Biologia Molecolare Applicata (1 di 2), Dispense di Biologia

Scarica Biologia Molecolare Applicata (1 di 2) e più Dispense in PDF di Biologia solo su Docsity! DIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA TECNICHE UTILIZIYABILI PER MISURARE LESPRESSIONE GENICA è d Misurazione arm espressione di singoli qeni : fNorthern Blot ( su RNA tot 0 su MARNA purificato) puo‘ dere information relative, ad esempio Quanto trascritto puo' variare dallo Stato Sano a queto Malato, non da info assolute BRibonuclrase protection Assay EIRT-PCR (Retrotraserition PCR) : Puo: esser QUALITATIVA £ a0 tra Scritto C'E © non C'E )e puo' dare info sia relative chi assotute £ tramite RT- PCR competitiva). Per avere informazioni QUANTITATVE NOn posso Usare la PER CRassica . La QUANTITA: all AMpRificato Ave rispertase £0 Quantita! dui templaro iniziola. Nuclear run-on BID" AIZIAZIONI IN NU Real tima POR : NO per USO QUALITATIVO, da info QUANTITATIVE in tempo FCANR cha possono essere < retative 0 asso lure. permerte du Querire Un numero mMAggHore di Campioni, si duiminutsca N'errore sperimentali perche diminurser JD ne du passaggi nitta mrroourcO. . B Misurazioni simuttanza dell espresmone du put geni (anche migliata) BHicroarray BHacro arra 4 NB! Lainfo. QUANTITATIVE possono essere RELATIVE + Quanto trascri tto ho inun compione rispetto ad un altro, ASSOLUTE > quanto trascritto ho in un campione. SAEGI DI IBRIDAZIONE | d STANDARD: : BB Dot-Blot : si deposita al DNA (o RNAY dinalinraro sul FUukro , Avo avere un campioni omo genio Altrimenti amo usare una sonda afttamenti specifica /sensibi a. IL campione vient SPOLEALO , ottengo un “punto”, 40 vantaggno € cha Si possono analiZiOte pui cCOMPIONI. gi Southern Blot gi Northern Blot, Stot Blot giibri daatone in ciUu su EeSSuto o crOoMOSOMIi —® 1 BERSAGLIO: NO MArcoto ea e Ragato al supporto Za SONDA : È marcata in somugiiona. d INVERSI BHICFOATFaY du DNA BHicroarray a'ougonucdiotiav —® IL BERSAGLIO |: È Marcato in seuatond La SONDA : NON € marcata eda € Regata. al supporto ANAUSI DI NORTHERN | tecnico dui ibridazione classica, sul supporto ho XP targtt mentre 10 sonda È MAFCOLa in soluzione Hi) Estramone dill''ANA dalle coMule: divo ricavare La quantita Y di RNA e divo sapere Quanto ni ho misurandona l'assorbanza a 60nm, Posso anchi valutare 20 bONta! dal campione veri ficanco fa presenza du contaminanti (ess proteint) Usando TYF,TrP, Phe cha Sono da che emettono un picco a 240nm. I) ciettroforesi su gel cu agarcesio dinaturanti : sparo in DASL al PM per dunomiuroate Uso formatatiat. viene USOko anche un intercatana. che permatte La visualizzatione dill' RVA ALL UV. Uso Etidio Bromulro Che si INTErcala in past al pm e alta quantita). Avendo caricato RNA tot, cosa mi asperto di vedere ? N MRNA 5 rrna : 255 SUL OE Mi danno banda percntuata DAassissma, ignis Î distorte chi inducano anche 2a. E' presente a cliversi Livelle bONtA' Ae CAMpione. e con cuversi PM, st carico , MRNA purificato ho una ‘str isctako di coloe Per avere band discrete argo avere un numero di campioni con Uguale peso malecotatt. NB: MENA € caratterizzato dalla coda ai pol A Lunga 2004 Per purificart L' mRNA posso uscut cromatografia su mattriot au du'go - nucroti dui 4 faccio passate La SOUrzioni CONEENENtE MRNA în colonna, ChL presenta LWagati su rgsina ou'gont con Lunghe sequenae di T 28 qual: Lagheranno At codi pol'a, poi uscoro in modo Specifico cambiando Lt conduatoni, infina doso cio! che ottengo all'uv per uedere quanto nr ho recuperato. ques termine “casuale” © perche su ew amano complimuntarieta). con xD template, da AUALCUNRO avra Losa serve ?- 9 Nucltotidi 3P marcati in a Frammento de Elanow + deriva detta DNApaLA NA manca cu' aktivita! esonucleasica 53’ percuo: quando si trovo di fronte ad un elica si ferma. E'un enzima con SCArso attivita pOlimerasica > non SINECLIZZA Lunghi frammenti s' i il 3! s' [ ibridazione con Inneschi ottgont 5! 3 sE TTT So gs gros s s ‘sia si a s! Frammenti klanow, attivita! soro 35" [i ANTP marcati(}) A 3! s'e arms. 8 8* d—- Non CGIE LI GAUONA tra L frammenti de nuova | dsnoiuro sintegi marcati e qli al'gont d'innesco + in e ny} & questo MOLO si aumenta indurekttamente PA NOS SA L'attivita‘ specifica e La sengibi Uta, perche avendo put frammenti corti MArcati ta PFODPADI LITA' di Legare it bersaglio aumento € cost anche ,0 segnala cUventa pux forte : EB Incuirettamente duventa Un sistemo, molto sencibila 23 OVTIAMENTE davo prima dinalurare La Sonda. primo. du usarla Untattra sonda € queta a RNASS chi si ottieni da trascriatone in vitro, Ho isolato € clonato 20 mio DNA s'(feomoroee ls DNA AS d'interesse in un SISTEMA chi fa si che 40 Yin E! promotore sia riconosciuto data JRNAPpot , RINApoL . Scatogo 2'RINA pal + efficiente e + processiva (ovvero L'RINApoL faqicha) RNA SS Tn questo MOdAO ottengo tantissima COpie di RNA. TL sistema, preveda L'uso di SPE, T3, T* > RNA pal FAQNChI. I promotori pre Senti sul DVA ARUono essere riconosciuti in modo specifico dalla RNAPOL presa in CONSIALFAZIONE. Esistono vettori opportuni dove sono Ma' statu clonati — promo tori ricono - —SCIUEÌ colle 3 RINAPOL, questi vettori presentano : Forinne dui replicationi per coli ‘UN Marcatore di seLrITO Na Per co ; Jun POL PLNFEEr a cha in QRnNare e UN SISTEMA. cha permette L'ampaumercaatoni IN Celi au un qualsiasi £rammento Questo sistema presenta a astra e a sINISTTA as pal linker un promotore riconosciuto da SPE e 10 promotore per TI POLILINK Promotore TI IBRIDAZIONE RNA_IN SITU ! LagLio dui restrizione Specifico alla fina di ODIA, iN questo modo Lincari 30. RNApoa E + ENTPS marcati «- parto da 1 malacdla du' CONA CRA alri ottengo A00 (CRNA) veHnore spe Pertanto % vado a misurcire L'attivita: specifica. sara! pur alta rispetto ad altri sistemi (attivita! specrtica magmiore in assoruto ) Tnoltre in questa MEtoaL'ca. POSSO EliMINATE AD EEMPLALO di DNA non marcato USANAdO DIVA ASI 1 in Eccesso. Se uso questa sonda con DNAdS non ho a%oun problaima perche: si appata sia su un fuamanto cha R'ALEro ; add ESeMPLo ner caso duna southern Btot va bene. Se ta uso in un esperimento di North&trn devo conoscere 20 senso dual trascritto MA € una tipologia dui sonda chi tramite analtgi du Northern mi permette diri Cavarni 0 SENSO du trascrizione porche se uso 2 sonar chi vanno in cureatoni opposta Solo 1 aialla 2 si Appowiera! al campiona, in questo Modo! nNceavo fa durerione du entrambe. Sonda 4 scompone 3 in questo Modo ho ricavato Le Sonda 4 cdureatone dalla sono: sonda 2 + da 348! = S'U3? Sonda 2 La sonde a RIA sono poco usate perche 2'ENA MSPEELO al DINA si dugrada faccmente. +/05 IBRIDAZIONE | Procasso per cui 2 filamenti cli DNA (0 RNA) possono AP e formate un ibrido (doppia eu'ca ) pur o mano stabilL attraverso 4a i formazione cu Ligani aclroquno chi coinvolgeranno un certo numiro de basi complementari. L'a'brico puo' formarsi tra DNA/DNA , RVA/RNA DNA/RNA. L'ibridaZione puo' avvenite anchi tra MaLLcoL non persemamani. complementari. Un parametro importanti sono Lt concurioni in cui si fa avventr® questo processo, Le quali possono essere put 0 meno StrinQenti, M@astringenti 9 richiedono una maggior omologa tra sonda e bersaglio e sono :'minore temperatura minare conc. saRinQ, presenta! du dinatiuranti chimier. paio.rs MO stringenti » permettono minor percintuate du omolomo sa sonda e bersaglio, prevedono : temperalurt pui basse, magqor conc. salina £ chi favorisoa R'amalting aspecirico) e no denotiranti. Queste conouaroni sono correlate anchi atta Lunghi z3A ditta sondQ L atta composizione in basti. Usando sondî racu'cattive posso Monitorare tutto Y processo, ad segnata ra duoattivo proclotto puo' essere quantificato MICUANE® un contatore dui scinti dtationi (to scintillatore) ma per fa maggior parte. canta APpLiICAIIONI du’ pioatocnia Marco tate sono richieste informazrranti posizionali chi si ottengono tramite esposizioni cli una tastra sensibili au raggi X (qutoradiogratia) 0 du' Uno schermo sensibile alle radiazioni (phosphorima ping) MARCATURA NON RADIORTTIVA : La USO per MAFcare x. target in gene chip , posso usare : . 4 jmarcatura diretta si marco dl fosfato dl nucleotidi, quindi si vanno ad incor porore ne marcati con fiuorocromi £ gruppo chimico in grado du emettere fruorescenaa. se esposto ad una certa Lunghea22a a'onda) jmarcatura induretta > 40) nt vieni sempre modificato con una meltcoela | ÎNOLCOENTOL + BiOTINA 0 DIGOSSIGENIVA Sono te maltcote pui UuSoke 4 4 . Riconosciuta dalla (DIG)C Un apteni stergicto riconosciuto streptavi duna. da un Ab Specifico | Entrambe La moftco le non emettono nulla. du per se, quinar LL divo MOAUELCAT® per permetterni wu riconoscimento, posso farlo: jateraverso 4) Mrgame di fLLOrOcromi (aMa StiepenvI CURA © odl' Ab) “oppure attraverso a LIOAML dl' eEnriMI, ad esempio LO foseatasi cha carol iia Lo defosîforitariona percio: posso agRUNQRH. un substrato fosSforilato , ad quasi una volta defosforilato emette colore 0 Luminescanta A Y 5 Consiste in 2 passaggi : RNA 3 3 Retrotraseriaioni Adult RNA templato in moltecol di e DNA MEdTonte _ n trascrittasi inversa (potimerrzzarione 51,3’, necessita du un innesco >-0! MAMPLFicaRIONA dal eDNA cost ottenuto medrante L'uso dulla PCR. T£ CDNA puo' essere! preparato usando 3 metodi diversi Cin base all primar che USO): FA) SPECIFIC PRIMING Uso un primer specitico per 4 EArqet smi retrotraserive UN SOLO cDNA per 40 qual È Specifico. EEFOLIGO (cli) PRIMING! Uso come innesco una miscsta du' primer costituiti solo da T, comptamentari alla coda porA degl mRNA Lunghi A48-70nt. se La cedo. poLiA € dunqga 2700nt coma mat qli OLQOdT SI Appaiono all'inizio e non aa fini (o nil canti)? Perchu agli aL goAT vengono agNRUnti 102 residui contenenti LL oLtre baci. E) RANDOM PRIMING: ULI LIAZO una miscala analoga a queta usato nel random FEREEÀ dulla marcatura, ossia una. MiscAlA du esanuclroticii cha rappresentano tutte Lo combinazioni possibili con 4 basi, questi Eroveran- 200 do put recponi complementari nek target e pos- - SONO essere usate coma innesco per Na trascuttaS Inverso. ALLA Lina du questa reoaiona € necaSsor io PEFELEUOt® uno. L'qaArioneI dti nick. 40 metodo ® e@ permettono cli attenaie pur retrotrastritti. con 40 marocdo ® € possibile chi Lengano perse informazioni al S' (si ferma prima), con 4) metodo @ possibile percuta. du informarioni al > » acpende da acve si appara sd! esapeptiae. SPECIFIC PRIMING: MRNA + DNA, devo eAiminare il templato, posso usare 2' RNAASI H cha degrada in modo seltitivo L'RVA sodo in un ibrido RNA/cDNA . Questa attivita Alli RNAGSIA € ANChL un attivito: intrinseca du alcune trasentiasi inverse . A questo punto ho cDuaAss cha E Specifico quinoli conosto la sequento. e coseruusto L'altro primer chi fara da innesco per una potimerasi chi puo' essere usate. per ra PER, ad esempio posso ustea Jo Taq palmerasi, popo Lo PER ottengo come pro ciotto d'amplicone cha avra‘ cuMansioni definite data distano du 2 Ugo uti Liztati. A questo punto carico i piOclorto ampritcoro su qet du agerozio 20 quali mi oura\ se c'e o no 20 trascritto d'interesse. (Questa È una RT-PER priming Specifit classica)  # EMA AAA -3' RT-PCR: L'entima trascritta inverso USS i î vr 3 e un otiqonucteon al compitmentare pe primera A inizicue La sintem cu DNA da UNO [er MOLLCoLA dU RNA. La sinqota etica ent ONA prodotta © poi utiLizzata comi sai ‘ i seconda ’ stampo per fa santesì di Una S ’ ° } N FICAZLONL CREA. d alica cu DIVA 2 por per L'ampli i 7, con PCR. Primer? | - Ò 3 ® a gs! È o [ra o Ò ciiir obi ce > to e 0° 7 : Roca a < s' + Retrotraser uona ENA A _ La specific pramng 7 primer (3% 206) Primer4 3 La oLigode priming. |uScE a a AT 3; Ru 3 Ss L random primin9 amerite 35 a 2 593 % a 5 sAmpliFicariona civA (Tom pol) Ser P > QT-PCR relativa zcon di @aon! | a restare in fate esponenziale (dove Pa 2"-T) i . Crommanti di cumenSiOnI same tHascurAbifti (cis AL00bP) Prodotto AMpLificoto RT-PCR RELATIVA : Non € una PER CAsSicQ, ma Noa EfFEttuo in conduzuoni quantitative. La quantita: Ai ampilrertone dive essere uguate atta quantita iniziate au trascritto”. AmpQ@iconn= 27 FASI DELLA PCR: F ” © FASE_ESPONENZIALE . © FASE LINEANE ? perché man mano nucîlaiotidu, a ® © Mg?t... LIVENTANO. LIMIEANEÌ, MENTITE L'AMplieica TO AUMENEA. © PLATEAU? Lo IRORIONAL Si ferma, non ho pur pro dquziona di ampLieicato 9 (09 CONAI noci © DEGRBDAZIONE PRODOTTO : AD prodotto inizia a aeggradarsì perche essendo una reaatonsa all'equilibrio dopo un po' torna. incieEro Normalmente ci si ferma al Platea HA se voglio un dato quantitativo avo fermarmi atta fase esponenZiati dove La resa € = 2 TÀ prodotto (P)= 2"+T = N.B4AV0 ammittert chi Ia resa sia dil 100%. RI gg se no non e valtaa L'eFEIciEnta delta. PCR dipenda da : dimensioni e Lun hat + divo fare in modo che questi due parametri infiuentino pochissimo La ra >LONL rercio' Lengono AMPorercoti frammenti di dimensioni trascur abita ( < 450-200bp) R r p, CR_QUANTITATIVA PAPAMEETI da consgiclureure + DESTITS AMPLLALCAHE. frammenti du clmenzioni trasuua tl È) ckevo restare IN Face espontnriola SeLo in queste conduaioni ho Ps 2"xT (AD -2puo' Esse 4ascusato) Questo cu Permette du' KErmincue La cuantito! di LArctE du Partema NB ieSe La reazioni vena fermato QUANALO Na cCUWErsi campioni La cinetica di ampLificatione € ancora. espone nrialie, La aufreren- 20 di INTENTA! dela banc chi «i uttengono rif stre Lo AUFFEFEMA del ne iniricule du' mafiacole (Matodica cemi- Quanti tati - Va Comi nal cato oWila Northern, ce si vuole essere siuuri cha dffeerenae d'intenmta' 4a campioni rif Qttano dela dieferenze du' espressione, bisogna rapportate x valori asseluti ad Un CONtTrAMO Interno costituito da un RNA di cui si sa che non ci sono vari attoni nadia Concurioni sperimentali utiliz Zate. Come stabi Qisco a ne cu' ciel in cus mi EOLO in fase esponentiale 7? A duversi cieli di PER pretvo un CAMPIONE e carico qll amparticati SU QU, Lo faccio per ne cio : dot Srafico ricavo a quali cucto g£ > s m i, ave - -<3 x elsonda 5 ge --__emnltort È Tarqgi che per 20 Ù xeicle sonda n® cevoli A questo punto rifaccio La PeR fermandomi al a® du cieli precadentemen- —te stabi Ltvo e carico su QU, facuio lo normali ga gzuWona e analizza 4 doti. Posso anche otrenert un' informazioni dirttta du quanto trascritto ho nu Campione se conosco quanto trastritto du sonda ho nIL campione (Cha E un dato noto); rispetto alla Northern Relativa è Un sistemo pur SensibilL perche passa attraverso L'AMpufrcarione der SEGNANA } INQUTE E pur rapida e permitte du anal 230€ £ congrantoxe pur campioni. I risultati ottenuti sono comunque confrantapi li con quel ottenuti da uno Morthern. PCR- COMPETITIVA + La USO per ottenere info assolute, La mercato prevede L'amplficarione ad frammenti du dumen gioni tras curabi Li in Fast esponenziali. Sen sibi uta + atomari (d) = 10-18 La PCR viene CFFEELUOFEa in presenza dl un compertitore du DNA cha COMPEEE CON dd tarqgt per gli stessi cUgoNt ; to competuarono e Reqata soto ana quantrta retativa presente na due. Du compattare (purifi cato) so Lo quantita! quindi 20 posso dose. Ottengo cosr ua sistema automatrazato /standardiriato chi consente v\ x . e L'analisi du' tanti CAMPIONI in contemporanea in mocto ri produci le. Come risuttato CLUENAO vin DIA fiCO in cui O9NI punto corrisponda ac LUN SEONAta ell £AUOFESCONAN retativo eci acjni ciclo du renriona A Ye sì Vai scala Rimare dI y C'una cinatico. chi 1ENAIONL. ta ed -———— n'evell Ho un sistema ottico cli {lLuarewenia (nel visibifà : va cla 3fonm a ISO nm) 4 filuorofaro assarbe entraia euttamagnatico ed EMeLte Luorescenza, ad una ceréa A 380 + ‘9 H i | Li fi il, OSSOI0)}U1 vIsIDIO UU ano) uo <i ——_—_—____—_—_—_—_——_—_———_—_ > Na AQMMENTA, 2'‘encrcpia@ cminuteta. Per La REAL-TIME PCR passo USAre : »> Colorante intercatante (ES: SYBR GREENYA SI Intercata in modo stechiomattio ml DNA d Sondt ad ibridaatoni, specifiche per 0 frammento d'interesse, marcare con mafltcoli fluorescenti { £ifamenti di DNASS Compiltmentari AL Larqle). Posso Sagliere tra: guOna Labelad probes + vengono usate 2 sonde, cgnuna comp lemantargtal tarqet, una E marcata in 3' mentre Naltra in S' (quindi ho 4ougo asta fina, Zaligo specifici e ? sona ) pIpuat tabeled probes 4 Ho una sonda sala. chi porta u' 7 ftuoro fori, ad esempio La Tacman probe d cha prenci anchi 10 noma du' probe di AroLisi) a sonda viene idratata durante 2a renzioni di Reattima PCR. Tacman Probes ; Usate per FRET. Neltcular BeaconS Scorpions SYBR GREEN : E'un aromatico policiclico cha si intercola cd solco minore del DNA AS (in modo stechiamatrico)  II - n PIER GREEN LUNA molLeo Da. fluorescente chi ha uno spero cl £% MAIN nel blu (ABPNM) eo EmeLte mul verdu (S72 nm). Perche uso SYBRGREEV è non 50 Br di Eriduo 7 A - . TPercht Lp PACEArEUNA du fondo di SYER-G € put basso rispetto a AUARO date dal Bromuro di Etiduo (Non voglio rumore di fondo) 2} Con SYBR-G ho un segnali ci FRuoreccania aumentato di A00vette è quindu moggnor sensabrQuro:. TI vistema e stiro dall computer, quindi posso decidere io a chi punto dello. PCR ecctare oc acquu'sire a cegnoda Step! 4) Denaturazione d Annealna- (abbasso la temperatura + si forma 4D ds per annolina) 3) AUungamento (atto la T, palimori 2021000 ,0 sYeR-G Si Intertoto) 4) Denaturazione S)... ricomincio da capo La quantita du SYBPR-G cha si intercata, € proporziono8 atta quantita» cli ds presente in un dato ciclo. 29 Quando termina. Na polimerizzazione eccito e acquusicto LI) segnala (valore di fluorescenza), ricomincio 10 ciclo e cost via , otterro' un segno per ogni ciclo in modo dol costruture un gragilo. Vanta gm: EHsasso costo Posso fart curve du melting attraverso 28 qual posso Individucie 2 presenza cu' CONFAMINANKi , vISUORI ALONE scali cLgont hanno fatto sere annealing- 2 far discriminazione agleli co. svantaggi : gis' puo: intercalar@ con qli ugont Bon di scrimino varianti asta cha (7) BI contaminanti possono InFiIGIOYE 40 risultato &Non posso anolita pui campioni nulta stessa provetta perchu non riesco a riConoserti (no ruttip Qaxing) A4103 CURVA DI MELTING: Si ottiene seguendo 20 DNA allo spettro Fotometro > ovvero Pa varia tione du assorbanza al’ aumentare ditta Femperatura in presenza du una Soluzione tampone con una acdta forza son CO (€) oNAdS at'aumentare atta T si ainatura e N'assorbania aumenta), Tn questo modo s puo' identificare fa Ty a temperatura alla quel 0 So% cdl DNA risutta essere dinaturato, fa quale dipende dall contenuto in Dax Ei So prattutto Ge C e dalla Lunght42%a. Ta questo caso pero' non Sato L'ossorbanza ma id variare dello. fiuorercenga. La Tu corrisponda aL punto du' flesso dura curva £ punto nt quosi fa derivata 2° cambia di SANO). TI cofhvare rieLabota Li valori esprimendo comi dirivata nmoativa sottengo un grafico du' pui facla LYEEUra in cu 40 picco put atto corrisponde allo Tm € l'ampierta di questo picco correta con Ra quantita du campioni Tm a TUO Dopo L'amplificatione £ campioni vengono riscaldati e 2a variazione Autl’enercna di fiuorescinga viene monitorata per qunerare uno, curva. du arsso cia rione santi “AI TO Quando scelgo <ypp-GREEN ?' <agY che non richiedono specifica ( sencibiluto: dellla sonda l poecreening qenrat cu trascritti psistema du PCR È ottimitàato per non avere olimeri o amp@ficati non Specieroi 7) Validazione du dati di array Fiuores. Non uso SYBR-GPEEN in @so dr: gi iscriminazione cu' Meli gReazioni multipla BAMPLFicadion dui trascritti fari PRilQuvamento di passi Livelli du' patogeni EFFETTO FRET : Prevedi' L'uso du TA Morofori di cu A € definito donatore e d'altro accettore +0 qual deve essere ectakto ad energia inferiore rispetto al donatore. Nel caso dalle sondt ad idraliza è IGP sistema E mano LUussibila ed ecerciente SIPErmatte analisi in multipeax + ho una sonda per ogni camprons e È importan@ € cha 10 reporter possa essere eccitato ata stessa £ ma duwe emettere a A differenti per ciascun campiona Sipermitte di duscriminore tra Muri gino curue du MELtina- perchio La sonda. € varoliarata: Coma posso ovviare atcuni probQamatichi che riguardano 20 TAQHAN? Porto vicino Re GA e ottengo una nuova sonda - FARO MOLECOLARE, cha ho una struttura sten -loop dove dd L00p Arne to ST) ceret essere complementare alla QQ: del tarqeue as ds mentre Xo sten non Lo ©. 5'Sreporter stampo 34 quencher y ibridazione no e P freno, comparsa dt fluorescenza. relativa Roo ftuorotoro, ho eccitationei € rilevamento primà, ala poumarvaa. E5)Quando alzo la temperatura. , inizia 20 polimerizzazione e La IL'emisswona du fluorescenza. Vieni persa percher La sonda sv staccQ , sonda. si assoni le. a stelo fo DiFETCALtA! na disegno dalla Struttura cill PIObL è EFPerfect quenching- back gfound signo Maiusta rigida del Loop + Asve sciogliersi Quando c'e ibridazione E'possibila fare analuei in Muttiplax, sfruttando fluoro fori duegerenti cha emettono a 4 cdiverst e posso fare cune du MIMinq. Vanta QI î fjuso MINO reaggni fg} meno COMPIONA qLiminazione du' errori di pipetrtamento svantaggi s JOifFicoMta' mill ottimiztationi dilti condizioni di reaaione (etcrcienza.) Sulla past di Fafo molicotare (motscullar BeACONS) € stata. idtata la sondo. SCORPION + Îa sua progettazione E simili a queta du saro m con da dueferenta chi al 3'terminalt du prob vi © una Stq.> PCR primor cha e speci FICO. per L'OSFENZIONE del tarqti, questa sequenza € Rtgarta al 5'terminaQt cu un primer per mazzo du un “blo KU seg. complementare atta sonda 1 Primar cha saro) comp lamentare al DNA +arqui (\ o UNI 5 Ora qu sea Blockera impedisce di copiare La sonda fluoroforo Questo sistema prevedu chi fa sonda scorpion venca. estesa sul tarate Aocp &ece 0 PIO do fIStERA_____ filomanto du _—_—_____—_uUl@lt 1 no0-goteci zona compumentrare Target Primer al iccp O TITTI LITT TTI ILL INIL {IK1{L{ ULI Blocker ‘Tancer 1) Hoop win quasto caso sara! compli mantare al futamento du ALO- NTeSsa prodotto dalla polmora Sn. Guardo 20 sonda si amnita non ho pur efeerto FIET) si tratta du uno reazione intramolicotate, € pui sensibile e specifica. Tra da Taqman, Beacons e Scorpion, La scorpion e ta sonda migluove. 44103 APPLICAZIONI REAL TIME PCR: Permette 7 tipi di quanti ZXGA(0ONL HH Quantiatationi relativa > per durerminare L dueferenze du Livello du espressioni cli Ac. nUcWawCi ; iI Livetto di espressioni € comparato con L'espressioni di UN GIN di riferimento, comi Un GRANI housck eepinQ o un RIA ribosomiale Zagrioni assoluta per diterminare 0 ne inigialla du copie 0 Ia pQOuantid ‘ont aria moltcoti du AC.NUSLICO . Richiedi La preparazione concentra di curve standara du fluorescenza di RNA 0 ONA contro UNA quantita variabile di temprato. N84 GENE HOUSEKEEPING : Geni costitutivi, geni chi vengono trascntti e tiadoti ad un Livetto relativamente elevato, generalmente si tratta du eniimi e proteina fondamentati per La vita delta CIuLA.. j uso amplificati di 100bPp perche danno curve maori TL sistema prevede du USAre una serie clu' contralle internù, prima du tutto Avo dafinire 40 backgrouna di fondo + provetta contenente tutto TRANNE 1) KEMPLoto ; vient preso in considurarioni anchi un'altro Contrelto interno, cli ipo Passivo, chi E fapprestntoro da un eiuoro fofo chi non c'entra nutta con LA feazioni cli AMPLI LICAZIONI, questo controllo Lo eseguo sia con chi senz temprato + perchi. questo MI permatte au valutare eventuali 4) alterazioni nell'emISSIONI dui ALUOFeESCINTA dl sistema; ogni valore di fIUorescanza viene normarnizzato con questo controllo passivo. Quesro parametro viene di finito con Agn=Rn"-fnT dove : R@n*. contemplato Rina Senza remplato Alla fin posso costruite un grafico chi presenta x An (N) in redoariona au ne ui cile (x) Cr} ciclo Soglia + e 9 d’aumento significativo ent " nill'ammontare dul prodotto du PCR, (N | CL OVVERO : 9 Ci € un punto dalla reazioni du RaGELNE : gn- AMPLATCOIVONI al quali dd Livello du CT ciclo fUWorESCIN AD SUpera Una soglio stabi ato. chi stia al du sopio. dl segnali di bacegraund (si trovera' Sempre. nulla {ast fose, esponinarole culla cur va) esponenziale | — — = BASELINE : indica 40 valore aL di sopra dl qual inizia l'accumulo du amplificato An y CT n°cicli soglia s Linta di soglra sata dall'operatore in modo do interserare ge Ue cli EuttUa campioni in Last esponen riot . i \ Per facif&trare La Qettura dit Arafico a softuare lo converte in scala Log: SCALA L0G SCALA LINEANE »|—- Tanto put campioni ho tanto put basso sara' xl CT, perche saranno necCossari meno cicli per ragqunagre La stesso quantita‘ di fluofescenia Ad ogni campione corfispondera! un valore du' Cr) ML coso du una. quantiza azioni assoluta 4 vado a cuterminare dl (7 du uno stancara. A CONC. NOLO e costruuro' una curva. in cu mtttero! x Cr auto standara, IN funZiona duta Quantita. Net caso dutta QUANLIAT AZIONI reIOKiVas normalizzare 4 CT rispetto alt house reepincy Pa - gr e) $ Durata du cicli uttra-rapida (da 30min a 2h) 9 Richiedi motto mano templato du un SAMO convenatonale Applicazioni : IA Quanti fica rioni virata Bawantificarioni espresmoni genica gEfeicacia duta terapia farmacologia gIHisura du danni al DIVA "9 Contratto di QuaLta' e validazione du SAGGI POKENZIONL du patogeni # Controito degli OGM wGenotyping- mi MRD ESEMPIO : (Per vedtre comi cambia 4) stgno nigativo) campione | CT_HE | Ct geni target (1.10) CERVELLO (atibratoro)| 34 pù FEGATO 46 28 Eiauanto varia 2' espressione di IO tra Legato e corueito 7 Att CERVELO = 37-44 =48 ACT FEGATO = 28-16 = 47 E) Catcolo dit AAct = (42-48)=-6 Ey 2-000r= 2°= 64 MDR. ( Minimal Residual Distase) * | Quota residuo cu comu noplastichi non eraducate dalla terapia du induzione Aulla remissione 0 AAlll SUCCESSIVE MISULE. terapeutichi, Tot eimenti Moplasktici, presenti act un Livello inferiore alla capaata di rilnuarioni dille mitoduichi convenzionali, sono in grado du' espandersi e dare origini atta recrcuva. REeat tima PCL 2 AFFAY sono tecniche complmantari. La Realtime non PEIMELLO du anali tore in contemporana un ne cost eltuato cu' COAMPaONI comi nt coso cteql' Arrey ; i quali pero' restituiscono dati retativi (N0 quantizzazioni assolute). La reot tima È put sentibili e specifica 1a Ra. posso usare per val'dase x risultati ottenuti da arrar. REGOLAMONE e CO-REGOLAYIONE GenicA —(ertande) * Geni co-regolatori spesso esprimono proteina di funzioni correlata e Iqclntificarione di meccanismi cli’ co-reqoLazione “gtobale" + ANALISI du'un picco lo ne di Qeni rappresentativi sogQReti a regolaarone gtobalt. (Approccio conventionoQa ) » Hisure paraMete cit! espressione di tutti x' geni o d'un Loro Largo sottoinsiemi IN Un singolo esperimento. ( Functional Genomics) MICROARRAV! _ Sono supporti sur quali vengono immobilizzate culla sonde in modo tau da aver? un sistema miniaturi zrato e COMPAATO. Lo HICROARRAY TECHNO - _-L06Y si basa Sult ibrida zioni du miscalte complesse du cDNA marcati a sequeni rarQlt , corrispondenti a qfgni specerficr, immobi LIXrOte cu arros ad Otto densita” su superfici miniaturi zare , CAratkerisEache : - Elvata senabi Uta‘ + Possibi&ta' ai condurre screening gu migtiara di eni in paratliato * Opportunita du operare con quantita! du materiali Limitate L'ad esempio posso operare su picco LL campioni, 3B0UWUS) per valutare 20 (ecco. > matto utile in prognosti(Q) TIPOLO GIE DI MICNOARRAN : + Foto LIEOGrafia + devo conoscere La sq. dute sonda » Spotted glass slide cDNA fronda) arraus + da uso quando non mi interessa conoscere Lo stq. dit Sonda (La posso usare sempre) » SPOtERA. Nylon eDIVA arraus ‘+ spotted giass shlidi cUgOo arfays Caratterishco. che accomuna tutte queste mitodiuche : sono tutte bOosakte SULL! IDrICLAAIONI inversa -> La Sonda (e probe) © immobiLiazata sul SUPPOPTO MUNE ad targri Sono marcati L posti iN soluzione . COSTRUZIONE DEGLI ARRAY : cievo rispettare 3 requstti minima À) ALta dinsito? cu probes AREA densita‘ cu' sondi differenti, ovvero, per ogni trascritto (0 geni) voglio chi ci sia una sonda. Per ciascuna sonda. duo poter inSerirt un atro Ne au copie in modo da saqrare La modula. 10M cdi CAMpiona f ò RIPrOdUCI biduta! e Precisione 4 perche Lo stesso esperimento deve essere TIPERUTO Put vate e Le condutioni (densita prove... ) duvono rimanere costanti 3) srabi.uta du uoane probe- supporto + se L'ancoraagio all supporto € labii La sonda si stacca e s'dati Finali ottenuti sono inconsistenti. Esistono prinupodmente 2 metodo Locgie : * Sintesi diretta du agonuctrotiali sulla superfiae (Gene chip) « DVA micro dispensinQ- 48/03 GENE CHIP: LL probe sono costituite da oUGONE direttamente sinteriggoti sutta SUPEIEICI 2 dell'Arrat ; viene soddusfatto 40 requisito di stabilita du degama. probe- SUPPOrEO (perche: ho sintesi durekta ), Inottre Lauro con moLtrco le piccole n 25NE, Si basa sut principio dla. f'otolitografia : sintesi a partire da RINKEr- primary protetti da gruppi fotolabilt, chi vengono attivati con alta SPECIFICHO! mediante esposizioni a duce duetto. , La Luco € dureaio - - NOEO. MEAL'ANTE Li'uso cli maschere £ Supporta forok0) attraverso La quale sctgo qual' posizioni sul chip aktivore E'un processo seQuenaiadli attraverso 4) quali viene Ar9AkO un nucieoti dl osta LatEo. a ciascun Linker Fino ad ottenere La seouenza di oLigont desiato. b zzz MOSCHLIO. LIEXEX è 20 Qua Filtra solo attraverso TITTI T*bloccante * pori aperti » III 9 Anker oHonodéd AA $ z s, 23 S @Nuclotidi Gi TT gw TT —© Riapplico le mascara, cktivo 2a POSIZIONI 2 cui MIO INteresee, AqGUnGO WU nt € ricomnco — da Copo fino ad ettenere ga sea. cu oLigo dui mio INEEresse, 25nt eda, Aunghexta. cttimoQ chi mi garantis a una Sintesi fedele della. Sta. ALsIARerOtO.. Dar 2Snt in poi L'EFeIruenza, diminuisce (non Sono sicura chi si sia formato proprio quer''aligontò) Già DA Questa metodica e L'unica. chi mi da un profilo trascrizionasa asso uto attencubili 4 ricavo QUAL''e quanti trascritti ho naL campione (non c'e Competizioni tra trascritti per ai Legami ama prove ) Ficoeritrina > efficienza. di emissioni attissima. ( fLuoroforo ), Permette PASSAGGI fiperwti du' SCANSIONI SENZA. cha Questa si bruci Altra meitocu ca : DNA MCRODISPENSING: Consiste nea diposition® in seAuenia orcdunata du micro Qocee- spet ; BOpL CIASCUNA; du probe pre-Sintetiarati su supporto solido b vetro rivestito da politisina, minimizi@ af bacForouna dovuto Lt autor Luoresca - “N30. 2 LA pretenza du pol Lisina. permerte 20 LIGAMA COVAMINTO Ea L'NA dulta patitisina con I fosfato dello Probe (> fosfoammidi) Consente du' re OUtAAre array con cunstardi 7500 spot Yum? , e un sistema aUtomanizaato e sufeterente mente riproctcrbila ; permttte du usare Probe di diverse Qunghexte: oligont o chiNA ; consente J'updoate agli arca ; ha costi accessibili a singoli Laboratori di rilerco.. ‘se ho dalle prabe che mi danno un seanala brutto, posso ALe adi soshtu- 1LL conaltre probe, basta duro al costruttore dull'array e fornirqu La prove per ristampar0e, questo rende ta mitocita motto eussibilt. [21/03 Principaga dufferenza tra questa metodica e a Gene chip e che in questo I caso marco subito (in gene chip marco dopo La trascrizione in vitro ca € Una marcatura indiretta) ed eTuna marcatura duretta + fornisco uno. base mocuficata. chi in cofpora x? fiuorocromo — in questo caso posso usare questo tipo du marcoturo. perche Lavoro su cONA du da man coni AiSerete chi consentono Quineu' Un bon apporaminto anche in prestnrà dust intercaronte (sugli aLiGont cli 2Snt nOn e'porpibitetariio) Fauorocromi pur usati cianime, Cyd e Cy5, Co! atteriztate da alta CFEIcIEnZOA cli EMISSIONI. Permettono, ripetute scansioni senia attenuare L'omiISSIONI. Con questa tecnico. posso mettere a confronto 7 campioni MALCCANDOLL con cianint cha emuttono ELuorescana Q aistinguibi li (es: rosso - verde) Un agtfo Lantag Quo e cha in questa metodico non e necessaria, Lo tascri- “Alone in vitro, «D cONASS vieni atrettamente marcato. — protocollo pur semplita = mano errori sperimentale. Tnottr® qui non devo dinalirare nutta 4 CPNA Li ricavo da Library du plasmiat deu auag,', per attenere 0 CDIVA, La Mitocl'ca Miguore e eseguire una Per ed cktengo DNA ds chi anco 'a cdinaturare (ato da Ta 100°) prima du stamparli sul SUPPORTO du vetro a Stampo cDMA “aperto” e per via dutta polilisina 4° 2 fuamenti non si riappareranna per (perche sono stati Legati cCOVALINEEMENTe comt flamenti SEPArAK i), una complcationi cu Questo sistema si riscontro. QUANTO MItEto a confronto 7 tampioni MArcati con fluoro comi differenti, devo essere siCuro chi L'{ Luorocromi non interferiscano tia cu Loro per Quanto riguardo, Le bandi du' emissioni [assorbimento > in caso contrario un fiuorocromo potrebbe attenuare 4) StgnAl au'attro (A assorbe Gp stessa banda cu emissione du 8). Non si tratta di ecfetto FnET ‘@ Solo 2-3 tipologie du' { Wuorocromi garantiscono una buona risaluatona, qundu'd) Limit® sta nl! ere ettuare 'unconfronto InbinNArio OPPUTE miscegllo 3 MMPLONI. @ HO etfetto Fret nel momento in cuu' x 7 target Marcoti con 1 £luorocromi Aversi si appatano a 2 probe VICI (€ un interferenza minoritaria) Alla domanda. : Percha' para ialmente sovrapposti ? Perche: devo cuitare uno stago enerqerico dovuto dot trasferimento du ritorno dull'enziQn'a tra quencher e reporter. TL fAusso energetico dwe andare solo da eeporter a Quencher, non de tornare incuetro £D Quundu' per questo voglio UNO par Fot sovrapposizione ci SPOLErI ) PISCORZO NELATIA ALL'EFFETTO FRET in POR (0) Negli array quo minimizzare al massimo Q'efeno Fnet | Una wata avuenuta L'ibridarioni su'arral si esegue NO SCANSIONI CON confocale chi permerte elevato. e EETCIenAO. du rigrvamento, quindi MAGIA eeusibilura‘. ottengo un eltvata risoluzioni da Spor : se San da cu 19 cuametro ci una Spot risulta. pari a SUO pixel L'immagine vieni acquisita a bassa. pro fon Aua' du CAMpo e quindu Minima intro du gione du' arte Fatti. T fiuorofori vengono ecautati contemporaneamente a 532n (CUS) e 633nm (45) Limite per fa corretariona Rinuare +ro. INtensita di fIUOCEOSCLNIO Q cui «DNA ibri dato sSULU array : A4- 300.000 uno scanner Laper qu antito‘ 6 Per L'analisi cu fluorescanta dell'arrat + divido l'arrav in settori, per CIASCUNO d'inteneita’ e induviduo t'intensita' cli fluorescenza inferiore al 2° La Quali verra! sottratta AUL ALtre intensita' » rappre senta. sl bacEgraina cu fondo. Ricorda : Ad 09n' gent corrispondono melti OUGONE, visto chi non posso produrre aligonte tanto Lunghi da coprire 4'intera «Qq. dl gene ; percuoi inatulduo un set du oligo clStfiburti su tutta L'estensione du geni in modo tate da sagQate 2a prestnaa cdi un cato messa cero. E massario un controllo : per ogni ougont Perfettamanti omo Jogo al targge, ne hanno disegnato un altro che non omologo al 100% aL target ma ha. 4 sostiturione Singola di past (zAnt sono uguali, 4 & mutato) la sostituzioni du' bas VIENI. inserito, nu antro (Atomolloghi, Amurato, 12 omo loghi ) 4 in mOdo cha si formi una sorta du “botta per via du ripiegamanto du porzioni omo Logha, na risulta una dustabilie. «RAZIONI di' tutti quegii appata menti chi non sono robe as t00/ omologhi _ Dos con Sall'arrau per ogni 9g. AL a' sono adgont duversi, per ognuno du questi c'e’ un controllo. A Livello teorico Se un dato MENA ©" presente nsk ampio - ML avro! segnali solo nta f‘Ga corri spondenti agli’ ago omo leghi al 400/ } nitto. riga dagli OUGENt mutanti (contralto) non no segnata. Nea FeaLta' por non Sara’ proprio coseno. La differenza cu'segnala. Sonda, compera . Per un gene PERFECT HATCH PNORET der EVITATE PH LIAN: Ì LL Ì MISNATCH PAOBES ai Percw' vado a valutare, su 10 sondi Quanti segnali +eorcamtati Perfetti ho, ctovrer avere una preva02A di segnali gli eligo KON mutati) Se non vieni sodausfatta questa Condoni, scarto i) dato. a Dopo d'ibridarzione deu microarray x dati vengono analizzati de un software cha prevede 2 Avere: tipi al anag isa ANALISI ASSOLUTA : DELErmina se £L t{ascritti rappresentati sul vetrino sono presenti e riLlvabilt ne campioni anaLiatoti ANALISI COMPARATIVA : DAermina + caminamenti au espressione genica. tia campioni di‘ rferimento (es-tessuto Sans) e 4 cMPioni sperimentati (2s+tessuto malato) ES Geni dal metaboliemo du galattosio sono fortemente requiotta Liveto trascrizionali . Dagla qunitica cRasstea Ai N0' cha nil pokhwaw entrano un certo ni du prodotti qgrici collocati nat vari step: doll rego Latore. trascrionala Gal4 agli enzimi cha modificano 49 nutrienti. «se trow tutte QeNI del pathway 4) metabalismo duo cellula & attivo (induzione del pathway meraboelico) (GaLamo nb) e Se tro so20 alcuni QQRNI, Ad esempio le parte regolotiva., posso assumere Chi a) segnage sia stato solo pararoLmente attivato £ so cell sintenrzza. solo © fattori «(ascririonali ) ma non ha ancora iniziato ® Promuovere La sinteri aeglu enZimi mMIitabalici , da questo posso aRdurre che Ja CIN e in UNA CONCURIONI du dite pre SSiona. * Se pon trow MSSUn Qent ALL pathway, Ra cl E in una condiitons ci repressione (Guucowio) APPLICAZIONI CONCRETE + 7) HIGLIORARE LA ROSA < Rosa cia Giardino (6 Rosa do. Serro (Fc) *molto profumotQ * » Poco profumota TA marcoro ehiedi dl amano beuwo e put bEelaX creare un Mutante dui *meano granda e put granda* rosa che accocrpy la caratteristiche PORTE * #% approccio ! Confronto stucco KA GG e FC ; ottengo TIOPPI d'ioki, non vo bene. Quindi si procdk attraverso un primo confronto secco GG US EC e un sucrondo Confronto in cut anatiaào Lo stadio in cu. Cuore e profumato rispetto ce quello in cut 0 fuoie non Lo Ta Borciolo , Metto a Confronto + doti ottenuti : e studio solo dati Presenti nia inter. - Sezione — ho un piccolo aruuppo dui eDNA an quali anoaLaaz att lo sq. Canatisi di omoloma....) Bocciolo pollo toi sono 7 sradi diversi riferiti Sempre @ FC GGYS FC La. rosa non presenta. un Genoma. consertato + per uia ai tutte Na Mutazioni subite nol tempo ad opero dl chi NL commertiQ per cuo' non ho una Seq. Standard. cli dligont dal poreie usare nulle tecni (a Ul QUI Chip Ab Quuncu duo per forza usar? da tecnica cui micro-aispenting , creo una banca a ceDnA da cu OKeEngo ‘i cDNA da STAMPA SUL sU-pOrÀ Lretatuva ala rosa profumata, non ha Senso ussit la rose. de _. 9 quardino chi KON presento. tutti x geni cu mio interesse. chi cauregarie du geni trovo ? «Forma, fio “coro usi »(profumoniona) non L° inclivicuo come categoria, Li Liceo indirettamente + forma. pianta... Eseguo 4 2° confronto Bocciolo vs Fog profumato eel INEErSeco d' dar ottenuti CON Quei OREnNUTY primo. In questo modo voglio indivicuatt 4' cONA corri sponde Impurcate nuto. protumazioni . nti atta molecola 2) INDIVIDUARE UNO STRUMENTO DI PROGNOSI PER TUMORI Cambito clinico) Scopo : aumentare Q£ prospettive di vita cul pariente. te caratteristiche cui tumori variano do Fariente o PATiLNEL + Zpazienti con La stessa portata. (stesso tumore) possono Kart in modo cUuverso ; uno SOPravvive uno va in contfo o HeCiduvo. ; St INAIYIOUMO gu etementi responsabili cella Hoidivo posso Qma' in Pargenda AF otktoy® 4) patiente con un approccio duverso Come. individuo + geni responsabi Li tito. Fecidiva? A° confronto : tumore normale vs tumore ch da recicuva ; sull'arraY stampo gu algo retativi al tumore recicuvante (uso geni chip) 2° confronto : uso Lr cul staminali tumorali 'S sono Qt cell cha dificatmantt riesco ad eliminate con Lr terapia de a° Lino ; sono altamente resistenti fprolif@rano meno rispetto atte quere cell tumorali ) Quunar metto a confronto Le coll stamina sane con cati staminali tumorol ì È un confronto efficace, tovrebbero risattart 1 geni responsabi Lu det rischio di reciduva. I chNA chi immobi Lio SUL chip sono riferiti alta etamino lr tumorali Anche in questo coso pot metto in retoQonr 1 7 confronti € studio solo £ datti che finiscono nel! iIntersralo nt. Risultato : hanno ottenuto 44 qthi chi posso anal'arare tramite RR ROL TIME, alcuni esempi: BUBA > regotatote del proctsso mitotico, importante per fo forme Hcidwa USP27- gene Wgato all contrell'o astio stato dillo cromati ; e un regolatore cpigeneiico ) E' importanti per Lo suifuppo AM col tumoratei. toeauco che ha com AnoLkta IRMMALENO PRECIPITAMONE DELLA CRONATINA è ME omate a proteine; sq. incdiuduare dti scquenie specifico tamente ass di che possono quiet espe isctate cal genoma toratt sfruttando Ab cuie Ri contro fa pieteini d'interesse + GTeENAO UN immUPOPrECIPITAtO cli DIVA LU QUOfL puo' cssue quantificato, € Hanmte array pesso ip LEdEre qual componente dil genoma stata IMMUNO PILOIPICALO. L'immunoprecipirazionei ailta cromatina fa riferimento ad ua camplusto nucfte proterco in cu st ha DINA QENOMICO + PIOTRINE a9guts0O, per fo Mag - -Gior parte, sono rappresentati da nucltotomi bewuttura istonico sutta quan si audgt a dra, Lo restante parte © rappresentata cia enzimi cafattori chi strano ala replicazione, tfascritione.. step: A) Stabilizzazione + dull'internitone PFOtEIRC- DIA (cha ele per se € cu carattere arotle in mado da garantire cunamicetteì) ; agqungo in vivo {osomministro net terreno au coltura aatutare) so-fomatacuat we=0 che permette cli CrCAre ALL ponti stabili tra Citosint e LISINI ; “i tratta du porti stabituma reversibilifin mado chi par io possa Separare 2a Tcompeonenti) 7) Riduzione ARIRa cromatina nella sue unta: fondamentale ; ottengo Cest X singoli nuciictomi ; per Far questo USO Un sistema MECCANICO cha genera frammenti cmogenti (no ENZIMI civ restrizione) > fa metoclica È fa SONICALONI : attraverso gii uttrasuoni viene CONAEILTA ENLIQIO CINRATCO qu’ cingoli nuctoScmi tale da permettere fo sottura Au Acer co ONA che connutte 7 nucttosemi acuia canti. np Otengo Ld genoma. Tidotio in unita strutturati 3) Scotta dill'Ab appiopriato al riccnosamento ALLE protenna d'interegt, quanto pu vasta € ia colt'ioni di Ab disponibili tanto magquere SAra' ta versatiàita: cit sitema : Ab contro Fatteni tasciiz tonali, aston, Aston: moclficatt, DIA MOALAICOTO. NBA ESSENLO una tecnica QUantitativa in egni esperimento atvo avere una SAMA di quanto e stato Immunoprecipitato rispetto allo. quantità cu materiali trattato (quantita iniziale) ; quunae prima di agg. R'Ab E bene prettuare un Campione rappre gentativo alquanto materniati È stato USATO per d'immuNnop. CÀ! cosidetto input Pepo duche agg. d'Ab, Lascio tn INCUDATTTEAL, ci sara* dì riconoscimento SPECIFICO Ab-Proteina , Lascio precipitare e separo di mmuno tegiti 4 METILAZIONE DEL DNA CLONATO : Siccome procarioti ed eucarioti hanno MetiLasi diverse, 4 DIVA clonato da organismi superiori tend: a perdere Lo schema ALU MENIORIONE dagli eucarioti nat corso auto repLicarionei nella citi cli E.cott per assumere quello dita cemula ospite. Pertanto gi possono verificare fx seguenti gituazioni : > TL DVvA metrtato deli eucarioti e donato in modo poco eeficrente perche viene Aggreduto e taguato do particolari endonudttasi di Call 1 ILONA ALqti Cucosioti assuma Lo schima, du Metilaziona ae procarioti, cio vieni mibagato dalla meatuityansferagî DAM € DCOM du COLL e duventa renstente al taguo da part? dl alcuni enadimidu restrratone TL DINA DEI PROCARIOTI RESISTE ALTAGUO DI ALCUNI ENZIMI DI PESTRIZ (ONE | DI sito du riconosermento du alcun enzimi cu restrizione conuene al suo interno L'intera sequenza GATC chi uient convertita in: GATTE dalla DAM Gli enumi du restriatoni BELT e MboT tagliano lo seg: GANTE, Se si uve digerire xD DIA clonato con BALlo HboT, bisognera' usare ceppi mutati DAM" privi di attivita! metiltfans ferasica. Lo stesso probiama lo si ha con atti endimi in cui 40 sito di riconosarmento contiene at suo interno solo parte dilla sequenia GATC (es: cat ATC); La proporaionei du sequenze GAMTO chi non possono ecue toguiate sara comunque minore (4su4 per Cat). Quando si usa un ersima ai restrizione, contraltare sempre se € nY'bvLt allla MUAZIONE ISOSCHIRZOMERI : Enzimi cli restrizione isolati da organisni deri cha hanno un nomi duverso ma riconoscono La stessa sequenza e possono tagliar® allo sta sso MOCLO O inimodo cuverso co‘ significa cha cono euscortibili in modo diverso alla Merita moni . E' percuo' posa bili aiscriminare La presento du''un Sruppo mena all'interno Amo stessa Sea, Usando ISOschizomari chi tag®iano in modo cuverso e HpaT riconoscono lo stessa seg. 5° ccaG-3' es: isoschizromeri NSPI differenze: e HopT- taglia SEMPAE 20 SQ. LCCGG ancha st mebilata + HPa XL > non tagua 20 DIVA se C'E CM in seconda. posizione (<' celee-3) Questi isoschizaomeri' cli Coli possono essere usati per studiare lo MIblazionI Mqu eucar on. NB: Esistono ancha enzimi che tagliano Lo stesso, anche st dd sito cu meiparione E mentoto (NSpT) EUCARION | Mentattoni a carico di C ; donator.> sam. TI contenuto du' Cmenlote Varia dad es: un Juievito € una bassismmO, Mentre nat vertebra si arriva anchi all'u4t/. In generale 'Î0/ dute CM si Eiovano a Lvetlo di CONETOMECI, In tue Qi ZON ripetute cul DIVA CA NONNO Una. funatone di repressioni ; 2) restante 107: culle CM si trcuano in unconterto 5-Cp-G-3 questo dunuotrotida Lo SI trova nelle CpG stand cha gl rovano all'interno du promotori . Queste isola Cpa st trovano davanti au geni houceg Keepin® e NON cono essere mibntate (perche 1 geni houggkeep ALvona essere cempre espressi). Queste isole ct trovano anchi niu promotori ressuto- specifici in questo caso, La sequenza. Cp@ sara' put o mano mentato a seconde cha xi GRAN debba essere espresso © MANO. Le Cp&lstand si trovano ancha Lungo La Sea. du alcuni gent > Significato ancora SUnosuuto- Le Cp&istand st trovo anche nel corpo du Bar, sempre con funalona di repressiona > 2 cromosomi X, uno awe essere mattivato e L'inatavar one E a carico dutta minitaatonai dul DIVA la mentazione gr trova anchi nu' geni sottoposti all imprinti nq REPRESSIONE : 2 MECCANISML Diretto + essendoci A Het ud Fattore trascrizionala. non si 9a e 29 qena non viene trascritto {ndiretto A Esiste un complesso proteico MecP (MatUl Cpa Binduhg ProtUun) che riconoscono ul KU; nat compusso Ci sono Anche dutt ISTOnEi dracth- -fagi chi eseguono La kat lazione atul'istone chi, in qenire, porto. ALLO repressioni ( passo attraverso una modut'carioni (stonica) Mer Ltransferan' a Zi : du Mantenimento È introduzioni di'mtatozione Qx-N0VO A- Le KLET du mantenimento ripristinano o Met se viene rimosso dat meccanismi du' r'parazioni 2-1 MutT. ex-now, interengone nello sviluppo e sono responsabili dille nuove men'lazioni (Invecchiamanto, patologie ..) Pare che Le piccoti cufferenae tro. omozigoni (gem) siano dovute atte moti Lo riona du DIVA Ualterazioni cio MILila ZIONI SA HOyYo. ANCh£ In NUMAFOXI Lipr di tumori «[pomebilazioni> instabi Wta! ct cro mosoma. (€ du cantromero;. non si ha pux repressioni) foP, *‘PErMERtIA ZIONI A attermina repressioni du' geni chi normatmante vengono espresse ( cpa istand) SINDROME DEL CPOMOSONA X FRAGIUE: Patotomia x-Linted, colpisca Gu UOMINI, Matarttia mentale erecitaria. Causa : metitaronei alle Cpa icland net promotore che precedi N'istona 4. Questi CpGistand normalmente fon sonO metltare (a carico del cromosoma X, FNR4) . In questo istoni in geni Sono presenti repeot CGG Sono 29 repents ; nu portatore alla patologia copie (Ja matattia non si manifesto, Le cPa stand non cha nmge persona SsOnL svua dalla S0 alte 200 cono malate) questi riperiioni si’ sono originati dallo “strping" Quest ripeniztoni formano dla strutture 7° cha vengono rino sSuute aalla ctiuta. come elamanti ripeti chi cliiono essere. repressi, ul che provoca fa mt tazioni culla Cpa iStana in modo da silenarare dr vepeoks Ne risulta una repressioni con conseguente in SorQ@nAA ALU Antoni di questa patologia. di04 METODICHE PER INDIVIDUARE DNA-Net A- SÙ paso, SUL uso dui enami du restriatone che sono sensibili asta meLifozione ; una votra digerito 4) DNA posso proctaere con PCR cppure Con Southera n-Nerodo basato sut'unliazo di Biselfito 4 ha come carart Na l, cha Viene atamminato. dando duogo all’ uracu ; percio introduce un cambiamento cui base. La C* non attaccato. dell BIselBta . Succass va mante viene eseguita una POR Per L'amplificarione con POR Uso QLaI normali e sequenzio sl flomento ottenuto. Oppure allo PCR skque un analisi con enaimi du restriguona sengibi Lo no ama MIL TAZLONI ‘ OPpur puo! SLQUU un'altra Pe usando primer chi si annidano o no ama reqIons E e puo! essere abbinata ala Mral-Tma e quindi ottengo dati quantita EVI HELOTAVI. 1B4 Nttoaica per vatutare giobolmenti 20 Quello di mate presenti sul DIVA : HPLC con Lo quasa stimo do quantita: Tot HA nen mo du dove + QVano sin base all'amplitiicato chi atrengo ricavo dove gi trovano La C" Per avere un risuttato QUANTITATIVO AaUo atmtustice una _ QUANTITATIVE METHYLIGHT (QM) chi sfrurto. La TAAGMON : costrusco 1 SondL TAQMAN (che presentino Re Q chi duano fiILKOrescanze duverse in modo da pocer riconoscore xy segnata dl ciascuna. sonda.) ; una presentera' ga <0q. CG per tr regioni m@tilote e l'attfa do SQ. TE per Q0 regioni non MILILOTE . In questo modo riconosco in maniera simuttanro quantitativa La pregenta due remoni meitote (es: cpa stando) (- prima tratto sempre con Bisotfito ) Posso fare una TAQMAaN anchi diretta. conto du primor (7) V Me DIP : Preveds 4 seguenti ckep DNA > SONTCARLONA + ottengo 4 frammenti du DNA 7A N tengo da parte 10 restante parte fo immuna pre. un'atiquoto. che Sara con Ab specifi, ad esempio A'UINPUT ubi Liazo Ab direte contro C* { L marco con 43 marco con C4S Xx 7 Esgguo un MircarraY Come faccio ad ceRettuore fa marcatura con 2Ganina diverse? » Parto con un pool dl frammenti aventi estremita' eteroqenee cha cuvo frenare omogenee ; } Quendu posso usare Un pool di primevs con estremità‘ 3 random a cut agmungo codt iù S' dute quod so lo cuenta A primi cicli saranno a bassa stringenao duomologo , por aumento ga Ta ancalling Lo ottengo una popol@2t0N2£ con turte estremita: uguali bnrassario, perche” poi in feet uso un innesco uguala per tutte 4 frammenti) ; questo punto posso aqqungere La cianina 5/%4 Ricapitolando : usando La Real-Time PCR posso ricavane info. quanti- _rative, oppure posso sfruttare L'utilizzo du microarrost e chip on chip). gut Chip Sono state sintenziate oU'go chi fappre sentano n° promateri in una data conouzconi , Eseguo L'IMMUNOPHUPitazlone SENZA Lo Step. N32 di STADI LIFIGZLONI, parto dallo frammentazione, metto do parte un INPUT E L'Altra. parte La tratto con Ab contro Cut, denaluro perche MI INFErEssa Li) SS Chi gi APPOLErO! poi sui Chip. (gi eseque un aerereniale MELO L'Input e xl trattato su cl un unico chip fa quindu dI problema. E 4a marcatura 4 uso 2 cianini duerse : 3 e Gs. Un'attra Modalita: du' MAFCORUrO. : parto da un peol eterogeneo chi vaglio fare atventare OMOgGLNLO Usando ad esempio du primer cha hanno in i B'atlle coda fanciom (9-15 bp sono presenti ture Le possibi Li combinaRoni POSSIBILI con Ma 4 basi, principio analogo al fanciom priming) avro r° proba - Di LLTO' ci tTOUAIL ditile seg. per fertamenti compumentari tra peo! el QUESTI PrIMEr e LI targgi. A questo poat du primer Wengono po: aggiunte AU cod in S'au' mia setta. che sono costanti so 0a seg. questo mi Servi FA' Poi per costru 40 primar per La marcato). I primi il du ancaling. sono a resti ingenaa DASso per permeincere cha. tuti + Possibile apponamenti auuengano £ anchi quei con PORTAL È | COmpumantarieto tra basi) succassivamente ata0 SL Flame o quendu x Criceri cu' stringenaa 4 ottengo Uno popota one risponde con LL estremi ta' uqualli e posso ora aqqungere Ne cranina. CA 7 nb. EPIGENETICA : (AIseto) ISTONI : +53 « H4 «H2A +H28 «Hi —> Quinto istona esterno all nudicosoma. che ha 0a funawona cui fare da Linker tra nucliosomi auacenti Componenti del core del nuclrosoma. Gli istoni sono proteine pagiche sad atto contenuto di aa bagitL: Lys, Arq) 40 doro P.I. € basito, hanno un basso PM (tra 10:45 KDa) —o Ho alta carica @ condensata. in un valume piccolo, cuo' favorisat La formartoni du' nucdrosomI per interaatonei du coricha OPPOSKE., carica ® du Lys-Arq con carica E del fosfato ditta doppia cca InEeraziona Non covolinte Ma. comunque ad awa energia. SCOMPOSIZIONE CROMATINA è Si parte isolando Ho Struttura a collana du perle CORPO ISTONICO DEL NUUEOSOMA S 146nt LEGATI AL LINKER, fino a SOObp (max) NUCLEOSOMA Questo valore © stato ottenuto andando a digerire tutto d) DNA cha non È PIOLPETO dial LegaME con AL proteine dia nucleosoma. otengo cost frammento minimo cha ha uno Aun9QhLz20 pari a 146 coppie cui nuctnoticì La masso. proteica e queta di DNA hanno bene 0 mod No stesso valore (stessa massa) : vIl corpo istonico € cktamerito (2x U2A, Lx W2B, 2x 43, 2x Hd), congidaro uno Massa. Medua du ASKda ciascuno : 1Sx8= 4120KDa + Coansiduro una massa du E60Da per Ogni coppia di DASe + 660 x146 =963600Da 4 n 400000 Da = 400 kDa Superfiaie. esposto. agli istoni : si traktero: dla. sUPertiue supertore, superfiae inferiore e qualche coda che esce dar complesso + s'tatra dute esremito!' n-term, cha vengono proposte come bersaquio di modificazioni dame quali du'pendi, la funzonalito®, dall punto du visAa +{QSCriztonoMa, AULA crOMAZINA.. Queste cods N-term e trovano in posiztoni citichi e possono Favorire o sfavorire Aa t{Ascrizuione. II 20% degli istoni € costituito da residui basici (Ls, Arg), sono + put importanti dall punto cui vista due Modificazioni post tfasdualonoli HODIFICAZIONI DELLA CRONATINA : o COVAUENTI : ACEETLORIONL + SOLO Su LIS (no Arg), reazionI (eversbiRa per ruoli Deactita%one Fosforr dazione + avvieni su -OH du' Ser (Thr , roversipilà PpeEfosForila zone UbiQuiENAZIONI +attacco cli ubiquitina (4620), si forma un Legomi isopepricito IQUATINAVOnNL era Li residuo terminase dell ubiguitina con dl suo peubia ui CArbossifa chi vieni coniugato al gruppo amminico ®metita ona culla. Lys, reazioni reversibile Demati LA TONI LPNON COVAUENTI ! Rimozione, spostamento e n'assembioggrio du nucleosomi d Hetilarone > bersagtio sono LIS e Arg, € un prousso reversabilà, per fa rimo renne necessario ossicare 40 -CH3 (non lo si rimuore semp@icimante) . E' una iRoRuoni eni dor punto cu' vista termodinamico e pur a'ffiale.. La MEtIRRIONI porta allo formazioni du un game motto stabili per questo € stata tata” per 4) MANTeEnimiINTO dul genoma. 0A ssgr® ESEMPIO: SISTEMA LIEVITO , Attivazione cl mitabaismo dul qalatmosto Cin assenza di gtucoswo). I geni che ni permettono a) metabo Lismo Sono regglati dall'attivatore +rascrizonaQ GAl4 chi ha coma bersoaQUo seguente Up-SETeAM e da qui promuae Ra trascrizione qeni ca. In presena du' glucosio Gal e INAttIVO ; In una concleatona de VON INAUZIONI Bowero no gucosuo, NO gANAGUOSTO) Garg © posizionato suse sequenze versaglio MA non e attivo, perche bloccato al C-term da un intbitore + Got 80 @Auando vieni Fornito galatto gio, d'inibitore si stacca e GaLg4 presenta. 40 dOMINIO di attivazone Libero al quali ora puo' Aegarsi SAGA chi permette 29. SEGA AUMA TATA - BP (Bincunq Protein) sull TAMI-Box ea inizia ancha LQ cCOAScata at euenti chi portano atta modufico Alone du nuctro SOmi sul promotore : EVENTI 4) Attivazione du Gold per rimogone delli inibitore 7) Gad lega SAGA e vecluto anche un compusso ubiquitina Ligagico (F0A6) (UBIQUITINARIONE, Primo step dill codKoL istonico) S) A seguito Aull'ubiqUItINARIONL ( H28,L4S123) viena reclutato il compllazzso che miclà LG MIKmtaatonea, rn particolare operata da StE1 cha ha Coma bersaglio La Lisina due N-term du H3 ( LYS4) (METITAZMONE, Secondo Step) d) UN tiMO Step 20 A' ACETILARIONE compiuta da SAGA B) A questo punto L'RNApAL puo' iniziare ko +ascriXM one, per porer protedme (attungamento ail trascritto) © nemsenrio chi L'enzima. percia affinieo: per 49 sito d'iniLO (perch 4' RVAPOL € fortemente Xagarta aL TATA-bOx, ALUO indebolita questo Asgama ogfinchu da trascrizione praudo.) DAL punto Auvista Ale modificazioni istonicha «1 passaggio dall'iizto tra seri zona all'aftungamento € stgnoto da 2 eventi . e MEHAMILONL eAe-ubiquitina tane Questo favorisca la perdita di afinita' con 40 promotore ; dl coda istoni- co deve essere -funadionali ner confronti Aeg allungamento trascriatonala Pertanto perdo a' ubiauitina LUgGAasi e N'ubiquutinazione nai primi nuclgosomi davanti alti RIApOL perchic omar non serono pui, ta trascrittone © partita Vengono rimossi dol SAGA A ENZIMA. Ubbè ch? e un ubiquitina proteasi cha rimuoR 2' ubiquitina e vieni aggiunto un gruppd metile (inun vito diverso) sutta (US3E dall’ H3 chi € nu co du nucrrosoma e fa matitarana du questa Lys 4a peraure + giado du COMPAMOALONI deopa a 20 nuetnosoma. cio! favorisca to trasenzione. La Meti i | € operata da REL. E evidunte come ubiguitinozione lacerazione sono moduficazioni fondamentali e Soprattutto dinamicha. ; per chy L'attivazione cu un geni dave poter escere accesa e Spenta,; ai tratta du geni finemente regolati (non sono sempre attivi coma qu house keeping) L'UBIQUITINAZIONE REGOLA LA METUAZIONE : Coma? Ubiquutina. , proteina dui -_ 4400. . Z mode : A) WADGE è: L'introduagione cult upiquitina, determina. La formazione dui UNO sparo Libero per d'accesso di SA (per La MItitazone) 7) BRIDGE © preveda cha L'ublquetina possa essere essa stessa un stgnodi riconosciuto da un dominio du SerA copata di formate Un compasso stabue così da. mantenere. ta metrtasi associata alla cromatina. per x! em po necrssatto ad introdurre ta mintazxoni. Un modtito comunque non esclude L'atto SILENUAMENTO — in Levito— : Fin ora si © visto chi un promotore attivo sara' caratteri ato da : alta UbiqUitiNA RIONI. Sugir iStoni H7B ) alta MTUazIONI su H3 e alta actitaatone NEL COSO AUl SULRNATOMINEO mi aspetto bassa ubiquitinarione / met act. A Livello ALL DIVA AMI aSpetto pa a vand motto minata . interruttore. molrcotor® regolato dala mitiladXONL > mono- Mati IAZIONI (spento); tri-mentazoni ( acgso). è (nanca un petto, r.0 ?) + un'aftira Kona sottoposta A silantiamento sono x lou'chi definiscono Ja potarita) sessuali du LEVITO + ceMluto identiche du' Lievito gi vanno a d'fFerenziase new 2 tipi sessuati MatalNtatg tramite 4 silunaiamento setutrivo del loci, » tima. Hana soggeita a sueinziamento e x locus du DNA cha cocufico 2h0 por RNA ribotomali ; questo perche © uno dui Loca pur altamente ripetuti (400-450 copie) * dovessi trascrivere tutte non basta 4 pool du ribonuelroticà rifosfati ; Perch ns ho cost tante 7 Perche e non ho Un né cufercrente av Copie funzionali non fa ginter proterco e 20 Cui MUOR + circa mita: dui Loci CONO N LUNIYOA' attraverso Lo formaaLon2 eu’ una struttura. csomotidi co CONCA SATA + Ono COrmvorLte ancha chi chiamate Sir por La ForMaztona Qua Struttura. roteni non istoni I P dov voto Ar ha crmivitaÈ condensata, in particolare Sr4,7,3,4 enumancasdrachtas istonica. Sir4,7,3,4 AL tfowo au 4001 cut mattng pe (per a potorta: gruquale ) Sir 2,3,4> QU ARMOMIII , Sr74 RNA nibosomiala Queste protein non istoniche nterengono per ripristinare Lo toto du condansorione ad ogni ciclo cututare; A4/04 TELOMERO + costituito da sequenze riperute introdotte dolo tellomerata che presenta una tegionga singoto fulamento (SS) a tegiona CL Interagi - -sce con La proteine, netto. reiona prossimate at SS si LocaU XA Un Complasso chi funge da prote tone, © uncumiro di proterns. Futo/kuA0 . REGIONE SUB-TELueRiCA RIPETIZIONI TELOME PICHE 5! x È s ie), ot DNASS ( | bivAds Qui si fermano nucleosomi CENTROMERO a SUMA SeEquenIig ripetute no nucliozomi + Sugli KQuenae riperute € presente. una. Proteina (BP) Rap/, 9a la poratona deal DVAdS ‘ UNA. regione DNASS c'presente 10 dimero kutolkuo che rectura un ererodimero SirZ2/Siw4. Sir2 + 0tivita: diacom LOSCO che ha coma bersaglio Lys 46 dtt istoni H4; quando questo residuo du Lic CC acniloto Sir scindi 4) ALGOME e Ribera an gruppo actit tasctando L'istona dracen Loto. SA FUNZIONI strutturale, modula L'interaavonea con x) dumaro kuzo/80 £ posirtona 40 cComplsso adatta fina dll singolo {danen- to); a questo punto 40 Atgaue Ku30/80 con Sv2 [4 astermina un nu confronti di Lapt ; 0 Iagamra Rap4d indu ci utteriori mocufica zioni conformomionali in cvz(vr4 al punto chi Lo E in grado du sta bite un Rigoni n duimaro Cmeionte è ssoveraziio coni Is attre unta di Papi ; in questo moco Wa proteina Sir si spostano Mano a Mano ver so sb nucleosoma. . Love i APULO! COST ALLO CREVIAPO L'istoni. A quesro punto interviene Lo proteina Sd cha € in grado di promuovere 29 progredute du questa ctruttura verso gli altri ISTONI. «r3 puo‘ Asgars all nucisosoma. solo quando ta LYSA6 E dinatitato, ; una uo figata, al nucdkosoma, Sd puo' reclutate doll sull nuoto SOMA viUno, Sr 2 MuddaA estonmoni massama. € circa. T0Kb6AS aumento du attinito‘ 0 compusso Sirt[suA posauonan La dracetitorzioni 2 cOSC vio. ; £' (+ 40 nucteosomi).