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LEZIONE N.1 - 30-09-2022

GENOMICA E DNA PROFILING - ACHILLI

PERRONE

PRESENTAZIONE DEL CORSO

Una parte del corso prevede laboratori la cui presenza è obbligatoria; da fare almeno 3 su 4.

Attività di laboratorio:

1. Attività che prevede analisi di barcoding dove in base al sequenziamento di estratti biologici si vede se

riusciamo a identificare la specie; prevede metodi di genetica molecolare.

2. Analisi sul proprio DNA; estrazione del DNA, quantificazione, PCR, elettroforesi e sequenziamento Sanger

con lo scopo non di identificare la specie di provenienza del campione biologico, ma l’estrazione del nostro

DNA e tramite l’origine filogenetica vedere l’origine degli antenati femminili.

-Probabilmente si farà la seconda opzione. I mesi saranno novembre-dicembre.

-Date e orari dei laboratori e materiale didattico si troveranno su Kiro.

Contenuti: non si sa se verranno svolti tutti.

METODI ALLA BASE DELLA RICERCA GENOMICA

Elenco dei contenuti raffigurati in tabella:

-Estrazione del DNA per analizzare un genoma.

-Quantificazione dell’estratto; metodi funzionali all’analisi.

-Enzimi per studiare il DNA.

-Southern Blotting e RealTime PCR

-Genoteche e Clonaggio

Parte centrale del corso:

-Sequenziamento del DNA; è il sistema più utilizzato per fare un’analisi genomica. Lo si fa perché sequenziare

il DNA ci dà il massimo livello di risoluzione e mi fa vedere tutte le varianti che abbiamo rispetto ad una

sequenza di riferimento, ed anche perché c’è stato un incremento delle tecniche che ha permesso di

diminuire i costi ed allargare le possibilità di utilizzo anche a laboratori più piccoli.

-Sequenziamento Sanger

-Sequenziamento di nuova generazione; NGS è una delle metodiche più utilizzate. Tra le piattaforme

disponibili le due più in uso sono Illumina e Ion Torrent.

-Annotazione genomica

-Caratterizzazione funzionale di un gene

-Marcatori molecolari

-Genomica comparativa; anziché sfruttare le varianti genomiche a scopo identificativo, in questo caso si

mettono in comparazione le sequenze genomiche per ricostruire la storia di una popolazione, o specie

animale o vegetale.

-Filogenesi molecolare e studi di associazione; ovvero metto in relazione le sequenze in un albero

filogenetico. In relazione a ciò c’è una nuova parte di archeogenomica, ovvero non analizzo i genomi attuali

ma quelli antichi. (Ci si può fare il percorso di tesi solo se in prospettiva si sa che si vuole fare il dottorato).

-Applicazione del DNA profiling

-DNA barcoding; basi genetiche e molecolari della tecnica del barcoding ed esempi applicativi.

-Possibile seminario di esperto; uno dei collaboratori che hanno lavorato sui morti in mare.

-Seminario di applicazioni in ambito zootecnico.

La genomica è sequenziamento attualmente, che ci permette di identificare varianti nuove e varianti note.

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LEZIONE N.1 - 30 - 09 - 2022

GENOMICA E DNA PROFILING - ACHILLI

PERRONE

PRESENTAZIONE DEL CORSO

Una parte del corso prevede laboratori la cui presenza è obbligatoria; da fare almeno 3 su 4.

Attività di laboratorio:

1. Attività che prevede analisi di barcoding dove in base al sequenziamento di estratti biologici si vede se riusciamo a identificare la specie; prevede metodi di genetica molecolare. 2. Analisi sul proprio DNA; estrazione del DNA, quantificazione, PCR, elettroforesi e sequenziamento Sanger con lo scopo non di identificare la specie di provenienza del campione biologico, ma l’estrazione del nostro DNA e tramite l’origine filogenetica vedere l’origine degli antenati femminili.

Probabilmente si farà la seconda opzione. I mesi saranno novembre-dicembre.
Date e orari dei laboratori e materiale didattico si troveranno su Kiro. Contenuti: non si sa se verranno svolti tutti. METODI ALLA BASE DELLA RICERCA GENOMICA

Elenco dei contenuti raffigurati in tabella:

Estrazione del DNA per analizzare un genoma.
Quantificazione dell’estratto; metodi funzionali all’analisi.
Enzimi per studiare il DNA.
Southern Blotting e RealTime PCR
Genoteche e Clonaggio

Parte centrale del corso:

Sequenziamento del DNA; è il sistema più utilizzato per fare un’analisi genomica. Lo si fa perché sequenziare il DNA ci dà il massimo livello di risoluzione e mi fa vedere tutte le varianti che abbiamo rispetto ad una sequenza di riferimento, ed anche perché c’è stato un incremento delle tecniche che ha permesso di diminuire i costi ed allargare le possibilità di utilizzo anche a laboratori più piccoli.
Sequenziamento Sanger
Sequenziamento di nuova generazione; NGS è una delle metodiche più utilizzate. Tra le piattaforme disponibili le due più in uso sono Illumina e Ion Torrent.
Annotazione genomica
Caratterizzazione funzionale di un gene
Marcatori molecolari
Genomica comparativa; anziché sfruttare le varianti genomiche a scopo identificativo, in questo caso si mettono in comparazione le sequenze genomiche per ricostruire la storia di una popolazione, o specie animale o vegetale.
Filogenesi molecolare e studi di associazione; ovvero metto in relazione le sequenze in un albero filogenetico. In relazione a ciò c’è una nuova parte di archeogenomica, ovvero non analizzo i genomi attuali ma quelli antichi. (Ci si può fare il percorso di tesi solo se in prospettiva si sa che si vuole fare il dottorato).
Applicazione del DNA profiling
DNA barcoding; basi genetiche e molecolari della tecnica del barcoding ed esempi applicativi.
Possibile seminario di esperto; uno dei collaboratori che hanno lavorato sui morti in mare.
Seminario di applicazioni in ambito zootecnico. La genomica è sequenziamento attualmente, che ci permette di identificare varianti nuove e varianti note.

Le varianti (SNP o SNV) possono essere di due tipi:

sono polimorfismi se sono abbastanza frequenti nella popolazione; è qualcosa di molto diffuso nella specie che sto analizzando e non caratterizza l’individuo ma la popolazione (animale, vegetale, batterica).
varianti; è qualcosa di identificativo e specifico della persona. I polimorfismi caratteristici della popolazione - e non del singolo individuo - mi aspetto di trovarli e mi servono ad identificare una certa popolazione. Ad esempio, nell’ambito animale mi identificano una certa razza; nell’ambito della tracciabilità alimentare se voglio capire se una carne è effettivamente di un tipo (Es. chianina) faccio una tracciabilità usando marcatori molecolari di quella carne comprata e vedo se ha quegli alleli e varianti che sono caratteristiche di quella razza. Questo tipo di screening lo faccio col sequenziamento o con la genotipizzazione. Genotipizzazione vuol dire che non sequenzio tutto il DNA, ma prendo soltanto quei locus e posizioni nucleotidiche che so che sono molto diffuse in quella razza animale, o se parlo di uomo, all’interno della popolazione. Quindi genotipizzazione è identificazione di marcatori noti in modo da caratterizzate un certo genoma sfruttando le varianti già identificate in precedenza. Questo sistema è da imparare meglio perché, dopo il sequenziamento, è quello che si applica di più a livello di genomica; vado a caratterizzare un genoma identificando in modo selettivo le varianti note. Questo ha applicazione non solo in ambito di tracciabilità alimentare, ma anche nell’ambito delle patologie (ci sono panelli di SNV noti specifici per certe patologie). Quindi è importante l’applicazione in ambito sia agroalimentare che medico. Un’altra cosa interessante sono i test del DNA fai da te; cioè test per fare analisi ancestrale o di portatori di patologie; questo sistema usa i marcatori molecolari e gli altri sistemi di genotipizzazione che vedremo. È stata fatta un’analisi su un test di paternità di 150 anni fa sul fondatore della chiesa mormone; quindi ci sono applicazioni anche non in ambito forense con dati totalmente attendibili.

Seminario studenti; ci si può candidare per fare un seminario il cui vantaggio è approfondire un argomento ed avere una domanda in meno all’orale. Esame: orale con 3 domande; ogni domanda ha un voto da 1 a 10; il voto finale è dato dalla somma. Facendo il seminario si parte già da 10. In due o tre persone si parla del sequenziamento di terza generazione (PacBIO) o quarta generazione (Nanopore). Come funziona e che applicazioni può avere. Si fa un powerpoint di 5- 10min. MATERIALE DI STUDIO: La lezione; pdf delle diapositive e appunti; paper. Le registrazioni delle lezioni fornite sono quelle di 2 anni fa. Per chi volesse il libro: genomi 3 o 4 di Terry Brown; la versione inglese online è disponibile sull’NCBI all’interno di books.
Per il seminario si parte da un libro o una review (non si presentano dati nuovi ma una revisione di un argomento in quel momento). Appelli: uno a gennaio, due a febbraio. Esposizione seminario: fine novembre, inizi di dicembre.

CAPITOLO 1: GENOMI, TRASCRITTOMI, PROTEOMI

Parliamo di genomica, quindi si parla di un’analisi sulle potenzialità o sull’informazione del genoma, andando a vedere le informazioni scritte a livello di DNA, RNA o proteine. Questa analisi ha delle limitazioni e degli scopi (soprattutto RNA e proteoma per un’analisi funzionale; genoma per identificare tutte le varianti). Il genoma non è tutto codificante e le sequenze di DNA non diventano tutte sequenze RNA. La porzione codificante è circa l’1% (la porzione di genoma che diventa trascrittoma è molto limitata). Nel corso andremo a parlare soprattutto di genomi.

A dimostrare la struttura del DNA sono stati invece Watson e Crick; ciò è stato fondamentale per mettere a punto le tecniche di sequenziamento. I sistemi di sequenziamento sono ricerche scientifiche applicate a livello di tecnica. I sequenziatori derivano da ricerche scientifiche e su queste sono state create delle macchine. La scoperta del 1953 era inoltre di una pagina di pubblicazione. Al di là della struttura che serve a mettere a punto le tecniche, serve sapere come la sequenza di DNA è in maniera differente scritta all’interno di ciascun genoma. A seconda di come è scritta ci sono le varie specie, organismi e nella stessa specie le diverse varianti che possiamo osservare. Anche Darwin è importante da citare, in quanto il merito di Darwin è stato dire che esistevano varianti molto maggiori di quanto si pensasse e che derivano da evoluzione casuale e che esiste la selezione naturale; ma soprattutto diceva che tutti gli esseri viventi possono essere raggruppati sotto un grande albero filogenetico.

La definizione corretta di gene attuale è una porzione di DNA che contiene le informazioni per essere trasformata in una molecola di RNA. Quando si parla di RNA esistono oltre al messaggero gli RNA funzionali (96% del totale). Adesso tanto laboro va ai snRNA che sono sempre più identificati negli organismi e che hanno importanza nella funzionalità della cellula. Geni che codificano per RNA funzionali sono ad esempio il tRNA che ha una struttura che dipende da come la sequenza è riportata all’interno del genoma. Non si pensa solo alla struttura proteica, che a livello tridimensionale ha una sua funzionalità, ma bisogna pensare anche a molecole degli RNA funzionali che di per sé sono il risultato finale dell’espressione genica. Quando parliamo di espressione genica e vogliamo arrivare alla proteina abbiamo tanti passaggi che prevedono anche la traduzione, ma nel caso dell’RNA la struttura funzionale è l’RNA stesso. Importanti sono tRNA e rRNA.
Quando si parla di RNA, che ha l’informazione per essere tradotto in una proteina, si parla di qualcosa che ha un codone di inizio e un codone di stop (importante quando si parla di annotazione genica). La tabella mi dà info sul codice genetico e mi dice che è a triplette ed è ridondante. Più triplette codificano per lo stesso amminoacido e questo è molto importante dal punto di vista funzionale di associazioni di varianti con patologie, perché se ho una mutazione che mi cambia un amminoacido a livello funzionale è di possibile ruolo patogenetico. Importante è anche il modo: la tripletta GU, ad esempio di una molecola di mRNA, diventa amminoacido valina. Il DNA è trascritto in RNA per complementarietà. La sequenza che io vado a vedere di AUG, si riferisce alla sequenza letta sul genoma, nel senso che sostituisco la T. Quindi scrivo la tripletta come è scritta sul genoma (nell’identificazione genica scrivo AUG sul DNA come ATG); viene scritta con la U per identificare che quella porzione sarà trascritta in un RNA. Inoltre, se io vado a cercare una sequenza proteica, in banca dati la si trova scritta con il codice ad una lettera.

Il codice genetico tripletta ridondante non è universale; il mitocondriale, ad esempio, ha un genoma con deviazioni rispetto a quello standard nucleare ma anche da specie a specie. Il genoma mitocondriale ha quindi un codice genetico suo; questo perché la variazione è avvenuta in diversi momenti dell’evoluzione per mantenere sé stesso. Il genoma mitocondriale deriva dal batterio, anche se alcuni geni si sono trasferiti nel genoma nucleare attuale. Una parte non si è potuta trasferire proprio per la deviazione del codice genetico, in modo che il genoma nucleare non lo possa più utilizzare ed in questo modo il mitocondrio preserva se stesso, altrimenti si sarebbe perso. Esistono inoltre delle NIMS (nuclear insertions of mitochondrial sequencing), ovvero sequenze di derivazione mitocondriale che troviamo nel genoma nucleare umano.

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Attività di laboratorio:

Elenco dei contenuti raffigurati in tabella:

Parte centrale del corso:

CAPITOLO 1: GENOMI, TRASCRITTOMI, PROTEOMI