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Scarica appunti biologia molecolare applicata e più Sbobinature in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! Prof.ssa Crosio Biologia Molecolare Applicata 8 CFU ~ 1 ~ -Per questa registrazione riferirsi al file PDF “A1-Epigenetica-PTMistoni”- I° PARTE DEL PROGRAMMA: EPIGENETICA ED ESPRESSIONE GENETICA. L’Epigenetica. L’Epigenetica è un insieme di modificazioni che in qualche modo si sovrascrive sugli acidi nucleici che costituiscono il genoma delle cellule, per cui il prefisso “epi” sta ad indicare qualcosa che sta sopra, un qualcosa che viene scritto senza modificare quello che c’è sotto, che in questo caso è rappresentato dal genoma. L’Epigenetica consiste in tutto quel complesso di modificazioni che ha un apparato di modificatori estremamente complesso, che va in qualche modo ad aggiungere altre informazioni, rispetto a quelle già contenute all’interno del genoma; per cui, ripetendo, l’Epigenetica è tutto ciò che sta sopra le quattro basi che costituiscono le “lettere” del genoma. Si parlerà molto di Epigenetica perché quello che è emerso negli ultimi 15-20 anni è che le modificazioni epigenetiche sono alla base dell’espressione genica e sono la base molecolare che consente lo sviluppo e il differenziamento. La scoperta delle cellule staminali a staminalità indotta, ossia la scoperta della possibilità di prendere una cellula differenziata e di farla ritornare cellula indifferenziata quindi cellula staminale, ha dato la cognizione di quanto ciò che viene scritto sul DNA è un fenomeno transitorio, che può essere cancellato in modo da riportare indietro il processo di differenziamento. Per lunghissimi anni si è pensato che il differenziamento fosse un processo unidirezionale (ad esempio come nel caso dell’uovo un processo unidirezionale consiste nella rottura dell’uovo e nella sua cottura, poiché quando l’uovo è cotto non si può ritornare all’inizio, ovvero a quando l’uovo era ancora racchiuso nel suo guscio), ovvero che, quando la cellula uovo viene fecondata e si ha la formazione prima dello zigote e poi dell’embrione, si ha l’inizio di un processo di sviluppo e di differenziamento, per cui si ottengono da un’unica cellula circa 200 tipi cellulari differenti, che non possono più tornare ad essere cellula uovo. In realtà questo processo è almeno in parte unidirezionale, ovvero può essere in qualche modo indotto il de-differenziamento cellulare e tutto questo dipende dal cambiamento delle modificazioni epigenetiche; quindi tutto ciò che viene scritto sopra il genoma può essere in qualche modo cancellato e si può quindi in qualche modo ritornare indietro lungo la strada del differenziamento. Fino agli albori della definizione di gene, il gene era definito semplicemente come un’unità di trascrizione, cioè il gene corrispondeva alla lunghezza del suo trascritto primario, qualunque fosse questo RNA trascritto, RNA ribosomiale, tRNA o RNA messaggero, e soprattutto, dato che gli esperimenti di genetica provenivano dalla genetica batterica, in cui la relazione “un gene --> una proteina” è vera nella stragrande maggioranza dei casi, i geni venivano visti quasi esclusivamente come unità trascrizionali, che servono per l’appunto a produrre dei trascritti, che nella maggior parte dei casi danno luogo alla formazione di prodotti proteici. In realtà successivamente si sono aggiunti gradi di complessità, come ad esempio nell’operone lattosio, in cui sono presenti fattori di trascrizione che regolano l’attività trascrizionale di quel certo gene, per cui la stragrande maggioranza dell’attenzione si è focalizzata sul ruolo dei fattori di trascrizione: se il fattore di trascrizione è attivo, allora ci sarà un evento trascrizionale. In realtà a queste scoperte e a questo grado di complessità raggiunto mancava ancora qualcosa, che consiste nella cromatina, in quanto il DNA non è in Prof.ssa Crosio Biologia Molecolare Applicata 8 CFU ~ 2 ~ soluzione libera ma è sempre complessato alle proteine istoniche e le modalità con cui il DNA si avvolge attorno all’ottetto istonico cambia la capacità di essere espresso; quindi non basta che ci sia il fattore di trascrizione attivo, ma questo fattore di trascrizione attivo o attivato in qualche modo, ad esempio tramite fosforilazione, traslocazione nucleare o altro, deve avere accesso alla sua sequenza bersaglio, quindi, essendo la sequenza bersaglio arrotolata sulle proteine istoniche (come il filo è arrotolato sul rocchetto), non è detto che la presenza del fattore di trascrizione attivo sia una condizione sufficiente all’attivazione trascrizionale. Quello che cambia a livello della cromatina sono le modificazioni epigenetiche, per cui ci possono essere dei casi in cui una modificazione epigenetica l’attivazione trascrizionale indipendentemente dalla presenza di tutti i fattori trascrizionali necessari all’attivazione in vitro di quella sequenza genica. Questo appena detto vuol dire che si può prendere un promotore, isolarlo, inserirlo in un tubo da provetta e aggiungere i fattori di trascrizione in modo da controllare l’espressione di un gene reporter, dato che, in questo caso, con la sola aggiunta dei fattori di trascrizione, la trascrizione avviene; se, però, quello stesso DNA è all’interno di una cellula o di un determinato tipo cellulare con tutto l’apparato necessario per la trascrizione, si può non avere espressione genica, perché quel promotore è in una condizione cromatinica tale da non poter essere espresso. Come se non bastasse tutte le fasi della trascrizione si influenzano reciprocamente l’un l’altra, e le fasi di maturazione di un RNA sono anch’esse soggette a controllo reciproco, per cui la trascrizione deve iniziare, l’RNA neo-trascritto, se si tratta di un RNA messaggero, viene immediatamente incappucciato, successivamente ci sarà lo splicing, le proteine che svolgono l’incappucciamento andranno ad influenzare la fase di allungamento della trascrizione, quindi il reticolo che coinvolge tutta la trascrizione risulta essere molto complesso. In tutte le fasi della trascrizione, la cromatina continua ad avere un ruolo fondamentale nel controllo dell’espressione genetica. Oltre a questo bisogna ricordare che gli stessi RNA controllano l’espressione genica, non solo a livello di RNA (interferenza dell’RNA operata da microRNA), ma anche a livello di modificazioni della cromatina, come i piRNA, che vanno a modificare l’assetto cromatinico di un gene e quindi la sua capacità espressiva. Tutte queste modificazioni a carico delle proteine che servono da impalcatura al DNA vengono chiamate modificazioni epigenetiche. Il termine Epigenetica è stato coniato da Waddington nel 1942 ed ha una definizione poco molecolare, in quanto negli anni ’40 non si era ancora ottenuta la struttura del DNA. Waddington definisce l’Epigenetica come “la branca della biologia che studia le interazioni casuali fra i geni e il loro prodotto e pone in essere il fenotipo”. Questa definizione significa che non basta che un individuo abbia lo stesso gene, ma questo individuo interagisce con l’ambiente e in qualche modo l’ambiente altera l’espressione di un determinato gene. Per cui Waddington aveva intuito quella che è la base della modificazione epigenetica, ovvero gli individui si trovano in una ambiente che in qualche modo influenza loro, e quindi l’influenza dell’ambiente sul genoma, che nella sua globalità viene definita Epigenetica, cambia il fenotipo, che dipende dall’espressione di un certo tipo di geni. Queste modificazioni epigenetiche sono dei tratti ereditabili sia meioticamente che mitoticamente: così come alla divisione cellulare ciascuna cellula eredita lo stesso genoma della cellula madre, quindi la stessa composizione in basi con un certo pannello di polimorfismi, allo stesso modo ciascuna cellula eredita le modificazioni epigenetiche, il che vuol dire che una cellula differenziata, ad esempio una cellula gliale, quando si divide da luogo alla formazione di due cellule della glia Prof.ssa Crosio Biologia Molecolare Applicata 8 CFU ~ 5 ~ un punto che identifica la fine di essa; se invece si utilizzassero solo le lettere, come le basi azotate, senza la punteggiatura, si avrebbe una situazione di questo tipo: “itagepigeneticihannolastessafunzionedellapunteggiaturanellalinguaitaliana” Il motivo per il quale si riesce a leggere e a comprendere il senso della frase anche in questo caso è solo perché è stata letta precedentemente la stessa frase con però la punteggiatura. Di conseguenza i tag epigenetici, come la punteggiatura, costituiscono una sorta di formattazione delle informazioni contenute all’interno del genoma. Questi tag epigenetici dicono all’apparato di trascrizione di una cellula dove deve cominciare a trascrivere, dove deve terminare la trascrizione, che cosa può essere trascritto e cosa invece deve rimanere in qualche modo silente; per cui queste modificazioni a carico del DNA e delle porzioni ammino-terminali degli istoni vanno ad alterare la capacità dell’apparato trascrizionale di interpretare l’informazione che c’è all’interno del genoma. Per cui i tag epigenetici indicano qual sia l’inizio e quale la fine nei geni, come la lettera maiuscola all’inizio e il punto alla fine; forniscono una sorta di struttura al cromosoma, perché organizzano tutto l’insieme di geni che sono delle singole frasi che devono essere organizzate all’interno di un discorso per avere un senso; alterano la modalità con cui si legge una frase. Per cui l’insieme di queste modificazioni epigenetiche determina chi deve essere attivo trascrizionalmente e chi deve essere espresso trascrizionalmente, e questo nel complesso determina l’identità di una cellula, e il preservare l’identità di una cellula è indispensabile affinché ad esempio questa cellula non diventi una cellula tumorale, infatti una cellula tumorale è una cellula che sfugge al controllo del ciclo cellulare, per cui comincia a dividersi e a proliferare in maniera aberrante e questo può essere dannoso per l’organismo, infatti in genere le cellule tumorali sono cellule che de-differenziano. Quindi ritornando ai differenti tipi cellulari visti in precedenza, nel neurone si avranno i loci dell’emoglobina e della mioglobina silenti a causa di modificazioni epigenetiche, per cui tag epigenetici aggiunti a livello di quei loci rendono questi geni trascrizionalmente silenti; in maniera incrociata nella cellula muscolare e nella cellula rossa del sangue avremo invece dei tag epigenetici nei loci per la trascrizione dell’emoglobina e della dopamina nella cellula muscolare, e nei loci della mioglobina e della dopamina nella cellula rossa del sangue, che rendono questi ultimi loci trascrizionalmente silenti. Se si prendessero i fattori di trascrizione necessari per la trascrizione della dopamina nella cellula nervosa e si mettessero in una cellula rossa del sangue, anche in questo caso in questo tipo cellulare non avverrebbe la trascrizione del gene per la dopamina, che nella cellula rossa del sangue il gene che codifica per tale proteina non risulta accessibile per la trascrizione grazie alla presenza di tag epigenetici, quindi la presenza dei fattori di trascrizione adatti non comporta comunque e in ogni caso la trascrizione di quel determinato gene. Ricapitolando, quindi, al momento della formazione dello zigote si ha un corredo di tag epigenetici ereditati dai genitori, quindi appartenenti alla linea maschile e alla linea femminile, e una serie di tag epigenetici che vengono “scritti” durante la crescita dell’organismo. Le modificazioni epigenetiche sono presenti nell’individuo durante tutto lo sviluppo, dalla formazione dello zigote fino alla produzione delle cellule della linea germinale di quello stesso adulto che si è generato dallo zigote citato pocanzi, e alterazioni del macchinario epigenetico possono essere in qualche modo nefaste per la sopravvivenza dell’organismo Prof.ssa Crosio Biologia Molecolare Applicata 8 CFU ~ 6 ~ stesso, cioè, ad esempio, l’inattivazione genica delle proteine che aggiungono questi tag epigenetici sono spesso causa di letalità embrionale. È vero che il DNA è il depositario dell’informazione genetica, ma su questo “pacchetto base” che si eredita dai genitori vengono scritte tantissime cose e vengono scritte dal momento della fecondazione in poi, per cui le abitudini delle madri durante il periodo gestazionale possono influenzare in qualche modo l’espressione genica all’interno del feto e ovviamente poi anche all’interno del bambino, quindi ad esempio il diabete gestazionale influenza la probabilità che il bambino potrà sviluppare il diabete da adulto, questo perché durante il periodo gestazionale il feto interagisce con l’ambiente e per lui l’ambiente esterno è dato la placente, per cui tutto ciò che succede alla madre in quel periodo, come stress e circolo di ormoni, lasciano delle tracce a livello del genoma del feto. Quindi c’è una prima generazione, costituita dalla madre e dal padre, che hanno dato luogo alla formazione di quel zigote con quel determinato pacchetto di geni; tale pacchetto di geni, però, già dalla fecondazione, sarà soggetto a successive modificazioni epigenetiche, non ereditate, che influenzeranno l’utilizzo di quel tipo di informazione genica ereditata. Questo fatto è testimoniato dal fatto che i gemelli omozigoti sono praticamente identici alla nascita, ma l’ambiente sia gestazionale che post-gestazionale all’interno del quale i due gemelli cresceranno ne influenzerà profondamente il fenotipo di questi individui. Se i gemelli omozigoti, che hanno sostanzialmente lo stesso genoma con un numero di tag epigenetici uguale ereditati dai genitori, vengono separati alla nascita e messi in due ambienti completamente differenti, saranno individui da adulti fenotipicamente differenti, perché il sistema nervoso soprattutto impara durante tutto l’arco della vita e tutto ciò con cui si interagisce, cibo, sport e quant’altro, aggiunge informazioni aggiuntive sul genoma. (vedi slide n°14) Nella seguente slide è riportata una ibridazione cromosomica su un locus particolare di due gemelli omozigoti che va a valutare diversi tag epigenetici: nella prima parte la colorazione gialla dimostra che entrambi i gemelli hanno lo stesso tipo di tag epigenetici in un determinato locus a tre anni di vita; quando invece i gemelli omozigoti hanno 50 anni la quantità della colorazione gialla cambia e in proporzione a quanto varia i due gemelli hanno marker epigenetici differenti, che fanno si che sviluppino molto probabilmente fenotipi differenti. Questo sta a dimostrare la profonda influenza dell’ambiente sull’utilizzo di un determinato genoma e sui risultati che da esso ne derivano. Tutto ciò sta a dimostrare che tutto l’ambiente influenza in qualche modo il fenotipo. Molti dei tag epigenetici che si vanno a scrivere sul DNA sono costituiti da metilazioni e la sorgente di gruppi metilici è essenzialmente di tipo alimentare, per cui il tipo di dieta in qualche modo influenza il tipo di tag epigenetici che possono essere scritti sul DNA. I tag epigenetici sono anche dati da l’utilizzo di droghe d’abuso, che vanno a lasciare dei segni sul DNA anche dopo che lo stimolo dovuto a queste sostanze viene rimosso, per cui chi è stato esposto a una determinata droga di abuso e in particolare le cellule che sono state sottoposte a quella determinata sostanza, mantengono nel loro genoma tracce di quell’esposizione, quindi non tutte le tracce sparisco immediatamente anche se l’espressione genica sembra ritornata alla sua normalità; però a una successiva esposizione, quei geni che erano stati pre-attivati o inibiti sono già in qualche modo pre-allertati a causa della presenza di quei tag epigenetici che sono stati scritti la prima volta che quelle determinate cellule sono state esposte a una droga d’abuso. Questo è vero sia per quanto riguarda le droghe di abuso, che per quanto riguarda le crisi Prof.ssa Crosio Biologia Molecolare Applicata 8 CFU ~ 7 ~ glicemiche: esistono pazienti diabetici che sono sotto controllo insulemico, che non hanno crisi glicemiche, anche per anni, in realtà però possono sviluppare delle complicazioni di chi invece ha frequenti crisi glicemiche, perché esiste una sorta di memoria glicemica nelle cellule, per cui quelle cellule che sono state esposte a concentrazioni eccessive di glucosio portano sul loro genoma delle modificazioni epigenetiche che sono memoria di quella passata esposizione, che in determinato contesto genomico e in un determinato contesto cellulare possono dare la complicanza di quella crisi ipoglicemica anche se quella crisi ipoglicemica non è più presente. L’epigenetica e la conoscenza delle modificazioni epigenetiche è indispensabile per padroneggiare le cellule staminali, che sono la frontiera più all’avanguardia della medicina rigenerativa odierna. Per utilizzare le cellule staminali in terapie è stato molto importante avere un background sulle modificazioni epigenetiche, perché ciò che succede durante il differenziamento è aggiungere delle informazioni che fanno in modo che quella cellula staminale si differenzi in un determinato tipo cellulare, e tutto ciò ora si è scoperto essere reversibile, in modo da poter ottenere da una cellula differenziata nuovamente una cellula staminale. (vedi slide n°21) Quello raffigurato in questa diapositiva è l’albero della vita di Klimt, che descrive il percorso che verrà affrontato nelle lezioni successive, in cui si inizierà dalle basi molecolari dell’Epigenetica fino ad arrivare all’applicazione delle modificazioni epigenetiche ai diversi campi della biologia molecolare.