Geometria Molecolare dell'Acqua e Interazioni Intermolecolari, Appunti di Biochimica

Scarica Geometria Molecolare dell'Acqua e Interazioni Intermolecolari e più Appunti in PDF di Biochimica solo su Docsity! BIOCHIMICA Antoine-Laurent Lavoisier (1743-1794) aveva notato la relativa semplicità del mondo minerale rispetto alla complessità dei mondi vegetale ed animale che sapeva essere costituiti da composti ricchi di carbonio, ossigeno, azoto e fosforo. L’idea che tutti gli organismi viventi abbiano un’origine comune è basata in parte sull’universalità delle trasformazioni chimiche e degli intermedi chimici, che va spesso sotto il nome di unitarietà biochimica. | quattro elementi più abbondanti negli organismi viventi espressi come percentuale del numero totale di atomi, sono l'idrogeno, l'ossigeno, l'azoto e il carbonio, che insieme ammontano al 99% della massa della maggioranza delle cellule. Gli elementi presenti in traccia rappresentano solo una minuscola frazione in peso del corpo umano, ma sono tutti essenziali per la vita, soprattutto perché sono indispensabili per la funzione di specifiche proteine, tra cui molti enzimi. Secondo un'ipotesi, i primi organismi viventi, si sono formati sotto la spinta di potenti forze atmosferiche, come raggi UV, scariche elettriche o eruzioni vulcaniche, sui gas presenti nell'atmosfera terrestre prebiotica, oppure sui soluti inorganici delle correnti profonde oceaniche superriscaldate. Questa ipotesi è stata sottoposta a verifica in un classico esperimento sull’origine abiotica della vita, condotto nel 1953 da Stanley Miller nel laboratorio di Harold Urey. Miller sottopose miscele gassose come quelle presumibilmente presenti sulla Terra in era prebiotica a scariche elettriche prodotte da una coppia di elettrodi, quindi analizzò il contenuto del recipiente in cui era avvenuta la reazione. Dopo aver sottoposto a scariche elettriche la RUBINETTO miscela gassosa, i prodotti sono stati raccolti per PERIL PRELIEVO DI CAMPIONI SCARICA ELETTRICA CONDENSATORE condensazione. La fase gassosa della miscela risultante conteneva CO e CO... La fase acquosa conteneva una serie di composti organici. Questo esperimento dimostrò la possibilità di produzione abiotica di biomolecole in tempi GOCCIOLINE D'ACQUA ] FovrenìcaLoRE relativamente brevi e in condizioni relativamente blande. Altri esperimenti condotti con tecniche più sofisticate hanno dimostrato che altri componenti chimici presenti nelle cellule viventi possono formarsi nelle condizioni dell'esperimento di Miller. L'acqua è la sostanza più abbondante in tutti gli esseri viventi e rappresenta più del 70% del peso della maggior parte degli organismi. La geometria della molecola di acqua è determinata dalla disposizione dei due orbitali elettronici esterni dell'ossigeno, simile a quella degli orbitali sp? di legame del carbonio. Questi orbitali descrivono grosso modo un tetraedro, con un atomo di idrogeno a due degli angoli e gli elettroni non condivisi agli altri due. Il legame H—O—H ha un angolo di 104,5°. Il nucleo dell'ossigeno attrae molto più frequentemente del nucleo dell'idrogeno; ciò significa che l'ossigeno è più elettronegativo. La distribuzione degli elettroni in compartecipazione tra H e O non è quindi simmetrica. Il risultato di questa distribuzione ineguale degli elettroni è la formazione di due dipoli elettrici nella molecola dell’acqua, uno lungo ciascuno dei legami H—O. L’attrazione elettrostatica tra l'atomo di ossigeno di una molecola e l'atomo di idrogeno di un’altra detta legame idrogeno. Ogni atomo di idrogeno di una molecola di acqua condivide una coppia di elettroni con l'atomo di ossigeno. 1,77 À lunghezza del legame idrogeno. | legami idrogeno sono relativamente deboli e nell'acqua allo stato liquido hanno un'energia di dissociazione di circa 23kJ/mole, rispetto ai 470kJ/mole del legame covalente. La vita media di ogni legame varia da 1a 20 picosecondi (1ps=10””°s); dopo la rottura di un legame idrogeno, se ne forma immediatamente un altro. Allo stato liquido, a temperatura ambiente e a pressione atmosferica, le molecole sono in uno stato disordinato e in continuo movimento. Nel ghiaccio, ogni molecola di acqua è bloccata nello spazio e forma quattro legami idrogeno con molecole vicine, determinando una struttura lineare a reticolo. La disposizione quasi tetraedrica degli orbitali attorno all’ossigeno consente a ogni molecola di di acqua di formare legami idrogeno con altre quattro molecole vicine. L’acqua ha un punto di fusione, un punto di ebollizione e un calore di evaporazione più elevati rispetto agli altri liquidi che conosciamo. Quando il ghiaccio fonde o l’acqua evapora, il sistema assorbe calore: H30 solida) ? H2Ofiquida) AH = +5,9k]/mole H20(iquida) > H20(gassosa) AH = +44,0kJ/mole Durante la fusione o l’evaporazione, l'entropia del sistema acquoso aumenta per il fatto che la disposizione ordinata delle molecole di acqua nel ghiaccio decade in quella meno ordinata dello stato liquido o addirittura nel caos dello stato gassoso. La variazione di energia libera deve avere un valore negativo perché il processo sia spontaneo: AG=AH-TAS. È l’aumento dell’entropia AS che rende il AG negativo e che favorisce le trasformazioni. Elemento | Elettronegatività o 3,5 cl 3,0 N 3,0 Ss 2,5 Cc 2,5 P 2,1 H 2,1 cu 1,9 Fe 1,8 Co 1,8 Mg 1,2 Ca 1,0 Na 0,9 K 0,8 La chimica degli organismi viventi è organizzata intorno al carbonio, che corrisponde a più della metà del peso secco della cellula. Il carbonio può formare legami singoli con gli atomi di idrogeno, e un legame singolo o un legame doppio con l'ossigeno e con l’azoto. Quando due atomi privi di carica vengono portati molto vicini l'uno all’altro, le loro nuvole elettroniche si influenzano vicendevolmente. | due dipoli si attraggono debolmente l’un l’altro, avvicinando ancora i due nuclei. Queste deboli attrazioni sono chiamate interazioni di van der Waals. Ogni atomo che ha un suo caratteristico raggio di van der Waals, che è misura di quanto l'atomo permette ad un altro atomo di avvicinarsi. Le interazioni con covalenti che abbiamo descritto, cioè i legami idrogeno e ionici, le interazioni idrofobiche e di van der Waals, sono molto più deboli dei legami covalenti. Occorre un apporto energetico di circa 350 kJ per romper una mole di legami C—C e di circa 410 kJ per rompere una mole di legami C—H, ma sono sufficienti appena 4 kJ per rompere una mole di tipici legami di van der Waals. La forza delle interazioni ioniche e dei legami idrogeno varia in funzione della polarità del solvente e dell’allineamento degli atomi che formano il legame, ma è comunque significativamente inferiore a quella dei legami covalenti. L'interazione fra le molecole di soluto e di solvente è favorita quasi quanto le interazioni idrofobiche e di van der Waals si formano e si rompono continuamente. La Terra si formò circa 4,6 miliardi di anni fa e le prime forme di vita risalgono a 3,5 miliardi di anni fa. In qualche parte sulla Terra, durante il primo miliardo di anni, forse comparve il primo semplice organismo. 0 500 Diversificazione degli eucarioti multicellulari (piante, funghi, plastidi) 1000 Alghe rosse e verdi. Endosimbionti (mitocondri, plastidi) 1500 Protisti, i primi eucarioti 2000 2500 Batteri aerobi otici. Sviluppo di un'atmosfera ricca di O, 3000 3500 Cianobatteri fotosintetici che producono O.. Solfobatteri fotosintetici. Metanogeni 4000 Formazione degli oceani e dei continenti 4500 Formazione della Terra Si possono classificare gli organismi sulla base dell’energia e degli atomi di carbonio richiesti per sintetizzare il materiale cellulare. Esistono due ampie categorie basate sulle sorgenti di energia: i fototrofi assorbono e usano la luce solare, e i chemiotrofi traggono la loro energia dall’ossidazione dei combustibili chimici. Alcuni chemiotrofi, i litotrofi, ossidano combustibili inorganici. Gli organotrofi ossidano una grande varietà di composti organici disponibili nell'ambiente. | fototrofi possono essere suddivisi in organismi che ottengono tutto il carbonio di cui hanno bisogno dalla CO; (autotrofi), o che richiedono nutrienti organici (eterotrofi). Tutti gli organismi one Conbistiila Fototrofi Chemiotrofi Nu iaibustibilo Sorgente {energia dalla luce) Conergia dall'ossitazione dei corebustibili climi ossidato dî energia Litotrofi Organotrofi (combustibili (combusubili inorganici) organici) Sorgente Eterotrofi HS în S; S in S0,}; NO Sorgent Autotrofi a {HSinS; a NO, di carbonio | (aMetiiacoS (carbonio dai composti in NO;; Fe*in Fe) organici) maggioranza dei batteri Tutti gli cucarioli non fovotrofici Pianto vascolari Batteri verdi Idrogeno batteri [ Cianobarteri Batteri purpurci Batteri sulfurei Tutti gli organismi viventi possono essere suddivisi in tre grandi gruppi, che corrispondono a tre branche evolutive che si dipartono da un progenitore comune. Due di questi gruppi sono costituiti da organismi unicellulari, distinguibili sulla base delle loro caratteristiche biochimiche e genetiche: i batteri e gli archea. Tutti gli organismi eucariotici raggruppati nel terzo dominio si sono evoluti dalla stessa branca da cui sono derivati gli archea. Bacteria Archaea Eucarya Green Filamentous Myxomycota Spirochetes bacteria Entamoebae Gram positive: Methanosarcina Methanobacterium | Halophiles Methanococcus Proteobact Cyanobacteria Planetomyces. Thermoproteus! [Pyrodicticum Flagellates Bacteroides, Cytophaga Trichomonads ‘Microsporidia Thermotoga Diplomonads Aquifex Le cellule animali e vegetali hanno di norma un diametro compreso tra 5 e 100 um e molti batteri sono lunghi solo 10 2 um. | caratteri distintivi delle cellule eucariotiche sono il nucleo e vari organelli circondati da membrana, con funzioni specializzate: i mitocondtri, il reticolo endoplasmatico, il complesso di Golgi, i perossidi e i lisosomi. Le cellule vegetali contengono anche i vacuoli e i cloroplasti. Golgi apparatus Peroxisome- Pilus REavER Celi membrane Capsule Nucleus. Nucleolus Nuclecid Ribosomes tyeareme Cell wall Centriole Smooh ER Cyioplasm Mesosome Cytoskeleton È: degni Mitochondrion Le cellule batteriche hanno in comune alcune caratteristiche strutturali, ma mostrano anche alcune caratteristiche gruppo-specifiche. La cellula batterica possiede una membrana esterna protettiva e una membrana plasmatica interna che racchiude il citoplasma e il nucleotide. La membrana plasmatica e gli strati più esterni costituiscono l'involucro cellulare. Negli archea la rigidità è dovuta alla presenza di un polimero differente. Le membrane plasmatiche dei batteri sono formate da un sottile doppio strato lipidico in cui sono immerse proteine. Il nucleotide contiene una singola molecola circolare di DNA e il citoplasma contiene uno o più segmenti circolari di DNA di piccole dimensioni, chiamati plasmidi. | plasmidi conferiscono la resistenza alle tossine e agli antibiotici presenti nell'ambiente. La maggior parte dei batteri esistono sotto forma di cellule isolate, ma le cellule di alcune specie batteriche tendono ad associarsi, formando aggregati cellulari. Negli habitat aerobici, caratterizzati dall’abbondante disponibilità di ossigeno, alcuni organismi traggono l'energia dal trasferimento degli elettroni dalle molecole combustibili all’ossigeno. Altri habitat sono invece anaerobici, cioè praticamente privi di ossigeno, e i microrganismi che vi si sono adattati ottengono energia dal trasferimento degli elettroni al nitrato, al solfato o alla CO.. Le proteine mediano tutti i processi che hanno luogo nelle cellule e svolgono un numero enorme di funzioni. Le proteine sono formate sempre dalla stessa serie di 20 amminoacidi, uniti covalentemente in caratteristiche sequenze lineari. Le proteine sono polimeri di amminoacidi in cui ogni residuo amminoacidico è unito a quello vicino da un legame covalente. Gli amminoacidi possono essere considerati come le unità costruttive con cui gli organismi diversi possono generare prodotti molto diversi, come enzimi, ormoni, anticorpi, trasportatori, fibre muscolari, ecc. Il primo amminoacido a essere scoperto fu l’asparagina, nel 1806; l’ultimo è stata la treonina nel 1938. L’asparagina fu trovata per la prima volta negli asparagi. Tutti i 20 amminoacidi presenti nelle proteine sono a-amminoacidi. Il codice a tre lettere è di facile interpretazione, perché consiste delle prime tre lettere del nome inglese dell’amminoacido. Il codice a una lettera è stato introdotto al tempo dei computer per ridurre le dimensioni dei file. Amminoacido | Abbreviazione | Peso pK -COOH | pK-NH3* |pKgruppo | pl punto eM® molecolare R isoelettrico | cm! Gruppi R alifatici non polari Glicina Gly G 75 2,34 9,60 5,97 Alanina Ala A 89 2,34 9,69 6,01 Prolina Pro P 115 1,99 10,96 6,48 Valina Val Vv 117 2,32 9,62 5,97 Laucina Leu L 131 2,36 9,60 5,98 Isoleucina Ile I 131 2,36 9,68 6,02 Metionina Met M 149 2,28 9,21 5,74 Gruppi R aromatici Fenilalanina Phe F 165 1,83 9,13 5,48 125 Tirosina Tyr Y 181 2,20 9,11 10,07 5,66 1490 Triptofano Trp w 204 2,38 9,39 5,89 5500 Gruppi R polari non carichi Serina Ser Ss 105 2,21 9,15 5,68 Treonina Thr T 119 2,11 9,62 5,87 Cisteina Cys Cc 121 1,96 10,28 8,18 5,07 Asparagina Asn N 132 2,02 8,80 5,41 Glutammina Gin Q 146 2,17 9,13 5,65 Gruppi R carichi positivamente Lisina Lys K 146 2,18 8,95 10,53 9,74 Istidina His H 155 1,82 9,17 6,00 7,59 Arginina Arg R 174 2,17 9,04 12,48 10,76 Gruppi R carichi negativamente Aspartato Asp D 133 1,88 9,60 3,65 2,77 Glutammato Glu E 147 2,19 9,67 4,25 3,22 In tutti gli amminoacidi il carbonio a è legato a quattro gruppi differenti: un gruppo carbossilico, un gruppo ‘amminico, un gruppo R e un atomo di idrogeno. Il carbonio a è un centro chirale. *Gruppi R carichi positivamente (basi). | gruppi R più idrofilici sono quelli che contengono cariche nette sia positiva che negative. La lisina, che ha un secondo gruppo amminico primario nella posizione e della sua catena alifatica. L’arginina, che ha un gruppo guanidinico carico positivamente. L’istidina, che contiene un gruppo imidazolico aromatico. L’istidina è il solo amminoacido delle proteine ad avere una catena laterale ionizzabile con pK, vicino alla neutralità. *Gruppi R carichi negativamente (acidi). A pH 7,0 sono l’aspartato e il glutammato, ognuno dei quali ha un secondo gruppo carbossilico. La misura dell’assorbimento della luce con uno spettrofotometro è utilizzata per identificare le molecole e per valutare la loro concentrazione in soluzione. Legge di Lambert-Beer: log10® = ecl , . Io a L'espressione log107 viene detta assorbanza e indicata con A. L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto. Il coefficiente di estinzione molare varia con la natura chimica del composto, con il solvente, con la lunghezza d'onda e anche con il pH. Oltre ai 20 amminoacidi comuni ce ne sono degli altri. Per esempio la 4-idrossiprolina, un derivato della prolina, e la 5-idrossilisina, un derivato della lisina. La prima si trova nelle proteine della parete cellulare delle cellule vegetali ed entrambe si trovano nel collageno. H3N—CH:—CH—CH—CH;—CH—C00" OH NH3 La 6-N-metillisina si trova nella miosina, un proteina contrattile del muscolo. CH3—-NH—CH—CH>—CHa— CH; —CH—C00" NH; Il y-carbossiglutammato, presente nella protrombina, una proteina che partecipa al processo di coagulazione del sangue. (colo) 00C—CH—CH;—CH—C00 NH3 La desmosina, un derivato di quattro residui di lisina presente nella proteina fibrosa elastina. La selenocisteina contiene selenio al posto dell'atomo di zolfo della cisteina. HSe—CH,—CH—COO NH3 La fosforilazione è una modificazione reversibile molto comune finalizzata alla regolazione delle attività delle proteine. o o CH 0—P—0—CH;—CH—C00 0—P—0—CH—CH—C00 o NH; o NH; o 0-0) — CH;—CH—C00 o NH; Modificazioni irreversibili, sono intermedi della biosintesi dell’arginina nel ciclo dell’urea e non si trovano nelle proteine. H3N—CH,—CH>—CHo—CH—C00 HaN—C—N—CH;—CH7—CH,—CH—C00 NH; O H NH; | gruppi amminici e i gruppi carbossilici degli amminoacidi, insieme ai gruppi R ionizzabili di alcuni di essi, agiscono da acidi e basi deboli. Quando un amminoacido che non possiede un gruppo R ionizzabile viene sciolto in acqua a pH neutro, esso esiste in soluzione sotto forma di ione dipolare, o zwitterione, e può comportarsi come acido o base. I composti che hanno questa doppia natura sono detti anfoterici e spesso sono chiamati anfoliti. La titolazione acido-base comporta la graduale aggiunta o rimozione di protoni a gruppi funzionali ionizzabili. | due gruppi ionizzabili della glicina, il gruppo carbossilico e il gruppo amminico, vengono titolati con una base forte come l’NaOH. La curva di titolazione mostra due fasi distinte. A pH bassi prevale la forma completamente protonata della glicina. AI punto di mazzo della prima fase della titolazione, il gruppo -COOH della glicina perde il protone, e concentrazioni equimolari delle due forme protonata e non protonata si equivalgono. Per la glicina il pH al punto di mezzo è 2,34, quindi il suo gruppo -COOH ha un pK di 2,34. A pH 5,97 si può osservare un punto di flesso, a cui corrisponde la rimozione quasi completa del primo protone. La seconda fase della titolazione corrisponde alla rimozione di un protone dal gruppo -H3'. Il pH corrispondente al punto di mezzo di questa fase della titolazione è 9,60 e corrisponde al pK; del gruppo —NH:. La titolazione è completa a pH 12. Gli amminoacidi con un solo gruppo amminico, un solo gruppo carbossilico e un gruppo R non ionizzabile ha valori di pK, molto simili, anche se non identici: il pK del gruppo -COOH ha una variabilità da 1,8 a 2,4e il pK: del gruppo —NH3* ha una variabilità da 8,8 a 11,0. Gli amminoacidi con un gruppo R ionizzabile hanno curve di titolazione più complesse, con tre fasi corrispondenti alle tre possibili tappe di ionizzazione; quindi avremo in questi casi tre valori di pK,. Il caratteristico pH al quale la carica netta è zero si chiama punto isoelettrico, o pH isoelettrico. pl =3(K; + pKa) | peptidi presenti negli organismi viventi hanno dimensioni che variano da due o tre residui amminoacidici fino a migliaia di residui. Due molecole di amminoacidi possono unirsi mediante un legame ammidico, chiamato legame peptidico. Questo tipo di legame si genera per eliminazione di una molecola di acqua. La formazione di un legame peptidico è un esempio di una reazione di condensazione (reazione endoergonica). Quando il numero degli amminoacidi è relativamente piccolo la struttura viene detta oligopeptide (2<n<50 AA); se gli amminoacidi sono invece tanti, il prodotto viene chiamato polipeptide (n>>50 AA). Le proteine possono avere migliaia di residui amminoacidici. Le unità amminoacidiche presenti in un peptide sono spesso chiamate residui. In un peptide, il residuo amminoacidico con cui termina la catena polipeptidica, il residuo ‘amminoterminale, ha il gruppo amminico libero; il residuo all’altra estremità ha un gruppo carbossilico libero ed è il residuo carbossiterminale. 0H CHA i H H CH (H CH, H CH + Ì MaN_f — DE + ec E 1 000 TH do Hd Ho Ho H Estremit: rm ammini L’estremità amminoterminale viene posta a sinistra e quella carbossilica a destra. L’idrolisi del legame peptidico, nonostante sia una reazione esoergonica, avviene molto lentamente per l'elevata energia di attivazione. | peptidi contengono un solo gruppo amminico libero e un solo gruppo carbossilico libero, posti alle estremità. Molti peptidi di piccole dimensioni svolgono la loro funzione biologica a concentrazioni molto basse. Tra questi vi è l’ossitocina, che viene secreta dalla ghiandola pituitaria posteriore e stimola la contrazione dell'utero. Alcuni veleni estremamente tossici dei funghi, sono anch'essi piccoli peptidi, come pure alcuni antibiotici. Alla fine degli anni ’30 Pauling e Corey iniziarono una serie di studi che gettarono le basi per la comprensione della struttura delle proteine. Essi iniziarono con un'analisi dettagliata delle proprietà del legame peptidico. Gli atomi di carbonio a di residui amminoacidici adiacenti sono separati da 3 legami covalenti (Ca -C-N- Ca). Studi condotti con la tecnica della diffrazione dei raggi X hanno dimostrato che il legame peptidico C- N (1.32 À) è più corto del legame C — N (1.47 À) di una ammina primaria. Queste osservazioni indicavano l’esistenza di una risonanza o di una parziale condivisione di due coppie di elettroni tra l'ossigeno carbonilico e l'azoto ammidico. L’ossigeno ha una carica parziale negativa e l'azoto una carica parziale positiva, generando così un dipolo. Utilizzando modellistiche molecolari più raffinate, si è visto che si possono formare a eliche partendo sia da L- che da D- amminoacidi. Però, tutti i residui devono appartenere ad una sola serie di stereoisomeri. Gli L-amminoacidi che si trovano in natura possono formare eliche destrorse e sinistrorse, ma le eliche sinistrorse sono in teoria meno stabili. Ciascuno dei 20 amminoacidi mostra una specifica propensione, o meno, ad assumere una conformazione ada elica e questo dipende dalle proprietà del gruppo R. Interazioni tra catene laterali possono stabilizzare o destabilizzare la struttura ad a elica. Una limitazione alla formazione dell’a elica è rappresentata dai residui di Pro e Gly che hanno la propensione più bassa a formare l’a elica. Nella prolina, l'atomo di azoto fa parte di un anello rigido e non è possibile alcuna rotazione intorno al legame N—Ca. Inoltre, l'atomo di azoto di un residuo di Pro impegnato in un legame peptidico non ha l’atomo di idrogeno sostituente che è necessario per generare un legame idrogeno con altri residui. La prolina è raramente presente all’interno di un’a elica. La glicina è difficilmente presente in un’a elica. Ha una flessibilità conformazionale superiore a tutti gli altri residui. | polimeri di glicina tendono ad assumere strutture avvolte casualmente. In ogni legame peptidico esiste un piccolo dipolo elettrico. Questi dipoli si sommano attraverso i legami idrogeno presenti nell’elica e quindi il dipolo netto aumenta con la lunghezza dell'elica. Gli amminoacidi carichi negativamente sono spesso presenti vicino all'estremità amminoterminale del segmento elicoidale, dove possono generare interazioni stabilizzanti con la carica positiva del dipolo dell'elica. Vi sono cinque tipi di restrizioni che alterano la stabilità dell'elica: 1.La propensione intrinseca di un residuo amminoacidico a formare un’a elica. 2.L’interazione tra gruppi R, specialmente quelli che si trovano lontani 3 o 4 residui. 3.L’ingombro sterico di gruppi R adiacenti. 4.La presenza di residui di Pro e Gly. 5.Le interazioni tra residui amminoacidi che si trovano alla fine del segmento dell'elica e il dipolo elettrico dell’a elica. Nella conformazione f lo scheletro della catena polipeptidica si estende in una conformazione a zig-zag. Si tratta di una configurazione più estesa della catena polipeptidica. In questa disposizione delle catene polipeptidi che, detta foglietto f, i legami idrogeno si formano tra regioni adiacenti delle catene polipeptidiche. | gruppi R di amminoacidi adiacenti sporgono dalla struttura a zig-zag in direzioni opposte, creando un'alternanza “sopra-sotto” che è possibile osservare nella prospettiva laterale. Le catene polipeptidiche adiacenti di un foglietto B possono essere parallele o antiparallele (possono cioè avere lo stesso orientamento o un orientamento opposto del legame carbamidico NH—CO). Le due strutture sono abbastanza simili, anche se il periodo che si ripete è più corto per la conformazione parallela (6,5 À) mentre l’antiparallela è leggermente più lunga (7 À), e la disposizione dei legami idrogeno è diversa. Nelle strutture f tipiche l'angolo $=-119°, p=+113° (parallela) e d=-139°, w=+135° (antiparallela). | filamenti B si possono anche combinare a formare un foglietto B misto, con alcune coppie di filamenti antiparalleli ed altre paralleli. | foglietti B antiparalleli sono più stabili di quelli paralleli: i legami idrogeno dei foglietti B antiparalleli hanno una geometria più favorevole. | foglietti B non hanno momento dipolare. Tutti i foglietti B osservati (paralleli, antiparalleli e misti) presentano una torsione (twist) destrorsa (fino a 30°) di ciascun filamento B che li compone. Nelle proteine globulari hanno una struttura ripiegata compatta, dove la catena polipeptidica inverte la sua direzione. Molto comuni sono i ripiegamenti B, che collegano le estremità di due segmenti adiacenti di un foglietto B antiparallelo. La struttura consiste di un ripiegamento a 180° di una sequenza di quattro residui. Residui di glicina e di prolina spesso si trovano nei ripiegamenti B; i primi in quanto hanno una struttura piccola e flessibile; i legami peptidici che coinvolgono l'azoto imminico della prolina assumono facilmente la configurazione cis, particolarmente adatta ai foglietti R. | ripiegamenti f di tipo | e Il sono i più comuni. Il tipo | ha una frequenza nelle proteine circa doppia rispetto al tipo Il. Il ripiegamento K di tipo Il ha sempre il residue Gly alla terza posizione. Meno comune è il ripiegamento y, formato da tre residui, con un legame idrogeno tra il primo e il terzo. Si osserva quando solo un amminoacido non è coinvolto nei legami idrogeno caratteristici del foglietto R. La disposizione nello spazio di tutti gli atomi di una proteina viene definita come struttura terziaria. La struttura terziaria tiene conto delle relazioni a lungo raggio nella sequenza amminoacidica. Segmenti della catena polipeptidica vengono mantenuti nelle loro caratteristiche posizioni tipiche della struttura terziaria tramite diversi tipi di interazioni deboli e talora anche tramite legami covalenti, come i ponti disolfuro che si instaurano tra segmenti diversi di una proteina. Alcune proteine contengono due o più catene polipeptidiche distinte, o sub unità, che possono essere identiche o diverse. La disposizione di quelle sub unità in complessi tridimensionali prende il nome di struttura quaternaria. Le proteine fibrose hanno catene polipeptidiche disposte in lunghi fasci o foglietti. Le proteine globulari hanno catene polipeptidiche ripiegate e assumono forme globulari o sferiche. Le proteine fibrose sono costituite in gran parte da un unico tipo di struttura secondaria e la struttura terziaria è relativamente semplice, mentre le proteine globulari contengono più tipi di struttura secondaria. Le proteine fibrose hanno proprietà tali da conferire resistenza e/o elasticità alla struttura di cui fanno parte. Tutte le proteine fibrose sono insolubili in acqua. Per poter studiare le proprietà strutturali e funzionali di una proteina per prima cosa bisogna ottenerla in forma pura. | metodi classici sfruttano le proprietà che differenziano una proteina dall’altra, tra cui la grandezza, la carica e le proprietà di legame. La fonte della proteina è in genere un tessuto o una coltura di cellule batteriche. Il primo passaggio di purificazione consiste nella rottura delle cellule, provocando il rilascio delle proteine in una soluzione, chiamata estratto grezzo. Si può utilizzare la centrifugazione frazionata. Una volta ottenuto l’estratto grezzo, l'estratto viene sottoposto a trattamenti che hanno lo scopo di separare le diverse proteine in frazioni, sfruttando proprietà come la grandezza e la carica, mediante un processo chiamato frazionamento. Nel frazionamento si possono utilizzare vari tipi di separazione delle proteine: 1.Solubilità: salting out con il solfato di ammonio. 2.Carica: cromatografia a scambio ionico. 3.Dimansioni: cromatografia ad esclusione molecolare. 4.Specificità: cromatografia di affinità. La solubilità generalmente diminuisce in funzione della concentrazione salina, un effetto chiamato salting out. L'aggiunta di certi sali nella quantità giusta può selettivamente precipitare solo alcune proteine, mentre altre rimangono in soluzione. Il solfato di ammonio è particolarmente adatto allo scopo, e vien spesso usato per precipitare le proteine. Il metodo più adatto alla separazione delle proteine è la cromatografia su colonna, che sfrutta differenze di carica, grandezza, affinità di legame e altre proprietà. Un tubo di vetro viene riempito di un materiale solido poroso dotato di proprietà chimiche opportune (fase stazionaria), e una soluzione tampone (fase mobile) viene fatta percolare attraverso la colonna. La soluzione proteica viene stratificata sulla sommità della colonna e patta percolare attraverso la matrice solida, e diffondendo lungo la colonna tende a dividersi in zone contenenti proteine diverse. Le singole proteine migrano più o meno velocemente in base alle loro proprietà. Al A n La cromatografia a scambio ionico sfrutta le differenze nel tipo e nell’intensità della carica elettrica netta delle proteine ad un certo pH. Le resine con gruppi carichi negativamente sono dette scambiatori di cationi e quelle con gruppi carichi positivamente scambiatori di anioni. La separazione può essere ottimizzata variando gradualmente il pH e/o la concentrazione salina della fase mobile. Nella cromatografia a scambio ionico, la diffusione della banda proteica nella fase mobile è causata sia dalla separazione delle proteine, che hanno proprietà diverse, sia dalla semplice diffusione della banda. Nella cromatografia a scambio cationico la matrice solida possiede gruppi carichi negativamente. Nella fase mobile le proteine con una carica netta positiva migrano verso la matrice più lentamente di quelle con una carica netta negativa, in quanto la migrazione delle prime viene ritardata dall’interazione con la fase stazionaria. Man mano che la soluzione contenente le proteine fuoriesce dalla colonna, porzioni successive dell’effluente vengono raccolte in una serie di provette. Tutte le frazioni positive che contengono la proteina di interesse vengono riunite e costituiscono il prodotto finale basato sulla cromatografia a scambio ionico di questa tappa.