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Scarica appunti biologia molecolare applicata e più Sbobinature in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! Lezione 5 – mercoled ì 17 marzo 2010 Nella lezione precedente… Le code N-terminali degli istoni rappresentano le porzioni dei nucleosomi più accessibili dall’esterno: sono brevi sequenze di amminoacidi, da 20 a 40 residui, che possono essere variamente modificate. L’acetilazione e la fosforilazione ne sono un esempio: quest’ultima è associata a eventi trascrizionali scatenati dall’azione di specifiche chinasi, che presentano quale substrato la serina 10 dell’istone H3. Altri enzimi, al contrario, fosforilano questo residuo al momento della condensazione dei cromosomi, portando quindi la cellula verso una fase replicativa. Questo implica che una stessa modificazione, in questo caso la fosforilazione, può essere associata a fenomeni diametralmente opposti. Figura La metilazione può avvenire su due tipi di amminoacidi, la lisina (K) e l’arginina (R). La metilazione delle arginine ad opera di specifici enzimi, chiamati PRMT, è in genere associata a loci trascrizionalmente attivi; perciò, in corrispondenza di un promotore attivo possono essere ritrovate arginine metilate. La metilazione delle lisine, invece, può comportare una serie di conseguenze: in questo caso gioca un ruolo fondamentale lo specifico residuo di lisina che può essere metilato, che varia in corrispondenza dei loci trascrizionalmente attivi o repressi. Le lisine, inoltre, possono subire una, due o tre reazioni di metilazione: ad esempio, la metilazione della lisina 4 dell’istone H3 influisce maggiormente sull’attivazione trascrizionale in funzione del suo grado di metilazione. I complessi proteici come l’RNA pol o i fattori di trascrizione, infatti, possono legare con maggiore o minore affinità le sequenze di specificità sul DNA, determinando una maggiore o minore efficienza dell’inizio della trascrizione. Quindi la metilazione influisce sull’efficienza della trascrizione sia in modo dose-risposta che in base alla localizzazione dei residui di lisina. Studi di attività proteica hanno rivelato come l’enzima responsabile della monometilazione differisca dall’enzima responsabile della dimetilazione (probabilmente lo stesso responsabile della successiva trimetilazione): questa suddivisione dei compiti è riferibile alla necessità di creare un primo segnale molecolare di riconoscimento, per il successivo legame di complessi enzimatici dotati anch’essi di attività metiltrasferasica. Demetilazione… vivere pericolosamente Esistono due classi di Histon metilasi che agiscono sulle arginine monometilate, e quelle di classe 1 fanno una dimetilazione asimmetrica e quelle di classe 2 operano una dimetilazione simmetrica. Le arginino metiltransferasi identificate condividono il dominio chinasico, la prima scoperta è Carm1 che ha il suo omologo umano PMRT 4. La metilazione delle arginine a differenza di quello che succede con le lisine, questa è associata a eventi trascrizionali. Il dominio che opera la metilazione è un dominio estremamente complesso e la reazione opposta avviene diversamente dalle lisine e la rimozione di questo enzima PAD i4 rimuove il gruppo metilico e trrasforma l’argiina in citrullina che non potrà più essere metilato e l’istone verrà allontanato e sostituito con un istone normale ma non VERRà Più USATO LO STESSO ISTONE. La reazione di demetilazione comporta la formazione di specie altamente reattive e potenzialmente dannose per la cellula stessa: questo, in passato, aveva creato forti dubbi sul ruolo e sulla reale necessità del fenomeno della metilazione, quale segnale di regolazione sull’attività genica. La rimozione di un gruppo metilico dall’arginina genera specie radicaliche reattive: il sottoprodotto della demetilazione è infatti la formaldeide, in grado di causare la formazione di legami crociati proteina-proteina o DNA-proteina. Inoltre, l’amminoacido modificato che deriva dalla demetilazione dell’arginina è la citrullina, che deve essere riconvertito nella forma originaria. La proteina PAD4/PADI4 (peptidylarginine deaminase 4) è considerata la prima demetilasi scoperta, in grado di convertire dei residui di monometilarginina, presenti sugli istoni H3 e H4 (le arginine infatti sono presenti solo sull’istone H£ e una su H4), in citrullina e metilammonio attraverso una reazione di deaminazione. Tale reazione in realtà differisce da una reazione canonica di demetilazione, in quanto non viene solamente rimosso un gruppo metilico, ma viene generata la citrullina. Negli ultimi anni è stata identificata un’ulteriore classe di demetilasi istoniche, caratterizzate dalla presenza del dominio jumonji C (JmjC), che è responsabile della loro attività enzimatica. Tali proteine sono state denominate JHDM (Jumonji Histone Demethylases) e demetilano residui di lisina o arginina metilati, attraverso una reazione di idrossilazione, che richiede ferro e -chetoglutarato come cofattori. A differenza della proteina HsLSD1, questi enzimi quindi possono agire anche su residui di lisina trimetilati e su residui di arginina metilati. La funzione delle demetilasi appartenenti alla famiglia JHDM è associata ad una malattia neurodegenerativa di tipo genetico. La proteina HsLSD1 (Homo sapiens lysin-specific demethylase 1), infatti, è in grado di demetilare specificamente la lisina 4 monometilata o dimetilata dell’istone H3 attraverso una reazione ossidativa dipendente dal FAD, che determina, come spiegato prima, il rilascio di formaldeide. Figura 2 – Two possible mechanisms of PAD4 reaction on methyl-Arg in a protein substrate. PAD4 come tutte le arginine demetilasi presenta cinque siti di legame per il Ca2+ non-EF-hand, ed adotta un ripiegamento allungato con due domini. Il dominio N- terminale è divisibile in due subdomini Ig-like (immunoglobuline simile) (subdomini 1 e 2. Il subdominio 1 presenta 9 -foglietti ed un segnale di localizzazione nucleare, sulla superficie della regione che forma il loop. Il subdominio 2 presenta 10 -foglietti, 4 corte -eliche e lega 3 ioni Ca2+. Il dominio C-terminale, invece, rappresenta il sito attivo, che presenta due ioni Ca2+ e lega le code istoniche N-terminali. Carm 1 per esempio può opereare la mono o la dimetilazione e fino a quando l’arginina è monometilata può agrire un tipo di demetilasi 1 che trasformano l’amminoacido arginina in citrullina (non si conosce ancora come avviene la modificazione ne gli enzimi che agiscono per la rimozione del dimetile). Come le demetilasi delle lisine anche quelle delle arginine possono essere coinvolte nella regolazione dell’espressione genica. Quando l’istone H3 è metilato sul residuo di arginina, la trascrizione viene attivata; il meccanismo che stà alla base dello spegnimento della trascrizione non è ancora completamente noto: la citrullinazione dell’arginina sull’istone H3, mediata dall’enzima peptidylarginine deaminase 4 (PAD4), antagonizza la metilazione da parte dell’enzima PRMT (protein arginine methyltransferases), e rappresenta una ulteriore modificazione post-trascrizionale che regola i livelli di metilazione dell’arginina e l’attività genica, Se l’azione dell’enzima demetilasi avviene prima del completamento del processo di metilazione a carico dell’arginina sull’istone H3, che porta ad un’attivazione trascrizionale, viene catalizzata la reazione contraria, impedendo la loro metilazione e silenziando l’espressione dei geni in determinati contesti. Ad esempio, la trascrizione genica regolata dagli estrogeni (testata sulla linea cellulare MCF-7) è attivata dalla dimetilazione dell’arginina 17 dell’istone H3 e dell’arginina 3 dell’istone H4, ma è soppressa dalla citrullinazione. Infatti, PAD4 viene reclutata sull’elemento genico di risposta agli estrogeni (promotore pS2), a cui segue la comparsa degli istoni citrullinati e il disimpegno della RNA pol II (Wang Yanming et al., 2004). Review: Human PAD4 Regulates Histone Arginine Methylation Levels via Demethylimination Mediante un esperimento di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), Wang e collaboratori, nel 2004, hanno dimostrato che l’enzima PAD4 (peptidylarginine deiminase 4) regola la metilazione dell’arginina mediante la conversione della metil-arginina in citrullina, con rilascio di metilammina. Figura 3 recettore recluta sul promotore un complesso proteico di attivazione trascrizionale, che comprende anche un enzima ad attività demetilasica, in grado di rimuovere il metile dalla lisina 9. JHDM: jumonji histone demethylase Sono delle demetilasi che hanno dei domini di riconoscimento delle lisine metilato, hanno dei domini PHD che TUDOR e usano ferro, zinco e alfachetoglutarato come cofattori durante la loro reazione di demetilazione. È una famiglia costituita da 27 membri che condividono come regione di omologia il dominio catalitico e hanno tutta una serie di altri fattori. Nel 2007 è stato dimostrato che mutazioni a carico dei membri di questa famiglia sono legati ad una forma di ritardo mentale legato al cromosoma X e la maggior parte delle mutazioni riguardano il dominio catalitico della proteina. Così come per la metilazione anche nella demetilazione uno stesso residuo può essere demetilato in diverse demetilasi. Questo fa si che se una demetilasi è espressa in modo tessuto specifico in un certo tipo cellulare si ottiene una regolazione tessuto specifico. L’enzima è in grado di catalizzare la formazione di lisina a partire da monometil-lisina; mutazioni a carico dei geni che codificano per i membri della famiglia jumonji sono legate ad una forma di ritardo mentale correlata al cromosoma X. ] agiscono sulla lisina 9 dell’istone H4 qui la demetilazione di 9 attiva la trascrizione mentre quella della lisina 4 reprime la trascrizione. Il codice istonico Meccanismo Intrinseco Le modificazioni post-trascrizionali degli istoni possono essere associate anche ad altri output biologici, quali la riparazione del DNA, in seguito a rotture del doppio filamento, e l’apoptosi. Gli istoni esistono in alcune varianti, in particolare dell’istone H2A: l’istone H2A.X è più grande dell’istone tradizionale H2A e presenta nel residuo 139 nella regione carbossiterminale ,che non ha H2A, una serina che può essere fosforilata. Quando il DNA subisce un danno, che provoca la rottura di entrambi i filamenti, il meccanismo di riparazione più sicuro per la conservazione dell’informazione genica, è quello basato sulla ricombinazione omologa: come filamento stampo si utilizza l’altra copia del DNA presente sul cromosoma omologo, mediante l’azione di enzimi che compiono la cosiddetta invasione dell’elica. In casi estremi, oppure durante la sintesi delle regioni ipervariabili delle immunoglobuline, per generarne molteplici isoforme, e cioè quando il DNA non può essere riparato usando l’altra copia perché magari anche l’altra copia è danneggiata, si ricorre alla riparazione mediante ricombinazione non omologa. In questo caso i due tronconi di DNA generati sono legati nuovamente assieme, senza poter colmare l’eventuale mancanza nucleotidica creatasi: se la rottura è avvenuta su un tratto di DNA codificante, l’informazione genica in esso contenuta è persa; al contrario, se la rottura è occorsa in corrispondenza di una porzione non codificante, non comporta gravi conseguenze. In ogni caso quando avviene una rottura del doppio filamento viene attivata un chinasi chiamata ATM che fosforila anche il fattore di trascrizione p53 che controlla la scelta tra ciclo cellulare e apoptosi, questo perché a seconda del danno è meglio che la cellula esca dal ciclo cellulare e muoia per apoptosi piuttosto che proliferare in modo incontrollato. Quindi quando è presente questa rottura c’è la sostituzione dell’ istone H2A con H2A.X e una fosforilazione massiccia per megabasi intorno alla rottura che è un segnale d’allarme riconosciuto da complessi proteici che possiedono delle porzioni proteiche che riconoscono H2A.X fosforilato col compito di creare attorno al punto di rottura una situazione di allarme per cui i complessi di rimodellamento della cromatina, le protein chinasi e gli enzimi che dovranno riparare il danno vengano a trovarsi in questa regione. Quindi in questo caso è più importante per la cellula riparare il danno piuttosto che proseguire nel ciclo cellulare e quidni con l’espressione genica.------------------ una cosa simile avviene quando ci sono degli addoti che distorcono la struttura del DNA come gli addotti di timina indotti da luce ultravioletta e anche in questo caso i complessi che riparano il DNA contengono al loro interno enzinmi che modificano gli istoni, in questo caso ci sono delle acetilasi specifiche e intorno al punto in cui ci sono gli addotti v cercata una massiccia fosforilazione di H3. Il meccanismo che sta alla base del riconoscimento del danno a carico del DNA, risiede nella sostituzione dell’istone H2A con la sua variante H2A.X, la cui serina 139 viene massicciamente fosforilata, attorno alla rottura del filamento, e questo richiama in loco gli enzimi che si occupano della riparazione. Ovviamente le varianti istoniche inserite sono già presenti nel nucleo. [ Una variante mutante dell’istone H2A.X, in cui la serina viene sostituita con un’alanina, espressa nel lievito, non permette una efficace riparazione del DNA, a causa della mancanza dei siti di fosforilazione necessari per il reclutamento dei complessi responsabili della riparazione del DNA. Nonostante non si conoscano appieno i meccanismi in cui sono implicate le modificazioni degli istoni, si ritiene che le alterazioni a carico della struttura della cromatina siano necessarie per gli eventi molecolari di riparazione del DNA. ] Anche durante l’apoptosi così come avviene nel ciclo cellulare c'è un progressivo compattamento della cromatina in una caso volto alla separazione dei cromatidi fratelli durante a metafase mentre nell'apoptosi c'è un compattamento della cromatinache viene digerito in modo che possa essere poi espulsa dai corpi apoptototici. E' stato notato che durante l'apoptosi è presente un fenomeno di fosforilazione degli istoni, a carico dell’istone H2B: sono state sottoposte alcune cellule di lievito a stress ossidativi, in presenza di H2O2, ed è stata scoperta una kinasi specifica che opera la fosforilazione di un residuo di serina in posizione 14. Al contrario della necrosi, che è una forma di morte cellulare risultante da uno stress acuto o da un trauma cellulare, l’apoptosi è un fenomeno controllato di morte cellulare, durante il quale la cromatina viene ad essere condensata e degradata basata su fattori proteici all'interno della cellula che vengono attivati anche senza bisogno di trascrizione. Le modificazioni post-traduzionali sulle code N-terminali istoniche rappresentano un chiaro segnale per l’attività dei complessi proteici che operano dei cambiamenti alla struttura della cromatina e che possono alternativamente portare a fenomeni di trascrizione o repressione genica. Le modificazioni, però, sono effettuate anche in base ad un codice combinatorio: differenti tipi di modificazione, quali acetilazione- fosforilazione o acetilazione-metilazione, possono avere differenti conseguenze, se per esempio è avvenuta una modificazione attivatoria di qualsiasi tpo questa andrà ad interferire con le modificazioni di tipo regressivo e viceversa. la metilazine della lisina k9 su H3 è un segnale di repressione trascrizionale che influenza negativamente la fosforilazione della serina 10, potrebbero essere anche problemi di ingombro sterico, perchè non possono esistere informazioni contraddittorie sullo stesso istone e sullo stesso residuo sia C o N-termnale, ma la fosforilazione della serina 10 ha un effetto positivo sull'acetilazione della lisina vicina perchè sono entrambi fattori trascrizionali positivi che si influenzano tra loro. Queste evidenza di cross-talk diendono da mutazioni mutualmente esclusive , oppure una modificazione può recutare un enzima che faciltà la seconda modificazione. Uno stesso complesso può avere due modificazioni insieme questo perchè una modificazione ha la sua attività e si muovono di pari passo; esistono delle modificazioni che provocano il taglio N-terminale dell'istone imedendone la funzione e questo porterà alla sua sostituzione. L’utilizzo di anticorpi, in grado di riconoscere specificamente singoli residui amminoacidici modificati, ha portato alla scoperta che alcune combinazioni di segnali potevano essere associate ad un preciso fenomeno funzionale. In genere, la concomitante fosforilazione ed acetilazione dell’istone H3 porta all’espressione genica; la fosforilazione di due residui di serina posti in punti differenti lungo la coda N- terminale, determina invece un segnale per la condensazione della cromatina. La maggior parte delle modificazioni della coda N-terminale degli istoni sono mediate da proteine identificate inizialmente come co-attivatori o co-repressori trascrizionali. Queste proteine si associano al macchinario trascrizionale basale, alle TAF (TATA box binding protein associated factors) ed agli attivatori trascrizionali. Negli anni passati le modificazioni post-traduzionali degli istoni sono state studiate intensamente ed è stato proposto un modello che tenta di riassumere e far luce sulle complesse relazioni che legano queste al metabolismo del DNA. Secondo questa ipotesi, differenti modificazioni delle code istoniche lavorano sequenzialmente o combinatoriamente per costruire un vero e proprio “codice” istonico attinente alla modulazione dei processi cellulari, in grado di implementare ed ampliare le informazioni contenute all’interno del codice genetico. 2) Modello ESTRINSECO Dove l’aggiunta del gruppo funzionale altera i rapporti che intercorrono tra due nucleosomi adiacenti. Dalle analisi sulla struttura cristllografica dei nucleosomi è emerso che nell’interfaccia tra uno e l’altro nucleosoma c’era un’interazione tra la coda dell’istone H4 e una sorta di solco che si formava tra uno dei due dimeri H2A- H2B; quindi erano presenti delle interazioni elettrostatiche che contribuivano a mantenere vicini i due nucleosomi oltre ovviamente all’azione dell’istone H1. Da studi effettuati è emerso che se si elimina la regione basica per cui contenente le lisine dell’istone H4 e si fa una cristallografia su istoni che hanno l’H4 con coda N-terminale deleta, si può vedere che la struttura cristallografica è meno densa e quindi i due nucleosomi era più lontani tra loro. Acetilando le lisine degli sitoni ci si aspetta lo stesso effetto perché l’acetilazione neutralizza la carica positiva presente sulla lisina e rende la struttura più aperta e questo è l’unico caso dove c’è un’ associazione diretta tra modificazione post traduzionale e attività biologica. (acetilazione degli istoni = trascrizione; deacetilazione = repressione trascrizionale). Sono state identificate delle proteine capaci di riconoscere delle modificazioni a carico degli istoni. In accordo con il modello del codice istonico, le modificazioni delle code istoniche che interessano la struttura della cromatina, rendono quest’ultima più o meno accessibile ai fattori trascrizionali del macchinario basale, funzionando così da “recettori” per complessi multiproteici. Le modificazioni delle code istoniche identificate e caratterizzate sono: metilazione, acetilazione, ADP- ribosilazione, ubiquitinazione e fosforilazione. Considerando solamente le componenti elettrostatiche dell’assemblaggio cromatinico, una modificazione come l’acetilazione degli istoni, che neutralizza le cariche positive, o la fosforilazione, la quale aggiunge cariche negative, possono dare l’avvio alla decondensazione della fibra cromatinica. Di conseguenza, una combinazione di un certo numero di differenti modificazioni delle code istoniche può essere usata per amplificare il segnale che porta ad un ampio cambiamento nella struttura cromatinica, permettendo il legame dei fattori trascrizionali. E’ stato messo in evidenza che la stessa modificazione, ma in differenti residui aminoacidici o in combinazione con differenti modificazioni, può essere la causa di diversi stati di attivazione della cromatina. Ad esempio, l’acetilazione della lisina K16 della coda N-terminale dell’istone H4 è presente durante l’attivazione trascrizionale, mentre l’acetilazione di K12 della stessa coda si trova in regioni eterocromatiniche o in istoni neo-sintetizzati. Un esempio differente è rappresentato dalla metilazione di alcuni residui dell’istone H3. Questa modificazione è stata studiata attraverso la tecnica definita Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). Nello studio del processo di metilazione, gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando anticorpi specifici contro le lisine metilate K9 e K4 dell’istone H3. Il risultato mostra come la metilazione H3-K4 si manifesti in regioni silenti di eterocromatina, mentre la metilazione H3-K9 sia specifica per le regioni dell’eucromatina trascrizionalmente attive. Inoltre, le modificazioni istoniche possono reclutare proteine specifiche per una particolare condizione della cromatina. La forma metilata di H3-K9 recluta, ad esempio, la proteina eterocromatinica HP1 attraverso il suo cromodominio, favorendo così l’assemblaggio dell’eterocromatina. L’esito delle modificazioni istoniche dipende dal contesto cromatinico, dalla combinazione delle modificazioni o dai diversi tipi di enzimi reclutati. In un lavoro recente è stato dimostrato che p300/CBP interagisce con H3 metilato in K9, suggerendo un suo coinvolgimento nell’attività trascrizionale.