodomini. Il significato del processo di acetilazione è duplice: da una parte rappresenta un segnale molecolare di riconoscimento per il reclutamento di complessi proteici (ad esempio quelli deputati al rimodellamento della cromatina), dall’altra determina un mascheramento delle cariche basiche delle lisine, diminuendo le interazioni con le cariche acide presenti sul DNA. Il bromodominio è oltremodo presente in proteine già note per il loro ruolo di co-attivazione, come TAFII250, facente parte del complesso TFIID. Le componenti strutturali del fattore di trascrizione basale, fondamentali nel ruolo di reclutamento del complesso di preinizio, essendo il primo fattore che si lega alla TATA box, sono proteine ad attività acetiltransferasica. Oltre a TAFII250, anche la proteina CBP (Creb Binding Protein) è risultata possedere attività HAT: il fattore di trascrizione CREB è attivato in risposta all’aumento del livello di cAMP, derivante dall’attività di trasduzione del segnale, che porta all’attivazione di protein-kinasi, come la PKA: il risultato della sua attivazione dipende dalla rimozione delle subunità inibitorie dalle subunità catalitiche, che possono così traslocare nel nucleo e fosforilare i propri substrati, tra cui CREB. CREB (CyclicAMP Responsive Element Binding protein), lega la sequenza enhancer CRE sul DNA: la PKA attivata è in grado di fosforilare CREB che, legato al DNA, consente il reclutamento del complesso di preinizio, attraverso la mediazione di un coattivatore, chiamato CBP. L’attività HAT di CBP porta all’acetilazione degli istoni sulla regione genica da trascrivere, contribuendo esso stesso al reclutamento del complesso di preinizio, che può operare dopo l’azione del complesso di rimodellamento della cromatina. Inoltre, la fosforilazione di CREB rappresenta un fenomeno importante, poiché CREB-P viene efficacemente riconosciuto da un anticorpo commerciale, agevolando in questo modo lo sperimentatore che ne studi l’attività. Esiste una gerarchia precisa nel posizionamento dei fattori proteici che, in ultima analisi, portano alla regolazione trascrizionale: se iniziamo prendendo in considerazione TFIID, il suo compito è quello di legarsi alla TATA box e richiamare la RNA polimerasi II per dare inizio alla trascrizione; affinché TFIID riconosca la TATA box, è necessario operare un rimodellamento della cromatina, mediato dall’intervento del complesso proteico SWI/SNF; perché il complesso di rimodellamenti possa legarsi, è fondamentale la presenza di un istone acetilato che guidi il suo posizionamento: questo comporta l’azione di una HAT, preventivamente reclutata da un fattore di trascrizione che aveva legato una regione enhancer. CREB è un fattore di trascrizione costantemente legato alla propria sequenza enhancer sul DNA: all’arrivo del segnale di fosforilazione si attiva, recluta una proteina ad attività HAT, necessaria per acetilare gli istoni che sono il bersaglio del complesso di rimodellamento della cromatina (grazie all’idrolisi di ATP). Questo processo è seguito dal riconoscimento da parte di TBP della TATA box. In ogni caso, ogni via di trasduzione del segnale possiede molteplici e peculiari possibilità per portare all’attivazione dei processi di trascrizione. Attualmente gli enzimi della classe HAT sono considerati bersagli importanti nell’allestimento di una terapia antitumorale, grazie alla loro capacità di acetilare anche substrati non istonici, quali la proteina p53 (nota anche come “guardiano del genoma”) che è un fattore di trascrizione coinvolto nella regolazione al danno del DNA; inoltre acetilano alcune proteine della famiglia HSP, come la HSP-90, coinvolta nel ripiegamento delle proteine denaturate, la cui struttura funzionale non può essere recuperata autonomamente. La famiglia delle HAT-A L’acetilazione istonica è un fenomeno scoperto più di trent’anni fa ma la sua importanza è stata ampiamente riconosciuta solamente dopo la recente identificazione e clonazione della prima acetil-trasferasi istonica. Allis ed i suoi collaboratori hanno sviluppato un saggio “in-gel”, con il quale si può monitorare l’attività di acetilazione di proteine separate da estratti diversi e successivamente incubate in un gel contenente istoni polimerizzati insieme alla matrice del gel ed acetil-CoA radioattivo. La prima HAT-A identificata con questo metodo è stata la p55 di Tetrahymena. Questo enzima presenta una alta omologia con il co-attivatore trascrizionale di lievito Gcn5p. Sono stati isolati due complessi contenenti Gcn5p: il complesso SAGA (Spt-Ada-Gcn5-) di 2 MDa ed il più piccolo complesso Gcn5-Ada di 0,8 MDa. Entrambi i complessi sono effettivamente capaci di acetilare il nucleosoma H3 ed in maniera minore H2B ed H4. Sembra che le acetil-trasferasi abbiano come bersaglio promotori specifici e che il fenomeno avvenga attraverso l’azione dei fattori trascrizionali. Ad esempio, l’attivazione trascrizionale in vitro ad opera di attivatori (Vp16 e Gcn4p) di un templato cromatinico, fa affidamento sul reclutamento del complesso SAGA. Inoltre, il fatto che al massimo tre nucleosomi sono acetilati da Gcn5 all’interno del gene HIS3 regolato da Gcn4 fornisce un’ulteriore evidenza del fatto che le acetiltrasferasi abbiano come bersaglio alcuni promotori. Il reclutamento di SAGA è mediato probabilmente dalla sua subunità Ada2, che è capace di associarsi a Vp16 così come alla TBP. Negli anni più recenti il numero delle HATs conosciute è rapidamente cresciuto. Svariate proteine regolatrici della trascrizione, già conosciute da tempo, hanno mostrato di avere un’attività HAT. Queste includono, accanto a Gcn5p, molti co-attivatori trascrizionali come p300/CBP, P/CAF, ACTR, Src-l e TAFII250. L’acetilazione è l’unica delle modificazioni post-traduzionali associabili univocamente ad un solo evento molecolare, che risulta essere l’attivazione della trascrizione: in breve, ACETILAZIONE DEGLI ISTONI = ATTIVAZIONE TRASCRIZIONALE. Istone deacetilasi (HDAC, Histone DeACetylase) Ogni qualvolta deve essere repressa la trascrizione cellulare, è necessario reclutare degli enzimi in grado di invertire gli effetti attivanti del processo di acetilazione, agendo nel modo contrario e spegnendo il segnale mediante deacetilazione. In questo modo la carica basica della lisina torna ad essere disponibile dopo essere stata mascherata dalla presenza dell’acetile. Questi enzimi fanno parte di complessi detti di silenziamento o repressione ed appartengono a quattro categorie differenti: nelle classi 1, 2 e 4 l’attività della proteina dipende dal legame con lo zinco, mentre quelle di classe III sono NAD-dipendenti, fatto che le lega allo stato metabolico della cellula. Più precisamente, esistono tre classi di enzimi HDAC riferibili all’Uomo. La classe I include HDAC1, 2, 3, ed 8, aventi un peso molecolare compreso tra 22 e 55 kDa e che dimostrano un’omologia di sequenza nel loro sito catalitico. La classe II include le HDAC 4, 5, 6 e 9; sono molecole di grandi dimensioni con un peso molecolare tra i 120 e i 135 kDa. Una subclasse di HDAC è rappresentata dalle HDAC 6 e 10, che contengono due siti catalitici ciascuna. La terza classe di HDAC si identifica grazie all’utilizzo di NAD come cofattore, di cui non può fare a meno per la sua attività; questa classe di HDAC è chiamata Sir (le proteine di questa classe vengono chiamate sirculine o SIRT 1 2 3 4 ) e sembrano essere l’anello di congiunzione tra metabolismo e attività trascrizionale, perché, come detto, sono NAD dipendenti e di conseguenza a seconda di quello e di quanto si mangia lo stato di saluta della cellula influenza lo stato di questi residui che influenzano l’attività trascrizionale. E sembra non avere gli istoni quali substrati principali della loro azione catalitica. I complessi di silenziamento sono primariamente composti da: de-acetilasi (HDAC) co-repressori (possono reclutare l’enzima in modo sequenza specifico) DNA binding protein Così come i complessi di attivazione, anche i complessi di repressione sono formati da più subunità, da 3 a 9, che possono contenere deacetilasi differenti e non presentano domini di legame agli istoni acetilati, vista la loro funzione, ma presentano un chromodominio che, invece, riconosce gli istoni metilati. Anche il complesso di repressione trascrizionale risponde ad un segnale che dirige il suo posizionamento sulla cromatina. Una proteina di repressione trascrizionale lega una sequenza specifica in prossimità di un sito di inizio della trascrizione, per esempio sul promotore, o di un elemento enhancer (in questo caso chiamato silencer) e recluta attraverso interazioni proteina-proteina i complessi di inattivazione. Il posizionamento dei fattori proteici avviene attraverso il riconoscimento di modificazioni chimiche per aggiunta di gruppi funzionali. trascrizione nucleari, attivi nella regolazione dell’espressione di specifiche proteine coinvolte nel ciclo e nel differenziamento cellulare). Inoltre risulta essere correlata con la condensazione dei cromosomi durante la mitosi e con l’induzione genica dovuta a stimoli mitogenici. Una possibile spiegazione di queste due risposte contraddittorie sta nel fatto che la stessa fosforilazione in S10 o in combinazione con altre fosforilazioni potrebbe reclutare fattori responsabili della condensazione e della segregazione cromosomica mentre, in collaborazione con altre modificazioni (per esempio, acetilazione in K14) potrebbe indurre la decondensazione del cromosoma e l’inizio della trascrizione. Considerare le modificazioni istoniche una ad una potrebbe indurre a sbagliare, in quanto dovrebbe essere preso in esame l’insieme degli eventi di modificazione simultanei e la loro possibile mutua influenza. L’avvenimento di una modificazione può esercitare un effetto sui successivi cambiamenti e tutte le modificazioni avvenute possono andare a costituire un segnale per il reclutamento di differenti serie di proteine o di complessi. Alcune acetil-trasferasi istoniche si associano all’attivazione trascrizionale, come Gcn5p P/CAF e p300, ed acetilano più efficacemente la coda N-terminale dell’istone H3 quando questa è fosforilata in S10. Oltre a questo è stato stabilito che la fosforilazione in H3-S10 sostiene l’acetilazione in H3-K14 dovuta a Gcn5p e di conseguenza l’apertura della cromatina. Viceversa, l’acetilazione in K14 non ha effetti su una fosforilazione successiva in S10 Un altro esempio è fornito dal fattore di crescita dell’epidermide EGF, che agisce anche attraverso l’attivazione trascrizionale mediata da CREB (proteina di legame al DNA sito-specifica, sensibile ai livelli di cAMP), in seguito alla sua fosforilazione. La proteina che opera la fosforilazione di CREB, media anche la fosforilazione su S10 nell’istone H3. La serina fosforilata rappresenta un segnale molecolare per il richiamo delle proteine dotate di attività HAT, che acetilano gli istoni e consentono la piena attivazione. Gli eventi molecolari che portano alle modificazioni post-traduzionali degli istoni non sono lasciate al caso: nonostante le proteine deputate, come le acetilasi, non presentino una specificità di azione sui nucleosomi, queste agiscono guidate dalla presenza dei fattori di trascrizione che, al contrario, si posizionano in maniera altamente selettiva sulle sequenze geniche da trascrivere attivamente. Sia la pKa che RSk2 etc.. arrivano nel nucleo e fosforilano contemporaneamente sono il fattore di trascrizione CREB e l’istone H3 modificando la cromatina in modo globale agendo sull’attivazione del fattore di trascrizione che ha già riconosciuto la sua sequenza bersaglio sia cambiando la struttura cromatinica, questo segnale di fosforilazione è il segnale per una successiva acetilazione da parte della HAT, proteina che riconosce CREB fosforilato. Una volta acetilata c’è l’arrivo dei complessi di rimodellamento della cromatina (possiedono bromodomini) e assemblaggio del complesso di pre-inizio. Gli avvenimenti che contribuiscono al legame dell’RNA pol II sul promotore sono molteplici: il legame del fattore di trascrizione è il primo segnale che consente l’arrivo dei complessi chinasici che fosforilano sia la serina dell’istone H3 che l’attivatore trascrizionale, portandolo ad uno stato “acceso”. La fosforilazione consente il richiamo di un complesso ad attività HAT, la cui attività acetiltrasferasica consente il reclutamento dei complessi contenenti il bromodominio; il rimodellamento della cromatina determina la possibilità di legame del fattore TFIID sulla TATA box, a cui segue il richiamo della RNA pol II per l’inizio della trascrizione. Il fenomeno della fosforilazione può avere differenti significati funzionali, a seconda del tipo di condensazione strutturale in cui versa la cromatina, in un determinato momento della vita cellulare. La fosforilazione della serina in posizione 10 su un filamento di cromatina disteso, implica un’attivazione trascrizionale. È possibile che la fosforilazione di istoni diversi, o di aacidi diversi su un istone, abbia effetti opposti sulla struttura della cromatina. Inoltre, modificazioni multiple possono avvenire sulla coda dello stesso istone e una modificazione può influenzare le altre. La fosforilazione di una serina in una posizione può essere necessaria per l'acetilazione di una lisina in un'altra posizione. Per esempio, la coda di H3 può trovarsi in due stati alternativi. Lo stato inattivo ha una metil-lisina, mentre lo stato attivo ha acetil-lisina e fosfoserina. La fosforilazione della serina e la metilazione della lisina si inibiscono a vicenda, determinando l'alternanza tra lo stato attivo e inattivo. Al contrario, la massiccia fosforilazione delle code istoniche H3 nella serina 10 è associata ad una struttura cromatinica fortemente condensata (i primi studi sulla fosforilazione istonica sono stati compiuti proprio su cromosomi mitotici), un chiaro segnale molecolare che conduce la cellula verso la via replicativa. Metilazione delle proteine e regolazione trascrizionale ( la metilazione avviene su due residui e non su uno solo come l’acetilazione, perché possono essere metilate sia le lisine che le arginine) Così come la fosforilazione, anche la metilazione delle proteine è una modificazione covalente comunemente effettuata sui gruppi carbossilici di glutammato, leucina e cisteina isoprenilata, o sul lato della catena contenente l’atomo di azoto di residui di lisina, arginina e istidina. Benché numerosi studi abbiano assegnato un ruolo funzionale alla metilazione di alcune proteine, ad esempio nella trasduzione del segnale e nel metabolismo dell’RNA, l’esatta funzione della metilazione delle proteine rimane ancora largamente sconosciuta. La metilazione di lisina e arginina Figura 4 - Chemistry of arginine and lysine methylation. (A) Molecular structure of arginine, and mono- and di-methylarginine. Type I and II protein arginine methyltransferases catalyze asymmetric and symmetric dimethylation, respectively. (B) Molecular structure of lysine and mono-, di-, and tri- methyl-lysine. It is not clear whether the same HMT is able to make all the different methyl-lysines La metilazione sulle proteine istoniche può essere classificata in base al numero e alla posizione dei gruppi metili addizionati può avvenire su istoni con regione eucromatiche che eterocromatiche: l’arginina può essere mono- o di-acetilata, sia in configurazione simmetrica che asimmetrica (Figura 4). Gli enzimi che catalizzano questi processi sono stati suddivisi in due tipologie: tipo 1: catalizza la formazione della NG-monometilarginina e della NG,NG-dimetilarginina asimmetrica tipo II: catalizza la formazione di NG-monometilarginina e di NG,NG-dimetilarginina simmetrica In maniera simile alla metilazione dell’arginina, l’aggiunta del gruppo metilico sul gruppo ammino- della lisina può essere suddivisa in base alla formazione di amminoacidi mono-, di- o trimetilati (vedi Figura 1). [ [ [ Studi precedenti avevano identificato quali substrati dell’enzima PRMT di tipo I (protein arginine methyltrasferase) differenti proteine associate all’RNA, come hnRNP, fibrillarina e nucleolina, mentre l’unico substrato identificato per la PRMT di tipo II era la proteina basica mielina. ] Descritti per la prima volta nel 1964, gli istoni sono stati per lungo tempo considerati come substrati per la metilazione. Studi più recenti, che utilizzavano tecniche di analisi metabolica con traccianti e di sequenziamento per la determinazione delle dimensioni degli istoni, hanno dimostrato che numerose lisine, (le lisine possono essere mono bi o tri-metilate ma l’enzima che aggiunge un gruppo metilico non è detto sia lo stesso che aggiunge anche l’altro gruppo metilico) incluse le lisine 4, 9, 27 e 36 dell’istone H3 e la lisina 20 dell’istone H4, sono siti preferenziali di metilazione. In aggiunta, i membri della famiglia delle proteine ad azione arginina-metiltransferasica, hanno la capacità di metilare gli istoni in vitro. Uno dei maggiori ostacoli nello studio del ruolo della metilazione degli istoni è insita nella mancanza di informazioni riguardanti gli enzimi responsabili. Una recente dimostrazione sulla funzione di CARM1 (nota anche come PRMT4), una proteina associata al complesso coattivatore-recettore nucleare, che gli attribuisce il ruolo di arginina metiltransferasi H3-specifica, e della controparte umana (SUV39H1) della proteina eterocromatica Su(var)3-9 (espressa in Drosophila), che risulta essere una lisina metiltransferasi H3-specifica, fornisce una prova sostanziale del coinvolgimento della metilazione degli istoni nella regolazione della trascrizione. A differenza degli enzimi che operano l’acetilazione, le metiltransferasi agiscono in maniera sequenza- specifica, metilando una sola lisina per istone interessato. Sono state identificate metilasi che si differenziano per specificità di substrato: singoli enzimi sono in grado di metilare rispettivamente la lisina 9, 4 e l’arginina 3 dell’istone H3. Nella Figura 5 è possibile osservare la presenza, nell’istone H3, di almeno 4 lisine differenti che possono essere variamente modificate. L’attività enzimatica delle metiltransferasi è risultata estremamente conservata nel corso dell’evoluzione: questo è un indice dell’importanza funzionale del ruolo ricoperto da questi enzimi. Il dominio denominato SET presenta una sequenza proteica evolutivamente conservata, inizialmente identificata nel repressore di PEV (position effect variegation) di Drosophila e nella proteina Trithorax del gruppo genico trithorax. La funzione principale delle proteine contenute nel dominio SET riguarda la modulazione dell’attività genica. Nello specifico, la proteina Trithorax sembra stimolare l’espressione genica, mediante la metilazione (attività KMT) della lisina 4 dell’istone H3, inducendo la modificazione della struttura della cromatina, in corrispondenza di precisi loci, convertendola in una forma attiva e, quindi, trascrivibile. Gli enzimi responsabili della metilazione delle arginine sono invece noti come PRMT: possiedono, similmente agli enzimi che metilano le lisine, specificità di substrato e sono caratterizzati anch’essi da un dominio funzionale SET. La metilazione delle arginine, nonostante sia meno frequente di quella delle lisine, ha comunque un ruolo importante nell’attivazione trascrizionale. La metilazione è un segnale di reclutamento per altre proteine e l’acetilazione, e possono legare lisine metilate proteine che possiedono cromodomini o domini di tipo PHD, possono legare proteine del gruppo colicon (??) che sono proteine coinvolte nel mantenimento delle scelte di differenziamento che la cellula ha compiuto, e anche il dominio WD40. Chromodominio Mentre il bromodominio, costituito da tre foglietti  seguiti da una -elica, ha la capacità di riconoscere le lisine acetilate, il cromodominio riconosce i medesimi residui aminoacidici quando metilati. Esistono almeno altri due tipi di domini strutturali in Figura 6 - Le modificazioni istoniche alterano la struttura della cromatina, determinando uno stato “on-off” della trascrizione Figura 5 Interplay between different post-translational modifications occurring on histone H3 and H4 amino-terminal tails. Residues that are known to be acetylated (Ac), methylated (Me), and phosphorylated (P) are indicated. Positive and negative affects are indicated