Biologia Molecolare Applicata, Sbobinature di Biologia Molecolare

Scarica Biologia Molecolare Applicata e più Sbobinature in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA I PLASMIDI COME VETTORI Sono delle Entità Genetiche Aggiuntive che si trovano in molte Specie Batteriche ed in alcuni Lieviti. Sono dei DNA Circolari a Doppio Filamento che sono di ordine di grandezza delle Migliaia di Basi. Il Plasmide è caratterizzato dalla presenza di OriC, una sequenza che permette la Duplicazione perché viene riconosciuta dall’Apparato Proteico apposito. Sono quindi dei DNA aggiuntivi che contengono Vari Geni che non sono necessari per la Cellula ma che possono codificare per: La produzione di Tossine, per la Resistenza contro gli Antibiotici o per la Coniugazione (Plasmide F). Nella Cellula Batterica quando si duplica il Cromosoma si duplicano anche i Plasmidi e questi si distribuiscono casualmente nelle Cellule Figlie. Il DNA dei Plasmidi è uno strumento di lavoro perché: • Può essere Facilmente Purificato da una Cellula Batterica • Può essere Modificato in Vitro con l’inserimento di sequenze codificanti per Proteine che a noi interessa produrre nel Batterio • Può essere reinserito in un Ceppo Batterico mediante un processo chiamato Trasformazione. VETTORE DI CLONAGGIO Un Plasmide Naturale Modificato diventa un Vettore di Clonaggio, è un Plasmide naturale in cui è stato tolto tutto ed è rimasto Ori C ed un gene per la Resistenza all’Antibiotico. Quando si effettua la Trasformazione non tutte le Cellule riescono ad assumere il Plasmide Ricombinato, se sottoponiamo i Batteri all’Antibiotico possiamo però selezionare quelli che sono riusciti ad assumerlo, poiché tutti quelli che non hanno ricevuto il Plasmide muoiono. Quando parleremo di Batteri ci riferiremo soprattutto al Batterio Escherichia Coli, che è il modello universalmente utilizzato per quasi tutte le Proteine Ricombinanti ad eccetto il Vaccino della Pertosse che utilizza un’altro Batterio per funzionare. Nei Plasmidi l’Origine di Replicazione sarà sempre Ori C, che contiene le DNA-A Boxes e le Sequenze DUE. I Plasmidi Naturali hanno molte tipologie di Geni, tra cui anche i Geni della Mobilità, ma quelli che tratteremo non li contengono poiché gli sono stati tolti, questi Plasmidi modificati vengono chiamati Vettori. In tutti i Plasmidi sarà presente un Gene per la Resistenza ad un Antibiotico, questo ci permette di Tracciarlo poiché inserendo in una Coltura questo Antibiotico, tutti i Batteri che non lo hanno moriranno. I Plasmidi sono sempre in numero piuttosto alto in un Batterio, da Decine di copie a Centinaia. Nel Plasmide Ricombinante è essenziale che venga inserito un Gene che contenga un Promotore ed un Terminatore, e che si produca un mRNA che abbia un sito RBS Ribosomial Binding Site che permette al Ribosoma di riconoscere l’mRNA. Negli Anni 70 Contemporaneamente in due Laboratori Distinti vennero scoperti: I Plasmidi - Riuscirono a capire come questi potevano essere Estratti dai Batteri, essere Modificati e successivamente Reinseriti nei Batteri con una procedura molto semplice che si svolge in poche ore. Eco R1 - Enzima di Restrizione che riesce a Tagliare il Plasmide una volta sola Linearizzandolo e riesce a tagliare anche il DNA Eterologo permettendo di avere delle Sticky Ends complementari compatibili. ESPERIMENTO DI CLONAGGIO L’Esperimento di Clonaggio in Breve consiste nell’avere a disposizione un Vettore (Plasmide con Origine di Replicazione e Resistenza all’Antibiotico che spesso è l’Ampicillina) ed un DNA Eterologo. È un Alternanza di Lavoro in Vivo ed in Vitro: In Vitro - Si lavora in una Provetta, in un Tampone ben definito con il DNA Plasmidico purificato, Enzimi di Restrizione Purificati, DNA Ligasi e DNA Eterologo Purificato. In Vivo - Si lavora dentro la Cellula Batterica, e serve principalmente per far Proliferare e rendere più abbondante il Plasmide. Il Plasmide viene Tagliato e al suo interno viene Inserito il DNA Eterologo, legato Covalentemente grazie anche ad una DNA Ligasi, successivamente il Plasmide Modificato viene reinserito in E.Coli. Questo processo prende il nome di Trasformazione. Durante il Ciclo di Duplicazione in ogni Batterio il Plasmide Modificato viene duplicato e diviso equamente nelle Cellule Figlie. 1 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Quando si Inserisce il DNA Eterologo è importante avere 2 Accortezze: • Non Toccare la Sequenza di Resistenza all’Antibiotico - Se per assurdo questa venisse tagliata o ci venisse inserito il DNA Eterologo non sarebbe più prodotta la Beta-Lattamasi (Proteina che induce Resistenza all’Ampicillina). • Non Toccare l’Origine di Replicazione - Se viene tagliato o ci viene inserito il DNA Eterologo, il Plasmide non è più in grado di Replicarsi. Un esempio sarebbe quello che le DNA-A non riuscirebbero più ad agire sulle Sequenze DUE inducendo l’apertura del Doppio Filamento poiché nel mezzo ci è stato inserito il DNA Eterologo. Il Plasmide non ha delle Costrizioni di Misura, si può togliere ed inserire sequenze tranquillamente, basta non toccare le Zone Fondamentali. L’Unità di Misura è dell’ordine di migliaia di basi. Generalmente il Plasmide funziona fino anche a 10 volte la sua Lunghezza originale, quindi il Frammento Eterologo che viene inserito può essere anche più grande del Plasmide stesso. FASI DELL’ESPERIMENTO DI CLONAGGIO 1° FASE - In Vivo Il Primo Passaggio è in Vivo, serve semplicemente per Produrre tanto Plasmide su cui poi lavorare, si fanno crescere i nostri Batteri in Mezzo Litro 1/2 L di Terreno Liquido, la Mattina dopo si Centrifuga e tramite una Specifica Procedura si recuperano i Batteri per poi purificare il Plasmide. In questo modo si ottiene circa 1 milligrammo solamente di Plasmide Purificato da cui è stato tolto tutto (Proteine,Lipidi,RNA). Questo viene conservato in Freezer per 1 Mese in maniera che quando qualcuno ne ha bisogno lo utilizza, quando questo finisce viene ripreparato. 2° FASE - In Vitro Successivamente si procede con la Purificazione del Plasmide, e lo andiamo a Tagliare in un Sito di Restrizione Adeguato (Es. PST1) questo viene messo insieme ad un Frammento di DNA Eterologo tagliato con lo stesso Enzima di Restrizione e si inserisce anche una Ligasi e ATP (Serve alla Ligasi per Funzionare) in modo tale che il Frammento di DNA Eterologo venga inserito nel Plasmide, si ottiene un Plasmide Ricombinante o Vettore Ricombinante. 3° FASE - In Vivo Dopo aver operato in Vitro, per fare il Plasmide Ricombinante è necessario reinserire il Plasmide Ricombinante nelle Cellule Batteriche, questo processo viene chiamato Trasformazione. Per convincere le Cellule Batteriche ad assumere il Plasmide bisogna sottoporle ad uno Shock ad Alta Concentrazione di Calcio Cloruro creando così delle Cellule Competenti in grado di assumere il Plasmide. Utilizzando a freddo questi Sali di Cloruro questi Batteri verranno danneggiati, non in maniera mortale ma verrà danneggiata la loro Parete e la loro Membrana in modo tale che quando viene Indotto uno Shock Termico (42 Gradi) e vengono mescolati con il DNA (Plasmide Ricombinante) questo riesce ad entrare nella Cellula. A questo punto nella Provetta avremo alcune Cellule che sono Morte, mentre tra quelle che sono sopravvissute molte non avranno assunto il Plasmide mentre poche lo avranno assunto. 4° FASE - In Vivo Le Cellule Batteriche vengono spalmate su di una Piastra con una spatola, tra queste, quelle che hanno assunto il Plasmide saranno le uniche in grado di Sopravvivere e Proliferare su di una Piastra di L.B Broth con Ampicillina. Le Piastre di Petri sono dei Cilindretti Alti 1 cm e Larghi 10 cm Riempiti con una Gelatina che è il Terreno di Coltura dove si trovano tutti i Nutrienti che servono al Batterio per crescere più velocemente. Quando la Piastra assume un Colore Giallo vuol dire che è ricca di Nutrienti. Le Piastre con i Batteri vengono inserite in un Incubatore a 37 Gradi e successivamente si va a vedere quante Colonie si sono formate. Su di un Milione di Cellule messe sulla Piastra avremo 1 Cellula che Sopravvive e forma una Colonia. Tipicamente si utilizzano circa 10-20 Milioni di Batteri e ci si aspetta la sopravvivenza di 10-20 Batteri con la Formazione di 10-20 Colonie. Il Taglio mediato da Enzimi di Restrizione deve essere Unico, in questo modo il Plasmide viene linearizzato e non si perde niente. Se i Tagli fossero Multipli la DNA Ligasi non sarebbe in grado di Rimontare il Plasmide Corretto. Anche se l’Enzima di Restrizione Taglia una volta sola possono succedere varie cose: 2 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA • Terminatore • Sequenza Polylinker - che contiene siti di Taglio per Enzimi di Restrizione VETTORE RICOMBINANTE Nel Vettore possiamo inserire un Open Reading Frame, questa deve contenere: • Pribnow Box • Sequenza CAP - per aumentare l’efficienza della Trascrizione • ATG Sequenza Iniziale • Codone di Stop Nell’mRNA che viene Trascritto troveremo nella Sequenza un 3’ che non verrà tradotto ed un 5’ che non verrà tradotto ma che presenterà una RBS (Ribosomial Binding Protein) che è il Sito di Riconoscimento del Ribosoma (Ibridizza la Subunità Minore 16s del Ribosoma). Un’Altra cosa Importante è quella di introdurre un Promotore Forte ed Efficiente, generalmente si ricava il Promotore dai Batteriofagi (Fago Lamda) oppure si utilizza anche il Promotore del Gene per la Beta- Galattosidasi. Introducendo tutti gli Elementi Descritti si ricava un Vettore Ricombinante che una volta inserito nelle Cellule indurrà la Resistenza all’Antibiotico e produrrà anche una Proteina Eterologa. I Vettori di Espressione provvederanno a mantenersi come Plasmidi in numero costante nelle Cellule e quindi si Replicheranno. PERCHÈ SI CLONANO LE PROTEINE? Questa tecnica dei Vettori di Clonaggio viene utilizzata per produrre facilmente delle Proteine che prima erano difficilmente reperibili. • I primi tempi in cui venivano utilizzati gli Enzimi di Restrizione, ogni Enzima veniva purificato dal Batterio, partendo dal Batterio che lo produceva si facevano delle Colture e poi da questi venivano purificati gli Enzimi, ma questa era una procedura molto Laboriosa e Costosa. La cosa più semplice da fare è invece quella di Prelevare la Sequenza Codificante ed inserirla in un Vettore di Espressione facendola produrre poi ad E.Coli. • Un’Altro esempio è quella delle Lipasi Particolari prodotte da Pseudomonas, questo Batterio ne produce pochissime, per questo motivo è molto utile utilizzare il Vettore di Espressione contenente il Gene che codifica per le Lipasi e farla produrre ad E.Coli. UTILIZZO DI UN VETTORE INDUCIBILE Se inseriamo un Plasmide Ricombinante sotto un Promotore Forte il Gene viene trascritto moltissimo, c’è molto RNA Messaggero e quindi il Batterio è costretto a far tradurre questa Proteina. Qui si va incontro ad un Problema, ovvero che se non ponessimo un Vettore Inducibile il Batterio si impegnerebbe così tanto nella Produzione di quella Proteina che non avrebbe più risorse per Proliferare. Di conseguenza la Proteina verrebbe Prodotta in grande quantità ma solamente da Pochi Batteri. Il Vettore Inducibile È un Vettore che in certe condizioni non funziona e funziona solamente se è presente un Induttore. Un esempio di Vettore Inducibile è l’Operone del Lattosio che Funziona in presenza di Allolattosio che si attacca al Repressore permettendone il Distacco. In questo modo si permette ai Batteri che contengono il Vettore Inducibile di Proliferare arrivando alla Fase Plateau e successivamente una volta che questi hanno Proliferato si Aggiunge un Induttore (Che potrebbe essere anche il Lattosio o un’altra Sostanza) e si fa partire il Promotore che comincia a lavorare. Ciò che mi interessa è l’Operatore. È all’Operatore che si lega il Repressore impedendo alla RNA Polimerasi di lavorare, per cui il Gene è Represso. Nel momento in cui arriva l’Induttore, che nelle Cellule vive è l’Allolattosio, il Gene viene Indotto. Negli Esperimenti l’Induttore non è l’Allolattosio ma è il IPTG Isopropil- Tiogalattoside, una Molecola che come l’Allolattosio si lega al Repressore e lo stacca dall’Operatore. Si utilizza IGTP Isopropil-Tiogalattoside perché la Cellula è molto Permeabile a questa Molecola ed inoltre non viene Sottoposta ad Attività Enzimatica. L’Acrilammide è una sostanza in grado di separare per Elettroforesi le Proteine in base al Peso Molecolare. Nell’immagine si può vedere l’elettroforesi delle proteine, che vengono separate. Ci sono dei Promotori Inducibili con la Temperatura, di conseguenza a Basse Temperature non vengono riconosciute dall’RNA Polimerasi 5 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA mentre ad Alte Temperature vengono riconosciute dall’RNA Polimerasi. Aumentando la Temperatura quindi aumenteremo la Produzione di Proteine Ricombinanti. UTILIZZO DI UN GENE EUCARIOTICO Non si può Inserire un Gene Umano all’interno di un Vettore di Espressione, poiché i Geni Umani presentano molti Istoni e sono anche molto Lunghi, di conseguenza non possono essere inseriti nei Plasmidi dei Batteri che non possono fare Splicing. Per questo motivo quando vogliamo Esprimere delle Proteine Umane o Eucariotiche si utilizzano gli RNA Messaggeri, in cui si ha un Open Reading Frame continua. Il Recupero degli mRNA è possibile grazie alla Presenza della Coda Poli-A posseduta da quasi tutti gli mRNA. Purtroppo l’RNA non può essere inserito in un Plasmide, è quindi necessario che l’mRNA venga Trasformato in cDNA con una Retrotrascrizione (Stesso Meccanismo che utilizzano i Retrovirus ed i Retrotrasposoni). Viene quindi purificato l’RNA e da questo viene prodotto un cDNA che ha un Open Reading Frame continua che può essere inserita all’interno di un Vettore di Espressione. Il Trascrittoma - È l’insieme degli mRNA trascritti in un dato Tessuto o in un dato Organismo in quel momento. I Trascrittomi sono tutti diversi in dipendenza ovviamente dall’Organismo, dal Tipo di Tessuto e dalle Condizioni di Tessuto. Un Tessuto di un Neonato sarà diverso da un Tessuto Adulto, stessa cosa vale anche in presenza di un Danno Tissutale, Infezione o Azione di Farmaci. TECNICA DI LIBRARY DEL cDNA Esiste una Tecnica chiamata Library del cDNA che al giorno d’oggi non viene molto utilizzata perché esistono metodi più efficienti. Tuttavia se ci troviamo davanti ad un Organismo di cui non si conosce nulla, ad esempio una Pianta, questi Organismi produrranno degli RNA Messaggeri diversi a seconda del tipo della Pianta. Fare una Library del DNA vuol dire Costruirsi una Collezione di cDNA, si fa infatti una sorta di Biblioteca in cui si hanno tutti i cDNA di tutti gli RNA prodotti dalla Pianta. Ogni cDNA dovrà essere inserito in un Batterio differente in modo da avere dei Cloni diversi. Prima di tutto bisogna purificare l’mRNA che viene preso da un Tessuto per fare questo: 1. Le Cellule vengono Lisate e vengono tolte tutte le Proteine, Grassi e Lipidi in modo tale che rimangano solamente gli Acidi Nucleici. 2. A questo punto si Utilizza una DNAsi che Distrugge tutto il DNA senza attaccare l’RNA, di conseguenza rimane solamente l’RNA. 3. Per trovare gli mRNA all’Interno dell’RNA rimanente si devono purificare utilizzando una Cromatografia di Affinità, che consiste in una Colonnina con un Supporto Solido a cui sono attaccate in maniera covalente piccole Sequenze di OligodT a singolo filamento che servono a riconoscere la Coda di Poli-A contenuta negli mRNA. 4. Per far si che gli mRNA si attacchino a questa Colonnina di Supporto, si utilizza una Condizione di Alto Sale, si aumenta quindi la Concentrazione Salina, aumentando la forza dei Legami a Idrogeno. 5. La Colonnina viene lavata utilizzando questa Soluzione in Alto Sale in modo tale da Lavare via tutti gli RNA che non sono RNA Messaggeri e quindi che non sono Poli-Adenilati. 6. Successivamente gli mRNA vengono staccati dalla Colonnina utilizzando semplicemente Acqua Pura, destabilizzando i Legami a idrogeno ed ottenendo quella che si chiama la Frazione Poli-A + formata da più o meno tutti gli mRNA. Alla fine quindi avremo nella Provetta tutti gli mRNA che sono rappresentati in quella Cellula, ad eccezione degli mRNA Istonici che non presentano la Coda Poli-A. Osserviamo 2 Casi diversi di Clonaggio: 1) CLONAGGIO DI UNA PROTEINA UMANA DI CUI CONOSCIAMO LA SEQUENZA DI mRNA Per fare questo Esperimento Bisogna Sapere sia la Sequenza da Codificare sia Dove questa viene Espressa. La cosa importante è infatti che quell’mRNA di cui abbiamo bisogno sia espresso, anche se in piccole quantità. Questo Meccanismo vale per qualsiasi Sistema Modello, quindi per qualsiasi Organismo di cui si conosca la Sequenza del Genoma. ESEMPIO - Se vogliamo ad esempio Purificare l’Interleuchina 6 (IL-6) che è una Proteina che partecipa alla Risposta Infiammatoria, l’Approccio che si utilizza è semplice poiché Conosciamo il Genoma Umano, quindi andremo a ricercare in Banca Dati la Sequenza dell’mRNA di IL-6. Si Utilizza la RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) nella quale come primo passo si fa una Retrotrascrizione. Si conosce perfettamente la Sequenza da Amplificare e si inseriscono quindi gli Inneschi tipici e si utilizza il Primer Reverse per copiare l’mRNA. 6 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA 1. Si Creano degli Inneschi che non vanno a copiare tutto l’mRNA poiché il 5’ UTR e il 3’ UTR non ci interessano, ma ci interessa Amplificare solamente la Sequenza Codificante. 2. Con l’Azione della Transcrittasi Inversa si ottiene il Primo Filamento, che copierà tutto l’mRNA fino a suo 5’. 3. Poiché ci interessa Amplificare solamente la Zona dell’ORF si metterà a punto un Oligonucleotide (Primer Direct) che si ibridizzerà nella Zona dell’AUG di Inizio, in questo modo verrà Amplificato solamente la ORF. 4. L’RNA viene Eliminato, per fare questo basta solamente Alzare la Temperatura, inserire una RNasi o basta iniziare la PCR. 5. A questo punto Inizia la PCR, in questo modo Inizialmente si avrà la Formazione di un Filamento di DNA e successivamente la Formazione di un Doppio Filamento e così via. 6. Ottenuti tanti cDNA a Doppio Filamento questi si Inseriscono in Vettori di Espressione sotto il controllo di un Promotore Forte che a sua volta vengono inseriti in E.Coli facendogli esprimere quindi IL-6. 2) CLONAGGIO DI UNA PROTEINA DI CUI CONOSCIAMO SOLO ALCUNE PORZIONI DELLA SEQUENZA DELLA PROTEINA Se abbiamo a che fare con Organismi mai Studiati e con Genomi molto Grandi non è facile fare la Sequenza del loro Genoma. Fare il Sequenziamento del Genoma di questi Organismi richiederà sicuramente molto più tempo. Inoltre anche i Geni saranno dispersi, e ci sarà anche tanto DNA di origine Trasposonica che complica la Ricerca. In questi casi bisogna procedere con uno Screening (Analisi) di una Library di cDNA, infatti è più semplice partire dagli mRNA per arrivare poi ai Geni. La Library di cDNA - È una Collezione di tutti gli mRNA che vengono collezionati sotto forma di Vettori contenenti le loro Sequenze. È quindi una Collezione di Batteri ognuno dei quali ospita un Plasmide in cui è clonato uno dei tanti cDNA derivati dalla Retrotrascrizione degli mRNA totali di quelle Cellule. 1. Si Ottiene l’Insieme del Trascrittoma mediante la Tecnica della Library di cDNA, successivamente si utilizza un Primer Poli-T che Ibridizza la Coda di Poli-A al 3’ di quasi tutti gli mRNA. 2. La Trascrittasi Inversa Sintetizza il DNA utilizzando gli dNTP e come stampo l’RNA, si forma una Molecola Ibrida DNA-RNA. 3. Per formare il Secondo Filamento si ha bisogno di alcuni Inneschi, questo è possibile grazie al fatto che l’RNA viene Digerito Parzialmente e rimangono alcuni pezzi di RNA che possono essere utilizzati come Giunzione Innesco - Stampo. 4. La DNA Polimerasi I (Frammento di Klenow - DNA Polimerasi priva della sua Attività 5’-3’ Esonucleasica) copierà il Secondo Filamento, sarà anche in grado di Spostare i Frammenti di RNA. 5. I Nick che rimangono tra i vari Frammenti di DNA verranno Saldati dalla DNA Ligasi (Utilizza ATP). I DNA che si ottengono Iniziano e Finiscono con delle Estremità Piatte, di conseguenza per Clonarli bisogna prendere un qualsiasi Enzima di Restrizione che digerisca il DNA con Estremità Piatte. L’Attività della DNA Ligasi sarà leggermente più Difficile perché Non Facilitata dalle Sticky Ends, ma è comunque possibile. Un Trucco consiste nell’Aggiungere dei piccoli Oligonucleotidi Sfalsati in cima e infondo che vadano a riprodurre le Sticky Hands di un qualsiasi Enzima di Restrizione, ad esempio inserendo le Sticky Hands di Eco R1 questo Frammento diventerà facilmente inseribile all’interno di un Vettore tagliato con Eco R1. Quantità di mRNA = Quantità di Cellule che li contengono Partendo da un Trascrittoma, in questo ci saranno dei Trascritti più Abbondanti e meno Abbondanti, questa diversa Quantità rimarrà in tutti gli Step. Quando si farà la Sintesi dei cDNA si otterranno alcuni più abbondanti ed altri meno. La Library alla fine sarà una Collezione di Cellule nella quale dovrebbe essere di nuovo rispettata l’abbondanza dei vari mRNA. Nella Library ogni Colonia nasce da uno dei Batteri che ne fanno parte. 7 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Una Parte che Funziona solamente nel Lievito: • ORF (Open Reading Frame) - per l’Espressione in Lievito della Proteina • Promotore Forte di Lievito (Pnmtf) • Terminatore • Sequenza per Enzimi di Restrizione • Origine di Replicazione del Lievito (ARS Autonomy Replicating Sequence) • Alcuni Geni che vengono appositamente Sostituiti • Gene LEU2 per la Selezione in Lievito Una Parte che Funziona solamente in E.Coli: • Gene Resistenza ad Antibiotici • Origine di Replicazione Batterica Questo Vettore viene definito Vettore Shuttle perché si Replica sia in Coli che in Lievito, quindi se si vuole esprimere una certa Proteina non esprimibile in E.Coli si aprirà il Vettore, si inserirà dentro il cDNA, si reinserisce in E.Coli per ottenerne una Grande quantità e successivamente si inserisce nel Lievito per fargli produrre la Proteina. Perché non si fa tutto in Lievito? Non si fa tutto in Lievito poiché da 10mL di Coltura di E.Coli si ottiene moltissimo Plasmide, quasi 1mg mentre se facciamo la stessa cosa con il Lievito questo non è possibile poiché all’Interno dei Lieviti i Plasmidi sono circa una Decina e non in Centinaia come dentro ai Batteri ed inoltre da 10mL di Coltura di Lievito si otterrebbe 1000 volte meno Plasmide. GENE LEU2 Ci sono 4 Geni che servono per la Sintesi della Leucina. Per questi Lavori Utilizziamo dei Lieviti con Geni LEU2 (-) e quindi dei Geni Modificati che non funzionano più, di conseguenza i Lieviti che utilizzeremo Non sono capaci di Sopravvivere in Terreni privi di Leucina. Mettendo il Gene LEU2 nel Plasmide, nel momento in cui il Lievito lo Assume questo Sarà in grado di Sopravvivere in Terreni privi di Leucina. Una volta ogni circa 100.000 - 1.000.000 di Cellule c’è un Lievito che Assume il DNA. Piastrando questi Lieviti su di un Terreno privo di Leucina prolifereranno solamente i Lieviti che hanno assunto il Plasmide ed in questo modo verranno Selezionati. RIASSUNTO DI TUTTI GLI STEP 1. Si fa una Library di cDNA in E.Coli. 2. Tramite lo Screening con Oligonucleotide con Sequenza Degenerata si va a Trovare e Isolare il Clone Desiderato. 3. Si fa una Crescita di questo Batterio in Coltura Liquida e si Isola il Plasmide contenente il cDNA. 4. Si Taglia il Plasmide con un Enzima di Restrizione e si Trasferisce il cDNA nel Vettore Shuttle. 5. Si fa la Trasformazione in E.Coli e si fanno Crescere in Liquido queste Cellule Batteriche in modo da ottenere una Buona Produzione del Vettore Shuttle. 6. Il Vettore Shuttle viene Purificato e Trasferito in Cellule Eucariotiche di Lievito che saranno in Grado di Produrre le Proteine Ricombinanti. PURIFICAZIONE E SEQUENZIAMENTO DI UNA PROTEINA Le Proteine sono Molecole in teoria facilmente Purificabili. Per Purificarle si possono utilizzare vari Metodi Chimici come: Selezionamento in base al Peso Molecolare, poi per Carica Elettrica e poi con altri Metodi. Oltre alla Purificazione delle Proteine si sapeva anche la Sequenza, come erano fatte queste Molecole, lo studioso Eric Sanger negli anni 50 (1955) completò il Sequenziamento dell’Insulina. Il Sequenziamento - Si trattava di un Sistema che prevedeva il taglio con Metodi Chimici del primo Amminoacido, quindi si ha il distacco da una Proteina Purificata del Primo Amminoacido, che viene analizzato ed Identificato, e così via per tutti gli altri. Era un Metodo molto lungo e laborioso ma molto sicuro, ed il risultato alla fine era praticamente Certo. Eric Sanger vinse anche il Nobel per questa tecnica che mise in atto. SEQUENZIAMENTO DI UN GENE Completamente diverso è il Sequenziamento di un Gene, questo non possiamo purificarlo, poiché si trova all’interno del Cromosoma. 10 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Sequenziamento Iniziale - I Geni sono rimasti misteriosi fino agli anni 70 quando di nuovo Eric Sanger mise appunto un Metodo molto Laborioso ma Efficiente per capire l’intera Sequenza del Gene (Anche Promotore e Terminatore). Sequenziamento Attuale - I Metodi Odierni che vengono utilizzati sono stati messi appunto circa 10-15 anni fa e si chiamano Next Generation Sequencing, questi sono basati su principi totalmente diversi rispetto a quelli di Sanger. 3) COLTURE CELLULARI Per Aggirare il Problema delle Modificazioni Post-Traduzionali In questo caso bisogna utilizzare per forza le Cellule Animali in Coltura, questo perché ad esempio la Glicosilazione è qualcosa che avviene in modo diverso anche tra Cellule Eucariote. Sono le Proteine che devono intraprendere la via del RE e di Golgi dove queste vengono Modificate e raggiungono il Folding Corretto nel RE. Per essere abbastanza sicuri di avere la Proteina Corretta, con il Corretto Folding, è quindi necessario utilizzare un Sistema di Cellule Animali in Coltura che fa ripercorrere all’RNA Messaggero ricombinante lo stesso percorso di Traduzione che viene intrapreso dalla Proteina Naturale. Per fare questo si utilizzano le Cellule in Coltura. Le Colture Cellulari esistono da molto tempo e rappresentano la possibilità di avere delle Cellule derivate da un Organismo, se riesco a Coltivare in Vitro queste Cellule ottengono un sistema modello che sicuramente è un po’ distante dall’Organismo intero ma a livello Cellulare si tratta delle Cellule di Tessuto Specifico. Le Colture Cellulari presentano vari Vantaggi: • L'Ambiente Extracellulare può essere facilmente manipolato andando a cambiare Nutrienti o Farmaci. • Utilizzare un Tipo Cellulare ben Definito (Es. se voglio lavorare su Cellule di Fegato utilizzo Cellule che derivano dal Fegato). • Grandi Quantità di Cellule • Possibilità di Studiare varie Funzioni Cellulari, questo Sistema è ottimo per studiare ad esempio il Metabolismo Cellulare. Esistono due Tipologie di Colture Cellulari: Colture Primarie e Linee Cellulari COLTURE PRIMARIE Si prende direttamente del Tessuto da un Organismo, questa è una Tecnica vecchissima. Un Esempio è l’Espianto del Midollo Spinale dove le Cellule prelevate anche se non proliferano più dopo circa un giorno formano gli Assoni che si sviluppano anche in Coltura. Con le Colture Primarie posso portare avanti Esperimenti Veloci poiché le Cellule tendono a Morire. Le Cellule del Midollo tendono a Morire nel giro di pochissimi giorni mentre i Fibroblasti possono proliferare ma dopo 15 giorni muoiono. LINEE CELLULARI Le Linee Cellulari sono delle Cellule che hanno una Caratteristica Fondamentale: Proliferano Indefinitamente. Fonti delle Linee Cellulari: Tumori - Sono delle Cellule che si sono separate dall’Organismo diventando una sorta di Organismo Autonomo capace di Proliferare Vivacemente. Se si ha un Espianto del Tumore facendo una Coltura Primaria si ha che queste Cellule Proliferano Indefinitamente ed otteniamo la Linea Cellulare. Questa infatti ha il Pregio di Proliferazione Indefinita ma il Difetto è che le Cellule Tumorali non sono mai identiche al Tessuto di Partenza poiché tendono a differenziare. Bisogna quindi sempre tenere di conto che non sono delle Cellule Normali e che hanno Meccanismi Diversi dalle Cellule di Partenza. Cellule Trasformate in Vitro - Si tratta di Cellule che hanno subito delle Particolari Mutazioni a livello di Oncogeni e di Oncosoppressori e di conseguenza sono diventate Tumorali. La Proliferazione è Fondamentale perché possiamo poi andare a Coltivare le Cellule e se a queste ci aggiungiamo i Nutrienti come Ossigeno e le Teniamo a 37° allora cominceranno a Proliferare. Coltura in Piastre - La Coltura è in Piastre che sono praticamente uguali alle Piastre per la Batteriologia, l’unica differenza è come sono trattate le Cellule, perché in questo caso tutte le Cellule che derivano da Tessuti Soliti per Crescere devono Aderire a qualcosa. Le Colture si fanno quindi nelle Piastre, nelle Fiasche (Utili per il Trasporto delle Cellule) oppure nei Multi Pozzetti. Il Liquido di Coltura - è un Liquido che varia di Colore, dal Rosso al Violetto al Rosa Chiaro e questo ci indica come sta andando il PH (Se Rosso Vivo non sta andando bene), il PH viene mantenuto immettendo negli Incubatori a 37° delle quantità note di Ossigeno e di CO2. Aderenza delle Cellule - La Maggior parte delle Colture Cellulari sono Aderenti, se però studiamo dei Linfociti o Cellule che derivano da Linfomi o Mielomi allora abbiamo dei Tessuti Non Solidi le cui Cellule non si Coltivano in Adesione. 11 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Il Medium - è la cosa più Importante, si tratta di un Medium particolarmente Ricco poiché ci sono Amminoacidi (Le Cellule di Mammifero come le nostre non riescono a Sintetizzare tutti gli Amminoacidi). Si ha anche una serie di Vitamine e di Fattori di Crescita, molti di questi vengono resi disponibili aggiungendo una quantità alta di Siero Fetale di Vitello. La Crescita avviene negli Incubatori mentre la Coltura viene fatta nelle Cappe a Flusso Laminare. Cappe a Flusso Laminare - sono Cappe in cui essenzialmente deve essere mantenuta la Sterilità poiché il Terreno di Coltura delle Cellule è così ricco che se ci va a finire un Batterio o anche un Lievito questi cominceranno a Proliferare con una Velocità Elevata. Davanti c’è un Plexiglass che funziona da Saracinesca che sale e scende, all’interno l’aria viene filtrata ed in aggiunta vengono utilizzati dei Guanti Sterili, ed una volta che tutto il Materiale è stato Introdotto durante la notte questo Spazio viene illuminato da Raggi UV che dovrebbero mantenere la Sterilità. ES. Cellula C2C12 È una Cellula Muscolare che deriva dal Muscolo di Topo e che è stata messa in Coltura. Qui le Cellule in Vitro si possono addirittura differenziare e possono formare le Striature tipiche delle Fibre Muscolari, possono formare anche dei Sincizi, ricordando quindi il Tessuto da cui provengono. VETTORE DI ESPRESSIONE EUCARIOTICO Per far esprimere una Proteina Ricombinante nelle Nostre Cellule che si trovano sulla Piastra è necessario un Sistema di Selezione molto efficace. Nelle Cellule trasferiamo dei Plasmidi perché sono l’opzione più facile visto che possiedono due parti: Parte Batterica che serve per produrre grandi quantità di queste proteine, ed una Parte Eucariotica che avevamo già visto per il lievito. In questo caso la Parte Eucariotica è leggermente diversa, poiché nelle Cellule di Animali i Plasmidi entrano nel Nucleo e ci rimangono mentre nel Lievito i Plasmidi erano delle Entità a se stanti. Nella Parte Procariotica ci sono sempre le stesse cose: • Origine di Replicazione OriC • Gene di Resistenza ad un Antibiotico (Es.Ampicillina) • Promotore e Terminatore. Il Resto del Vettore contiene: • Il Gene che vogliamo esprimere, ovvero il gene che contiene il cDNA • Promotore Eucariotico che deriva da Virus Animali • Terminatore • Un Gene che conferisce resistenza ad un Veleno Cellulare, simile a quello della resistenza all’Ampicillina nei Batteri. Es. Gene per la Resistenza G418. TRASFEZIONE MEDIANTE LIPOFEZIONE Per trasferire il DNA in una Cellula si opera quella che si chiama Trasfezione con i Liposomi. Se noi versiamo del DNA sulle Cellule queste non lo assorbiranno poiché il DNA è una molecola molto grande e carica e non attraversa il Doppio Strato Fosfolipidico. Per convincere le Cellule ad assorbire il DNA si utilizzano i Liposomi, che sono delle Micelle formate da una Doppio Strato Fosfolipidico in cui all’interno inseriamo il DNA. Nella Lipofezione: 1. Si prendono dei Fosfolipidi, si fa un emulsione e si Formano delle Micelle che hanno catturato il DNA, le Micelle con il Doppio Strato Fosfolipidico riescono a fondersi con la Membrana Citoplasmatica delle Cellule. 2. Se facciamo questa emulsione otteniamo le Micelle e possiamo Trasferire il DNA Plasmidico in circa il 50% delle Cellule in cui tentiamo di farlo entrare. 3. Il DNA entra nel Citoplasma e spontaneamente Migra nel Nucleo attraverso i Pori Nucleari, in alcune Cellule questi non si inseriscono nel DNA Cellulare e di conseguenza in queste Cellule i Plasmidi tendono a sparire, mentre invece in maniera meno frequente questi Plasmidi riescono ad inserirsi nel DNA Cellulare e da qui possiamo avere due tipi di Ricombinazione: Mitotica o Meiotica. 4. Quando il Plasmide si integra nel DNA, quelle Cellule sono diventate con un Frammento di DNA in più che verrà duplicato con tutto il resto del DNA e diventerà quindi patrimonio genetico di tutto il clone. 5. Il Plasmide oltre che il cDNA porta anche la Resistenza al G418, per questo motivo dopo alcuni giorni, quando siamo sicuri che tutte le Cellule che hanno integrato il Gene di Resistenza al G418 siano in grado di esprimerlo, Aggiungiamo il G418. 6. Le Cellule che hanno Integrato il Gene di Resistenza al G418 Sopravvivono mentre tutte le altre Muoiono. Si lava via tutte le Cellule Morte mentre quelle rimaste Vive tendono a Proliferare. 12 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Il modo per utilizzare il Batterio è quello di Fare due Colture Separate; una per la Catena A ed una per la Catena B, andando a produrre le due Proteine in maniera Separata ma facendo una Fusione con un Dominio derivato dalla Maltose Binding Protein (MBP). La Maltose Binding Protein (MBP) è una Proteina che ha un alta affinità per il Maltosio, e serve ai Batteri per Catturare il Maltosio, nel nostro caso servirà per isolare la Proteina Ricombinante dalle altre Proteine. La Proteina che viene prodotta sarà quindi una Proteina di Fusione tra il Dominio MBP e la Catena A o B. Successivamente con una serie di Processi otteniamo la Catena A e la Catena B pura, e mescolandole in Vitro in Quantità Equimolari e sottoponendole in Ambiente Ossidante si andrà a formare la Proteina Attiva, ovvero l’Insulina Umana. Prima si utilizzava anche l’Insulina Porcina ma questa 1 volta su 10.000 casi ha sviluppato una Resistenza, quindi una Risposta Immunitaria Blanda in alcuni Individui. Processo Produzione di Insulina Umana 1. Si fanno le due Colture Separate e si forma rispettivamente la Catena A e la Catena B. 2. Queste due diverse Sequenze (Catena A e Catena B) vengono entrambe Fuse con il Dominio della Maltose Binding Protein (MBP). 3. Nel mezzo tra le due Sequenze (Catena A/B - MBP) Inserisco un Tetrapeptide ( Isoleucina - Leucina - Glutammico - Glicina - Arginina ) che sarà Bersaglio del Fattore 10A che taglia a valle dell’Arginina. 4. Si fa un Lisato dei Batteri poiché la Proteina viene prodotta a livello Endocellulare, e ricaviamo tutte le Proteine di cui solamente quelle che ci interessano saranno legate alla MBP. 5. Facciamo una Colonna di Affinità che contiene Molecole di Maltosio legate alla Matrice Solida (Colonna), di conseguenza tutte le Proteine che contengono MBP si legheranno a questa. 6. Lavando le Proteine Batteriche tutte quelle che non contengono MBP dovrebbero uscire e dovrebbero rimanere solamente le Proteine di Fusione attaccate alla Colonna di Affinità. 7. Per Staccare le Proteine di Fusione dalla Colonna si aggiunge in Soluzione il Maltosio Libero che compete con il Maltosio legato alla Colonna. 8. Facciamo una Dialisi per eliminare il Maltosio e successivamente utilizziamo il Fattore 10A per separare la nostra Proteina Ricombinante di Fusione dal Dominio MBP e dal Tetrapeptide. 9. Per separare le Proteine di Fusione dalla Soluzione, rimettiamo un’altra Colonna di Affinità che catturerà tutti i Domini MBP, lasciando solamente la Nostra Proteina Pura. SISTEMI DI PURIFICAZIONE Se oggi dovessimo fare una Proteina di Fusione e Purificarla non useremmo la MBP perché esistono dei Sistemi Migliori anche se per l’Insulina utilizziamo ancora questo. 1) HIS-TAG - Il Più Comune sono le His-Tag (Bandierine di Istidina), consistono nell’aggiungere all’N- Terminale una Coda di 6 Istidine, queste si legano avidamente ad uno Ione Nichel che sarà presente nella Colonna legato all’Acido Nitrilotriacetico (NTA). Questo è un sistema molto semplice di Purificazione che si utilizza soprattutto in Laboratorio poiché la Coda di Istidina non influenza l’attività della Proteina in Vitro quindi posso anche non eliminarla. Se voglio eliminare la Coda di Istidina utilizzerò un sistema simile a quello del Fattore 10A, si aggiunge una Sostanza che contiene Alte Concentrazioni di Imidazolo, un Anello Imidazolico che compete con le Istidine e stacca la Proteina che può essere eluita in forma pura. 2) GLUTATIONE S-TRANSFERASI - Si tratta di un’altro Sistema simile alla MBP, questa è la Glutatione S- Transferasi che ha come Substrato il Glutatione Ridotto (GSH) ed ha una fortissima affinità. La Proteina di Fusione ha il dominio di legame con il Glutatione della Glutatione S-Transferasi. Nella Colonna di Affinità verrà legato il Tripeptide di Glutatione che verrà riconosciuto e la Proteina di Fusione si bloccherà a quel livello. BIOFARMACI O FARMACI PROTEICI Inizialmente erano dei Farmaci che replicavano una Funzione, quindi erano la Proteina Tale e quale a quella Naturale, ma successivamente queste sono state modificate, con modificazioni che migliorano da un punto di vista farmacologico e sul mercato sono presenti molte varianti. MUTAGENESI IN VITRO o MUTAGENESI OLIGONUCLEOTIDE DIRETTA Serve per modificare un Amminoacido in Vitro introducendo piccole modifiche nella Sequenza della Proteina Ricombinante. Prima di fare l’esperimento mettiamo il DNA ad Alta Temperatura ed Otteniamo i due Singoli Filamenti separati, in modo tale che il Singolo Filamento sia disponibile all’Ibridazione con un Oligonucleotide che abbiamo costruito noi che è Complementare alla Zona di nostra scelta. Esempio: In un Esperimento si notò che il problema di una Proteina presa in esame poteva essere una Cisteina in Posizione 12, in quella particolare proteina doveva essere eliminata la Cisteina 12 perché si 15 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA pensava che fosse Coinvolta nel Meccanismo Catalitico di quell’Enzima. Sostituendo la Cisteina con un’altro Amminoacido si è visto che l’Attività Catalitica della Proteina Ricombinante non c’era più. A livello di Ricerca possiamo utilizzare la Mutagenesi per identificare le prerogative dei Singoli Amminoacidi. Nell’esempio volevamo modificare la Cisteina 12 con la Serina, un Amminoacido che differisce dalla Cisteina solamente di un Atomo, ovvero ha un Ossigeno al posto di uno Zolfo. Processo di Mutagenesi 1. Tratto il Plasmide ad Alta Temperatura in modo da far Separare i Due Filamenti del Plasmide in 2 Filamenti Singoli. 2. Inserisco un Primer, ovvero un Oligonucleotide che ad una certa Temperatura avrà un affinità maggiore nei confronti del Singolo Filamento del Plasmide e si attaccherà a questo prima che questo si ricongiunga con l’altro filamento. 3. L’Oligonucleotide che io inserisco presenta però un Miss Match di una Singola Base, ma questo non compromette l’adesione al Singolo Filamento. 4. Aggiungo una DNA Polimerasi I di E.Coli, e con l’aggiunta anche di Deossinucleosidi Trifosfato noi potremmo rifare la Sintesi del Filamento. 5. La Polimerasi porterà alla Sintesi del Secondo Filamento, e la DNA Ligasi chiuderà l’Ultimo Legame ricreando un Plasmide che inizialmente sarà composto da un Filamento Parentale e da un Nuovo Filamento perfettamente Complementare eccetto che in un Nucleotide. 6. Quando il Plasmide si duplicherà si formerà un Plasmide Identico a quello Iniziale (Es.Codone TGC per la Cisteina) e un Plasmide Nuovo che contiene il Miss Match (Es. Codone TCC per la Serina) e quindi il Filamento con un Nucleotide Diverso da quello Iniziale sarà capace di produrre una Proteina Diversa da quella Iniziale. In questo modo possiamo fare la Mutagenesi di Singoli Codoni, andando a vedere il Codice Genetico e scegliendo la modalità con cui possibilmente poter Cambiare solamente una Base per cambiare l’Amminoacido. Inizialmente i due Plasmidi diversi sono presenti nello Stesso Batterio ma poi nel corso delle Duplicazioni Cellulari abbiamo uno Sbilanciamento e quindi si formeranno Batteri che hanno solo Plasmidi Parentali e altri che invece hanno i Plasmidi Mutati. Oggi ci sono dei Kit che ci assicurano che il 90% delle Colonie che si ottengono sono Colonie che hanno il Plasmide Mutato. Fare la Mutagenesi in Vitro è quindi molto facile, quello che è difficile è capire quale è l’Amminoacido che devo mutare per avere quel Miglioramento Farmacologico o per annullare l’Attività Enzimatica di un Enzima. Utilizzando i Primer in maniera diversa possiamo anche fare delle Piccole Inserzioni o Piccole Delezioni. La Mutagenesi può essere: • Mutagenesi Conservativa - Sostituisco un Amminoacido con un’altro Amminoacido che è Estremamente Simile, ad esempio la Cisteina con la Serina. • Mutagenesi Non Conservativa - Sostituisco un Amminoacido con un’altro Amminoacido che non è Simile, ad esempio la Cisteina (Polare) con l’Alanina (Apolare). Anche per la Tecnica del CODON USAGE si può utilizzare la Mutagenesi del Plasmide, si modificano infatti per Mutagenesi quei Codoni che non sono appetibili. GENI SINTETICI: SE VOGLIAMO INTRODURRE MUTAZIONI MULTIPLE Potrebbe accadere che in una Proteina ce ne siano tantissimi di questi codoni, invece di mettersi a fare tante Mutagenesi diverse un’altro approccio, non molto complesso è quello di Sintetizzare noi una Sequenza a nostro piacimento. Lo si fa sintetizzando tutta una serie di Oligonucleotidi che possono arrivare fino a 100 basi che riproducono la sequenza di un Filamento e del Filamento Complementare. L’Unica accortezza è quella di farli in maniera sfalsata in modo tale che gli Oligonucleotidi si Ibridizzino in maniera Sfalsata e che abbiano quindi delle Sequenze Complementari sfalsate in grado di tenerli ben saldi. Se mescolo insieme questi Oligonucleotidi ad Alta Temperatura e poi faccio abbassare le Temperature, se le basi in comune sono 40/50 allora 16 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA l’Ibridazione è saldissima già a 70-60°. Possiamo quindi ottenere dei lunghi filamenti che alla fine tratteremo con DNA Ligasi in modo da riparare tutti i Nick presenti alla temperatura di 40/50°. ENZIMI PER OPERARE SUL DNA IN VITRO Gli Enzimi che vengono utilizzati per lavorare in Vitro sono tutti a Singolo Polipeptide e sono facilmente Purificabili ed Utilizzabili. Tra questi Enzimi si ha: • DNA Polimerasi I - Formata da 3 Domini anche se quello che si utilizza è il Frammento di Klenow che è formato dal Frammento di Polimerasi e quello di Proof Reading ed è stato eliminato il Dominio 5’-3’ Esonucleasico perché diminuisce l’efficienza dell’Enzima. Non è molto veloce in Vitro ma nell’arco di 10-15 Minuti riesce comunque a completare il suo lavoro con un attività di Proofreading abbastanza corretta. Abbiamo comunque un Tasso di Errore intorno a 10^-5. • Taq - quella della PCR • Trascrittasi Inversa • DNA Ligasi • Nucleasi di Restrizione - Sono Omodimeri e quindi sono un solo Polipeptide che dimerizza sul DNA • Terminal Transferasi - Serve per aggiungere ATP • Fosfatasi • Chinasi • Peptidi Sarebbe veramente molto difficile utilizzare Enzimi più complessi in Vitro, infatti non è possibile utilizzare la DNA Polimerasi III di Coli perché questa è una struttura estremamente complessa e dovrei aggiungere singoli componenti nella speranza che si rimontino nella maniera corretta. MUTAGENESI OLIGONUCLEOTIDE DIRETTA Mutagenesi Oligonucleotide Diretta che hanno portato ad un Miglioramento in campo medico sono: Insulina Attivatore Tissutale del Plasminogeno Vaccino per la Pertosse Tumor Necrosis Factor TNF INSULINA Un esempio interessante è quello dell’insulina, di cui esiste quella Ricombinante Umana che non induce una Risposta Immunitaria come fa quella Porcina. L’Industria Farmaceutica ha prodotto molte versioni dell’insulina, tra queste: • INSULINA Lys-Pro - Detta anche Insulina Pronta, ed è la più utilizzata. È un Insulina in cui c’è stata un Inversione tra la Prolina in Posizione 28 e la Lisina in Posizione 29, e quindi troveremo prima la Lisina e poi la Prolina. • INSULINA con Asparagina - Possiamo avere anche una Mutazione della Prolina ad Asparagina sempre nella stessa posizione 28. Queste due versioni dell’Insulina fanno si che questa sia prontamente disponibile, grazie ad una maggiore Solubilità ed una minore formazione di Polimeri. Infatti il Pancreas normalmente secerne Insulina sotto forma di Esameri Inattivi che poi si scindono in Dimeri Attivi nell’arco di 10 Minuti. Anche l’Insulina Ricombinante si trova sotto forma di Esamero, ma queste 2 Versioni elencate prima invece fanno si che non si formi l’Esamero e quindi l’insulina si trova direttamente sotto forma di Dimero che è prontamente utilizzabile. • INSULINE a Lento Rilascio - Sono delle Insuline con alcune Mutazioni che hanno reso l’Insulina prodotta Insolubile a PH Neutro e Solubile a PH Leggermente Acido. Queste Insuline vengono iniettate in forma Solubile in un liquido leggermente Acido, quando abbiamo l’Iniezione Sottocutanea, trovano un tessuto a PH Neutro e in quella sede l’Insulina precipita e viene rilasciata nell’arco della Giornata. Queste sono tutte le versioni ricombinanti che il medico ha a disposizione per fare una Terapia più personalizzata. Da alcuni anni l’Industria sta cercando di fare anche l’Insulina Orale, ma è difficile dosarla da un punto di assorbimento intestinale. ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO (tPA) Il tPA (Tissue Plasminogen Activators) è un Farmaco Importantissimo ed è un Antitrombotico. Nella cascata della Coagulazione si formano dei Coaguli di Fibrina che quando hanno terminato la loro funzione da un Punto di Vista fisiologico devono essere digeriti. Nella digestione dei Coaguli di Fibrina, il tPA insieme ad altri Enzimi Proteolitici attiva il Plasminogeno che diventa Plasmino che digerisce la Fibrina. 17 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Il Vaccino Sinovac, è un Vaccino Cinese in cui viene utilizzato il Virus Normale che viene Inattivato da una Molecola chiamata B-Propolactone che ha la capacità di legarsi alle Proteine del Capside che ricoprono l’RNA, Inibendo il Funzionamento del Genoma. Possiamo anche avere un Inattivazione di Tipo Genetico, ovvero operare delle Mutazioni a livello del Virus per produrre un Virus che non sia Infettivo ma che abbia la stessa Struttura Antigienica. C’è una certa Difficoltà di Produzione in grandi quantità ed è meno adatto per i Soggetti Immunodepressi perché può comunque causare una Malattia. Vengono quindi Iniettate le Particelle o il Virus Inattivato, anche se la Struttura è sempre la Stessa. VACCINI PROTEICI (Novavax) Vaccini Tradizionali in cui viene Iniettata la Proteina Antigenica, in questo caso la Proteina Spike che viene prodotta come Proteina Ricombinante in Combinazione con la Proteina M (L’altra Proteina che viene espressa sulle Cellule del Virus). La Combinazione di queste due Proteine viene Iniettata su dei Sistemi che formano (VLP) Virus Like Particles, sono dei Sistemi che fanno si che la Proteina sia posizionata su di una Sferetta che ricorda la struttura del Virus con la Proteina Spike esposta. Quindi possono essere Iniettate le Proteine Antigeniche oppure possono essere Iniettate le VLP che sono degli Aggregati del Capside che non contengono però il DNA Virale. VACCINI A VETTORI VIRALI Vaccini che utilizzano la Tecnologia dei Vettori Virali, in questo caso sono degli Adenovirus, ovvero dei Virus capaci di infettare il nostro organismo e che possono essere modificati in maniera tale da essere Virus Replicativi o Virus Non Replicativi. Questi Virus sono responsabili di Malattie Lievi del Tratto Respiratorio che sono capaci di Infettare le Cellule, ma per fare i Vaccini sono stati modificati e nel Genoma portano la Sequenza codificante per la Proteina Spike. Di questi Vaccini ne fanno parte Astrazeneca, Johnson&Johnson e Sputinik. Virus Replicativi - Sono Ceppi Attenuati, Ingenerizzati in modo tale da non dare una vera e propria Infezione, ma che portano all’espressione della Proteina Spike che è stata inserita sotto il controllo di un Forte Promotore. Una volta che il DNA del Virus si trova all’Interno della Cellula viene trascritto il Gene della Proteina Spike che viene rilasciata dalle Cellule diventando un Antigene. Questi Virus sono Prodotti in Cellule in Coltura che produrranno grandi quantità di Virus che poi vengono Ingegnerizzati. Virus Non Replicativi - Virus in cui il Genoma dell’Adenovirus è stato Ingegnerizzato in Vitro (Inserzione della Proteina Spike ed Eliminazione di alcuni Geni Replicativi). Questo DNA dell’Adenovirus Ingegnerizzato viene inserito in Cellule Helper Particolari che produrranno dei Virus Difettivi che libereranno, questi vengono recuperati dal Sopranatante e vengono Iniettati nel Paziente. Questi Virus nel Paziente non riusciranno a Replicarsi ma andranno ad Infettare le Cellule facendogli produrre la Proteina Spike. Cellule Helper - Nei Virus Non Replicativi le Cellule Helper servono per produrre grandi quantità di Virus Infetto, sono delle Cellule in cui sono state inserite tutte le Proteine che servono per la formazione del Virus e quindi la Cellula Helper le Produce, nel momento in cui queste Cellule vengono infettate dal Virus, questo Genoma trova nelle Cellule tutte le Proteine che servono alla Replicazione e di conseguenza il Virus in queste è in grado di replicarsi. VACCINI A RNA Tecnologia che è stata messa a Punto da 10-15 Anni per il Trattamento Tumorale. Il Principio di questi Vaccini è di Inoculare l’RNA Messaggero che entra nel Citoplasma delle Cellule e viene Riconosciuto e Tradotto come Proteina (Es. Proteina Spike) che viene rilasciata nell’Ambiente Extracellulare. Es. Vaccino contro il Tumore al Melanoma Il Tumore ha degli Antigeni specifici che il Sistema Immunitario cerca di aggredire, in alcuni tipi di Tumore come il Melanoma una delle modalità di cura è quella di fare dei Vaccini andando a vedere quali sono gli Antigeni più espressi in quel Tumore, in modo da stimolare la Risposta Immunitaria contro quegli Antigeni Specifici. 20 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Il Vantaggio di questa tipologia di Vaccini è quella di essere Composti da delle Sequenze Codificanti e quindi cambiando la Sequenza Codificante si cambia il Vaccino ma comunque rimane la stessa Molecola di mRNA ed anche i Sistemi di Purificazione e di Produzione rimangono gli stessi, è un Sistema Elastico. Questi Vaccini stimolano la Risposta Immunitaria che dovrebbe colpire le Cellule Metastatiche e reagire con gli Antigeni del Melanoma in maniera più forte ed efficiente del normale. Produzione dei Vaccini ad RNA La Produzione è puramente in Vitro e viene utilizzata una particolare RNA Polimerasi Virale che è di un Batteriofago che si chiama Sp6 e che può essere RNA Polimerasi T7 o T3. Queste sono delle Polimerasi molto efficienti e riconoscono degli specifici Promotori tipici per T7 o T3. Si ha quindi una Sequenza che contiene in ordine: 1. Promotore Forte Tipico per T3 o T9 2. Ribosome Binding Site 3. Sequenza Codificante per la Proteina Spike 4. Sequenza Poli-A 5. Terminatore Si ottiene in grandissime quantità un mRNA codificante per la Proteina Spike, che però può essere utilizzato solo in E.Coli ed in Cellule Batteriche. Per diventare un mRNA Eucariotico si devono Introdurre delle Modificazioni Post-Trascrizionali in Vitro: • Sequenza della Coda di Poli-A - Aggiunto alla Sequenza Codificante per l’mRNA • Cap al 5’ - Viene aggiunto Chimicamente, è un Cap Sintetico leggermente diverso da quello Naturale e permette al Messaggero di essere Tradotto più facilmente. Di conseguenza verrà Riconosciuto dai Ribosomi : 5’UTR - AUG di Inizio - Codone di Stop - 3’UTR - Poli-A. L’mRNA ha un Emivita molto Breve, di conseguenza nella Sintesi di questi RNA vengono utilizzati degli Analoghi di Base che sono Identici da un punto di vista Traduzionale ma rendono l’RNA più Stabile. Questo RNA non viene Iniettato Nudo, ma questo viene Complessato con Strutture come Nanoparticelle, Liposomi o Protamine. Di questi Vaccini ad RNA per il Covid-19 ne fanno parte Moderna e Pfizer. VACCINO PER HERPES ZOSTER E’ il Vaccino Vivo Attenuato, ma è stato approvato da poco un’altro Vaccino che contiene la Glicoproteina E. La Glicoproteina E è una Proteina espressa sulla Superficie del Virus. Questo Vaccino dovrebbe essere valido per anni, poiché questo è un Virus a DNA che non dovrebbe produrre molte varianti. VIRUS DELL’EPATITE C È un Virus a Genoma RNA particolarmente Instabile, per questo motivo non c’è ancora un Vaccino. Questo Virus a lungo andare porta alla formazione di Tumori a livello Epatico. Ci sono varie Cure Farmacologiche Specifiche che non utilizzano la Tecnologia del DNA Ricombinante. Ci sono alcune Molecole che Inibiscono Specificatamente delle Proteine del Virus e vengono utilizzate in Combinazione perché riescono a Bloccare il Virus ed Eradicarlo. È quindi una Cura Antivirale. • Sofosbuvir - Inibisce l’Enzima RNA Polimerasi RNA Dipendente (NS5B). • Simeprevir - Inibisce la Serina Proteasi (NS3/4A), essenziale per la Replicazione del Virus dell’Epatite C. • Declastasvir - Potente inibitore del complesso NS5A essenziale per la Replicazione del Virus. VACCINO PER LA PERTOSSE La Pertosse è una Malattia dovuta ad un Batterio chiamato Bordella Pertussis che per l’Infezione Batterica in se non darebbe problemi, ma, come tanti altri Batteri (Clostridium Tetani, Clostridium Botulinum) produce una Tossina estremamente dannosa. La Tossina della Pertosse non ha alto rischio di mortalità ma può essere molto pericolosa e fatale per i Bambini Piccoli, infatti è uno dei primi vaccini a cui vengono sottoposti. Se un individuo ha avuto la Pertosse da piccolo la protezione di solito vale per tutta la vita, per questo motivo infatti la Tossina prodotta è un Antigene molto forte. La Tossina della Pertosse è Tossica in virtù della sua Attività Enzimatica, infatti è un ADP Ribosilasi. L’ADP Ribosilazione Inattiva le Proteine G per cui queste Rimangono Legate a GDP e si verificano una serie di Segnali a Cascata. Abbiamo la Mancata Attivazione dell’Adenilato Ciclasi, Aumento dell’AMP Ciclico, Interferenza con le Segnalazioni Cellulari e la Morte della Cellula. La Ribosilazione delle Proteine G Trimeriche è il meccanismo di Azione di questa Tossina. L’Inattivazione della Tossina con il Calore (90-95°) Fu uno dei metodi che venivano inizialmente utilizzati per produrre il Vaccino, ma si è poi osservato che la Proteina manteneva comunque una Certa Tossicità, di conseguenza era pericolosa e la Vaccinazione fu interrotta. 21 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Vaccino Ricombinante con Mutagenesi La Vaccinazione riprese negli anni 90 quando venne utilizzata la Mutagenesi. Questa fu un Idea formulata a Siena dall’azienda Sclavo Vaccini (GSK) grazie ad un Ricercatore Rino Rappuoli. L’Idea era quella di Cercare delle Mutazioni a livello del Sito Attivo dell’Enzima che avrebbero interrotto l’Attività Enzimatica stessa rendendo la Tossina Inattiva. Inattivando l’Enzima si va a perdere la Tossicità della Tossina, che rimane comunque un Potente Antigene ma non tossico. Questa Tossina non può essere espressa in E.Coli, di conseguenza dovettero operare direttamente sul Batterio della Bordetella Pertussis utilizzando i suoi Plasmidi ed esprimendo questa proteina sempre in Bordetella Pertussis. La Tossina essendo un Antigene possiede delle Parti più Esposte chiamate Epitopi, ciascuno di questi viene riconosciuto da un Anticorpo diverso, di conseguenza Modificando la Proteina si sperava di non andare a toccare nessuno di questi Epitopi esposti. Alla fine i Mutanti che sono stati prodotti da un punto di vista Antigenico sono perfettamente sovrapponibili alla Tossina, e la Tossina in questo caso è un fortissimo Antigene per cui il Sistema Immunitario di una persona con una Risposta Immunitaria Normale reagisce molto violentemente creando una forte Memoria. Schema per la Produzione del Vaccino La Preparazione del Vaccino per prima cosa prevede il Clonaggio del Gene della Tossina. Questa Tossina è piuttosto grande, siamo intorno ai 1000 Amminoacidi e quindi fu molto difficile capire quale fosse il Sito Attivo visto che questo è anche Tridimensionale. Alla fine scoprirono quale era andando a vedere Siti Attivi di altre ADP Ribosilasi conosciute. 1. Mutarono 2 Amminoacidi anche se solamente la Mutazione di 1 Amminoacido portava all’Inattivazione dell’Enzima. (Non si può Mutare solamente 1 Amminoacido poiché si rischia che ci siano degli Errori/ Danni al DNA ed è possibile che l’Unico Codone Mutato Retromuti e torni nella sua Conformazione Normale, accendendo di nuovo la Tossicità della Tossina). 2. Il passo successivo fu di Inserire il Gene Mutato nel Batterio della Bordetella Pertussis e fu prodotta la Proteina Ricombinante, Ex Tossina, che a questo punto è Totalmente Inattiva anche se la sua Immunogenicità è rimasta invariata. 3. Il Vaccino viene prodotto in Grandi Fermentatori in cui Miliardi di Cellule Proliferano e producono la Tossina, uno dei Pericoli più grandi durante il Processo di Preparazione del Vaccino è proprio il Fermentatore, che se fosse pieno di Tossina Tossica si dovrebbe buttare via tutto il contenuto. VACCINO PER IL MENINGOCOCCO La Meningite è una Malattia del Sistema Nervoso dovuta ad un infezione batterica data dal Meningococco. Per questo Vaccino venne in mente di utilizzare la Reverse Vaccinology, ovvero la Vaccinologia Inversa. Il Principio di Pasteur prevede, come primo passaggio, di Isolare il Germe, poi fare la Detossificazione per Mutagenesi della Tossina ed infine l’Iniezione. Quando non si riesce a trovare la giusta Proteina (questo avviene principalmente nei Batteri in cui ci sono moltissime Proteine che producono) Si Parte dal Genoma per Avere una sorta di quadro di tutte le Proteine espresse dal Batterio. Oggi chiediamo direttamente al Computer tutte le ORF di quel Batterio Specifico, se invece viene fatto manualmente si cerca il Codone ATG e si guarda dopo quanti Codoni si trova un Codone di Stop, solitamente un ORF comincia ad avere un senso quando abbiamo un Numero di Codoni intorno a 200. Dopo che abbiamo un quadro di tutte le Proteine espresse dal Batterio il passaggio successivo è quello di mettere in atto una Serie di Passaggi al fine di Ricavare una Proteina che possa funzionare da Antigene. Per fare questo si fa riferimento ad una serie di Criteri tra cui il più importante è la Visibilità della Proteina. Tra tutte le Proteine, quelle di Membrana sono le più propense per l’utilizzo del Vaccino. Le Proteine di Membrana si riconoscono grazie al loro Dominio Transmembrana che è costituito da circa 20 Amminoacidi Idrofobici che devono formare una Struttura ad Alpha Elica. L’Individuazione di questi Domini viene fatta direttamente dal Computer, noi possiamo esclusivamente Personalizzare la Ricerca: • Bassa Stringenza - Si forniscono al Computer dei parametri per fare una ricerca che dia come risultato una Credibile Sequenza Transmembrana, questa è una Procedura Poco Specifica. • Alta Stringenza - Procedura più specifica, ho come risultato le Proteine contenenti il Dominio Transmembrana, escludendo completamente tutte le altre. 22 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Se entrambi i Vettori li Trasfettiamo nelle Cellule Linfocitarie queste andranno a Produrre gli Anticorpi che vengono poi Secreti e io li ritroverò nel Liquido Soprantante. L’Unica accortezza, poiché vanno inseriti 2 Vettori, è quella di avere 2 Modalità di Selezione Diverse, quindi se su di un Vettore utilizzo G418 sull’altro dovrò utilizzare un’altro Tipo di Selezione. Gli Anticorpi Umanizzati (95% Sequenze Umane) sono quando viene fatta la Sostituzione solo delle Zone CDR Umane con quelle Murine. Si prendono solamente pochi Residui della Regione Variabile. Le Reazioni che possiamo avere a seconda di quale Anticorpo Utilizziamo (Murino, Umanizzato, Chimerico) possono essere: • Marginabili • Tollerabili • Marcate ANTICORPI IN TERAPIA Gli Anticorpi in Terapia ad oggi possono essere utilizzati con varie modalità: • Blocco di Interazioni tra Ligando e Recettore - Se il Recettore è l’Oncogene e lo Blocchiamo con un Anticorpo, evitando la Dimerizzazione del Recettore, Blocchiamo di conseguenza il continuo segnale di proliferazione che manda l’oncogene. • Blocco di Funzioni Proteiche - Si blocca un Ligando e quindi una Proteina con un Anticorpo poiché questa è dannosa. • Stimolo di Segnalazione Intracellulare - Gli Anticorpi si mascherano da Ligando in grado di interagire con i Recettori di Morte e quindi capaci di indurre Apoptosi. Gli Anticorpi si possono applicare in caso di Malattie Infiammatorie, Tumori e Rigetti nei Trapianti. TNF - è una Molecola che troviamo come Antinfiammatorio, è una Molecola Mutata capace di Agire come Dominante Negativo sequestrando nel Trimero anche Molecole TNF Normali. Grazie alla Versione Mutata del TNF, i livelli di TNF Normali scendono. MAB (Monoclonal Antibody) - Sono degli Anticorpi che sono capaci di legare il TNF e possono combattere quindi Malattie Infiammatorie come Artrite Reumatoide o Malattia di Crohn. Per evitare il Rigetto di Organi Trapiantati sono stati messi a punto dei farmaci; Alcuni Inibiscono l’Interleuchina 2 che agisce sulle Cellule T mentre altri Bloccano le Immunoglobuline E. In Campo Antitumorale ci sono: • Anticorpi che possono bloccare i Fattori di Crescita Overespressi o Mutati che hanno un Gain Of Function • Anticorpi che si legano al Recettore per il Fattore di Crescita e che impediscono la Dimerizzazione del Recettore stesso. • Altri Anticorpi hanno invece come Bersaglio le Tirosino-Chinasi che sono Molecole che riescono anche a penetrare la Membrana Plasmatica e svolgere la propria funzione a Livello Endocellulare. È stato anche creato con successo un Anticorpo chiamato Anticorpo Armato a cui era stata legata una Tossina; questi riconoscevano il Recettore ma questa Tecnica ha molti effetti collaterali poiché oltre che le Cellule Tumorali attaccava anche le Cellule Sane. • Trastuzumab - è un Anticorpo Monoclonale Umanizzato utilizzato contro il Tumore alla Mammella, questo agisce sul Recettore di HER2 accoppiandosi con questo, in modo tale da impedire per Ingombro Sterico che la Proteina si leghi al Recettore, il Recettore viene quindi Disattivato. La Proteina HER2 è una Proteina che viene Over-espressa nei Tumori alla Mammella, questa si lega ala Recettore di HER2 che Dimerizza e si Attiva, attivando una Cascata Segnalatoria. Questi Anticorpi oltre che ad essere utili in Malattia sono anche utili in Diagnostica perché se associati al Cromoforo Rosso si possono utilizzare per vedere, su di un espianto di Cellule, la Concentrazione di Anticorpi sulla Superficie. • Bevacizumab - è un Anticorpo che è stato messo a punto per bloccare il VEGF (Un Fattore Angiogenico). I Tumori Solidi infatti hanno bisogno di Vascolarizzazione per Sopravvivere, questa è dovuta alla Produzione del Fattore Angiogenico da parte delle Cellule Tumorali stesse. Lavorando con le Cellule Tumorali si rischia che queste sviluppino una Resistenza nei confronti degli Anticorpi. Ma il Trattamento con Anticorpi ha Effetti Collaterali molto più ridotti rispetto ai Chemioterapici. Non c’è nessun tipo di Tumore in cui non esistano degli Anticorpi Ricombinanti che possano essere utilizzati in Terapia, anche se molto spesso non sono risolutivi come i Farmaci ma possono essere utilizzati in Combinazione con questi. Nel MELANOMA l’unica speranza per risolvere la situazione è quella di accorgersene in tempo ed asportarlo chirurgicamente, ma se questo è già progredito come Metastasi c’è poco da fare. Una volta che viene scoperto il Melanoma si possono andare a cercare gli Antigeni esposti da quel tumore e vaccinarsi con il metodo dell’RNA, questa metodologia però è abbastanza complessa. Le LEUCEMIE sono invece abbastanza trattabili, pur non essendo curabili. Vengono tenute a bada con cicli di cure, anche con farmaci di questo tipo che permettono al paziente di fare una vita quasi normale. 25 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Lo Spettro è quindi molto grande, e dipende dal tipo di Tumore e dalla fortuna che la ricerca ha avuto in quel particolare campo. Negli anni l’utilizzo di Anticorpi Ricombinanti è esploso: • L’Herceptin è uno dei più vecchi Anticorpi Ricombinanti che è stato creato quando questo tipo di cure erano “Eccezionali”. • L’Avastin è anche questo piuttosto Anzianotto ed interferisce con il Fattore di Crescita Vascolare. ANTICORPI MONOCLONALI UMANI Non si possono formare nello stesso modo in cui facciamo quelli di Topo poiché non possiamo infettare appositamente un Essere Umano per fargli produrre gli Anticorpi. Non è Etico. Possiamo però sfruttare i Pazienti che sono Guariti da quella Malattia, per recuperare gli Anticorpi. Ad esempio nelle Persone Guarite dal Covid, nei 10-15 giorni successivi alla guarigione sono presenti anche molte Cellule B ancora Attivate che possono essere recuperate: 1. Recuperando le Cellule B dal Paziente avremo tra queste anche quelle che esprimono l’Antigene che ci interessa (Proteina Spike nel Covid). 2. Tratteremo queste Cellule B con l’Antigene Marcato e di conseguenza quelle che esprimono l’Anticorpo che ci interessa vengono Colorate. 3. Una Macchinetta apposita fa un Sorting, mette da una parte tutte le Cellule Colorate e dall’altra quelle che non si sono colorate. 4. Troverò quindi in una Provetta tutte le Cellule Positive per la Reazione con l’Antigene e che esprimeranno l’Anticorpo Specifico. A questo punto esistono diverse Tecniche ma parleremo solo di 2 di esse: Memory B Cell Immortalization: Si recuperano le Cellule B del Paziente e si Trasformano con il Virus Eipstein-Barr, si fa quindi un Infezione con EBV (Eipstein Barr Virus) che porta alla Trasformazione ed alla Immortalizzazione delle Cellule B che diventano come se fossero un Ibridoma e producono Anticorpi. Se io per Diluizione essenzialmente faccio si che si deponga una sola Cellula in ognuno di questi Pozzetti da ogni Singola Cellula io mi ritrovo un Clone e nel Sopranatante di queste Cellule io potrò recuperare gli Anticorpi Monoclonali (Poiché mi derivano da una Singola Cellula Fondatrice) e tutte le figlie produrranno sempre lo stesso Anticorpo. In questo modo posso fare anche uno Screening e vedere tra questi che vengono prodotti da ogni Cellula B quali sono gli Anticorpi migliori. B Cell Culture: Vado a fare quello che si faceva con gli Anticorpi Monoclonali, quindi si va a recuperare l’RNA Messaggero. Dividiamo le Cellule in questi Pozzetti in maniera da avere una Singola Cellula Fondatrice per Pozzetto. Quando avrò un certo numero di Cellule io potrò per PCR amplificare per PCR le Catene Leggere e Pesanti. Parto quindi dagli RNA delle Cellule B che esprimono un Anticorpo (Es. Contro il Covid) e potrò amplificare non solo la Parte Variabile ma anche tutta la Catena Leggera e la Catena Pesante utilizzando la PCR. Inserirle in 2 Vettori di Espressione con un Promotore Forte e li Transetto in delle Cellule adatte che in genere sono le Cellule di Mieloma (Cellule di Linfoma che hanno perso la capacità di produrre i propri Anticorpi) che diventeranno capaci di esprimere l’Anticorpo. Le Linee Cellulari in cui sono stati Trasfettati i Vettori sono ora Capaci di Esprimere grandi quantità di quel particolare Anticorpo. In questo modo io ottengo una Sorgente di Cellule che Prolifera Continuamente e che Esprime l’Anticorpo Umano. L’Enorme Vantaggio degli Anticorpi Umani è che possono essere utilizzati in Terapia perché sono delle Molecole Self che il nostro Sistema Immunitario non riconosce. L’Altro Vantaggio è che io posso amplificare non solo una Cellula B, ma siccome la Risposta del Paziente è stata Policlonale, ci saranno Cellule B che esprimono Anticorpi un po’ diversi, alcuni saranno Migliori mentre altri saranno Peggiori. Di conseguenza potrò andare a saggiare 10,20,30 diverse tipologie di Anticorpi e posso andare a scegliermi quelli più Specifici nei confronti della Malattia e più Affini. Gli Anticorpi si differenziano grazie alla Parte Variabile sia della Catena Pesante che della Catena Leggera, quando faccio un esperimento io posso mettere insieme diverse Catene Pesanti e Leggere portando alla formazione di un Anticorpo totalmente nuovo che ancora non esisteva nel Soggetto in Considerazione. Si può quindi fare una Library di Catene Pesanti e di Catene Leggere per poi rimetterle insieme casualmente aumentando quindi la possibilità di avere Anticorpi Buoni. Gli Anticorpi non vengono sempre utilizzati Interi, ma possono utilizzare anche solo la Parte Variabile delle 2 Catene che vengono messe insieme con la Tecnica del “Phage Display” e vengono esposte sulla Superficie di un Fago. Anche questa forma estremamente ridotta di Anticorpo può essere utile e perché ha la Capacità di riconoscere lo stesso Antigene e possono essere espresse in E.Coli. 26 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Il Farmaco Anti-Covid è un Inibitore non Ricombinante, l’idea è quella di andare a Bloccare Specificamente gli Enzimi Virali come la RNA Polimerasi che duplica il Genoma del Virus. Il Farmaco risulta innocuo per le Cellule poiché questo Enzima viene prodotto solamente sulla Base del Virus. Gli Anticorpi Umani che sono stati selezionati per il Covid erano degli Anticorpi particolarmente Affini, per questo motivo sono stati utilizzati per la Diagnostica, i primi Test Diagnostici, quelli su saliva, non sempre funzionavano poiché erano poco sensibili. Successivamente nei Test Rapidi sono stati utilizzati i SuperAnticorpi, sono degli Anticorpi particolarmente efficaci che sono molto Avidi nel legarsi all’Antigene. TECNICHE DI ANALISI DI DNA, RNA e PROTEINE PER ELETTROFORESI Sono 3 Tecniche (Southern Blot, Northern Blot e Western Blot) in cui dopo Corsa Elettroforetica di DNA, RNA o Proteine andiamo a rilevare la presenza di specifici DNA o RNA o Specifiche Proteine usando varie Tipologie di Sonda. Per Corsa Sperimentale si intende, per gli Acidi Nucleici, vederli andare verso il Polo Positivo in una Camera Elettroforetica dove i due Liquidi dei due Elettrodi sono messi in comunicazione dal Gel. Il Gel serve come Setaccio Molecolare poiché tende a frenare le Molecole più pesanti. Il Gel di Agarosio è un Gel molto facile da fare, si tratta di una Gelatina formata da una sostanza, l’Agar derivante da un Alga che spesso è una Polvere che va Bollita, questa viene poi versata in uno stampo ed a Temperatura Ambiente diventa solida. In questi Gel è presente il Bromuro di Etidio che si localizza dove è presente il DNA e di conseguenza si vedono in DNA diversi più o meno Bande di Bromuro che è un Colorante Rosso Mutageno. Ogni Banda che si intercala in una DNA corrisponde ad un certo Peso Molecolare, in questo modo possiamo confrontare Bande Ignote ed assegnarli un Peso Molecolare o una Lunghezza Approssimata sufficientemente precisa. Questo Colorante è un Intercalante che si immette negli Acidi Nucleici a Doppio Filamento, di conseguenza nell’RNA si immetterà solamente dove sono presenti delle Strutture Secondarie che nascono tra Zone di Omologia dell’RNA che si ripiega. A parità di Peso Molecolare quindi l’RNA si colorerà meno del DNA. SOUTHERN BLOT Southern e Northern Blot sono abbastanza simili tra di loro, con l’unica differenza che per il Southern Blot si utilizza il DNA nel Northern Blot viene utilizzato RNA. Scoperta alla fine degli Anni 70, il suo nome deriva dal Signore Southern che inventò questa tecnica. Si sottopone delle Molecole di DNA ad un Campo Elettrico in un Gel di Agarosio che si comporterà da Setaccio Molecolare. Si creano dei Pozzetti, che sono delle tasche in cui si possono caricare i campioni di DNA (o RNA) e questi campioni che affondano nel Gel, quando viene applicata la Carica Elettrica migrano verso il Polo Positivo. Ogni singolo pezzetto darà quindi luogo a delle Colonne di Migrazione in cui io potrò vedere le varie molecole migrare verso il Polo Positivo ed in maniera proporzionale al Peso Molecolare. Il DNA viene Spezzettato in maniera Prevedibile e Ripetibile da un Enzima di Restrizione, per fare questo possiamo scegliere un Enzima che abbia come Sito di Riconoscimento, un Sito a 4 Basi o un Sito a 6 Basi, a seconda di quale utilizzerò avrò delle Bande di DNA più Corte o più Lunghe. Sono Inoltre presenti dei Marker di Peso Molecolare, questi sono semplicemente delle Molecole di DNA che formano delle Bande specifiche che mi danno un idea di Riferimento per la Corsa Elettroforetica. A questo punto si fa il Blot. “Blottare” vuol dire Assorbire, infatti sopra il Gel si trova una Membrana o di Nitrocellulosa o di Nylon che risulta impermeabile al DNA, al di sopra di questa viene messa una Carta Assorbente che assorbe il liquido che sale. Si crea quindi una Corrente di Tampone dal Basso verso l’Alto che Trascina il DNA presente sul Gel e lo porta a livello di questo Supporto di Nitrocellulosa o di Nylon dove si ferma e viene fissato con un Trattamento con gli Ultravioletti che creano dei Legami Covalenti. Le Bande di DNA rimangono intrappolate sulla Carta esattamente nella solita posizione in cui erano nel Gel. Il Southern Blot consiste nell’Utilizzare una Sonda (Complementare ad alcune Zone del Genoma) che va a ritrovare le Bande di DNA delle Sequenze Specifiche. Si legherà quindi ai Frammenti con le Sequenze Complementari. NORTHERN BLOT Nel Northern c’è una serie di particolarità tecniche poiché l’RNA è una Molecola Instabile che può sparire e distruggersi mentre viene lavorata. L’Unica differenza con il Southern Blot è che si lavora con gli RNA, se io recupero tutti gli RNA da una Coltura Cellulare, questi sono delle Molecole sufficientemente piccole per migrare su di un Gel. L’RNA viene caricato sul Gel senza essere spezzettato con Enzimi di Restrizione come invece succede per le Molecole di DNA. 27 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Questo lo facciamo poiché se devo fare 10 Diversi Anticorpi Monoclonali di Topo dovrei utilizzare il Cromoforo per tutti i 10 diversi tipi di Anticorpi, mentre posso utilizzarlo solamente per un Solo Anticorpo di Capra che mi riconosce tutti i 10 Anticorpi di Topo. Risultati del Western Blot Se io utilizzo un Anticorpo Monoclonale contro una Proteina Umana p38 che ha un peso di 38kd, vediamo che in tutte le Cellule Umane questa proteina viene espressa, in alcuni Tessuti di più mentre in altri Tessuti di meno, mentre negli ultimi 2 Tessuti di Topo non viene espressa. ANIMALI TRANSGENICI La Modalità di Trasferimento Genico che abbiamo visto nei Batteri, nei Lieviti e nelle Cellule in Coltura lo vedremo anche negli Animali e nelle Piante. Quando andiamo a studiare fenomeni più complessi che hanno una rilevanza Fenotipica a livello dell’Intero Organismo, lo studio delle Colture Cellulari è una Banalità e si utilizzano dei Modelli Animali o Vegetali. Partiamo comunque da un Batterio che contiene Plasmidi, si purifica il Vettore Plasmidico ed in questo si inserisce un cDNA codificante per una Proteina. A questo punto Trasformiamo questo DNA in un Batterio che facciamo crescere in un Liquido per ottenere grandi quantità di Plasmide, che purificheremo e che lo potremo utilizzare per Trasformare il Lievito o per Trasfettare le Cellule in Coltura oppure lo possiamo utilizzare per Modificare le Piante o gli Animali, formando quelli che si chiamano Animali Transgenici o Piante Transgeniche. Gain Of Function - Avviene quando abbiamo un Over-Espressione di una Proteina Normale o di una Versione Mutata di questa. Avviene anche quando abbiamo la Transfezione di Cellule in Coltura con un cDNA Codificante per una Proteina, che essendo sotto un Promotore Forte verrà Over-Espressa. Loss Of Function - Avviene quando abbiamo un Abolizione dell’Espressione di una Proteina, negli Animali Transgenici quelli che hanno subito una Loss Of Function prendono il nome di Topi Knock-Out. Tutte queste tecniche al giorno d’oggi vengono fatte utilizzando un’altra Tecnica, ovvero la Tecnica di Crispr che è una Tecnica di Editing Genomico. La Tecnica per la Formazione di Animali Transgenici è ormai desueta, e prevede il Trasferimento di DNA Linearizzato, messo sotto controllo di un Promotore Forte, all’interno dello Zigote di questi Animali. Si Iniettano notevoli quantità di DNA nel Nucleo, in particolare nel Pro-Nucleo Maschile dello Zigote, e questo DNA ha la possibilità di Integrarsi nel DNA dello Zigote, se questo avviene avremo un Animale Transgenico. Si fa un Iniezione del DNA utilizzando la Tecnica della Holding Pipet, con una leggera pressione negativa che tiene Bloccato l’Ovocita Fecondato e accanto un piccolo Ago di Vetro con cui si inietta il DNA. È una Tecnica molto efficace poiché lo Zigote veniva cresciuto poi in Vitro fino a formare la Blastocisti che poi veniva reinserita in una Femmina Pseudo-Gravida che portava a termine la Gestazione, dando alla luce un Topolino per ogni Zigote. Dai Topi si andava a prelevare il DNA dalla Coda e si andava a Saggiare per PCR la presenza del Transgene. Se la PCR risultava Negativa voleva dire che il Topo non era avvenuta la Ricombinazione, se invece la PCR risultava Positiva voleva dire che quel DNA si era inserito nel Genoma del Topo. Con questo esperimento mi aspetto che circa il 50% dei Nati siano Topi Transgenici. Inserimento di un Promotore Tessuto-Specifico Posso fare questo Esperimento in maniera più raffinata utilizzando dei Promotori Tessuto-Specifici, in questo modo il DNA è presente in tutte le Cellule ma viene Trascritto e Tradotto solamente dove voglio io: • Promotore dell’Albumina - Abbiamo l’Espressione nel Fegato della Proteina • Promotore della Caseina - Abbiamo l’Espressione nella Mammella delle femmine quando faranno il latte. Facendo una Capra Transgenica o un Bovino Transegnico io potevo inserire in questi un cDNA con un Promotore per la Caseina e ritrovarmi la Proteina prodotta nel Latte di questi Animali. È quindi un metodo non invasivo ma che però presenta un Rischio Industriale poiché se l’Animale si Ammala, noi dovremo riprodurre di nuovo un Animale Transgenico ripartendo da capo. TOPI KO (KNOCK-OUT) E TOPI KI (KNOCK-IN) Quando si parla di Topi Kock-Out stiamo parlando di una Loss of Function, in cui viene eliminato o disattivato un certo particolare Gene con lo scopo di vedere cosa succede nell’Animale. Quando invece che eliminare un Gene lo si mantiene Attivo e si Modifica introducendo una Mutazione ad esempio ad un Codone, la Delezione o l’Insersione con la produzione di una Proteina leggermente diversa si parla di Topi Knock In e di Different Function. Se nel Knock-In invece che un Promotore Naturale inserisco un Promotore Forte posso avere un Gain Of Function. Dalla Blastocisti posso andare a Togliere delle Cellule che poi possono essere Coltivate in Vitro, Modificate e successivamente Reinserite nella Blastociste. Solitamente si tratta di una Ricombinazione Omologa per Modificare un Particolare Gene. 30 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA A questo punto inserisco la Blastocisti in Utero Sicuro che svilupperà l’Animale Intero che sarà fatto da Cellule Normali della Blastocisti e Cellule Modificate a livello del Genoma. Esiste anche una Linea Cellulare ES (Embrionic Stem Cell) che viene Comprata e Mantenuta in Laboratorio ed Equivale alle Cellule della Blastocisti. Su questa Linea Cellulare viene operata la Ricombinazione Omologa, poi si attua una Selezione per controllare che il tutto sia andato a Buon Fine e si crea quindi una Linea di Cellule che si Inseriscono nella Blastociste Ospite. Si crea un Organismo composto da 2 Individui, sia da Cellula della Blastociste Ospite sia da Cellule Ricombinate, questi sono i Topi Chimera o Topi Mosaico, dei Topi apparentemente Normali ma che in realtà hanno la Caratteristica di essere formati da 2 Organismi Diversi. In Natura questi esistono quando dopo la Fecondazione si formano 2 Diversi Zigoti che se sviluppano portano alla formazione di 2 Gemelli Monozigotici. Raramente i 2 Zigoti possono fondersi e si vanno a formare delle Chimere, nell’Uomo possiamo avere individui che hanno i 2 Occhi di Colore Diverso. TOPI KNOCK-OUT Nei Topi Knock-Out si deve arrivare ad Interrompere un Gene della Cellula, per fare questo si può inserire nel Gene Target Stesso un’altra Sequenza, come la Resistenza alla Geomicina. Si va a produrre un Plasmide per la Ricombinazione che presenta delle Zone a Sinistra e a Destra della Sequenza che vogliamo inserire nel Gene Target che prendono il nome di Left Arm e Right Arm. Left Arm e Right Arm sono entrambi Omologhi a Zone sul Gene Target e di conseguenza si ha nell’Evento Ricombinativo un Appaiamento di queste Zone Omologhe che porta all’Inserimento di questa Zona all’interno del Gene Target, che smette di essere funzionale nella produzione della sua Proteina, ma che esprimerà quella che io ho inserito (Resistenza alla Neomicina). Meccanismo di Knock-Out Abbiamo ad esempio un Gene Target costituito da 3 Esoni, sul 1° Esone è presente la Sequenza ATG mentre sull’ultimo è presente un Codone di Stop. Si produce un Vettore per la Ricombinazione Omologa costituito da un Left Arm ed un Right Arm e nella Parte Centrale la Resistenza a G418 che si va ad inserire nella Zona Codificante del Gene Target costituita dalla Sequenza a Valle del 1°Esone fino alla Prima parte del 2°Esone. Una volta che avremo avuto l’Evento Ricombinativo si avrà un Prodotto a livello Genetico costituito da: • 5’ Non Tradotto del Gene Target • Sequenza Codificante per G418 e il suo Codone di Stop • 3’ Non Tradotto dove è presente il restante Gene Target Le Cellule in cui sarà avvenuta la Ricombinazione, se sottoposte a G418 Sopravviveranno e saranno le uniche in Grado di Proliferare formando una Coltura Cellulare. Quando queste Cellule saranno in Numero Sufficiente potranno essere Inserite nella Blastocisti Ospite. In Alcuni eventi di Ricombinazione si ha l’Inserimento della Sequenza Centrale del Plasmide sotto il Promotore Naturale, quando questo è abbastanza forte. Spesso però il Promotore Naturale potrebbe non essere attivo nelle Cellule Staminali Embrionali e di conseguenza viene sostituito con un Promotore Virale Forte ed Attivo. Per controllare che l’Inserzione sia avvenuta e sia stata corretta si utilizza il Sequenziamento e PCR. TOPI KNOCK-IN In questi casi si sostituisce il Gene con una Versione Modificata. Il Gene Modificato deve essere il più possibile uguale al Gene Naturale, quindi deve usare per forza il Promotore Naturale, inoltre a valle del Gene Modificato viene Inserito un’altro Promotore seguito dal Gene per la Resistenza a G418. Il Gene Target viene quindi Sostituito da 2 Geni: • Gene Modificato • Gene della Resistenza a G418 Il Gene che conferisce la resistenza a G418 viene utilizzato solamente per la Selezione delle Embrionali Staminali, che una volta Selezionate si Iniettano in una Blastocisti Ospite. Le Cellule Staminali Embrionali che presentano un Genotipo Omozigote per il Colore Nero possono subire la Ricombinazione Omologa solamente su uno dei due Alleli, è difficile che avvenga su 31 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Entrambi. La Blastocisti sarà quindi formata da 2 Tipi Cellulari Diversi e viene Inserita in Utero, si formeranno dei Topi Mosaico o Topi Chimerici. I Topi Mosaico sono comunque riconoscibili poiché hanno il Pelo a Chiazze, questo avviene perché: • Staminali Embrionali - Utilizzate inizialmente derivano da un Topo a Pelo Nero Omozigote. • Blastocisti Ospite - presenta un Genotipo Omozigote per il Pelo Bianco. Questi Topi Chimerici sono formati quindi da 2 Tipologie di Cellule, quelle che Derivano dal Topo Bianco (Non Modificate) e quelle che Derivano dal Topo Nero (Che sono quelle Modificate). Per dividere queste Cellule si Attua un Incrocio tra un Topo Chimerico ed un Topo Bianco Omozigote e da questi si otterranno dei Topi Bianchi e dei Topi Neri. Topi Bianchi - Saranno Omozigoti Bianchi Normali, poiché derivano da un Gamete del Topo Bianco e da un Gamete Bianco del Topo Chimerico (Non Porta la Mutazione). Topi Neri - Saranno degli Eterozigoti che derivano da un Gamete del Topo Bianco e da un Gamete Nero del Topo Chimerico (Potrà essere Ricombinato oppure No, questo perchè la Ricombinazione è un evento raro e difficilmente avviene su entrambi gli Alleli). Di conseguenza Metà di Topi Neri saranno Omozigoti Normali per il Gene Target e non presentano l’Eventi Ricombinativo mentre l’altra Metà di Topi saranno Eterozigoti per il Transgene e sono detti Founders. È Conveniente ottenere dei Topi Eterozigoti per il Transgene, questo perché spesso i casi di Knock-Out Totale presentano grandi interferenze con lo sviluppo del Topo. È possibile anche che il Knock-Out in Eterozigosi non porti a nessun Effetto Fenotipico particolare, questo può avvenire perché alcuni Geni sono vicariati da altri Geni. Es. Gene MyoD - Codifica per un Fattore Trascrizionale che serve per il Differenziamento Muscolare dell’Embrione e che attiva una serie di Eventi a Cascata che a loro volta attivano dei Fattori Trascrizionali. Facendo un Knock-Out su questo Gene nel Topo non succede niente di particolare poiché il Gene Mis5 ha la medesima funzione. Per Ottenere il Genotipo Omozigote per il Gene Knock-Out si devono incrociare 2 Topi Eterozigoti, in questo modo abbiamo una Proporzione Mendeliana in cui: • 25% - Topi Omozigoti per il Gene Knock-Out • 50% - Topi Eterozigoti per il Gene Knock-Out • 25% - Topi Omozigoti per il Gene Normale Per quanto Riguarda il Colore del Pelo, questo non c’entra più con il Gene Knock-Out, questo perché l’Allele che porta il Colore del Pelo è indipendente dall’Allele che porta il Gene Knock-Out o il Gene Normale. Il Genotipo del Colore del Topo non è legato al Genotipo del Transgene. Proteina BRK La Proteina BRK Influenza la Crescita dei Villi Intestinali a livello dell’Ileo, influenzando la loro lunghezza. La Proteina BRK non è espressa nei Topi Knock-Out e di conseguenza nel Northern Blot non è visibile, mentre è visibile in quello dei Topi che portano il Gene Normale. Questa Proteina, Influenza la lunghezza dei Villi Intestinali, di conseguenza se andiamo a vedere i Villi di un Topo Knock-Out questi saranno più lunghi rispetto ai Villi Intestinali dei Topi che portano il Gene Normale. CLONAGGIO DI ANIMALI Non è una Tecnica di DNA Ricombinante poiché non si ha nessun evento di Taglia e Cuci. Il Primo esperimento di Clonaggio fu la Pecora Dolly nel 1996, questo esperimento dimostrò che il Clonaggio era Possibile. Esperimento della Pecora Dolly L’Esperimento consisteva nel prendere il Nucleo di una Cellula della Ghiandola Mammaria di una Pecora (Pecora Dolly) ed inserirlo all’Interno di uno Zigote Enucleato appartenente ad un’altra Pecora (Pecora a Testa Nera). Il Nucleo Somatico che noi sappiamo essere Terminalmente Differenziato, una volta che si trova all’interno dello Zigote questo viene Riprogrammato e diventa tale da sembrare il Nucleo dello Zigote. La Pecora che nasce da questo Zigote ha lo stesso Aspetto Fenotipico della Pecora Donatrice del Nucleo, ha anche il DNA Genomico identico ad eccezione del DNA Mitocondriale che deriva dalla Pecora a Testa Nera, poiché i Mitocondri derivano dallo Zigote della Madre “Adottiva”. Tecnica nei Primati Recentemente è stata utilizzata la solita Tecnica per le Scimmie, in questo modo possiamo riprodurre dei modelli per le Malattie Umane poiché questi hanno dei Background Identici a quelli dell’Organismo Umano. Noi Uomini siamo molto diversi come Organismi anche nell’ambito della stessa popolazione, quando utilizziamo i Topi la situazione migliora poiché questi sono più Omozigoti e più simili tra di loro. 32 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Di Conseguenza si cercarono dei Vettori diversi come i Lentivirus, l’HIV ad esempio è un Lentivirus che hanno un Ciclo Vitale uguale al Retrovirus ma possono infettare anche Cellule Quiescenti (G0) e si Integrano in Maniera Casuale senza dare delle Mutagenesi Inserzionali. Nel 2006 utilizzando dei Topi Tumor-Prone Omozigoti Deleti per il Gene CdKn2a con la conseguente Deficienza delle Proteine p53 e RB1 videro che Utilizzando i Lentivirus non si avevano nuovi Tumori mentre con i Retrovirus si avevano delle Mutagenesi Inserzionali. Caratteristiche delle Tipologie di Virus: • Retrovirus - Possono Infettare solamente le Cellule in Divisione e si Integrano Stabilmente, possono dare Mutagenesi Inserzionale. • Lentivirus - Derivati da Virus dell’HIV, possono infettare Cellule Quiescienti e si integrano stabilmente in Maniera Casuale. • Adenovirus - Esprimono alti livelli la Proteina Eterologa, non si Integrano Stabilmente e possono essere facilmente Eliminati. Possono dare delle Reazioni Immunitarie. • Virus Adeno-Associati AAV - Integrazione Sito-Specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. • Herpes Simplex - Infezione molto selettiva nei Neuroni, ma importanti Effetti Citotossici. Non esiste ancora un Vettore Ideale che accomuna tutte le Caratteristiche Necessarie, per questo motivo i Problemi Irrisolti della Terapia Genica sono: - Efficienza di Trasferimento - Selettività del Bersaglio - Nei Retrovirus e nei Lentivirus il Bersaglio sono le Cellule T. - Durata dell’Espressione del Trascritto - questo può essere risolutivo se vengono modificate le Cellule Staminali perché sono quelle che poi riprodurranno le nuove Cellule differenziate. - Sicurezza della Procedura - Stare attenti a non creare dei danni al Paziente come successe con ADA. - Reazioni Immunitarie - Lo studio ha permesso di rendere alcune Proteine del Virus meno aggressive dal punto di vista Immunitario. LA FIBROSI CISTICA Riguarda la mutazione di una Proteina della Pompa del Cloro che ha subito Mutazione. Questa Malattia porta ad un Problema a Livello Respiratorio poiché questi soggetti producono un Muco più Denso che può portare a frequenti Infezioni. Sono coinvolte diverse Mutazioni: - Delezione di 3 Basi che porta al salto di un Amminoacido, questa è la più comune. - Splicing Aberrante con il Salto dell’Esone 9. Nel caso più comune il Sito di Delezione è il Sito di legame per l’ATP della Pompa Del Cloro, che è una Pompa ATP-Dipendente. Il Bersaglio è l’Epitelio Respiratorio, viene fatto un Trasferimento Genico utilizzando degli Adenovirus caricati con un DNA Codificante per il Gene Normale della Fibrosi Cistica. È un vero e proprio Spray che viene spruzzato all’interno della Bocca del Paziente che aspirando le particelle di Virus fa in modo che queste Infettino le Cellule dell’Epitelio Respiratorio. In questo modo è sicuro che il Trattamento avvenga a livello dei Bronchi, ma le Cellule che acquisiscono questo Gene non sono le Staminali (Che si trovano più in Profondità) di conseguenza questo trattamento dura circa 1 Mese fino a quando per desquamazione le Cellule Modificate in Superficie non vengono perse. Il Difetto è che il Paziente possa sviluppare una Risposta Immunitaria nei confronti del Virus, questo Difetto può essere aggirato andando ad Utilizzare Virus leggermente diversi e cercando di modificare le Proteine di Superficie per diminuire l’Immunogenicità. EMOFILIA In questi Pazienti il Fattore VIII non viene prodotto dal Fegato. Si potrebbe Iniettare anche direttamente il Fattore VIII ma è stata tentata anche la Terapia Genica, attraverso questa il Paziente si libera della Necessità di farsi Iniezioni di Fattore VIII. Sono stati utilizzati Virus Adeno-Associati dove si ha l’Integrazione del Genoma delle Cellule. Se vengono Iniettati questi Virus a livello della Vena Porta questi entrano in contatto con le Cellule Epatiche. Se l’Infezione ha successo si ottengono un certo numero di Cellule nel Fegato che sono in grado di produrre quantità rilevanti di Fattore VIII grazie alla presenza di un Promotore Forte. Le Sperimentazioni Cliniche della Terapia Genica sono Iniziate nel 1990 e fino ad ora ne sono state fatte circa 200 su circa 3000 Pazienti. I Risultati ottenuti fino ad ora sono quasi tutti strettamente sperimentali e molto spesso dipende anche dalla Gravità della Malattia: Sindrome di Lesh-Nyhan - Dovuta ad una Degradazione delle Purine, questa Malattia può essere presente in vari Livelli, se questa si trova al suo Livello più Grave i bambini affetti si Auto-Mutilano e presentano problematiche a Livello Neurologico. 35 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Per L’Oncogenesi il primo Approccio fu quello di aggredire gli Oncogeni o gli Oncosoppressori con un possibile Knock-Out Fenotipico di un Oncogene. Sono state tentate anche Tecniche di Interferenza ad RNA utilizzando i siRNA in modo da interferire con l’mRNA dell’Oncogene. Per gli Oncosoppressori con la Terapia Genica potremmo Riattivare p53 facendo un Trasferimento Genico, ma anche in questo caso il Delivery è molto difficile. Per questo motivo il Trattamento Gain Of Function e Loss Of Function è stato abbandonato come Terapia possibile contro i Tumori. Al momento la cosa più Interessante sono le Sperimentazioni di Editing Genomico non sul Tumore ma sulle Cellule del Sistema Immunitario del Paziente cercando di Potenziarne l’Azione. EDITING DEL GENOMA - TECNICA CRISPR / CRISPR Cas9 La Tecnica di CRISPR/CAS9 permette di Introdurre Mutazioni Mirate nel Genoma di qualsiasi Organismo. È una Tecnica di Editing Genomico che consiste nel Prendere delle Cellule e modificare alcune Basi o Frammenti di DNA di alcuni Geni. È interessante per la cura di Malattie Genetiche dovute a Mutazioni. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) è un acronimo che tradotto in Italiano significa “Brevi Ripetizioni Palindrome Raggruppate e Separate ad Intervalli Regolari”. Funzionamento di CRISPR in Cellula Batterica È infatti una sorta di Sistema Immunitario Batterico in cui i Ricercatori hanno individuato delle Ripetizioni (Sequenze Nere) uguali tra di loro e con uno Spazio che le Divide. All’Interno dello spazio che le Divide sono presenti delle Sequenze (Sequenze Colorate) che sono dei Frammenti di DNA di Batteriofagi diversi. Quando un Batteriofago Infetta una Cellula Batterica, è possibile che intervenga un Sistema Enzimatico che frammenta il DNA del Batteriofago, inserendolo in questo DNA tra due Sequenze Ripetitive. Se il Batterio sopravvive al Batteriofago, questa sequenza verrà trasmessa alla Progenie e così via per altri Batteriofagi. Tutta questa Sequenza può essere Trascritta in RNA, in un Trascritto chiamato pre-CrRNA nel quale, dove sono presenti le Sequenze Nere, si formano delle Strutture a Forcina. L’RNA viene Frammentato e si formano tante Strutture a Forcina che contengono anche un Filamento libero del Frammento del Batteriofago. Quando abbiamo un Infezione da parte del Batteriofago, il crRNA chiamato “RNA Guida” aderisce al Genoma del Batteriofago Complementare insieme ad un tracRNA formando una Struttura che viene Riconosciuta da una Proteina Endonucleasi CAS9 capace di tagliare il DNA del Batteriofago. La Proteina CAS9 è in Grado di Tagliare il DNA del Batteriofago in un Punto Preciso, ovvero nel punto dove si va a legare la Sonda. CAS9 inoltre Taglia solamente se vicino alla Sequenza è presente una Sequenza PAM (Sequenza Specifica di 2,3 Nucleotidi che rende il DNA Tagliabile agli Enzimi). Funzionamento di CRISP In Cellula Eucariotica Alcune Ricercatrici pensarono di utilizzare CRISPR-CAS9 nelle Cellule Eucariotiche al fine di Modificare dei Frammenti di DNA. La Prima cosa che queste due Ricercatrici fecero fu quella di Unire il crRNA e il tracRNA mediante un Link-Loop ossia un Ansa di Connessione. La Sequenza quando verrà Trascritta darà origine ad una Chimera crRNA - tracRNA. Conoscendo la Sequenza Bersaglio che voglio andare a Colpire nel Genoma Umano mi costruirò una Sequenza Complementare di circa 20 Basi (L’Unica cosa da rispettare è che ci sia una Sequenza PAM vicino alla Sequenza Bersaglio) e farò anche in modo che la Cellula che voglio Colpire mi Produca CAS9. In questo modo riuscirò a ricostruire nella Cellula il Sistema Artificiale CRISPR/CAS9. 1) Si Inserisce un Vettore di Espressione per Cellule Eucariotiche nella Cellula grazie a dei Liposomi, ossia delle Micelle che arrivano alla Membrana Fosfolipidica e ci si Fondono. 2) Il Vettore si ritrova nel Citoplasma e viene portato nel Nucleo della Cellula, dove, poiché il Vettore di Espressione è stato messo sotto il controllo di un Promotore molto forte di CMV avremo la Produzione di: • Proteina CAS9 • Sequenza Target (crRNA - tracRNA) in cui la Sequenza crRNA può essere cambiata a Piacimento a seconda del nostro Bersaglio. 3) Nel Genoma della Cellula crRNA-tracRNA sarà Complessato a CAS9 e verrà tagliato il Doppio Filamento a livello del nostro Gene Target. 36 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA Questo Sistema nella Cellula è spesso così efficiente che il Taglio del Doppio Filamento lo abbiamo su Entrambi gli Alleli. Oltre a Inserire il Vettore di Espressione infetteremo anche con un Plasmide contenente la Sequenza del Gene che può Ricombinare. Lo scopo è sempre quello di inserire un Taglio sul Doppio Filamento ma poi di Ripararlo reinserendo il Gene Normale. Quando avviene un Double Streand Break la Cellula può reagire in 2 Modalità: • Sistema NHEJ - Con questo Sistema vengono perse delle Sequenze, si forma la Y e vengono eliminate le Sequenze, quindi nel caso fosse un Gene che produce una Proteina potremmo avere dei Problemi. • Sistema HR - È il metodo che viene utilizzato, poiché più preciso e poiché non avviene la Perdita di Sequenze, per innescare questa Riparazione viene fornito alla Cellula un’altro Plasmide che contiene la Zona del DNA Omologa a quella dove noi facciamo il Taglio. Inducendo il Sistema di Riparazione HR avremo che il Doppio Filamento del Plasmide che abbiamo Inserito sarà utilizzato come DNA Stampo dal Filamento che ha Subito Double Streand Break. Il Frammento di Doppio Filamento che ha subito il Taglio dopo essere stato digerito e maturato da varie Esonucleasi essenzialmente invade il Filamento Omologo e ci sarà una Copiatura di questo in modo da Riparare il Taglio. In questo modo possiamo inserire anche delle Specifiche Mutazioni. Il Costrutto che abbiamo visto nei Topi Knock-Out è essenzialmente Identico, consiste infatti nel fornire un Plasmide che porti alla Ricombinazione, grazie all’esistenza di un Right Arm e di un Left Arm ai capi della Zona in cui Vogliamo fare Ricombinazione. Un Problema di CRISPR e di CAS9 è il fatto che questo Può Non essere Specifico e di conseguenza può Riconoscere Casualmente anche altre Posizioni nel Genoma, in cui avverranno Riparazioni con NHEJ e lì sicuramente si instaureranno delle Mutazioni. Con CRISPR si può agire su qualsiasi Organismo, anche a livello di Sistemi Animali. • Per le Piante è possibile tramite l’impiego di Colture di Cellule Vegetali, Rigenerare una Pianta, si procede facendo CRISPR su Cellule che si possono definire “Precursori di un Intera Pianta” e poi si selezionano per essere sicuri che l’evento sia avvenuto correttamente ed infine da queste Cellule si fanno crescere delle nuove Piante che saranno Modificate. • Per gli Animali dobbiamo partire modificando uno Zigote iniettando la Proteina CAS9, l’RNA Guida ed il Plasmide contenente il Nuovo Gene da Inserire. In questo modo nello Zigote avverrà la Ricombinazione Omologa ed otterremo l’Animale Transgenico. Questo metodo è importante per creare modelli animali per Malattie Genetiche o si può utilizzare per fare Ricerca andando a Modificare un Gene per studiare la Funzione di una Proteina. ZINC FINGER NUCLEASE Per introdurre il Taglio sul DNA si possono utilizzare anche delle Tecniche diverse, una di queste è l’utilizzo di un Endonucleasi che prende il nome di Zinc Finger Nuclease. Gli Zinc Finger Sono dei Fattori Trascrizionali (Es. p53) che riconoscono delle Specifiche Sequenze. Questi Fattori in virtù della presenza di una zona ad Alpha Elica di Riconoscimento interagiscono con il Solco Maggiore del DNA, nella maggior parte dei casi un singolo Zinc Finger è capace di riconoscere una Tripletta di Nucleotidi. p53 presenta 4 Zinc Finger ed ognuno di questi riconosce una Tripletta, di conseguenza questo fattore riconosce 12 Nucleotidi che fanno parte di Elementi a livello di Promotori di Geni coinvolti nell’Induzione di Apoptosi, promuovendone la Trascrizione. Esistono Zinc Finger diversi che saranno capaci di riconoscere Triplette Diverse ed ad oggi esiste una sorta di Library di 64 Zinc Finger, ognuno dei quali riconosce una Tripletta diversa. Zinc Finger Nuclease Quello che possiamo fare è creare delle Proteine di Fusione date dalla fusione di Zinc Finger diversi che saranno capaci di riconoscere una Specifica Sequenza. Per creare una Proteina di Fusione bisogna andare ad unire (Tramite la Tecnica delle Proteine di Fusione) le Sequenze codificanti i Domini Zinc Finger che si vogliono unire. Andremo quindi a Ricercare la Zona sul DNA a livello del quale si vuol far avvenire il Taglio, che deve poi essere suddivisa in Triplette e vado a scegliere dalla Library gli Zinc Finger Specifici per quelle Triplette disponendoli l’uno vicino all’altro creando una Proteina di Fusione. 37 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA I Tumori infatti sono capaci di Reprimere l’azione del Linfociti T attraverso la presenza di Particolari Proteine di Superficie che formano Interazioni di tipo Recettore-Ligando e che Attivano i Sistemi di Compensazione del Sistema Immunitario. Si può quindi pensare di andare a Modificare questo Tipo di Molecole: SISTEMA PD1 - PD1L Il Gene PD1 trascrive per un Recettore che si trova sulla Superficie delle Cellule T e Interagisce con un Ligando PD1L presente a livello delle Cellule Tumorali. Questo Ligando è una Proteina presente su molte Cellule Tumorali ed è capace di interagire con PD1 in modo tale da Reprimere l’azione dei Linfociti T. Facendo in modo che questa interazione non avvenga, il Linfocita T ritorna ad essere Aggressivo nei confronti del Tumore. Possiamo prelevare i Linfociti T dal Paziente ed andare a fare Editing Genomico su queste facendo un Knock-Out del Gene PD1 in modo tale che i Linfociti T non esprimano più questo Recettore e che non si possa più creare l’Asse PD1 - PD1L. Un Protocollo Alternativo è quello di usare Anticorpi Ricombinanti contro il Ligando PD1 impedendo l’interazione. Ma sicuramente l’Editing Genomico è molto più Efficace e di Lunga Durata. Questi protocolli hanno un certo successo ma possono creare altri problemi, possono infatti comparire dei Fenomeni di Autoimmunità da parte dei Linfociti T, di conseguenza utilizzare gli Anticorpi Monoclonali contro il Ligando PD1 sembrerebbe un idea migliore. SISTEMA CAR-T (Chimeric Antigen Receptor) Si tratta di un’altro tipo di trattamento di Grande Successo che prende il nome di CAR-T (Chimeric Antigen Receptor). Si tratta di Cellule T modificate che presentano Recettori Chimerici (Derivano dal TCR del Linfocita T) Specifici per un particolare Antigene Tumorale. La Sigla CAR fa riferimento al Recettore, mentre CAR-T fa riferimento al Linfocita T su cui è stato caricato il Recettore Chimerico. Il Paziente affetto da un Tumore esprimerà un Antigene Specifico, vengono quindi creati questi recettori definiti Chimerici perché la parte esterna contiene la porzione di riconoscimento di quel particolare Antigene. Si caricano specificamente le Cellule T mediante CRISPR di questi Recettori capaci di Riconoscere quel particolare Antigene Tumorale. In questa maniera vengono prodotte le Cellule T per ricombinazione che esprimono solo questo CAR-T. Nel caso precedente rendevamo le Cellule T più efficienti in maniera specifica verso un qualsiasi Tumore, mentre in questo caso noi rendiamo i Linfociti T capaci di riconoscere uno Specifico Tumore. Unione tra PD1 e CAR-T Alcuni Ricercatori hanno cercato di Unire i 2 Approcci Terapeutici in modo tale da Creare dei Linfociti T Potenziati che non presentano più il Recettore PD1 che li Reprime ed al Contempo di Esprimere un CAR-T Specifico per un particolare Antigene Tumorale. In questo modo l’aggressione a quel particolare Tumore dovrebbe essere Doppia. EDITING GENOMICO SU ZIGOTI UMANI La Tecnica della CRISPR ha abbattuto Barriere di Specie, è possibile quindi fare Editing Genomico sull’Uomo, tuttavia ad oggi applicare questa Tipologia di protocolli è Illegale. Fare Terapia Genica sulle Cellule Somatiche dell’individuo è possibile ed è stato fatto, ma questa è una scelta personale e le conseguenze che ne derivano riguardano l’Individuo stesso. Se Facciamo un Editing Genomico su di uno Zigote otteniamo invece un Individuo Transgenico che sarà Transgenico anche a livello dei Gameti, di conseguenza la sua Progenie presenterà questa modifica nel suo DNA, rendendo quindi la Modificazione Ereditabile. Nel Novembre del 2018 però in Cina un Genetista applicò la Tecnica della CRISPR su Zigoti di Gemelline per modificare un Gene in modo da scongiurare l’Infezione da HIV, anche se questa modificazione non era corretta. Questo scienziato venne messo in Galera ed Espulso come Ricercatore. Purtroppo la Tecnica di CRISPR ha un certo grado di Imprecisione, rappresenta quindi un grosso rischio per la specie. È rischioso utilizzare questa Tecnica su Zigoti Umani, perché non si possono prevedere le conseguenze nel Lungo Periodo. In tutte le Modalità che abbiamo visto (CRISPR, Zinc Finger, TALENs) possono avvenire dei Tagli Off-Target, questo perché le Sonde, seppur molto specifiche, possono casualmente operare un Taglio su un’altro punto del Genoma, dove avviene il Double Strand Break con una Riparazione NHEJ (Non Homologus Ending Joining) che porta alla perdita di Genoma. Gli Scienziati hanno scoperto che il Taglio Off-Target dipende anche dalle Sequenze, ad esempio: • Gene RNF2 con la Tecnica della CRISPR-CAS9 si ha solamente il Taglio On-Target. • Gene VEGFA con la Tecnica della CRISPR-CAS9 si trovano un Centinaio di Tagli Off-Target. Questi sono due esempi di estremi, ci sono dei Geni che si trovano in una Situazione Intermedia. 40 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA I Tagli Off-Target quindi ci fanno capire quanto può essere pericoloso applicare la CRISPR su Zigoti Animali, di conseguenza uno degli obbiettivi maggiori della Ricerca è quella di Diminuire e di Eliminare i Tagli Off-Target: Aumentando la Specificità di CAS9 e Aumentando la Lunghezza della Sonda RNA Guida oppure di Unire più di 4 Domini di Zinc Finger. TECNICA DELLA PCR È una Tecnica Classica che è stata creata negli Anni 90, PCR sta per Polimerase Chain Reaction, nell’ambito della Biologia Molecolare ha permesso, dal momento del suo Sviluppo di fare una Serie di Indagini che prima erano Estremamente Laboriose. La PCR è una Reazione a Catena della Polimerasi con la quale è possibile fare Moltissime Copie (1000-100 Milioni) e quindi di Amplificare un Frammento di DNA. Basta pochissima Quantità di DNA Bersaglio per poter Amplificare il Frammento scelto. Grazie a questa Tecnica nel tempo diventerà il 99,99% del Materiale all’interno della nostra Provetta. È una Tecnica a Cicli con una Progressione Esponenziale grazie alla quale da una Molecola a Singolo Filamento verranno Raddoppiate via via le Quantità che cresceranno in Maniera Esponenziale. La PCR è una Reazione Ciclica costituita da 25-35 Cicli Ciascuno costituito da 3 Passaggi Successivi: Denaturazione del DNA, Appaiamento degli Oligonucleotidi, Polimerizzazione . La PCR è Estremamente Sensibile, per questo motivo bastano Pochissime Quantità di DNA per essere Produttiva, per questo motivo possiamo anche avere dei Falsi Positivi, perché basta una Piccolissima Contaminazione mediante Sangue Infetto o Materiale Infetto da rendere Positiva la PCR. FASI DELLA PCR - Denaturazione, Ibridazione, Allungamento 1) DENATURAZIONE Durante la Denaturazione la Soluzione di DNA da Replicare e gli altri “Ingredienti" viene portata a una Temperatura compresa tra 94 e 99 °C in modo che la Doppia Elica del DNA venga completamente scissa. Prendendo un qualsiasi Doppio Filamento di DNA in vitro possiamo Denaturarlo esponendolo ad Elevate Temperature. Successivamente una volta che si sono formati i Singoli Filamenti aggiungiamo i Primer (Corti Oligonucleotidi di 20 Basi). I Primer sono degli Oligodeossinucleotidi che sono stati Sintetizzati con tecniche di Chimica Organica da una Sequenza che abbiamo deciso noi, infatti questi devono essere Complementari a due Precise Zone che che devono essere distanti un Tot di Nucleotidi tra di loro. I 2 Inneschi; Primer Direct e Primer Reverse saranno posizionati in modo tale da avere una Duplicazione del DNA nei punti in cui vogliamo analizzare la presenza di una Mutazione. Servono circa dai 19 ai 22 Nucleotidi per formare un Primer. 2) IBRIDAZIONE Successivamente la Temperatura viene abbassata fino a 55-60 °C circa per Permettere il Legame dei Primer alle Regioni loro Complementari dei Filamenti di DNA Denaturati (Fase di Appaiamento o di Annealing). In seguito ad un Raffreddamento i Primer si legano alle Sequenze Complementari presenti sui due Filamenti Bersaglio del DNA. A questo punto può intervenire la DNA Polimerasi che comincia a sintetizzare i Filamenti Complementari. La Temperatura di Annealing dipende dal Contenuto in Basi dei Primer, un Primer che è formato da coppie di A-T avrà una T Melting più bassa rispetto ad un Primer formato da coppie G-C. Per formare i Primer bisogna fare attenzione a produrli nella giusta Modalità e per favorire l’efficienza della PCR I 2 Primer devono avere la stessa T Melting. Si può calcolare la T Melting calcolando 4°C per ogni coppia di G-C e 2°C per ogni coppia di A-T di conseguenza avremo Tm = 4° (G+C) + 2° (A+T), nel caso le due Temperature dei Primer differiscano i 3/4° si può aggiustare allungando ad esempio la Sequenza del Primer con la Tm minore. 3) ALLUNGAMENTO Infine la Temperatura viene alzata fino a 72 °C al fine di Massimizzare l'Azione della DNA Polimerasi che determina un Allungamento dei Primer Legati, utilizzando come Stampo il Filamento Singolo di DNA (Fase di Polimerizzazione o di Prolungamento). La Tac Polimerasi allunga i due Nuovi Filamenti partendo dal 3’OH ed andando in Direzione 5’ —> 3’. 2n 41 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA In questo modo da 2 Singoli Filamenti si passa ad avere 2 Doppi Filamenti. Poiché siamo in presenza di Temperature abbastanza alte viene utilizzata la Tac Polimerasi che proviene da dei Batteri Termofili, questa è molto simile alla DNA Polimerasi I ma ha un Ottimo di Temperatura intorno ai 72°. Nei Passi successivi avremo l’Allungamento dei Filamenti che erano stati Prodotti dalla Reazione Precedente, questi porteranno alla Formazione di Filamenti che hanno la Lunghezza pari alla distanza di dove noi avevamo Inserito i Primer precedentemente, se i Primer sono messi a Distanza di 350 Nucleotidi dovrò ottenere un Frammento Amplificato di 350 Nucleotidi. Gli Altri Filamenti che si Formeranno dai Filamenti molto più Lunghi Iniziali seguiranno un Andamento Aritmetico e non Esponenziale come gli altri, saranno quindi presenti in un Numero molto Minore. Controllo della PCR Il Prodotto che si ottiene viene controllato su di un Gel di Agarosio, una PCR generalmente crea una quantità di Prodotto che è almeno 10 volte quello visibile sul Gel. Il Prodotto che vediamo sul Gel è abbondante, ma andrebbe bene anche se si ottenesse una Banda più sottile. Fare un Gel di Agarosio ci consente di controllare la lunghezza del prodotto per cui se io voglio fare una PCR in maniera da ottenere un Prodotto di 396 Basi, basta fare un Marker e valutare se ho ottenuto quello che mi aspettavo. Sequenziare un Gene ci da anche modo di vedere che non ci siano state mutazioni, questo è possibile perché la Tac Polimerasi come tutte le DNA Polimerasi può fare degli errori. Di conseguenza se nei primi cicli è avvenuto un Errore di Duplicazione nella reazione otterrò un abbondanza di molecole che hanno una Mutazione. Se abbiamo una Mutazione quando dobbiamo fare un Esperimento di Clonaggio con un Plasmide, se avviene un errore durante la PCR in cui io Amplifico il mio cDNA per inserirlo nel Plasmide, una volta che noi introduciamo nei Plasmidi queste copie di DNA alcune saranno Mutate mentre altre no. PREPARAZIONE DEL PCR L'intera Procedura è assai rapida poiché Ciascun Ciclo dura solo Pochi Minuti, e per essere realizzata si utilizza un Termociclatore ovvero uno Strumento in grado di Programmare nel tempo, in modo automatico, la Temperatura. Una reazione di PCR avviene all'interno di Micro-Provette da 200 µl che vengono inserite all'interno del Termociclatore. All'interno di ciascuna Microprovetta vengono inseriti i seguenti "Ingredienti" in soluzione: • Segmento di DNA - Che si Desidera Riprodurre • Nucleotidi Liberi - Desossiribonucleotidi Trifosfati, dNTP per Costituire i Nuovi Filamenti • Primer - costituiti da Brevi Sequenze di DNA Complementari agli Estremi 3’ dei due Filamenti del Segmento da Riprodurre • Tac Polimerasi - Dna Polimerasi Termo-Resistente • Buffer - che serve a Mantenere il PH stabile (Tampone) e necessario per Costituire l'Ambiente adatto alla Reazione • Elementi di Supporto - (ad es. Ioni Magnesio) Indispensabili per il Corretto Funzionamento della DNA Polimerasi; ed Acqua - Portare a Volume la Soluzione. RT-PCR PCR SUL GENOMA AD RNA Se vogliamo fare la PCR in un Genoma ad RNA ad esempio di un Virus, bisogna prima fare la RT-PCR o Reverse Transcriptase PCR, questa Tecnica Consiste di creare un Primer Complementare all’mRNA che vogliamo Amplificare e una volta che questo si è legato avremo una Trascrittasi Inversa che Formerà il Primo filamento di DNA. La Trascrittasi Inversa ha un Ottimo di Temperatura a 42°. Il Primo Filamento di DNA verrà Duplicato dalla Tac Polimerasi grazie all’Innesco da parte di un’altro Primer Complementare alla Sequenza del DNA, si Formerà anche il Secondo Filamento di DNA. A questo punto la PCR Procede Normalmente mentre l’mRNA di partenza si Degrada Spontaneamente a causa delle alte Temperature. APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE DELLA PCR Possiamo utilizzare la PCR per delle Applicazioni Diagnostiche, queste possono essere: Malattie Ereditarie - Es. Diagnostica Prenatale - L’analisi consiste nell’amplificare un Segmento di più o meno 100/200 Basi del Gene di Interesse ed analizzare la Sequenza che ho Ottenuto con 42 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA nel campione estraendo mRNA presente sia in Sede Tumorale che nel Tessuto Normale ed andando a Quantificare la Differenza. In questo caso andremo a fare un Analisi mediante PCR Quantitativa (Real-Time PCR) a partire da mRNA. Potremmo anche andare a vedere il Livello di Proteina che abbiamo nel Tessuto, quindi utilizzando il Western Blot che è di tipo Quantitativo, ma questo nella realtà non ha la Precisione di una PCR Quantitativa e se si ha un Raddoppio di Quantità della Proteina, con il Western Blot non ce ne accorgiamo bene. Alcuni Esempi di Proteine che se Mutate inducono a Tumorigenesi: Bcl2 È un Proto-Oncogene presente a livello del Cromosoma 18. Questo è un Gene Antiapoptotico, necessario per un Corretto Equilibrio tra Apoptosi e Proliferazione. Se su questo Gene avviene una Traslocazione t(18:14), e viene portato a valle di un Promotore Forte (Promotore delle Catene Pesanti delle Immunoglobuline) la Proteina Bcl2 viene prodotta decine di volte più abbondantemente e di conseguenza avremo la Cellula che non va più in Apoptosi. Myc È un Proto-Oncogene, che codifica per un Fattore di Trascrizione che regola l’espressione di altri Geni, di cui alcuni coinvolti nella Proliferazione Cellulare e quindi determinanti nello Sviluppo del Cancro. Anche questo Gene può fare una Traslocazione t(8:14) e di conseguenza essere inserito a valle di un Promotore Forte ed essere espresso costitutivamente. Un Tumore può quindi essere Catalogato come Myc Dipendente o Myc Indipendente a seconda della quantità di mRNA presente nella Cellula Tumorale. Sarc È una Proteina Tirosino-Chinasi, una Proteina di Segnalazione specializzata in Messaggi che controllano la Crescita Cellulare, partecipa alla trasmissione di segnale aggiungendo dei Gruppi Fosfato ad una grande varietà di Proteine che controllano la crescita della Cellula. Questa Proteina può essere Attivata o Disattivata attraverso una Particolare Tirosina presente nella sua Struttura. Se avviene una Mutazione che Elimina questa Tirosina avremo che la Proteina Sarc diventerà Costitutivamente Attiva e Segnalerà Sempre. Ras È una Proteina GTPasi ed è coinvolta nella Trasmissione dei Segnali all’interno delle Cellule. Quando Ras è attiva questa Attiva i Geni coinvolti nella Crescita Cellulare. La Proteina Ras ha anche un Attività GTPasica che permette di staccare il GTP e di Disattivarsi. Quando avviene una Mutazione, può succedere che si producano delle Proteine Ras permanentemente attive che portano ad un Iperattività della Cellula. Epitelial Growth Factor EGF EGF è un Recettore che viene attivato in Presenza del Ligando. Quando il Ligando è presente questo Recettore Dimerizza e manda un Segnale di Proliferazione dell’Epitelio. Se avviene una Mutazione questa può portare ad una Dimerizzazione spontanea dell’EGF anche in assenza del Ligando. LA MEDICINA FORENSE La determinazione del Profilo Genetico di un Individuo comporta la Genotipizzazione di 16 Regioni del DNA altamente Polimorfiche in Lunghezza, queste sono Variabili da Individuo ad Individuo e sono le Regioni Microsatelliti o SRT (Short Tandem Repeats). Le Analisi di Tipo Forense di Identità Personale o di Parentela Stretta si basano quindi sulle Sequenze Altamente Ripetitive, sono delle Ripetizioni di Sequenze molto Corte, che tendono ad avere un fortissimo Polimorfismo di Lunghezza. Ognuno di noi in questi Loci ha delle Sequenze che possono essere molto più lunghe o più corte rispetto ad un’altro Individuo. A livello di queste Sequenze è molto più facile che avvengano Fenomeni di Crossing-Over Ineguale poiché appunto queste sequenze sono identiche ed al momento della Meiosi ci può essere un Appaiamento non Corretto. L’Analisi dei Microsatelliti viene condotta mediante la Tecnica della PCR che consente di Amplificare in Vitro queste regioni Microsatellite del DNA. I Frammenti di DNA che si ottengono vengono Separati per Dimensione facendoli scorrere su di un Gel e si ottiene una sorta di Codice a Barre che è Unico per ogni Individuo anche se tra Parenti stretti si possono ritrovare delle Uniformità. Questo è il classico Test di Paternità. 45 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA STORIA DEL SEQUENZIAMENTO DEL GENOMA Lo Scienziato Renato Dulbecco lanciò la Proposta a livello mondiale di fare la Sequenza Totale del Genoma Umano. Fino a quel giorno in Laboratorio era difficile Studiare anche solo la Sequenza di un Singolo Gene, perché per fare la Sequenza si utilizzava il Metodo di Sanger, lungo e noioso. Il Progetto Dulbecco mise in moto alcuni meccanismi che portò le Company a mettere a punto dei Sistemi Automatizzati, ed aiutati anche dall’aumento della velocità del Computer, il Sequenziamento fu finito in 15 Anni. Al giorno d’Oggi la Velocità di Sequenziamento è Alta, per Sequenziare un Genoma Umano bastano solamente alcune ore. Questo progetto è stato un esempio di Collaborazione a livello mondiale in cui i Ricercatori di tutto il mondo misero a disposizione i risultati delle loro Ricerche. L’Idea fu quella di Distribuirsi il Lavoro. 1. Il Genoma Umano ( Base Pair) venne Segmentato, i vari Cromosomi vennero spezzettati in pezzi abbastanza grandi simili ai Cromosomi di Lievito. 2. Furono creati quindi dei Cromosomi Artificiali di Lievito YAC (Vennero usati anche i BAC Bacterial Artificial Cromosome) la cui lunghezza è di circa Base Pair, in questi venne inserito un ARS (Autonomously Replicating Sequence) ovvero una Sequenza, un Origine di Replicazione che permetteva una Replicazione in Lievito. 3. Furono quindi creati dei Ceppi di Lievito che accoglievano questi Cromosomi Artificiali YAC come se fossero dei Cromosomi Aggiuntivi. 4. Questi Lieviti vennero mandati in Giro nei Laboratori del Mondo, ed ogni Laboratorio si prese in carico di fare il Sequenziamento di un Determinato Segmento. 5. Una volta purificato il DNA con degli Enzimi di Restrizione (Come Bcl1) che tagliano in maniera casuale una volta ogni 100 Basi si ottengono dei Frammenti di YAC. Se utilizziamo una Quantità Modesta di Enzima di Restrizione in modo che tagli 1 Sito di Restrizione ogni 10, noi avremo delle Sequenze di 1000 Basi. 6. Ogni Sequenza quindi verrà digerita in maniera diversa da questi Enzimi di Restrizione e di conseguenza alla fine ci troveremo dei Frammenti che sono Overlappanti, ovvero Sovrapponibili. 7. Se Sequenziamo tutti i Frammenti Ottenuti alla fine riusciremo a ricostruire la Sequenza di tutto lo YAC aiutandoci con le zone Sovrapposte per capire l’Ordine dei Frammenti. Alla Fine del Sequenziamento veniva fuori quindi la Sequenza di tutto il Frammento, si era creata una sorta di Library di Frammenti di Restrizione che rimessi insieme potevano ricostruire lo YAC e successivamente anche tutto il Genoma Umano poiché anche gli YAC erano Overlappanti e quindi Sovrapposti tra di loro. METODO SANGER Il Metodo Sanger è una Tecnica di Sequenziamento Enzimatica che permette di stabilire la Sequenza di Nucleotidi di un Frammento di DNA. La Tecnica permette quindi di determinare la Sequenza e quindi l’Ordine dei Nucleotidi e delle Basi Azotate delle Molecole di DNA, ovvero di Adenina, Guanina, Citosina e Timina. Al Termine del Sequenziamento si ottiene infatti un lungo elenco di Lettere che definisce il Genoma di un Organismo. Ad oggi viene utilizzato solo nelle Macchine da Sequenza più vecchie, che vengono ancora utilizzate per fare Piccole Sequenze di Frammenti oppure per andare a controllare se un Clonaggio o una Ricombinazione è avvenuta in maniera corretta. Questo metodo si basa sull’uso di una Molecola di Dideossinucleotide, questa Possiede un 3’H al posto del 3’OH che è presente in un Deossinucleotide Normale. Quando la Polimerasi inserisce questo Dideossinucleotide, questa non è più in grado di procedere e l’Elongazione Termina. Per eseguire questa Tecnica di Sequenziamento è necessario fare 4 Sequenze di Elongazione Diverse, divideremo quindi tutto il materiale in 4 Provette Diverse, ogni Provetta conterrà: • Frammento di DNA che dobbiamo Sequenziare - Questo deve essere Denaturato, quindi a Singolo Filamento e presente in più copie. 6x109 106 46 Biologia Molecolare Applicata VERANI GIULIA • DNA Polimerasi I - Enzima capace di Sintetizzare un Filamento di DNA a partire dallo Stampo di un’altro Filamento. • Primer Sintetizzato Artificialmente - Un Innesco composto da pochi Nucleotidi che viene sfruttato per far partire la Sintesi del DNA. • Deossinucleotidi Trifosfato - Che hanno il 3’OH e permettono la Normale Sintesi di DNA. • Dideossinucleotidi Trifosfato - Che hanno il 3’H e Non permettono il continuo della Sintesi del DNA. Per procedere al Sequenziamento in ciascuna delle Provette viene aggiunto uno Specifico Dideossinucleotide (ddNTP) marcato Radioattivamente o con Fluorescenza, con uno Specifico Colore. Combinando il Contenuto delle provette si ottiene una Miscela di Reazione nella quale grazie al Processo di Duplicazione prendono vita Filamenti di DNA con Specifiche Caratteristiche. Infatti grazie ai Dideossinucleotidi verranno prodotti vari filamenti diversi, alcuni più lunghi altri più corti. I Frammenti di DNA ottenuto vengono analizzati attraverso una Tecnica chiamata Elettroforesi, durante la quale un Raggio Laser mette in evidenza i Marcatori ed i Rispettivi Colori, e grazie ad essi è possibile stabilire (Con un Computer) l’esatto ordine dei Nucleotidi del Frammento di DNA ed ottenere così il Sequenziamento. Il Risultato della Reazione è quindi un Diagramma in cui ci sono Picchi di Colori Diversi in ogni posizione. 47