biochimica applicata parte di biologia molecolare, Sbobinature di Biochimica

Scarica biochimica applicata parte di biologia molecolare e più Sbobinature in PDF di Biochimica solo su Docsity! NUCLEOTIDI I nucleotidi rappresentano la forma di energia corrente che viene utilizzata nelle attività metaboliche. I nucleotidi fungono da segnali chimici (es AMP ciclico). I nucleotidi sono i componenti strutturali di un certo numero di cofattori enzimatici (NADH/FADH) I nucleotidi sono i costituenti degli acidi nucleici. GLI ACIDI NUCLEICI Acido deossiribonucleico (DNA): contiene tutte le informazioni necessarie per la sintesi di un prodotto biologico funzionale (sintesi di una proteina). Acido ribonucleico (RNA): ampio spettro di funzioni RNA ribosomale (rRNA): componente strutturale dei ribosomi, i complessi ove ha luogo la sintesi proteica 1. RNA messaggero (mRNA): intermediario che porta l’informazione genetica ai ribosomi per la sintesi della 2. proteina. RNA di trasferimento (tRNA): adattatore che traduce fedelmente le informazioni presenti su mRNA in una 3. specifica sequenza di aminoacidi. STRUTTURA DEI NUCLEOTIDI Basi azotate + zucchero (pentosio-> ribosio o deossiribosio) + gruppo fosfato legato all’ossidrile 5’ del ribosio Nel deossiribosio il gruppo ossidrilico -OH nella posizione 2’ (-OH) viene sostituito da un atomo di idrogeno. BASI AZOTATE Le basi azotate si distinguono in pirimidine e purine. Tra le pirimidine ci sono: citosina, timina (nel DNA) e uracile (nel RNA in sostituzione della timina); tra le purine ci sono: adenina e guanina. RIBOSIO RNA DEOSSIRIBOSIO DNA NUCLEOSIDE Il nucleoside è formato da base azotata e zucchero. Il legame tra la base azotata e lo zucchero è un legame n- beta-glicosidico. NUCLEOTIDI I nucleotidi sono costuiti da una base azotata, uno zucchero e un gruppo fosfato. La base azotata si lega allo zucchero in corrispondenza: dell’azoto in posizione 9 se la base azotata è una purina • Dell’azoto in posizione 1 se la base azotata è una pirimidina • Negli acidi nucleici i nucleotidi sono uniti da legame fosfodiestere. Gli acidi nucleici sono dei polimeri di nucleotidi. Se il numero di nucleotidi è basso si parla di oligonucleotidi. I nucleotidi del DNA e dell’RNA sono uniti tra loro in successione mediante “ponti” costituiti da gruppi fosforici in cui il gruppo fosforico in posizione 5’ di un nucleotide è unito al gruppo ossidrilico 3’ del nucleotide precedente (legame fosfodiestere). Lo scheletro covalente di un acido nucleico è quindi costituito da un’alternanza di gruppi fosfato e residui di pentosio. Le basi azotate sono considerate come gruppi laterali uniti allo scheletro. Lo scheletro covalente del DNA e dell’RNA è idrofilico perché ci sono i gruppi fosfato che attirano l’H2O. Le basi puriniche e pirimidiniche sono molecole aromatiche con una delocalizzazione elettronica degli atomi legami idrogeno che tengono unite le due catene. Il superavvolgimento è un processo altamente regolato. Le topoisomerasi aumentano e o diminuiscono il grado disavvolgimento. Le topoisomerasi di tipo I:rompono transitoriamente una sola delle catene del DNA, introducendo un giro di elica e portando un rilassamento della doppia elica superavvolta. Il processo è termodinamicamente favorevole. Le Topoisomerasi tipo II (girasi): agiscono rompendo entrambe le catene, tolgono giri di elica e quindi aumentando i superavvolgimenti. Utilizzano ATP. Ci sono antibiotici inibitori delle topoisomerasi batteriche. Sono detti antibiotici chinolonici. Il cromosoma non si compatta. Altri farmaci come le antracicline antitumorali inibiscono le topoisomerasi umane. Negli eucarioti il DNA è lineare. Il ciclo cellulare eucariotico produce notevoli cambiamenti nella struttura dei cromosomi. I cromosomi diventano molto più condensati durante la profase della mitosi separandosi in un numero ben definito di coppie di cromatidi fratelli. Il DNA della cromatina interagisce strettamente con proteine, gli istoni che condensano e ordinano il DNA in unità strutturali chiamate nucleosomi. Gli istoni sono di 5 tipi, sono proteine di dimensioni relativamente piccole e sono H1, H2A, H2B, H3 e H4. Si forma un nucleo istonico formato da: H2A,H2B, H3 e H4 in duplice coppia. Il DNA si avvolge attorno la nucleo istonico. Il Nucleosoma è costituito da 200 coppie di basi, di cui 146 legate a 8 istoni. Le rimanenti 54, sono DNA di collegamento. L’istone H1 si lega nel DNA di collegamento. Se si considera la struttura senza l’istone H1 la struttura è detta “a collana di perle”. Questa struttura si compatta ulteriormente e forma una sorta di solenoide grazie alla presenza degli istoni H1. L’avvolgimento intorno agli istoni rende il DNA 7 volte più compatto. La compattazione del DNA nei cromosomi supera le 10000 volte, ciò è dovuto ad organizzazioni strutturali di livello superiore. LA REPLICAZIONE DEL DNA La replicazione (o duplicazione) è il meccanismo molecolare attraverso cui viene prodotta una copia del DNA cellulare. Ogni volta che una cellula si divide, l'intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso alla progenie. REGOLE DELLA REPLICAZIONE La replicazione è semiconservativa: ciascuna delle catene del DNA serve da stampo per la sintesi di una 1. nuova catena, generando due molecole di DNA ognuna delle quali contiene una catena neosintetizzata ed una parentale. La replicazione inizia da un sito d’origine e procede in entrambe le direzioni. Il punto di ramificazione delle 2. due catene parentali si chiama forcella replicativa. La sintesi del DNA procede sempre in direzione 5’-3’ ed è semidiscontinua. Viene detta semidiscontinua 3. perché i due filamenti sono antiparalleli e la sintesi complementare di uno dei due filamenti non sarà in modo continuo. L’elica usata come stampo viene letta dall’estremità 3’ verso l’estremità 5’. Una delle due nuove catene di DNA viene sintetizzata sottoforma di brevi frammenti denominati frammenti 4. di OKAZAKI, quindi ho una catena sintetizzata in modo continuo (catena veloce o leader) e una discontinua (catena lenta o ritardata). La DNA polimerasi si muove in una sola direzione. Le due catene vengono sintetizzate contemporaneamente. REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA 1. Ciascuna delle catene del DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova catena. Replicazione semiconservativa vuol dire che se partiamo da una molecola di DNA, le molecole figlie avranno un filamento parenterale che è quello usato come stampo e un filamento di nuova sintesi. Questo è stato dimostrato in un esperimento chiamato di Meselson-Stahl. Questi due scienziati per dimostrare che la replicazione del DNA fosse semiconservativa hanno preso delle cellule di E.coli e le hanno fatte crescere su un terreno di coltura che conteneva come fonte di azoto l’isotopo 15^N (un isotopo pesante). Ovviamente il DNA incorporava questo isotopo pesante. Dopo un ciclo cellulare il DNA veniva estratto dalle cellule e centrifugato in gradiente di densità di cloruro di cesio. Si vedeva la formazione di una banda sul fondo della provetta, questo stava a dire che il DNA aveva un certo peso proprio perché conteneva l’15^N (aveva quindi un peso maggiore del nostro DNA che contiene l’isotopo 14^N). Successivamente in un secondo esperimento sono state prese le cellule di DNA 15^N e sono state fatte crescere in un terreno che conteneva come fonte di azoto il normale 14^N che veniva incorporato nelle cellule. Una volta estratto il DNA da queste cellule e centrifugato in gradiente di cloruro di cesio si otteneva una banda più leggera rispetto a quella precedente e che aveva un peso che stava a metà tra il DNA “pesante” e quello che si presuppone essere il DNA “leggero” (solo con 14^N). Questo esperimento ha fatto pensare ai due scienziati che avessimo una molecola ibrida, cioè si ebbe la presupposizione che la duplicazione fosse un processo semiconservativo perché in questa generazione cellulare avremo una molecola con catena parentale che contiene l’15^N mentre l’altro filamento (di nuova sintesi) contiene l’14^N. Se in un terzo esperimento facciamo fare un altro ciclo cellulare in presenza di 14^N succede che otteniamo sia DNA ibrido che DNA leggero. 2. La replicazione inizia da un sito d'origine e procede in entrambe le direzioni. I punti di ramificazione delle due catene parenterali si chiama forcella replicativa. Nel caso di un DNA circolare le due forcelle di replicazione si incontrano in un punto della circonferenza opposto all’origine. Se consideriamo il cromosoma di E.coli, questo ha un DNA circolare. Si avrà l’apertura della doppia elica e la replicazione procederà in due sensi: orario e antiorario. La replicazione terminerà in un punto del cromosoma che sarà esattamente opposto rispetto a quello che è il sito di origine della replicazione. 3 e 4 . La sintesi del DNA procede sempre in direzione 5’→3’. L’elica usata come stampo viene letta in direzione 3’→5’ Avendo il filamento parenterale (stampo) che procede da 3’-5’, il filamento di nuova sintesi procederà dalla direzione 5’-3’ in modo continuo e voloce. Se consideriamo l’altro filamento parentale che ha direzionalità 5’-3’, in questo la sintesi del nuovo filamento avviene per frammenti (di Okazaki) siccome non possiamo fare una sintesi da 5’-3’ continua. Poiché la sintesi deve procedere sempre in direzione 5’→3’ e simultaneamente nella direzione della forcella replicativa, la catena lenta viene sintetizzata in modo discontinuo nei frammenti di Okazaki poi riuniti dalla DNA ligasi. ENZIMI CHE DEGRADANO IL DNA: NUCLEASI O DNAsi Ci sono due tipi di nucleasi: Esonucleasi: cominciano a digerire il DNA a partire dalle estremità della catena; effettuano i tagli alle • estremità della catena, liberando singoli nucleotidi. Se le esonucleasi tagliano a partire dall'estremità 3’ vengono chiamate esonucleasi 3’-5’. Se le esonucleasi tagliano a partire dall'estremità 5’ vengono chiamate esonucleasi 5’-3’. In poche parole, le esonucleasi sono in grado di tagliare i legami fosfodiesterici sia in un senso che nell’altro. Endonucleasi: tagliano la catena all'interno producendo delle interruzioni a filamento singolo. • ENZIMI CHE SINTETIZZANO IL DNA: DNA POLIMERASI Il meccanismo di azione è comune a tutte le DNA polimerasi. Inizialmente abbiamo una catena di DNA che si sta formando a partire da un filamento stampo. L’appaiamento delle basi avviene secondo le regole di Watson- Crick. Bisogna inserire quindi i nucleotidi per costruire il nuovo DNA. Supponiamo che sul nostro filamento stampo il prossimo nucleotide da appaiare è la timina, il nucleotide da aggiungere dovrà avere come base azotata l’adenina. Tutti i nucleotidi che entrano per formare il legame fosfodiestere entrano come deossiribonucleosidi-tri-fosfato. È fondamentale che ci sia un -OH libero in posizione 3’. Durante la formazione del legame fosofdiestere, l’ossigeno del gruppo -OH in 3’ compierà un attacco nucleofilo nei confronti del fosforo in α del nostro deossiribonucleoside-tri-fosfato entrante. A livello del sito attivo del nostro enzima ci sono 2 atomi di Mg2+ fondamentali affinché l'enzima possa esplicare la sua attività catalitica. Senza i due atomi di Mg2+ la DNA polimerasi non funziona. Il primo atomo di Mg facilita la deprotonazione dell’OH in 3’ rendendolo un nucleofilo più efficace. Il secondo favorisce allontanamento del pirofosfato. Questo gruppo viene idrolizzato dalla pirofosfatasi rompendo il legame fosfoanidridico che comporta la liberazione di una certa quantità di energia ha la funzione di spostare la reazione verso destra e di quindi renderla irreversibile. Anche la RNA polimerasi ha lo stesso modo operativo. Sono poi presenti una serie di siti di legame per una proteina che si chiama DnaA. Sono 8 siti sparsi. Otto molecole di DnaA andranno a legarsi corrispettivamente ciascuna ad uno dei 8 siti. Si forma un ottamero. Il DNA va ad avvolgersi attorno all’ottamero formando una sorta di solenoide che porta ad un superavvolgimento positivo. La tensione creata dal superavvolgimento porta alla denaturazione della sequenza 2 che ricca di adenina e timina. In questo modo la doppia elica si apre nella regione della sequenza 2. A questo punto una proteina DnaC va a portare due l’elicasi a livello della sequenza 2, che cominciano a svolgere il DNA in senso orario e antiorario. Si formano così le forcelle di replicazione. La DNA polimerasi III si lega all’elicasi tramite la sua subunità Ϯ (tau). Insieme all’elicasi scorre anche la DNA polimerasi che intanto sintetizza il filamento complementare. FASE DI ALLLUNGAMENTO La sintesi del filamento veloce e del filamento lento è contemporanea. Il primo enzima che interviene nella fase di allungamento è la primasi che ha la funzione di sintetizzare il primer sia per la catena veloce sia per ogni frammento di Okazaki del filamento lento. Prendendo in considerazione il filamento veloce, la primasi si lega all’elicasi e sintetizza il primer; dopodichè la DNA polimerasi III comincia a sintetizzare il filamento veloce usando come stampo il filamento di DNA. La sintesi della catena veloce ha direzionalità 5’-3’ (come la direzionalità della DNA polimerasi III). Il filamento lento ha direzionalità diversa di quella della DNA polimerasi III. A livello della forcella replicativa il filamento lento viene arrotolato a formare una sorta di ansa in modo tale che la sintesi del filamento di Okazaki, per un breve tempo, sia in direzionalità 5’-3’. Una volta che l’ansa viene sciolta la direzionalità del filamento lento cambia e diventa 3’-5’. In questo modo la sintesi a livello del filamento lento può comunque avvenire nonostante la sua direzionalità sia opposta. La DNA polimerasi III, come avevamo visto precedentemente, ha dei nuclei all’interno dei quali entrano i filamenti di DNA che vengono agganciati grazie alle pinze scorrevoli. La sintesi del filamento veloce avviene senza alcun problema. La DNA polimerasi III continua a scorrere lungo il DNA e ad un certo punto, l’ansa comincia ad allargarsi sempre di più e il DNA comincia a “tirare” comportando il rischio che si possa rompere per l’alta tensione che si sviluppa. Bisogna far in modo che l’ansa venga sciolta per impedire la rottura del DNA. Per sciogliere l’ansa interviene inizialmente una primasi che sintetizza un nuovo primer per il frammento di Okazaki successivo. Nel momento stesso in cui l’ansa comincia a tirare, la pinza scorrevole che tiene agganciato il filamento di DNA al nucleo che sta sintetizzando il filamento lento, viene rilasciata e di conseguenza l’ansa viene sciolta. Nello stesso tempo una nuova ansa viene formata e il complesso caricatore della pinza blocca nuovamente l’ansa con una nuova pinza scorrevole al nucleo in modo tale che venga sintetizzato un nuovo frammento di Okazaki. Il risultato finale è una serie di frammenti di Okazaki tutti separati fra di loro e ognuno con il proprio primer. A questo punto è necessario eliminare tutti i primer agganciati ai frammenti di Okazaki e unirli fra di loro. Interviene la DNA polimerasi I che avendo attività esonucleasica 5’-3’ toglie i ribonucleotidi del primer e aggiunge al loro posto i deossiribonucleotidi. Nello stesso momento l’attività di correzione di bozze controlla che siano introdotti i nucleotidi giusti. Nel momento in cui tutti i ribonucleotidi sono stati tutti sostituiti, i frammenti di Okazaki devono essere legati l’uno all’altro. Ciò che lega i frammenti di Okazaki tra di loro è la DNA ligasi. La DNA ligasi catalizza la formazione del legame fosfodiestere tra il gruppo -OH del frammento di Okazaki e il fosfato in 5’ del frammento di Okazaki successivo. La catena lenta sarà alla fine una catena “continua” senza interruzioni. FASE DI TERMINAZIONE Sul cromosoma di E.coli ci sono dei veri e propri siti di terminazione dove la DNA polimerasi III viene bloccata. Questi siti di terminazione vengono chiamate trappole. Ci sono 2 trappole: • Una trappola per la forcella replicativa in senso orario • Una trappola per la forcella replicativa in senso antiorario Ci sono due trappole perché come abbiamo detto prima ci sono due forcelle replicative e perciò ci saranno due DNA polimerasi che vanno una in senso antiorario e una in senso orario. A livello di queste trappole sono presenti delle sequenze chiamate sequenze TER che legano una proteina che si chiama TUS. Il complesso Tus-Ter va a bloccare la forcella di replicazione. Quando la forcella di replicazione raggiunge la proteina Tus che si è legata alla sequenza Ter, questa si blocca. Alla fine della fase di terminazione avremo due cromosomi figli. Negli eucarioti i cromosomi sono lunghi e le forcelle di replicazione sono più di una. RNA L’RNA è una macromolecola polimerica data dall'unione di tanti ribonucleotidi. L’RNA a contiene lo zucchero ribosio al posto del deossiribosio presente nel DNA e nell’RNA la base azotata uracile sostituisce la timina. Contrariamente al DNA, l’RNA si trova nella forma di filamento singolo che ha direzionalità 5’-3’. La maggior parte degli RNA è sotto forma di catene singole che si avvolgono su se stesse, producendo variazioni strutturali molto più numerose del DNA. Le molecole di RNA a catena singola possono avere delle sequenze autocomplementari che fanno si che si vengano a formare dei tratti a doppia elica all’interno della stessa catena. L’RNA trasmette l’informazione genica, partecipa alla sintesi delle proteine e può agire da catalizzatore. L’insieme di tutte le molecole di RNA prodotte dalla cellula è detto trascrittoma. Abbiamo: RNA ribosomale (rRNA): componente strutturale dei ribosomi, i complessi ove ha luogo la sintesi proteica 1. RNA messaggero (mRNA): intermediario che porta l’informazione genetica ai ribosomi 2. RNA di trasferimento (tRNA): adattatore che traduce fedelmente le informazioni presenti su mRNA in una 3. specifica sequenza di aminoacidi. Oltre a questi ci sono una serie di RNA diversi all’interno della cellula come i small interfering RNA (siRNA) che sono rare molecole di RNA (20-30 nucleotidi) a doppio filamento che presentano all’estremità 3’ due nucleotidi non appaiati che sporgono dal resto della molecola. Sono coinvolte in un processo chiamato interferenza dell’RNA, in grado di sopprimere l’espressione di determinati geni impedendone la trascrizione (li “spengono”). siRNA prodotti artificialmente possono essere utilizzati per silenziare specifici geni di cui si conosce la sequenza e quindi essere impiegati in diversi campi, tra cui quello farmacologico. In poche parole, i siRNA impediscono ad alcuni geni di essere trascritti in RNA messaggero e che quindi vengano tradotti in proteine. LA TRASCRIZIONE La sintesi di RNA si definisce trascrizione ed avviene per opera della RNA polimerasi. L’RNA polimerasi richiede come stampo il DNA, non necessita di primers (come per la replicazione del DNA) e interessa brevi segmenti del DNA (gene). L’RNA polimerasi si lega in corrispondenza di specifiche sequenze di DNA chiamate promotori. L’RNA polimerasi trascrive solamente dei brevi tratti di DNA perché sono i geni che devono essere trascritti. La trascrizione avviene in direzionalità 5’-3’. Il meccanismo d’azione della RNA polimerasi è lo stesso visto precedentemente per la DNA polimerasi, ma in questo caso prendiamo in considerazione i ribonucleosidi-tri-fosfato. Anche in questo caso ci sono i due ioni Mg2+ e svolgono le stesse funzioni. La catena di DNA stampo che viene usata dalla RNA polimerasi è quella che ha direzionalità 3’-5’ Il trascritto di RNA avrà la stessa sequenza della catena non stampo (catena codificante) ma la differenza è che al posto delle timine ci saranno gli uracili. È la catena non stampo che contiene l’informazione che poi verrà tradotta in proteina. Es. (5’) CGCTATAGCGTTT (3’) trascritto non stampo codificante di DNA (3’) GCGATATCGCAAA (5’) catena stampo di DNA poichè la RNA polimerasi sintetizza solo da 5’->3’ (5’) CGCUAUAGCGUUU (3’) trascritto di RNA identica al filamento DNA 5’->3’ con l’uracile al posto della timina Affinché la doppia elica di DNA venga trascritta, deve disavvolgersi per un breve tratto, affinché venga letto lo stampo. Aprendo però la doppia elica questa è soggetta a superavvolgimento a monte e a valle della bolla di trascrizione, perciò anche qui agisce la topoisomerasi per allentare la tensione. Si forma quindi la bolla di trascrizione, ovvero quella regione del DNA in cui le due catene sono separate ed è lunga circa 17 coppie di basi. RNA POLIMERASI La RNA polimerasi di E.coli è formata da 5 subunità che costituiscono il nucleo. Oltre alle 5 subunità ce n’è un’altra chiamata subunità δ (sigma) che si lega al nucleo solo quando l’RNA polimerasi è chiamata a trascrivere il DNA in RNA altrimenti non è vi è legata. La RNA polimerasi, a differenza della DNA polimerasi, non ha attività proofreading cioè non ha attività di correttore di bozze (frequenza di errore è maggiore della DNA polimerasi), poichè l’RNA messaggero non viene trasmesso alle cellule figlie. Questa frequenza di errori è tollerabile perché da un unico gene vengono prodotte in genere varie copie di RNA e tutte le copie di RNA sono degradate e sostituite. Le subunità che costituiscono il nucleo sono: 2 subunità α: riconoscono l’elemento UP (upstream promoter), una sequenza di • DNA che si trova a monte del promotore Subunità β: forma legami fosfodiestere tra un ribonucleotide e il ribonucleotide • successivo. Subunità β’: si lega al DNA stampo • Subunità ω: funzione sconosciuta • Subunità δ: riconosce il promotore e si associa alla polimerasi transitoriamente • La trascrizione dell’RNA inizia a livello dei promotori. Il promotore è sempre presente e si trova a monte del nucleotide detto nucletide +1. Per convenzione il primo nucleotide che viene trascritto viene chiamato nucleotide+1. Quelli che si trovano a monte saranno numerati -1, -2.... mentre quelli a valle saranno +1, +2..... Anche per la trascrizione riconosceremo tre fasi: inizio, allungamento e terminazione. Le regione -35 e -10 sono regioni che hanno una sequenza ben specifica detta sequenza consenso. Sequenza consenso più ci si allontana da essa e meno la RNA polimerasi è in grado di legarsi. Più la sequenza che si trova nella regione -10 e -35 sono vicine alle sequenze consenso e più la RNA polimerasi si lega. Queste sequenze sono ricche di adenine e timine perchè hanno solo 2 legami a idrogeno. LA TRASCRIZIONE FASE DI INIZIO La trascrizione inizia quando la subunità sigma 70 si lega al promotore, il nucleo si lega alla subunità sigma 70 e si forma la bolla di trascrizione, cioè la doppia elica del DNA viene aperta in un tratto che corrisponde a 17 coppie di base. La sequenza di DNA si apre a livello delle regioni -10/-35 che sono ricche di adenina e timina. Attivatori: sono delle molecole che legandosi al promotore favoriscono l’interazione dell’RNA polimerasi con 3. il promotore. FATTORI DI SPECIFICITÀ La subunità δ (sigma) dell’RNA polimerasi (E. coli) media il riconoscimento dell’RNA polimerasi al promotore (l’RNA polimerasi non si lega direttamente al promotore ma è la sub δ che si attacca e poi il nucleo). Ci sono diversi tipi di sub δ ma la δ 70 è la più diffusa che si lega alle sequenze -10/-35 che sono conservate e più la sequenza è vicina alla sequenza consenso e più la sub δ 70 riconosce facilmente il promotore; in alcune condizioni può essere sostituita con una delle altre subunità specifiche per altri promotori. REPRESSORI Sono molecole che si legano a siti specifici del DNA chiamati operatori che bloccano l’avanzamento della RNA polimerasi. L’operatore è quella sequenza presente o nel promotore o nelle sue immediate vicinanze al quale si lega il repressore. Quando il repressore si lega all’operatore l’RNA polimerasi non riconosce più il promotore e non si lega ad esso. Questa è una regolazione di tipo negativo perché non viene trascritto l’RNA messaggero. Questo meccanismo può avvenire in due modi: Il repressore si lega al promotore e quindi il gene è spento; in seguito a una • serie di stimoli si genera un segnale molecolare, cioè una molecola che lega al repressore. Quando la molecola si lega al repressore, questo cambia la sua conformazione, si stacca dall’operatore, l’RNA polimerasi può legare e il gene viene trascritto. L’operatore è libero e il gene è acceso. Il repressore non è legato e l’RNA • messaggero viene trascritto. In seguito a una serie di stimoli si genera una molecola si lega al repressore; il repressore cambia la sua conformazione, va a legarsi all’operatore, il gene viene spento e l’RNA messaggero non viene più trascritto. ATTIVATORI Gli attivatori si legano al promotore aumentando l'attività dell’RNA polimerasi. Quando l'attivatore si lega al promotore in un sito specifico (sito dell’attivatore) e facilita l'attacco dell’RNA polimerasi si parla di regolazione positiva. Quando l'attivatore è legato al promotore il gene è acceso e l’RNA messaggero viene trascritto. Questo meccanismo può avvenire in due modi: L'attivatore si lega al promotore nel suo sito di legame e l’RNA polimerasi • è legata in modo saldo. Il gene è acceso e quindi l’RNA messaggero viene trascritto. In seguito a degli stimoli viene sintetizzata una molecola che si lega all’attivatore, ne modifica la conformazione e questo si stacca dal promotore. In questo caso il gene è spento oppure viene trascritto comunque, ma il livello di trascrizione è basso. L’attivatore non è legato al promotore quindi l’RNA polimerasi o fa fatica a • legarsi o si lega debolmente. In seguito a degli stimoli viene sintetizzata una molecola che si lega all’attivatore, e questo va a legarsi al promotore. L’RNA polimerasi si lega più saldamente e il gene o viene attivato oppure la sintesi dell’RNA messaggero avviene ad alti livelli. OPERONE Nei procarioti i geni che codificano per proteine coinvolte in processi correlati fra loro sono raggruppati sui cromosomi e trascritti contemporaneamente. Ciò vuol dire che i geni che codificano per proteine coinvolte in processi correlati fra loro sono sotto il controllo dello stesso promotore. Nel momento in cui la RNA polimerasi si lega al promotore vengono trascritti tutti i geni vicini. L’RNA messaggero che viene prodotto contiene l’informazione per la sintesi di più proteine. Questi RNA messaggeri sono chiamati policistronici, cioè in un singolo trascritto noi abbiamo più geni (geni che sono sotto il controllo di un unico promotore). L’insieme del promotore, delle sequenze con funzione di regolazione e i relativi geni raggruppati (A-B-C) è chiamato operone. In poche parole, l’operone consiste nel promotore, nei geni che il promotore controlla (A-B- C) e nei siti di legame per il controllo dell’espressione di questi geni (sito di legame dell’attivatore e sito di legame del repressore). OPERONE LAC LATTOSIO (E.COLI) I geni codificanti per le proteine che intervengono nel metabolismo del lattosio risiedono sullo stesso operone (operone lac). Il tre geni sotto il controllo dello stesso promotore sono: lacZ: codifica per la β-galattosidasi che ha la funzione di idrolizzare il lattosio (scindere il legame β1-4 • glicosidico che tiene insieme il galattosio e il glucosio e rilasciare i due monosaccaridi) in modo tale da essere metabolizzato da E.coli. la β-galattosidasi catalizza anche una reazione secondaria che è la reazione di isomerizzazione del lattosio nel suo isomero allo-lattosio. lacY: codifica per la galattoside permeasi che fa da trasportatore di membrana del lattosio. Lo trasporta • dall’ambiente esterno all’ambiente interno. lacA: codifica per la tiogalattoside transacetilasi che ha la funzione di agire sui substrati analoghi al lattosio • ma che sono tossici per la cellula. Sono molecole che hanno struttura simile al lattosio ma sono tossiche per la cellula. L’RNA messaggero conterrà l’informazione per la sintesi di queste tre proteine. A livello del promotore ci sono il sito del legame per l’attivatore e tre operatori: O1, O2 e O3. Questi operatori non si trovano tutti nello stesso punto: O1 si trova all’interno del promotore; O3 si trova all’esterno del promotore ma molto vicino ad esso; O2 si trova all’interno del gene lacZ. L’operone lattosio consiste nel promotore, i geni lacZ, lacY, lacA, il sito di legame per l’attivatore e i tre operatori O1, O2, O3. A monte dell’operone lattosio c’è il gene che codifica per il repressore: gene lacI che ha un proprio promotore (quindi non fa parte dell’operone !). Ci sono 4 molecole di repressore che si uniscono a formare un tetramero e si legano agli operatori. Questi possono legarsi agli operatori O1 e O3 intrappolando il promotore (si forma una specie di cappio). Se il promotore viene intrappolato, l’RNA polimerasi può anche legarsi ma non sarebbe in grado di scorrere, perciò i tre geni sarebbero silenziati e l’RNA messaggero non viene trascritto. Alternativamente, il tetramero di repressori può andare a legarsi agli operatori O1 e O2; in questo caso si forma un cappio che intrappola il gene lacZ (siccome l’operatore O2 si trova all’interno del gene lacZ). Anche se la RNA polimerasi si lega al promotore, questa si fermerebbe nel punto dove il gene lacZ è intrappolato non potendo quindi scorrere ancora. Anche in questo caso non avviene la trascrizione dei geni e non si ha la formazione dell’RNA messaggero. In entrambi i casi la trascrizione non avviene e il gene è spento. La repressione però NON è assoluta. Il tetramero di repressori, di tanto in tanto si può staccare dagli operatori. Quando il repressore si stacca, la RNA polimerasi si lega e trascrive l’RNA messaggero. Visto che la repressione non è assoluta e può succedere che il repressore si stacchi, questo vuol dire che comunque una minima quantità dei prodotti codificati dai geni è presente nella cellula (ci saranno qualche trasportatore localizzato sulla membrana e qualche molecola di β galattosidasi pronta ad isomerizza il lattosio). In questo modo la cellula è pronta ad attivare l’operone in caso si trovi in presenza di lattosio. Quando la cellula batterica viene rifornita di lattosio, l’operone lac viene indotto. L’isomero del lattosio(allolattosio) lega il repressore lac causando la sua dissociazione dal DNA. Spiegazione: se E.coli nell’ambiente in cui si trova è presente del lattosio, visto che sulla membrana sono presenti un po’ di galattoside permeasi (trasportatori), questo entra nella cellula. Entrato nella cellula di E.coli questo diventa il substrato per la β galattosidasi che in parte lo scinde in galattosio e glucosio e in parte (minima) verrà isomerizzato in allolattosio che è il segnale molecolare (molecola) che legandosi al repressore ne cambia la conformazione provoca il distacco dagli operatori. In questo modo la RNA polimerasi riesce a legarsi al promotore e sintetizza l’RNA messaggero. L’operone lattosio è acceso e i geni vengono trascritti. Nei meccanismi di regolazione dell’operone lattosio entra in gioco quella che viene chiamata repressione da catabolita. La repressione da catabolita è quello che ci permette di mantenere repressi (spenti) i geni per il catabolismo di lattosio, arabinosio e di altri zuccheri in presenza di glucosio. Se E.coli si trova in una situazione in cui nell’ambiente esterno c’è il glucosio e altri zuccheri (come fruttosio), questo preferirebbe usare il glucosio che è lo zucchero principale che serve a produrre energia, perché entra in glicolisi. Bisogna quindi fare in modo che i geni che codificano per proteine coinvolte nel catabolismo di altri zuccheri vengano spenti. Qui entra in gioco la repressione da catabolita. L’effetto repressivo da parte del glucosio è mediato dall’cAMP (AMP ciclico) e da una proteina che fa da recettore per l’cAMP ovvero la CRP. La proteina CRP quando è legata all’cAMP è un attivatore, questo vuol dire che avrà un sito di legame sul promotore “sito CRP” (sito di legame per l’attivatore). La proteina CRP si lega al “sito CRP” che si trova a livello del promotore solo se si trova legata all’cAMP. Il complesso CRP-cAMP si trova nella cellula solo in assenza di glucosio. In assenza del complesso CRP-cAMP, il promotore lac è relativamente debole; questo vuol dire che l’RNA polimerasi si lega e viene trascritto l’RNA messaggero ma con una bassa efficienza. Se invece il complesso CRP-cAMP è presente, questo funge da attivatore e di conseguenza aumenta notevolmente l’affinità dell’RNA polimerasi nei confronti del promotore. In presenza di glucosio che viene introdotto nella cellula, la sintesi di cAMP è inibita e viene stimolato una fuoriuscita di cAMP della cellula, e quindi diminuisce anche il suo legame con la CRP. L’operone lattosio viene espresso in quantità minore perché non è più presente il complesso CRP-cAMP che faceva da attivatore. Si possono avere diversi casi: Glucosio elevato, cAMP basso e lattosio assente: se il lattosio è assente il repressore è legato agli 1. operatori e non avviene la trascrizione dei geni; l’attivazione non si può legare perchè non c’è l’cAMP. L’operone lattosio è completamente spento. Glucosio basso, cAMP elevato, lattosio assente: se c’è poco 2. glucosio abbiamo tanto cAMP e questo può legarsi alla proteina CRP formando il complesso attivatore ma questo poco importa perché in assenza di lattosio il repressore rimane legato all’operatore impedendo la trascrizione dell’RNA messaggero. L’operone è spento. Glucosio elevato, cAMP basso, lattosio presente: se il lattosio è 3. presente, questo in parte viene isomerizzato ad allolattosio che legandosi ai repressori li deforma e permette il loro distacco dagli operatori favorendo la trascrizione dell’RNA messaggero. C’è un ma se il glucosio è elevato, l’cAMP è presente in quantità basse nella cellula (perché la sua sintesi viene inibita e fuoriesce dalla cellula) e questo non si lega alla proteina CRP. Non si forma il complesso CRP-cAMP e siccome non c’è l’attivatore, la trascrizione avviene con un livello basso (verranno prodotte poche proteine per la digestione del lattosio). In questo modo viene favorito il metabolismo del glucosio (perché entra direttamente in glicolisi) e non quello del lattosio. Glucosio basso, cAMP alevato, lattosio presente: se il lattosio è 4. presente i repressori non sono legati agli operatori. Nello stesso tempo se c’è poco glucosio, l’cAMP è elevato e questo si lega alla proteina CRP formando il complesso CRP- cAMP che andando a legarsi al promotore aumenta l’affinità della RNA polimerasi nei confronti del promotore e si ha trascrizione di RNA messaggero in grande quantità. In questo caso è favorito il metabolismo del lattosio. Si avrà un elevatissimo livello si espressione genica. OPERONE TRIPTOFANO L’operone del triptofano è costituito da un promotore, attivatori e inibitori e una sequenza di cinque geni che codificano gli enzimi che trasformano il corismato in triptofano. Che differenza c’è tra l’operone lattosio e l’operone triptofano in termini di regolazione mediata dal repressore? La regolazione regolata dal repressore nel caso dell’operone triptofano è inversa rispetto a quella dell’operone lattosio. Nel caso dell’operone triptofano, il segnale molecolare che si lega al repressore è il triptofano stesso. Il triptofano si lega al repressore, ne modifica la conformazione e il repressore si lega all’operatore, si blocca la trascrizione dei geni. Classe I l’amminoacido viene spostato dall’AMP all’OH del 2’ e poi quello in 3’. Nell’ amminoacido sintetasi di classe II l’amminoacido viene trasferito direttamente in 3’. Sulla tRNA-amminacil-sintetasi c’è un’attività di correzione di bozze, ovvero un controllo per verificare che l’amminoacido caricato sia quello giusto. L’attività di correzione di bozze non è però così efficacie come quella della DNA polimerasi. 2. INIZIO DELLA SINTESI PROTEICA C’è uno specifico codone che segnala al ribosoma di iniziare la sintesi della proteina. Questo codone è l’AUG che codifica per la metionina anche se nei batteri la metionina viene incorporata come formil-metionina. La crescita di una proteina avviene dall’estremità amminica all’estremità carbossilica. Questo vuol dire che il legame peptidico si forma necessariamente tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico dell’amminoacido successivo (non il contrario) con l’eliminazione di una molecola d’acqua. In questo modo, nella proteina neosintetizzata possiamo distinguere una estremità amminoterminale costituita dal primo amminoacido e un’estremità carbossiterminale costituita dall’ultimo amminoacido. Nei procarioti ci sono due tRNA specifici, uno per la formil-metionina e l’altro per la metionina. Quello che interviene all’inizio è quello specifico per la formil-metionina. La fase di inizio richiede: L’mRNA che codifica per il polipeptide • La formil-Met legata al tRNA • La subunità ribosomiale 30S (minore) • La subunità ribosomiale 50S (maggiore) • Fattori d’inizio (IF-1; IF-2; IF-3) • Perché possa iniziare la sintesi proteica. Le due subunità del ribosoma devono essere separate. Sul ribosoma ci sono tre siti di legame: • Sito E: viene chiamato sito di uscita • Sito P: viene chiamato sito pectidilico • Sito A: viene chiamato sito amminoacilico Per essere completi, questi siti, deve legarsi anche la subunità maggiore. Il fattore di inizio IF3 va a legarsi al sito E per impedire che le due subunità del ribosoma si associno prima del tempo. Il fattore di inizio IF1 va a legarsi al sito A perché il tRNA che porta legato la formil- metionina deve necessariamente andare a legarsi al sito peptidilico (P) e a nessun altro sito; il fattore IF1 ha la funzione di indirizzare il tRNA al posto giusto. A questo punto anche l’mRNA si posiziona. L’mRNA deve posizionarsi correttamente perché il codone AUG deve trovarsi esattamente a livello del sito P perchè è proprio qui che si legherà al tRNA che porta legata la formil-metionina ed è proprio qui che avverrà l’appaiamento codone-anticodone. Come fa il codone di inizio dell’mRNA a posizionarsi a livello del sito P? Per far sì che il codone AUG sia posizionato correttamente a livello del sito P c’è una sequenza che si trova a monte dell’AUG chiamata sequenza di Shine-Delgarno (AGGAG) che si vanno ad appaiare con una sequenza complementare che si trova sull’rRNA 16s della subunità minore. Adesso che l’RNA messaggero si è posizionato correttamente, può arrivare il tRNA che porta legata la formil-metionina. Successivamente entra in gioco un altro fattore di inizio che è il fattore IF2. Il fattore IF2 porta legato una molecola di GTP. Il fattore IF2 che porta legato una molecola di GTP aiuta il tRNA che porta legata la formil- metionina a legarsi a livello del sito peptidilico. A questo punto avremo l’appaiamento tra il codone AUG e l’anticodone. Il GTP presente sul fattore IF2 viene idrolizzato in GDP+Pi. Questa idrolisi comporta la liberazione di una quantità di energia tale da far sì che tutti i fattori (IF1, IF2, IF3) si distacchino dal ribosoma e la subunità 50s (maggiore) possa andare ad associarsi alla subunità 30s. Si forma così il complesso di inizio (il sito peptidilico è occupato mentre i siti A e E sono liberi). 3. FASE DI ALLUNGAMENTO La fase di allungamento richiede: • Il complesso di inizio • Amminoacil-tRNA (tutti i tRNA che portano legati gli altri amminoacidi) • Tre fattori di allungamento (EF-Tu; EF-Ts; EF-G) Una volta formatosi il complesso di inizio, il codone AUG di trovo correttamente al suo posto. Immediatamente dopo il codone AUG c’è un secondo codone che si trova a livello del sito A. Adesso deve arrivare il tRNA (con anticodone corrispondente al secondo codone) che porta legato un amminoacido che deve appaiarsi con il secondo codone. Ad aiutare questo tRNA ad andare al sito ammiacilico è un fattore Tu che porta legato un GTP. Il GTP si idrolizzerà a GDP+Pi. Durante l’idrolisi si libererà una quantità di energia che causa una rotazione del tRNA tale per cui il braccio accettore si troverà rivolto verso la stessa parte della formil-metionina e i due amminoacidi si troveranno vicini. Il fattore Tu viene allontanato e grazie al fattore Ts, il fattore Tu viene legato ad un altro tRNA. Il legame peptidico si forma grazie a un enzima che è presente nella subunità maggiore chiamato peptidil- transferasi. La peptidil transferasi non è una proteina ma è una parte dell’rRNA 23s della subunità ribosomiale maggiore. A questo punto si forma il legame peptidico catalizzato dalla peptidil-transferasi tra il gruppo carbossilico della frormil-metionina e il gruppo amminico del secondo amminoacido e il gruppo amminico dell’aminoacido legato al tRNA presente nel sito A. La catena polipeptidica che sta crescendo si trova legata al tRNA posizionato sul sito A. Il tRNA che legava la formi- metionina è vuoto e nello stesso momento il suo braccio accettore ruota verso il sito E. Adesso interviene il fattore G che porta legato un GTP. Questo fattore va a legarsi in prossimità del sito A. Il GTP verrà idrolizzato. Questa idrolisi comporta la liberazione di energia che porta il ribosoma a traslocare di una posizione in avanti in modo tale che il tRNA che porta legato la catena polipeptidica si trovi nel sito P, e che quello vuoto si trovi nel sito E pronto ad uscire. Sul sito A si posiziona il terzo codone. Sempre sul sito A andrà a posizionarsi il tRNA che porta legato il terzo amminoacido e così via fino a che nel sito A si avrà un codone di stop (UGA, UAA, UGA). 4. FASE DI TERMINAZIONE L’allungamento continua sino al codone di STOP (UAA, UAG, UGA). Se a livello del sito A abbiamo un codone di stop che non codifica per nessun amminoacido, ovviamente non potrà andare a legarsi nessun tRNA, allora si legherà un fattore di rilascio RF. I fattori di terminazione (RF) legati al codone di stop inducono la peptidil transferasi a idrolizzare il legame che tiene legata la catena al tRNA e quindi a trasferire la catena polipeptidica nascente ad una molecola di H2O. A questo punto intervengono altri fattori di rilascio che fanno sì che la subunità maggiore e minore dei ribosomi vengano distaccate e si leghi di nuovo il fattore IF3 (fattore che nalla fase di inizio inibiva l’associazione della sub maggiore e minore). Abbiamo una subunità maggiore minore pronte per iniziare un nuovo ciclo di sintesi proteica. Ci sono una serie di antibiotici che hanno la funzione di bloccare la sintesi proteica nei batteri. Le tetracicline vanno a legarsi alla subunità 30 s inibendo la sintesi proteica. PURIFICAZIONE DNA Il discorso sulla purificazione del DNA è simile a quello che è stato fatto per la purificazione delle proteine. Si parte sempre da una fonte, si ottiene l’estratto grezzo e da questo si procede per la purificazione del DNA. La manipolazione degli acidi nucleici si basa essenzialmente sulle loro proprietà chimico-fisiche. La molecola di DNA è estremamente stabile sia dal punto di vista chimico che fisico. Stabilità chimica DNA I legami idrogeno tra i filamenti complementari sono stabili in un intervallo di pH compreso tra 4 e 10 • I legami fosfodiesterici nello scheletro del DNA sono stabili a pH compresi tra 3 e 12 • I legami N-glicosidici con le basi sono idrolizzati a pH minori o uguali a 3 • Stabilità fisica DNA I legami fosfodiesterici e N-glicosidici sono stabili a temperature fino a 100°C • La rottura dei legami a idrogeno responsabile della denaturazione del DNA dipende dalla composizione in basi • del DNA stesso e dalla lunghezza del filamento considerato. Definiamo la temperatura di fusione del DNA quella T alla quale metà del frammento di DNA è associato a doppia elica e l’altra metà si trova separata nei due filamenti complementare e dipende dalla sua composizione in basi. Ricordiamo che il punto di fusione (Tm) è tanto più elevato quanto più alto è il suo contenuto in coppie di basi GC perché bisogna fornire una quantità di energia più alta in quanto i legami idrogeno tra guanina citosina sono tre rispetto ai i due tra adenina e timina. L’assorbimento del DNA avviene a 260 nm perchè questa è la lunghezza d’onda che porta un’eccitazione elettronica a livello delle basi azotate. L’assorbimento è maggiore per il DNA catena singola rispetto al DNA a doppia elica, questo perchè le basi azotate sono rivolte all’interno e la radiazione elettromagnetica fa più fatica a raggiungerle. All’aumentare della temperatura l’assorbanza aumenta fino ad arrivare alla completa denaturazione della doppia elica. Temperatura di denaturazione Colore rosso temperatura di fusione più elevato e dunque sarà più ricca di G- C. Mentre il colore azzurro he una temperatura di fusione minore e dunque è più ricca di T-A. La Tm di una molecola di DNA a doppia elica è fortemente dipendente dalla forza ionica (concentrazione di sali) della soluzione in cui si trova. Tanto maggiore la concentrazione di sali in soluzione tanto maggiore è la forza ionica. I gruppi fosfato a carica negativa non vengono neutralizzati se la concentrazione salina è bassa, e le repulsioni elettrostatiche causano la separazione dei due filamenti di DNA a temperature minori. Le alte concentrazioni saline, invece, schermano le cariche negative degli atomi di ossigeno dei gruppi fosfato, che vengono quindi neutralizzate e quindi il DNA a doppio filamento si denatura a temperature più elevate. ESTRAZIONE DEL DNA Quando si va ad estrarre una molecola di DNA bisogna fare attenzione all'azione delle endonucleasi e delle esonucleasi che sono presenti all’interno delle cellule o nella polvere che contamina l'ambiente e la vetreria di laboratorio. In alcuni casi la rottura delle cellule va eseguita a 4 °C e con una vetreria e soluzioni precedentemente trattati in autoclave proprio per evitare il danneggiamento del DNA dalle DNasi. frammento che vogliamo andare ad amplificare. La resa della PCR è 2^n dove “n” è il numero dei cicli. Se io facessi 35 cicli avrei una resa di 2^35. Non si fanno più di 35/40 cicli perché dobbiamo considerare il fatto che abbiamo una miscela di reazione che contiene primers, deossiribinucleotidi trifosfato che ad un certo punto finiscono. Se andassimo a vedere la concentrazione del DNA in funzione del numero di cicli, abbiamo una prima fase esponenziale che corrisponde alla resa 2n; mano a mano la curva diventa lineare fino ad arrivare ad un plateau perché ad un certo punto non ci sono più primers e deossiribonucleotidi trifosfato. Si fanno quindi solo tra i 35 e i 40 cicli per rimanere nella fase esponenziale dove la resa è molto elevata. *Temperatura di appaiamento (annealing) = Tm – 5 °C Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Esempio: Calcolare la temperatura di annealing del primer: CCCGAGCCCTTACATGTATCGATACCAC Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Tm = 4(4 + 11) + 2(7 + 6) Tm = 60 + 26 = 86 °C Temperatura di annealing = 81 °C APPLICAZIONI DELLA PCR Il DNA amplificato può essere usato per ulteriori analisi, ad es. sequenziamento, clonaggio, digestione con enzimi di restrizione. Le applicazioni della PCR sono numerosissime sia nella ricerca di base che in campi più applicativi: • strumento diagnostico (infezioni virali o batteriche); • per diagnosi precoci o prenatali di malattie genetiche; • nella medicina forense (test di paternità, identificazione personale in criminologia o dopo disastri); • nella paleontologia molecolare e nell’archeologia; • per sventare frodi alimentari (riconoscimento di OGM non dichiarati). SEQUENZIMENTO DEL DNA Dopo aver amplificato il nostro frammento ora lo si vuole sequenziare cioè vogliamo conoscere quella che è la sequenza dei nucleotidi. Il sequenziamento del DNA avviene attraverso due metodiche: Metodo di Maxam e Gilbert detto metodo a degradazione chimica del DNA): è un metodo obsoleto perché 1. utilizza dei reagenti tossici. Viene raramente usato. Metodo di Sanger detto metodo a terminazione di catena): metodo tutt’oggi usato. 2. Questi due metodi hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNA a singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base (di un solo nucleotide). Questi frammenti di dimensioni crescenti possono essere separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (non si utilizza l’agarosio eprchè i frammenti sono troppo piccoli). A corsa ultimata il gel viene posto a contatto con una pellicola fotografica sulla quale lascia impressa la disposizione delle bande corrispondenti ai frammenti generati. L’immagine ottenuta, viene “letta” di seguito darà la sequenza delle basi sul filamento di DNA. Il metodo originale di Sanger consiste nella sintesi di nuovi filamenti di DNA, a singolo filamento complementari ad uno stampo a singolo filamento, ciascuno dei quali è più lungo rispetto a quello precedente di una base, in presenza di ddNTP (terminatori dideossi) che sono dei di-deossi- nucleosidi-trifosfato. La differenza tra i di-deossi-nucleosidi-trifosfato e i deossiribonucleosidi- tifosfato è che il ddNTP non ha l’OH in 3’ ma ha un atomo di idrogeno. Se il ddNTP in 3’ non ha l’OH e ha semplicemente un atomo di H, se per caso è presente nella miscela di reazione e viene inserito al posto di un normale nucleotide succede che quando questo vien inserito il filamento termina con quest’ultimo e a questo punto non possiamo aggiungere nessun altro nucleotide proprio per il fatto che non essendoci un altro OH in 3’ non si potrà fare l’attacco nucleofilo e la sintesi si blocca. IL METODO ORIGINALE DI SANGER AVVIENE IN 5 FASI: 1. Il campione di DNA da sequenziare viene denaturato per ottenere lo stampo a singolo filamento 2. Il campione viene suddiviso in 4 provette con l'aggiunta di: Un tampone di incubazione opportuno a pH 8 e contenente Mg. ◦ un primer specifico complementare al filamento da sequenziare e marcato radioattivamente, questo vuol ◦ dire che il fosforo in 5’ del primer è l’isotopo radioattivo del normale fosforo presente nelle nostre cellule. la DNA polimerasi che sintetizza il filamento complementare allo stampo che volgiamo sequenziare ◦ una miscela dei 4 dNTP (normali deossiribonucleosidi trifosfato) ◦ un ddNTP diverso in ognuna delle 4 provette (in una il ddATP, un’altra il ddCTP ecc) e in concentrazione ◦ 1:100 rispetto al dNTP corrispondente. Pur essendo presente in quantità molto minori, se questo entra nella sequenza la sintesi terminerà. In ognuna delle 4 provette la sequenza si interromperà in corrispondenza di una base diversa a seconda del ddNTP presente. Nella prima provetta la sintesi del nuovo filamento termina a livello della adenina in quanto al suo interno è presente il ddATP che non avendo un OH in 3’ non potrà più effettuare nessun attacco nucleofilo e di conseguenza non si possono più attaccare i nucleotidi. Tutti i frammenti contenuti nella prima provetta terminano con l’adenina. In poche parole, a seconda al ddNTP aggiunto alla miscela io avrò dei frammenti che terminano in base alla base del ddNTP. Al termine della reazione di sintesi ogni provetta conterrà nuovi frammenti di DNA marcati di lunghezza diversa (a seconda della posizione 3' in cui è stato incorporato il ddNTP) che vengono poi caricati in 4 pozzetti diversi e separati con elettroforesi su gel di poliacrilammide. ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE Per analizzare i prodotti finali delle reazioni è necessario utilizzare un gel ad altissima risoluzione poiché si devono separare frammenti di DNA che differiscono tra di loro per un solo nucleotide. Si tratta di un gel sottilissimo (0,3-0,4 mm) di poliacrilamide ed urea preparato tra due lastre di vetro di notevole lunghezza (circa 40 cm). Si carica il contenuto di ciascuna provetta in un pozzetto diverso. Corsa elettroforetica. I frammenti si separano. I frammenti più lunghi si troveranno nella parte alta del gel, quelli piccoli avranno una mobilità maggiore e correranno più velocemente. Una volta finita la corsa elettroforetica si prende il gel, e lo si mette a contatto con una lastra fotografica. Siccome all'inizio avevamo utilizzato un primer marcatore radioattivamente, questo emetterà delle radiazioni elettromagnetiche che vanno ad impressionare la lastra. Alla fine, ci troviamo ad avere la lastra con una serie di bande che è la copia esatta di quello che è successo nel gel elettroforetico. Adesso bisogna “leggere” i frammenti presenti sulla lastra per poter ricostruire la sequenza del DNA. La sequenza del DNA viene ricostruita a partire dall'estremità 5' a quella 3' (cioè dal frammento più corto a quello più lungo). Si parte considerando il frammento che sta nella parte più bassa della lastra andando sempre più in alto. Nel primo pozzetto tutti i frammenti terminano per A, nel secondo terminano per C, nel terzo terminano per T, e nel quarto terminano per G. Per ricostruire la sequenza del DNA bisogno prendere in considerazione il filamento più corto che si trova la base della lastra. Siccome il filamento più corto termina con una citosina, all'estremità 5’ ci sarà una citosina; il filamento più corto successivo termina con una guanina, perciò dopo la citosina avrò una guanina nella sequenza. Si continua in questo modo fino ad arrivare all'estremità 3’ che termina con una G. Il metodo di Sanger è stato automatizzato, mediante l’introduzione dei sequenziatori automatici. In questo caso i ddNTPs sono marcati con 4 fluorocromi differenti e si otterranno perciò frammenti con fluorescenza diversa. In questo caso, perciò, non sarà più necessario prendere il campione dividerlo in quattro provette ma proprio per il fatto che vengono utilizzati degli indicatori si può utilizzare un'unica provetta. Si ottiene direttamente la sequenza di DNA. CLONAGGIO Il clonaggio consiste nel far esprimere una proteina eterologa da un organismo ospite. Un organismo ospite si troverà a produrre una proteina che normalmente non si trova nel suo codice genetico. Il clonaggio è una tecnologia del DNA ricombinante. Tecnologia del DNA ricombinante Si definisce tecnologia del DNA ricombinante l’insieme delle tecniche che permettono di isolare uno specifico gene al fine di inserirlo nel genoma di altre cellule, modificandone il genotipo. Poiché il gene inserito è di altra origine, viene definito eterologo. Questa tecnologia permette di trasferire geni anche tra specie diverse, per esempio introducendo in un batterio un gene proveniente da una cellula eucariotica. Se il gene inserito codifica per una proteina, l’organismo ricevente acquisisce la capacità di produrre elevati quantitativi di quella molecola. La tecnica ha trovato numerose applicazioni, tra queste il clonaggio e l’espressione in Escherichia coli del gene codificante l’insulina umana. (E. coli è in grado di produrre l’insulina umana). Vettori di clonaggio o plasmide Il gene eterologo viene introdotto nella cellula ospite per mezzo di un vettore, chiamato vettore di clonaggio o plasmide. Qualsiasi vettore con un’origine di replicazione adatta si replica con successo nell’ospite (assieme al DNA inserito). I plasmidi sono molecole circolari di DNA extracromosomico, che possono integrare, attraverso tecniche di ingegneria genetica, brevi sequenze di DNA eterologo. La molecola ottenuta prende il nome di DNA ricombinante, essa può essere stabilmente mantenuta e propagata in un organismo ospite in cui possa replicarsi. L’ospite del vettore di clonaggio: Escherichia coli L’ospite del vettore di clonaggi è di solito Escherichia coli, che cresce e si divide rapidamente. Tra i vantaggi nell’utilizzo di un batterio come ospite ci sono i costi contenuti per la sua crescita e l’elevata produzione di biomassa. Il batterio geneticamente modificato messo in coltura si divide per formare un clone di cellule tutte identiche e in grado di esprimere il gene eterologo. Un esempio di vettori di clonaggio: pUC18: il vettore di clonaggio (plasmide) più comunemente utilizzato è il pUC18 (UC sta per Università della California). Questa molecola deriva da modificazioni di un plasmide naturale di E.coli. Il vettore di clonaggio pUC18 contiene: Un sito di origine di replicazione che ne assicura la replicazione nel batterio (sito ORIc); 1. Un gene di resistenza all’antibiotico (l’ampicillina) che permette la selezione delle cellule che contengono il 2. plasmide: se nel terreno di coltura viene aggiunto l’antibiotico, solo quelli contenenti il plasmide possono formare colonie; Una regione “multiple cloning site” (MCS “sito di clonaggio multiplo”) o polylinker, dove sono raccolti una 3. serie di sequenze di DNA di riconoscimento di alcuni enzimi di restrizione usati per tagliare il plasmide e per inserire il gene eterologo. Il gene lac Z che codifica per l’enzima b-galattosidasi. A livello del gene lac Z è presente il MCS. 4. Il gene lac I che codifica per il repressore che andava a legarsi all’operatore presente in lac Z 5. Il plasmide deve essere di piccole dimensioni per poter riuscire ad introdurlo nella cellula. Endonucleasi di restrizione o enzimi di restrizione Le endonucleasi di restrizione, o enzimi di restrizione, (essendo delle endonucleasi, questi sono in grado di tagliare i legami fosfodiesterici) rappresentano una classe di enzimi di origine batterica in grado di tagliare molecole di DNA a doppia elica in siti specifici denominati sequenze di riconoscimento o siti di restrizione. Gli enzimi di restrizione servono a tagliare il plasmide in modo tale da poter inserire al suo interno il gene