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MICROBIOLOGIA
Studia i MICRORGANISMI, un numeroso gruppo di organismi viventi microscopici ed unicellulari che sono capaci di vita autonoma, al contrario degli organismi pluricellulari. TIPOLOGIE DI MICRORGANISMI:
- BATTERI
- VIRUS —> non sono veri e propri di microrganismi perché non sono capaci di vita autonoma
- FUNGHI
- PROTOZOI —> trasmesso dalla zanzara
- ALGHE —> non sono patogene per l’uomo
- PARASSITI —> organismi pluricellulari (vermi intestinali —> tenia, si trasmette per ingestione di carne bovina contaminata, può essere lunga 10m) DIMENSIONI DEI MICRORGANISMI:
- Parassiti —> tenia 10 m.
- Protozoi —> ameba(intestinali che causano diarrea, un altro tipo che può arrivare al cervello, vivono nei fiumi, causano meningiti fulminanti) si muovono attraverso allungamenti della loro struttura dai 10 ai 100 micron.
- Batteri —> circa 1 micrometro( 10 alla meno 6 m, mille volte più piccolo di 1 mm) sono visibili solo al microscopio.
- virus —> 100 nm (nanometri, 10 alla meno 9 m) HIV, sono visibili al microscopio elettronico. CELLULA Può essere eucariota o procariota. È un microrganismo capace di metabolismo (cattura i nutrienti dall’ambiente e li trasforma in prodotti di scarto), è capace di riprodursi per scissione binaria, le cellule possono differenziarsi e alcune possono formano le spore (sfruttate per il bioterrorismo). Quando un batterio si trova in ambienti avversi si trasforma in spora per sopravvivere; sono in grado di comunicare perché rilasciano molecole chimiche che arrivano alla cellula ricevente. Alcune cellule sono capaci di muoversi. Le cellule sono capaci di evolvere, mutare, questa caratteristica è l’unica che hanno anche i virus (modificare il proprio genoma), mutano per adattarsi all’ambiente, per sopravvivere. Il virus muta continuamente. Se si considerano tutti i microrganismi presenti sulla terra, pochi sono patogeni, la maggior parte ha un ruolo positivo per l’uomo o per l’ambiente. In natura i microrganismi servono per il ciclo dei nutrienti, per trasformare la materia in sostanze in decomposizione, anche l’uomo sfrutta i microrganismi (formaggi, birra, vino, yogurt). Più di 100 anni fa le principali cause di morte erano i virus e i microrganismi. Tubercolosi = il più pericoloso batterio esistente perché può essere farmaco resistente. Oggi le principali cause di morte non sono più i microrganismi, ma sono le malattie cardiache, tumori, questo grazie ai vaccini e ai farmaci contro i batteri, ma anche grazie all’igiene. Alcune cellule possono trasformarsi in SPORE che sopravvivono a lungo nell’ambiente, anche nelle condizioni più sfavorevoli, le spore sono la più grande arma di BIOTERRORISMO—> USA 2001, spore nelle buste. IL MONDO MICROBICO I microrganismi possono essere due tipi di cellule diversi: PROCARIOTI ED EUCARIOTI
- Procarioti = batteri —> non hanno la membrana nucleare, il genoma è sparso, non ha il RE, l’apparato di Golgi.
- Eucarioti = funghi e protozoi —> più grande, dai 10 micron in su, ha il nucleo per proteggere il DNA. (Originati dai procarioti). STRUTTURA E FUNZIONE DELLA CELLULA PROCARIOTA (descrivimi la struttura dei batteri) I batteri possono essere COCCHI o BACILLI. I cocchi sono sferici e possono essere:
- singoli
- a coppia di due —> DIPLOCOCCHI
- a catenella —> STREPTOCOCCHI
- a gruppi di 4 —> TETRACOCCHI
- a grappolo —> STAFILOCOCCHI I bacilli sono a forma di bastoncello un pochino allungati e possono essere:
- singoli
- A coppia di due —> DIPLOBACILLI
- A catenella —> STREPTOBACILLI Esistono anche:
- COCCOBACILLI , che sono una via di mezzo, una sfera leggermente allungata;
- VIBRIONI^ che sono a virgola (vibrio colera causa una diarrea secretoria);
- SPIRILLI che sono spiraliformi;
- SPIROCHETE , “fusilli” con tante curve(sifilide). I batteri sono dotati di una parete cellulare( eucarioti no), un rivestimento esterno che conferisce forma e rigidità al batterio, lo protegge dal danno meccanico, previene la lisi osmotica, impedisce che l’acqua entri facendo scoppiare il batterio, regola gli scambi con l’esterno di nutrienti, è antigenica (antigene è la molecola che interagisce con l’anticorpo, per lo più possono essere proteine, stimola la produzione di anticorpi, gli anticorpi sono contro l’antigene) ed è un importante bersaglio per il lisozima, una molecola che abbiamo in saliva, taglia la parete cellulare; la parete è un bersaglio degli antibiotici, farmaci contro i batteri, deve essere tossico per i batteri ma non per noi. I batteri si dividono in due grossi categorie per come è fatta la parete, per la sua composizione; GRAM scoprí una colorazione per differenziare queste due tipologie:
- GRAM POSITIVI —> appaiono blu-viola, soprattutto stafilococchi e streptococchi
- GRAM^ NEGATIVI^ —> rosa-fucsia, bacillo Escherichia coli. La parete dei Gram positivi è costituta da uno spesso strato di PEPTIDOGLICANO con molecole di ACIDI TEICOICI; il peptidoglicano è costituito da catene lineari di due zuccheri che si alternano, questi due zuccheri sono NAG ( N-acetilglucosammina) e NAM (acido N-acetilmuramico), queste catene sono unite da legami peptidici (le penicilline tagliano questi legami peptidici e uccidono i batteri). La parete dei Gram negativi ha un sottile strato di peptidoglicano con una membrana esterna, questa membrana ha il foglietto interno fatto di fosfolipidi mentre il foglietto esterno è costituito dal LIPOPOLISACCARIDE (LPS), tossico per noi (quindi tutte le soluzioni iniettabili devono essere senza LPS) detto anche endotossina, quando un batterio gram negativo entra in circolo sanguigno può
conferisce resistenza all’essicamento, permette di sopravvivere se le temperature non sono ideali ed è antigenica, quindi i componenti inducono la produzione di anticorpi. Alcuni possono produrre le spore, chiamate anche ENDOSPORE perche si formano dentro il corpo del batterio, è una struttura cellulare specializzata che il batterio produce quando si trova in ambienti sfavorevoli, per esempio quando non ci sono nutrimenti. Quindi questi batteri sono detti SPORIGENI , dotati di spore e sono la maggior parte gram positivi. CLOSTRIDIUM —> genere —> Clostridium tetani è il nome della specie. Clostridium botulinum , Clostridium difficile( pazienti con questo devono essere messi in isolamenti, è un batterio intestinale, può causare diarrea e colite pseudomembranosa) nell’ambiente si trasforma in spora. BACILLUS —>genere, Bacillus. Antracis, Bacillus cereus(contaminano il riso, le spore resistono alla frittura) Questi due generi producono spore. La spora permette al batterio la sopravvivenza in condizioni ambientali sfavorevoli, è resistente al calore, all’essicamento, ai disinfettanti, alle radiazioni UV,grazie ai diversi strati di rivestimento e al basso contenuto di acqua, è metabolicamente inerte, non fa nulla, ma dentro ha il genoma, quindi se le condizioni sono favorevoli dalla spora può fuoriuscire di nuovo il batterio. SPORULAZIONE = il batterio si trasforma in spora GERMINAZIONE = dalla spora emerge di nuovo il batterio che poi riprende a replicarli e quindi torna ad essere metabolicamente attivo. ?DESCRIVIMI LA CELLULA BATTERICA ?MI PARLI DEL MICROBIOTA RELAZIONI CHE ESISTONO TRA L’UOMO E I MICRORGANISMI SIMBIOSI = vivere insieme, indica un’interazione tra due organismi, il più grande è chiamato OSPITE mentre il più piccolo SIMBIONTE. Licheni sono simbiosi tra un fungo e un alga. Può essere di tre tipi diversi:
- COMMENSALISMO —>^ indica una^ relazione indifferente per l’ospite e vantaggiosa per il commensale.
- MUTUALISMO —> indica una relazione vantaggiosa per entrambi.
- PARASSITISMO^ —> indica una relazione dannosa per l’ospite ma vantaggiosa per il parassita. La flora microbica si localizza tra il commensalismo e il mutualismo. Il microbiota che è una flora, un gruppo di batteri si localizza nel parassitismo. Gli OPPORTUNISTI sono i microrganismi che normalmente sono asintomatici o danno sintomi lievi ma in alcune condizioni possono diventare patogeni importanti. Un batterio buono può diventare patogeno. EZIOLOGIA =causa di una malattia PATOGENESI = meccanismo di insorgenza e di sviluppo di una malattia PATOGENICITÀ = è la capacità di un microrganismo di causare malattia VIRULENZA = è una misura quantitativa della patogenicità di un microrganismo INFEZIONE = è l’insediamento nel nostro organismo di un microrganismo potenzialmente patogeno
MALATTIA = è un danno causato da un microrganismo che compromette lo stato di salute dell’ospite Infezione è diversa dalla malattia (soggetti asintomatici) MICROBIOTA È la popolazione di microrganismi presenti sul o dentro il corpo umano, nel corpo ci sono più batteri che cellule umane, la maggior parte del microbiota si trova nell’ intestino crasso. Può essere: TRANSIENTE —> quando colonizza l’ospite per un periodo limitato (giorni o settimane) RESIDENTE —> quando c’è in maniera permanente Varia per numero e composizione nelle differenti aere del corpo sotto l’influenza di vari fattori: età, dieta, stato ormonale, stato di salute, condizioni igieniche. In utero il feto è sterile, ma alcuni virus possono attraversare la placenta; il microbiota del bambino si inizia a formare durante il passaggio nel canale del parto, attraverso le mani che toccano il neonato e ingerendo i primi alimenti. Entro poche ore dalla nascita si stabilisce una flora microbica residente nel cavo orale e nel nasofaringe; in circa 24 ore si stabilisce una flora microbica residente intestinale. RUOLO POSITIVO DEL MICROBIOTA :
- STIMOLAZIONE ANTIGENICA —> il microbiota induce la produzione di anticorpi
- RUOLO NELLA NUTRIZIONE E NEL METABOLISMO —> i batteri dell’ intestino producono acidi organici e la vitamina B e K e aiutano nella digestione dei polisaccaridi vegetali
- OSTACOLA LA COLONIZZAZIONE DI PATOGENI —> perché rivestono la mucosa intestinale ,ci protegge dai patogeni Anticorpi= immunoglobuline —> IgM- IgG- IgA- IgE GLI OPPORTUNISTI DIVENTANO PATOGENI:
- Nei soggetti IMMUNODEPRESSI —> pazienti con leucemia, con aids , che fanno uso di farmaci immunosoppressivi
- PER CAMBIAMENTO DI SEDE ANATOMICA —> Escherichia coli, un batterio commensale dell’ intestino, ma puo cambiare sede, se finisce nell’uretra causa cistite; stafiloccocus epidermi; streptococchi viridanti orali, in bocca( fondamentale l’antibiotico prima durante e dopo l’estrazione di un dente per evitare che entrino nel circolo sanguigno e arrivare al cuore causando endocarditi.
- DISMICROBISMO —> cambiamento qualitativo e quantitativo della flora batterica , quindi cambia la composizione e il numero della flora batterica in una sede anatomica, esempio più famoso è nel caso del Clostridium difficile, dopo terapia antibiotica prolifera perché è resistente ai comuni antibiotici, causando malattia come diarrea o colite pseudomembranosa, e perché gli altri batteri del microbiota si sono ridotti quindi ha più spazio. Per candida in vagina causando vaginite. COME AVVIENE LA COLONIZZAZIONE Abbiamo un SUBSTRATO (mucosa-pelle-denti-oggetti), su di esso si accumulano nutrienti per i batteri costituiti da glicoproteine che sono il sito di attacco per i batteri; il batterio singolo prende contatto con la superficie, poi si replica e si formano delle microcolonie, la colonia è un gruppo di batteri che derivano da un batterio iniziale; continuano a crescere finché si forma il BIOFILM , che è
maggior produzione di sebo e occlude il follicolo del pelo, si crea un ambiente anaerobio e causa acne. ALTRI MICRORGANISMI PRESENTI SULLA PELLE TRANSIENTEMENTE SONO:
- Corinebatteri difteroidi —> Gram positivi
- Streptococcus spp. —> Gram positivi
- Escherichia coli —> Gram negativo
- Candida albicans —> lievito FLORA TRANSITORIA DELLE MANI Si trova negli strati più superficiali della cute, è facilmente rimovibile con il lavaggio, spesso viene acquisita dal personale sanitario direttamente dal contatto con i pazienti o indirettamente da superfici contaminate ed inoltre è spesso associata alle infezioni ospedaliere. È costituita da: **- STAFILOCOCCO AUREUS
- ENTEROBATTERI
- ENTEROCOCCHI
- PSEUDOMONAS MICROBIOTA DEL CAVO ORALE** Ci sono tanti batteri situati sul biofilm sulla superficie dei denti ovvero sulla placca dentale. Streptococcus mutans è il batterio associato alle carie, per ridurre la carie è necessario somministrare più fluoro perché viene incorporato nello smalto e lo rende più resistente, fare una corretta igiene orale, soprattutto dopo aver mangiato zuccheri e ridurre gli zuccheri fermentabili e sostituirli con lo xilitolo che è uno zucchero non fermentabile. La carie si forma attraverso reazioni enzimatiche dei batteri che portano due eventi: la decalcificazione delllo smalto causata dai batteri e attraverso la digestione della dentina; I batteri rilasciano enzimi proteolitici che causano la digestione della dentina. Importante rimuoverle perché si possono formare dei GRANULOMI (processo infiammatorio a carico dei tessuti adiacenti al dente) o degli ASCESSI (accumulo di pus nei tessuti che circondano la radice). FLORA INTESTINALE Lo stomaco ha pH acido e quindi ci sono pochissimi batteri; nel duodeno ci sono pochi batteri; nel digiuno e ileo ci sono già milioni di batteri; ma la zona in cui ci sono piu batterti è il colon, ce ne sono miliardi. Sono microrganismi anaerobi Nell’ intestino ci sono 100 milioni di neuroni, che servono per favorire il transito del cibo, ci sono anche tantissime cellule del sistema immunitario; la superficie dell’ intestino è di circa 300 metri quadri per favorire l’assorbimento e la digestione. STOMACO Ci sono pochissimi batteri perchè il pH è acido e perchè il transito del cibo nello stomaco è molto veloce e perchè ci sono delle molecole antimicrobiche., quindi i microrganismi non crescono tranne uno: helicobacter pylori. HELYCOBACTER PYLORI È un bacillo Gram negativo ricurvo a spirale, è mobile, si puo muovere grazie ai flagelli; vive nella mucosa gastrica dello stomaco umano; causa l’ulcera, l’ulcera gastrica/duodenale, gastrite cronica,
puo causare anche il tumore allo stomaco: adenocarcinoma gastrico e linfoma MALT(tessuto linfoide associato a mucose). L’ulcera duodenale è piu frequente di quella gastrica; si forma perchè il batterio rende la mucosa gastrica più sensibile e favorisce l’ insorgenza dell’ulcera. Si stima che meta della popolazione umana sia infetta, cioè che abbia questo batterio nell’organismo, ma solo il 10-15% sviluppa i sintomi, il resto è asintomatico. In alcuni si sviluppa la malattia e in altri no perchè alcuni sono più predisposti geneticamente a sviluppare la malattia e perchè ci sono alcuni ceppi di questo batterio che sono più virulenti. Questo batterio riesce a sopravvivere nello stomaco grazie ad un enzima speciale: l’ UREASI , che neutralizza l’acidità dello stomaco e fa sopravvivere il batterio, inoltre grazie ai flagelli riesce ad entrare nello strato mucoso, e poi ha delle molecole chiamate adesine che gli permettono di attaccarsi e di aderire alle cellule delle mucose e formare uno strato. INTESTINO Ha miliardi di batteri, soprattutto localizzati nel colon. Il microbiota intestinale ha funzione protettiva, perchè forma uno strato sulla mucosa intestinale e cosi ci protegge dall’attacco dei batteri patogeni, evita la colonizzazione dei patogeni; inoltre sono capaci di indurre le IgA (anticorpi, immunoglobuline) che sono secretorie e vengono prodotte a livello delle mucose, e servono per proteggerci da altri batteri; ha anche funzione metabolica, i batteri intestinali producono vitamine K, acido folico e biotina, e favoriscono la digestione dei polisaccaridi vegetali. Con la terapia antibiotica è molto importante prendere i fermenti lattici. CLOSTRIDIUM DIFFICILE È un batterio opportunista (di solito da sintomi lievi ma in alcuni casi può essere patogeno). Diventa patogeno quando c’è una condizione di dismicrobismo, ovvero quando ce un’alterazione della flora quantitativa(diminuiscono) e qualitativa. Dopo terapia antibiotica il numero dei batteri intestinali si riduce, ma clostridium difficile è resistente ai comuni antibiotici e cresce di più. Causa diarrea o enterocolicote pseudomembranosa. Esce dal nostro corpo con le feci, ma è molto resistente nell’ambiente quindi è importante che tutti i pazienti positivi al clostridium difficile siano messi in isolamento perchè con le loro feci contaminate possono infettare altri pazienti. Inoltre forma anche le spore. TRATTO URINARIO La flora nel tratto urinario è presente solo in un punto, perchè solitamente il tratto urinario è sterile; i batteri sono localizzati nell’ URETRA DISTALE (ultimo pezzo), i quali provengono dall’ano, dal colon. È più colonizzata la donna rispetto all’uomo perche c’è meno tratto. Possono causare infezione della vescica (cistite) e infezione dei nei (pielonefrite). Nell’85% dei casi Escherichia Coli causa cistite.(è un opportunista, perche è commensale nel nostro intestino ma diventa patogeno per cambiamento di sede). Se c’e il sospetto di un infezione urinaria per l’urocoltura la raccolta delle urine deve essere fatta con il mitto intermedio (flusso urinario intermedio, secondo pezzo senza interrrompere il flusso), perche nella prima urina ci sono i batteri dell’ uretra distale. TRATTO GENITALE
- SIMMETRIA^ ELICOIDALE^ , quando sono lunghi tubulari —> i capsomeri sono avvolti a spirale intorno al genoma, con struttura molto lunga (virus dell’ ebola, della rabbia)
- SIMMETRIA^ ICOSAEDRICA^ —> hanno forma di un icosaedro (solido con 20 facce e 12 vertici) La simmetria dei capsidi è stata scoperta da Watson e crick FUNZIONI DEL CAPSIDE Protegge il genoma dal danno fisico, chimico ed enzimatico (proteggerlo dalle nucleari che degradano il genoma). Serve per impacchettare il genoma e nel caso dei virus nudi interagisce con le nostre cellule perché non hanno rivestimento. È antigienico, quindi stimola il nostro sistema immunitario e induce la produzione di anticorpi contro le proteine del capside. PERICAPSIDE Costituito da una membrana fosfolipidica che deriva dalle nostre cellule (un pezzo di membrana delle celllule) con all’interno glicoproteine virali che protrudono verso l’esterno. ADENOVIRUS —> virus nudo con capside icosaedrica PAPILOMA VIRUS —> virus nudo, simmetria icosaedrica HERPERVIRUS —> virus rivestito a simmetria icosaedrica VESCUCULAR STOMATITIS VIRUS —> rivestito a simmetria elicoidale EBOLA —> rivestito a simmetria elicoidale. (Mortale al 50%) BATTERIOFAGI Sono i virus che infettano i batteri. Hanno la testa con il capside che contiene il genoma, un corpo e delle appendici usate per prendere contatto con la cellula ospite, dopo che si attacca si piega e inietta il DNA nel batterio. CLASSIFICAZIONE DEI VIRUS
- in base all’ospite —> virus dell’uomo, piante, dei batteri
- In base al genoma —> DNA o RNA
- In base alla simmetria del capside —> icosaedrica o elicoidale
- In base alla presenza o assenza del pericapside —> nudi o rivestiti
- In base all’architettura del genoma —> singolo o doppio filamento, frammentato
- In base all’ omologia di sequenza genetica —> sì sequenzia il genoma, si comparano i genomi, usato per trovare nuove varianti (sars cov 2)
- In base alle strategie replicative dei virus —> sono uno diverso dall’altro per come si replicano nelle cellule. REPLICAZIONE DEI VIRUS DENTRO LE CELLULE Diverse fasi del ciclo replicativo :
- ATTACCO ALLA CELLULA —> il virus si attacca ad un recettore cellulare (sulla superficie) (recettore cellulare di HIV e cd4, di sars cov 2 è ace-2)
- PENETRAZIONE —> entra nella cellula per fusione delle membrane, si fondono il pericapside e la membrana delle cellule, o per endocitosi, il virus entra e viene avvolto da una vescicola.
- DENUDAMENTO —> perde il capside e resta solo il genoma (scapsidazione)
- REPLICAZIONE DEL GENOMA —> per formare i genomi della progenie (dei milioni di virus che si formeranno nella cellula) (enzima —> dna polimerasi che può essere o della cellula o del virus)
- SINTESI DELLE PROTEINE VIRALI —> servono, avviene dall’una si formano gli amminoacidi presi dai nostri ribosomi
- ASSEMBLAGGIO DEL VIRUS —> si forma il capside con dentro il genoma
- Adesso il virus è pronto ad uscire, e quando esce si avvolge di membrane che diventano pericapside nel caso dei rivestiti. Dopo la sintesi proteica alcune proteine vanno ad inserirsi nella membrana. Le fasi del ciclo replicativo rappresentano i bersagli per la terapia antivirale, dove si bersaglia una componete virale. (Enzima che replica i virus) Ci sono pochi farmaci contro i virus perchè sono nascosti dentro le cellule. Ci sono tante vie di trasmissione dei virus: **- PER VIE AEREA
- PER VIE OROFECALE
- SESSUALMENTE
- PER VIA EMATICA
- PER VIA VERTICALE (DA MADRE A FETO)** Una volta che il virus entra nel corpo l’iniezione è LOCALIZZATA o SISTEMICA (il virus entra in circolo raggiunge altri organi) DIAGNOSI DEI VIRUS Per fare diagnosi dei virus si utilizzano i test sierologici, che ricercano la risposta anticorpale, vanno a ricercare se abbiamo anticorpi specifici per quel virus, è una tecnica di ricerca indiretta perche non si ricerca il virus ma gli anticorpi. Poi abbiamo la diagnosi diretta dove si ricerca il genoma virale, è la tecnica più specifica, diagnosi molecolare, è la migliore. Si possono anche cercare gli antigeni/ le proteine del virus, ha molti falsi negativi o falsi positivi. La diagnosi del virus si può fare anche coltivando il virus in laboratorio, vuol dire che prendo il campione biologico sospetto, infetto le cellule e guardo se il virus danneggia le cellule. (Coltura cellulare) è estremamente costosa, si fa per isolare il virus, non è una tecnica che si usa sempre ma è usata soprattutto per fare ricerca in laboratorio e produrre vaccini. Chi produce vaccini in alcuni casi deve produrre prima tanti tanti virus. Il vaccino per l’influenza si produce dentro le uova embrionale del pollo perche è un ambiente ideale per il virus. In laboratorio si infettano le colture cellulari, che sono strati di tante cellule. Per capire se il virus si sta replicando nelle cellule si osserva l’effetto cito pratico, ovvero dal danno che il virus causa nelle cellule. Cellule rotonde sono quelle in cui si sta replicando il virus. Il virus del morbillo causa la formazione di sincipsi, sono cellule multinucleate fuse insieme da parte del virus, e cosi è nascosto e il nostro sistema immunitario non lo vede. IL VIRUS PUÒ CAUSARE TUMORE PAPILOMA virus causa carcinoma della cervice Virus dell’epatite B e C possono causare epatocarcinoma. ITER DEL CAMPIONE BIOLOGICO E DIAGNOSI MICROBIOLOGICA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA È l’identificazione del microrganismo patogeno che ha causato quella malattia, il fine ultimo è la scelta della terapia appropriata. ITER DEL CAMPIONE BIOLOGICO
- (^) fase pre-analitica —> fase in cui il medico richiede un esame, si raccoglie il campione e si invia in laboratorio.
contenitori sterili e di strumenti sterili è fondamentale per evitare contaminazioni da parte di microrganismi ambientali. Alcuni campioni provenienti da zone che dovrebbero essere sterili come quelli mostrati in tabella, solitamente sono raccolti dopo il passaggio attraverso orifizi non sterili nei quali è presente un microbiota residente che può contaminare i campioni. Ciò deve essere considerato nell’interpretazione dei risultati. Ad esempio, il sangue raccolto per eseguire l’EMOCOLTURA potrebbe essere contaminato da batteri presenti sulla cute del paziente, qualora non fossero adottate misure di pulizia e di asepsi della cute prima dell’esecuzione del prelievo. VALUTAZIONE DEL GRADO DI CONTAMINAZIONE DEL CAMPIONE DA PARTE DELLA FLORA MICROBICA RESIDENTE L’escreato non deve essere eccessivamente contaminato da microrganismi residenti nel tratto orofaringeo. Tale valutazione viene eseguita con un esame microscopico preceduto da colorazione di Gram. Il rapporto granulociti/cellule pavimentose viene valutato come indicazione della contaminazione da parte delle vie aeree superiori. Le cellule pavimentose sono presenti a livello del cavo orale; un alto numero di cellule pavimentose è indicativo della contaminazione da parte della flora microbica residente nel cavo orale. I granulociti sono indicativi di un’infezione delle basse vie respiratorie. Questo rapporto deve essere a favore dei granulociti, per potere affermare che il campione biologico origini correttamente ed esclusivamente dalle basse vie aeree. Il referto preliminare si basa sulla visualizzazione di batteri al microscopio; l’esame colturale standard permette di rilevare ed identificare una specie batterica. Ricerche mirate per microrganismi particolari vengono condotte su richiesta esplicita del personale medico che ha in cura il paziente. TECNICHE DI PRELIEVO UROCOLTURA Viene fatto prima della terapia antibiotica, deve essere raccolto 5 ore prima dall’ultima minzione; si preleva il MITTO INTERMEDIO ovvero non la prima minzione, poiché nella prima vi può essere contaminazione da batteri commensali dell’uretra distale. In caso di catetere è necessario chiudere il catetere con pinza al di sopra del raccordo con la sacca per almeno un’ora; disinfettare il catetere al di sopra della giunzione con il tubo di raccordo, dopo aspirare con una siringa sterile e inserire in contenuto in un contenitore sterile. Se possibile sostituire il catetere prima del prelievo, è necessario lavarsi bene le mani e indossare i guanti sterili, pulire esternamente il catetere con alcool 70%. SACCHETTO DI PLASTICA ADESIVO PEDIATRICO
- Lavare accuratamente i genitali, la zona sovra-pubica e perineale
- Applicare il sacchetto facendolo aderire al perineo ed alla zona sovrapubica
- La minzione deve avvenire entro 30’ altrimenti rimuovere il sacchetto e ripetere l’operazione
- Rimuovere il sacchetto e inviarlo al laboratorio ben chiuso in un contenitore sterile PUNTURA SOVRAPUBICA Neonati, pazienti pediatrici, in caso di cateterizzazione è controindicata.
COPROCOLTURA
—> prelievo: raccolta di feci in un contenitore sterile con paletta e consegna al laboratorio entro poche ore dal prelievo(eventualmente refrigerato) —> tampone rettale EMOCOLTURA Il sangue è un campione normalmente sterile, ma in particolari processi infettivi può essere colonizzato da microrganismi di diverse specie (setticemia). In corso di setticemia, il sangue è il campione clinico da utilizzare per l’esame colturale. È necessario effettuare tre prelievi consecutivi di sangue ad intervalli di 15/20 minuti all’inizio del rialzo della febbre, prima dell’inizio della terapia antibiotica o, se necessario iniziarla, prima della somministrazione del farmaco. Il volume di sangue da prelevare cambia a seconda dell’età del paziente: 10ml per i soggetti adulti, 5ml per i bambini e 2ml per i neonati. Il campione ematico, al momento del prelievo, in presenza di anticoagulante, deve essere introdotto mediante l’uso di un ago sterile all’interno di appositi contenitori pronti all’uso, contenenti terreni di coltura appropriati per l’isolamento di batteri aerobi, anaerobi e funghi. I contenitori inoculati (almeno due per paziente) devono essere inviati celermente al laboratorio di microbiologia per consentire l’incubazione a 37°C; in alternativa è possibile conservarli a temperatura ambiente, è molto importante NON refrigerarli. Il prelievo viene sempre eseguito in doppio, essendo che si utilizzano bottiglie differenti per batteri aerobi e anaerobi. In laboratorio di microbiologia si utilizzano degli incubatori a temperatura costante per permettere la crescita dei batteri eventualmente presenti nel sangue. L’abitazione delle bottiglie permette una crescita microbica migliore. Strumentazioni automatizzate permettono la lettura in continuo, al fine di rilevare in tempi rapidi segnali di una crescita microbica nel campione in esame. —> MODALITÀ DI RACCOLTA
- Effettuare il lavaggio antisettico delle mani
- Detergere la cute con alcool isopropilico e lasciare asciugare
- Applicare clorexidina/soluzione alcolica/tintura di iodio nella zona del prelievo con movimenti concentrici dal centro alla periferia (non toccare la cute pulita)
- Decontaminare con alcool i tappi dei flaconi
- Indossare guanti sterili e pungere il sito con l’ago ad un’estremità del dispositivo e inserire l’ago posto all’altra estremità nel tappo di gomma del flacone —> TRASPORTO : inviare subito in laboratorio o conservare per massimo16/18 h a temperatura ambiente. LIQUOR Il liquidocefalorachidiano, detto anche liquor o liquido celebrospinale, è un fluido corporeo trasparente ed incolore che si trova nel sistema nervoso centrale. Tra le sue varie funzioni, quella di ridurre il peso dell’encefalo e di consentirne la perfusione a pressioni costanti, trovandosi al di sopra della pompa cardiaca. Il liquor agisce come cuscinetto per il cervello, fornendo una protezione meccanica e immunologica di base al cervello all’interno del cranio. Il liquido celebrospinale svolge anche una funzione vitale nell’autoregolazione del flusso sanguigno cerebrale. Occupa lo spazio subaracnoideo, tra le meningi aracnoide e pia madre, permea la corteccia cerebrale, il midollo spinale, i globi oculari, ma occupa anche gli spazi interni al sistema nervoso centrale: cisterne, ventricoli cerebrali e canale midollare.
CAMPIONI LA CUI COLTURA NON FORNISCE NOTIZIE
CLINICHE SIGNIFICATIVE
Lesioni peridontali: categoria di patologie infettive del dente. Catetere Foley: è un tubo flessibile posizionato lungo l’uretra e si ancora alla vescica per il tramite di un palloncino riempito di soluzione fisiologica. DIAGNOSI MICROBIOLOGICA La diagnosi eziologica di una malattia da infezione consiste nell’identificazione del microrganismo patogeno che ne è la causa. Il suo fine ultimo è la scelta della terapia appropriata. Per poter eseguire una diagnosi microbiologica corretta è necessario prelevare il campione clinico adeguato. La diagnosi eziologica può essere:
- DIRETTA —> prevede la ricerca dell’agente patogeno o di suoi componenti nel campione clinico. Metodi di diagnosi diretta sono l’osservazione microscopica riservata ad agenti patogeni cellulari (batteri, miceti, parassiti). Per i virus è necessario il microscopio elettronico. Nel caso di diagnosi microbiologica, l’esame può essere effettuato a fresco o dopo colorazione semplice o differenziale. Può essere effettuato direttamente qualora provenga da un distretto corporeo normalmente sterile o comunque contenente una sola specie microbica (liquor, sangue). Più frequentemente viene effettuato dopo l’isolamento colturale a partire da colonie isolate su terreni agarizzati al fine di indirizzare le procedure di identificazione del microrganismo. Altro metodo di diagnosi diretta è quindi l’isolamento tramite coltura: i microrganismi vengono fatti crescere su terreni artificiali o nel caso dei virus su linee cellulari. Infine la diagnosi diretta comprende anche la ricerca di antigeni microbici o la ricerca del genoma microbica (PCR)
- INDIRETTA —> prevede la ricerca degli anticorpi sierici (sierologia) nei confronti dell’agente infettivo (rileva la risposta immune del paziente all’infezione). Particolarmente importante quando l’agente patogeno non può essere coltivato nei terreni di laboratorio o quando la coltura è particolarmente pericolosa per il personale di laboratorio. È importante per fare diagnosi di infezione recente o pregressa. Le IgM sono le prime ad essere prodotte, hanno un’emivita relativamente breve e il loro ritrovamento è indicativo di infezione recente. Le IgG vengono invece prodotte in un secondo momento, hanno un’emivita lunga e la loro presenza è indicativa di un’infezione pregressa. DIAGNOSI DIRETTA OSSERVAZIONE MICROSCOPICA Si può fare a fresco o dopo colorazione semplice o differenziale. Le preparazioni a fresco sono usate per le cellule del sangue o microbi in campioni fluidi(urina,feci); ci possono essere cisti, uova, parassiti nelle feci, funghi in prelievi cutanei; protozoi nel sangue e nei tessuti. Gli organismi viventi possono essere esaminati anche per rilevarne la motilità. I coloranti invece vengono applicati su materiale secco, fissato su vetrino con calore o alcool. I campioni stessi o i microrganismi provenienti da colture possono essere colorati. Per i micobatteri si utilizza una colorazione diversa perché con quella di Gram non si colorano. La colorazione in questione è quella di Ziehl-Nielsen che prevede l’utilizzo del calore per veicolare la
fucsina all’interno delle cellule. Successivamente, i micobatteri resistono alla decolorazione con acido e alcool mentre altri no; perciò sono definiti alcool- resistenti e acido-resistenti. COLTURA DEI MICRORGANISMI IN LABORATORIO Per la coltivazione dei microrganismi è necessario un terreno di coltura. Il terreno in questione è una soluzione liquida o solida che contiene sostanze nutritive per la crescita di microrganismi in vitro. Organismi diversi richiedono una composizione diversa, ma tutti richiedono alcuni macronutrenti fondamentali. I principali macronutrienti sono C, O, N. Altri sono H, P, S,K, Mg, Ca, Fe. Il terreno di coltura deve contenere la corretta quantità di nutrienti, deve avere il corretto pH, deve contenere la corretta quantità di ossigeno, inizialmente deve essere sterile e deve essere incubato alla corretta temperatura. I terreni liquidi si preparano pesando gli ingredienti necessari e poi aggiungendo acqua distillata. Sono usati per fare crescere grosse quantità di batteri. Hanno però lo svantaggio che non permettono di differenziare il microrganismo. La torbidità è indice di crescita batterica. I terreni solidi sono molto più usati in diagnostica. I primi esperimenti di Koch erano fatti su patate bollite, che vennero poi sostituite da una gelatina. Questa però fondeva a 37°C, temperatura ottimale per la crescita batterica. Quindi venne poi sostituita dall’agar che è un estratto polisaccaridico di un’alta marina che fonde a 80°C e rimane liquido fino a 40°C. Per seminare i batteri in piastra occorre utilizzare un’ansa sterile. Una piccola quantità di brodocoltura viene seminata sulla piastra utilizzando la tecnica dei quadranti: la viene idealmente suddivisa in 4 quadranti. Si semina prima un quadrante, poi si ruota la piastra di 90 gradi, si semina il quadrante risultante, si ruota di nuovo e così fino a seminare tutta la piastra. Poiché si sono prelevati i batteri una sola volta, l’ultimo quadrante seminato conterrà la quantità minore di batteri. Sono necessarie almeno 12 ore affinché da una singola cellula batterica si formi un numero di cellule sufficiente per essere viste ad occhio nudo. I terreni di coltura possono essere:
- DEFINITI^ —> quando l’ossidazione parte da un composto organico si parla di chemioeterotrofi, se invece parte da un composto inorganico si parla di organismi chemioautotrofi. L’ossidazione è operata secondo due processi fondamentali: la FERMENTAZIONE e la RESPIRAZIONE. Sono preparati aggiungendo all’acqua distillata precise quantità di sostanze organiche ed inorganiche altamente purificate.
- COMPLESSE^ —> la cui composizione non è del tutto nota, questo perchè derivano da materiale organico a basso costo e sono principalmente estratti di carne, costituiti da proteine parzialmente idrolizzate, estratti di soia, di lievito, il sangue e il siero. Sono anche detti TERRENI NUTRITIVI. La maggior parte dei campioni clinici infetti, come le feci e l’urina, contiene diversi tipi di microrganismi per cui quando seminati su terreno solido si formano delle colture miste che si presentano sotto forma di colonie con diversa morfologia visibili a occhio nudo. Le diverse colonie
DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO
L’identificazione del microrganismo isolato in coltura si realizza studiandone le proprietà biochimiche, antigeniche e genomiche. Prima si coltiva il microrganismo per ottenere la coltura pura e poi si eseguono i saggi biochimici per l’identificazione del microrganismo in coltura pura. Il sistema API è costituito da strip plastificati su cui sono posizionati dei pozzetti contenenti dei reagenti disidratati/dei terreni. Si utilizza una sospensione cellulare per idratare tutti i pozzetti. In ogni pozzetto si realizzerà una reazione (idrolisi, fermentazione, decarbossilazione, ecc.) facilmente interpretabile dal cambio di colore del pozzetto. Ogni test positivo viene cerchiato e ad esso associato un valore numerico. Si otterrà un codice numerico, e dal codice si risale alla specie microbica consultando un database di riferimento. L‘ Enterotube è formato da un tubo sterile contenente un ago o un tampone da inoculo e dodici scompartimenti contenenti ciascuno un terreno di coltura di tipo differenziale, ovvero che contiene un indicatore il cui colore vira alla presenza di particolari sostanze o caratteristiche permettendo all'operatore di identificare il microrganismo in questione. Rimuovendo i tappi ai lati del sistema si può procedere al prelevamento di una colonia (precedentemente all'utilizzo di questo metodo bisogna aver coltivato i batteri in modo da avere colonie isolate) direttamente con la punta del tampone e dell'ago da inoculo. Successivamente, avendo cura di toccare ogni terreno, estrarre e reinserire senza disinfettare il sistema di inoculo. Alcuni degli scompartimenti richiedono la presenza di ossigeno per reagire per questo il dispositivo è dotato di fori in prossimità di questi scomparti che vengono aperti dopo l'inoculo. Richiudere dunque l' enterotube e riporlo su superficie piana a 37° gradi per ventiquattro ore. Trascorso il tempo di incubazione è possibile interpretare l‘ enterotube senza l'ausilio di particolari macchinari ma confrontando le colorazioni assunte dai terreni con quelle di un'apposita legenda. Per l’identificazione di un virus isolato in colture cellulari più frequentemente si ricorre alla caratterizzazione antigenica mediante immunofluorescenza. Oggi nei laboratori analisi si utilizzano sistemi automatizzati che identificano il patogeno e ne studiano la sensibilità. PROVE BIOCHIMICHE Si deve partire da una coltura pura, viene fatta con sistema API e denterò tube. Il sistema API è costituito da strip plastificati su cui sono posizionati dei pozzetti contenenti dei reagenti disidratati. Si utilizza una sospensione cellulare per idratare tutti i pozzetti; in ogni pozzetto si realizzerà una reazione (idrolisi, fermentazione) facilmente interpretabile dal cambio di colore. Un codice è generato per ogni risposta ai vari test, dal codice si risale poi alla specie microbica. ENTEROTUBE È un sistema colorimetrico per l’identificazione delle Enterobatteriacee, sfrutta una serie di test biochimici per la rapida identificazione di un microrganismo batterico appartenente al genere degli
Enterobatteri, solitamente viene utilizzato per velocizzare le operazioni di identificazione e di analisi dei campioni presunti portatori di patogeni. È formato da un tubo sterile contenente un ago o un tampone da inoculo e 12 scompartimenti contenenti ciascuno un terreno di coltura di tipo differenziale, ovvero che contiene un indicatore il cui colore vira alla presenza di particolari sostanze o caratteristiche, permettendo all’operatore di identificare il microrganismo in questione. SCELTA DEL FARMACO ANTIMICROBICO Dopo avere identificato il batterio responsabile dell’infezione nel paziente, si esegue l’Antibiogramma per valutare la sensibilità del batterio isolato a vari farmaci antibatterici. Il metodo di Kirby-Bauer è un saggio di diffusione in agar basato sull’utilizzo di dischetti impregnati con quantità note di farmaci antibatterici (un singolo dischetto per ciascun farmaco antibatterico saggiato). I dischetti vengono applicati su una piastra di terreno solido preventivamente inoculata, omogeneamente e in modo standardizzato, con una sospensione del batterio in esame isolato dal paziente. I farmaci, diffondendo dai dischetti, creano un gradiente di concentrazione inversamente proporzionale alla distanza dal disco. Dopo il periodo di incubazione (16-20 ore a 35 °C) vengono misurati gli aloni di inibizione della crescita batterica intorno ai dischetti. La dimensione degli aloni di inibizione è inversamente proporzionale alla MIC del farmaco contenuto nel dischetto per il ceppo batterico saggiato (aloni di inibizione grandi sono indicativi di MIC basse, e viceversa). Facendo riferimento a valori soglia forniti da Organismi Internazionali di riferimento, le misure degli aloni di inibizione vengono interpretate in modo qualitativo, ed il ceppo batterico viene classificato come Sensibile, Intermedio, o Resistente ai rispettivi farmaci antibatterici. Studio della sensibilità del batterio a vari antibiotici; il metodo di diffusione= il diametro dell’alone è indicativo se il batterio è sensibile, intermedio o resistente. C’è una proporzione diretta tra MIC e alone. MIC = concentrazione più bassa del farmaco che è in grado di inibire la crescita del microrganismo. Per la diagnosi diretta vengono anche utilizzati dei sistemi automatizzati per identificazione e antibiogramma —> Vidas, Phoenix. DIAGNOSI INDIRETTA La Diagnosi indiretta prevede la ricerca degli anticorpi sierici («sierologia») nei confronti dell’agente infettivo (rileva la risposta immune del paziente all’infezione). Particolarmente importante quando l’agente patogeno non può essere coltivato nei terreni di laboratorio (es. per la sifilide) o quando la coltura è particolarmente pericolosa per il personale di laboratorio. E’ importante per fare diagnosi di infezione recente o pregressa. Le IgM sono le prime ad essere prodotte e hanno un’emivita relativamente breve e il loro ritrovamento è indicativo di infezione recente. Le IgG vengono invece prodotte in un secondo momento, hanno un’emivita lunga e la loro presenza è indicativa di un’infezione pregressa. Per stabilire se un paziente è immune nei confronti di un determinato agente patogeno in seguito ad infezione naturale o a vaccinazione si ricercano le IgG specifiche sul singolo campione di siero. Per effettuare diagnosi di infezione recente è possibile ricercare le IgG in due campioni di siero per evidenziare la siero-conversione: se siero acuto (prelevato all’esordio della malattia) è IgG-negativo mentre il siero convalescente è IgG-positivo, allora la presenza di IgG è indicativa di infezione recente. Nel caso in cui nel campione siano presenti sia IgG che IgM, può essere necessario datare il momento dell’infezione determinando l’indice di avidità delle IgG. Le IgG a bassa avidità sono indicative di
