Biologia Molecolare Applicata (2 di 2), Dispense di Biologia

Scarica Biologia Molecolare Applicata (2 di 2) e più Dispense in PDF di Biologia solo su Docsity! IL PARTE : TRANSFERONE * Inserire DIVA estranco in una atua ospite faando in modo che venga integrato (Mantenuto. TL DVA € una macromatecoto cu granch cumEnSIONI e non permia. spontansamanti . Perco' : *Tratto 0£ cottute con Calcio Croruro Calia in presenza a un tamponi FoSfato au' Sodio (NasP04) » St formano cu cristati cui fosfato au calcio INsoLubiLL, se nuto. Saualona e presente anchi di DIA, questo forma du complica con 4) Fosfato ch Ga, eni. coprecipitano sulla cuttutli ® VENGONO Internal'a tan da mMICcaAnimni du endouto gi Una uatta. internatiàXato +) DIA puo' : > Essere replicato (in questo caso due pero' contange Un oricpina du replicatione riconosciuta dall'OSpite) > Essere integrato nu genoma dul’ospit, evento a bassa. probabiuta' ye ALI METODI : > ALtrimarti viene perso. LEIELETOPOMA ZIONE . e LU posomi NB: NEGLI eucarioti superiori gentratmanti L'integrauone e casuola , in Q'euto € inveca possibili fare integrazioni Sito Specifica. Usando dit DNA che porti una Seq. oMmoLoga a. quefito cu'uno dei geni presenti in Lieyito. L'inteorazioni gito-spectita e dovuto. ad un Da > evento du' Ricombinaaione Sito- Specifica > Siti a Livetto di NVva esoggno e do DIVA dell'OSpite pg (nitta reqont in au glio fare QUENTE AMIR. -Natione ‘ A - davgno esset presenti du siti du riLOMbINARONI cha dovranno esstre riconosciuti da enmi Le RICOMBINASI, SISTEMI DI SELE UONE Amminopr iNibis@ fa ua ie marciò? È . Classico A) Uso di gene marcatore chi compumaenta. UNO MUtOAlONL > Tpoxant + atiia 2a via di , GENE TK : USO CUL TK- (Mancano di Timidina Chinasi), Seltziona su terr } HAT (Ipoxantina, amminopterina Timidina) . L'ammmopterina inibista La SINgri NOW di TMP, GMP e AMP por carenza. ch TEKTCU'ATOFOIOLO . L'ipoxambina. duavone dl TMP a presenza cul'enzuLo Tk. Sopravuilono Su OL consente au attivare 4a u'a di salvataggio per La pro parhre dallo. timida auccharo +Timina) esogena n Timuduha China. La CAM chi hanno Integraro i qua terreno HAT. , GENE Ahfr > Uso IU dhfr- (di'idrofolato redumasi) iI MU che hanno integrato 49 geni dihfr crescono in terreno privo au supplemanti (normata sintesi di nuctrotici ) ° Le cult Ahfr= neerssitano invea du' iPorantina & Timiclina. per SIpravUiVeRE attiva La via di Wataggio Tnottre xe geni Ahfr ha la capaata' cu amplificare (comprese Qt seo. acdliacanti) indotta da HKetotrfexat0 . KOtto uSAtO per la procrluzioni cl' protrini. industriali + Transfetto fe colluta con al Gene cihfr + gene di mio interesse + Seltatono su terreno prio cu' ipoxantina. e Timiclina . I ' *TI cloni cha honno integrato 10 DNA vengono piastiati su 4errena contenente una Piccoto. Quantita: cu Nitotrex. fun inibitore Aula Aher) » Recupero d' cloni resistenti e Li fipiastto aumentando da conc. di inibitore è cost via Nino a raggiunge 2a, conc. du MKutotrex è SpM . Recpero 4 cloni resistenti, st anaLiz®0 A DNA posso vedore cha i gens dhfr E qQuemro cu MiO Inveresse cono stati amplificati fino a AO0cOpie. . Quindi guengo Grana Quantita' dito proteina. al mio interesse , d'atto N° di copie viene Mantenuto nil 4@MPo. 7) SoleZiont basata Ssut' acquisiaroni du un gene marcatore dominante > (romutant) + G4I84 C un derivato aula Neomicina, motto eFficienee in uconioti , € iN GrAdO du inibire La sintesi proterca. Quindi posso usare come marcatore 40 gens NEO > chi codifica per un'amminaglicosice fosfotransegrasi cha fosfori lo l'antibiotico . inattivandola. sernziono Mu cat che Sopron vivono Su terreno contenente GA LIGRONICINA : blocca No SINtTeERI proterca in eucarioti e procarioti , uso COMI marcatori aL geni HPTS chi cocufica per L'igromi cina fosFottansferasi cha fosforilo d'igromicina. inagtivandola.. Se walio creare una Lina tansfemante Srabili, a plasmide dee comteniue: . promotor o FErMINATOn . marcatore ai sunaoni (88:10) , gens d'interesse GRI (origina au replicazione) La cat trans femote con questo plasmide, in buora. pafti (10-40) tiauono 40 DNA, poi con i vari pasSaqgu ar stuaione Su GAB AI plasmide puo' essere perso. seto pochi cotonie Lo integre ranno stabilmente. inforti F'iNtEAIAZIONIL dr plasmide e” un EVENTO A passa frequenza + Spesso di plasmiai RA A: QULRONI, NAMrongiAMeEnNto, mutazioni... T Singolu' cloni trasforman etabili verano anquiziati SinqoJarmenti con ! SOURhIrn, Northarn... SVANTA GGI ! . Richiedi motto mPpo , Etevcienae DOSse «L'integrazione du ene d'interesse puo! vari cloni, questo puo' influenzate A avente in Punti cliversi Ar qenoma nat Espressione chi QANLI, EFFETTO AS RIONE TRASFORMATIONE CELL DI MAMMIFERO CON VETTORI VIRALI i * SVAO ! Virus Litico a DNA (ds cucotare) cha infetta Qa scimmie e presenta promotori: PATLY ! genera un mENA ch codifica per Na proteina. "antigenet* PIAEL I ETASCIHVE IN senso GpPposto generando un mRNA chi codifica per proteina VPA,VP2,UP3 [3 proteina del rivostima Mo), Questo virus puo' replicarsi solo in cettule cli SCIMMIA, St infetta atrre specie ano roplicarone virale MA InegrALo -M nel genoma aell'ospiti dtterminanco Ja produmane cli tanti amigeniT (hanno un'atoni Las formante + ali tumorali). Se uatio usare AO come vettore devo Loquee atcuni porQiOni dui quioma virale per fare PALO al DIVA cli Mmuo intereste ; questo cttermina, La formazione di Virus Attivi chi. nttaSsiItAnO di virus hat per per to. produriona di perticalla virali. Qlirus difcitno, manca dato antigent-T , qui vieni fornito lat u hatperr per complamantoruone dti funzioni manconti .; Oppure4 cosiruicco vettori cha portano solo L'origini di replicazione di svao @ Li inserisco in UU chi producono L'antiqena=T . HA ho una grandi auPlif\COUO- “ina CUL CHO La cit va in SAtUrgA toni € Mure. (non c'e Un sisteua du contratto per dl Ne di copie) Replicazione. di SYAO in ALtre Specie animali a e stato okenuko questo risuttato con I'intfodurione di sequende MARE frammenti cli DNA cli mammifero chi Lagano fa MAXTiLa NICMOre ) nu prasmidi portante d'origine chi ICPL'CARLONA di SVAO. Questo permitte La (Cplicazioni QUEONOMO dal prasmidi anchi in cl non à scimmia. ; l'amplificarroni È bosso ma stobila (AO plasmidi x cu) dette La sea.HAR inibiscono N'efcetto POSIZIONI ; per poter Ra usate ora ER e fepirtazssaL Si ALUONO ATOVare dopo Un promotore . n ‘ asta. duns ‘ vi ; Ì sistema. perdi cli effiuienaa. (stabili fino a 190 QeALGUON e Poltoma Virus * virus murino cha fepiica. in eu ail topo , ha DIA ds aucolart , Z promOLOrI, CAT LYS prociitioni ANMIGENL-T , Rates proteina du rivestimento * Papilloma virus | origini BOVINA, DIAdS CIT Cota + AGIENOVIFUS 1 vIFUS Cha funauona, benz anche ‘n call umana VETTORI RETROVIRALI : Sono basati su PEErovirus, hanno un sistema. di transferone estremamente efficiente, GenIrano iransfekttanti stabili e sono alla base der vertori su Luppati per la terapia qenica. Genoma © costituito do mattone dii RVASS. Sono Specie. specifi, MOdieicAndo AL iglitoproteini dit copsida ne modifico 20 specitiato!. MECcanismo ! al IEtravirus adiriSc atta per via del riconoscimento cita proteina du MAMOFANAL, LIENI ENTOULAKO , a. partire dell'EVA ci Qengra una COPIA. di ONAdS Chi si INEegre ra! nu QenoMa. dell'Ospite. Questo DIA presenta AL 9tq. LTR- SRQ-rIPeLUtO chi contengono Un promotOie forte e Si generano morte copie cli MANA CON Z FUNZIONI | n) Sintesi proteina viral: 2) Serve da Genoma, Per 1 UIFOni cha verranno prodotti TI rorsovirus medrano un'infezione cronica no morte cetultate RETROVIRUS RICOMBINANTE : SY OtHiena por rimozione paratasm o completo. del QgRnROVA virata, si maAntiena AD SIEO Xi per L'impacchattamento e Mr sto. LTR> Si aggiunge 40 DIA d'interesse e un marcasore. CALO) ; questo prasmiae Lo uso per infettare Lino camudori impacchi ttattici 4 fibroblasti o qui Halo, chi contengono ne foro genoma, Furto i) necessario per Jo. produaioni di virioni a KEEngO COST VITUS FiCOMPINANTI Cha posso uSOTE per infettare. con grandissima erercienaa Qu cenn bersagrio (n.8 per ridurre Lo probobiita' di Cuenti di ricOmbiINAUONE rimuaw 2a porzioni \TR) Applicozuoni: + omenere Linar cai HTansettate stabili con atiissima errruienra, + stud SUL daifferenriamento cauta + TErapia quaica Svantagg : *L'INTEGFAZIONI PUO! PArRtart all'attivarioni di Qeni adubcanti o ad inattivorone genico per MUTAGLNIEY INSeratonola , QUeEst'uttima compensata dol qui wt «TL NL gi INEEOFO in singola copia. (non vo bena se Laglio grandi Quantta'di pratena) » Infetta soto co in proliferazione attivo, La corr quiescanti non Lenqono AFOSFOMMOLE (4° LENTIVIRUS infettano anche cali quiescanti) ANIMALI TRANSGENCI * AnimaluUehi portano na loro AenoMO. un gent esogeno cha È presenta in Gkerozigohi A <g000 aMola. HeKocliChA : + Introduzione di DNA In cala somarioha di un organiemo adutto È “ 1 mato. cul uovo fecondato, ’ “ negli spermatozoi per usarli coms \&ktori + Intro duatone nill'embrioni cli (UL embrionali gentticamenti noditicate . IntFOCUZIONI AI EMbTiONI cli cesti GERIhRI CAMENTE Cliverse transfettate cond) ONA chi MIO INtEeresse. FECONDAZIONE (N VITRO © Giù ovuli du topo femmina. Vengono reouperata Q TTAXAT) CON Spermoatagoie now fecondato vieni trattato cOn DIVA eSOQRNO (no marcatore, non c'e seluzoni) e poi vengono re-impiantati nella Kmmina pseudo - SRUIAI (Kfottakte con ormani). Gli ovaditi attecchiscono € Si formiranno gli embrioni da cu nasaLranno du topi cha dovranno essere anaLiziati per vedere se presentano a DNA esoqgnO (estrazloni adi DIVA data Coda + POR) TEST DI TRASMISSIONE : | kopi Ottenuti si fanno crescare per poi incrouarti con topi wi; Se LD DNA esogeno E presente Lo tiovero' in admeno mero) aula discandenza .( perche 29 cn è semi-domnante ) aLrimenti otterro' tutta wr. Scopi: - Studi di ricarca - Miglioramento du un “prodotto PERA plasmidi contenenti La nea. sMAR + che consentono Ja replicazione in ceti du MAMMIFErO è restano Stabili, usati per cmenere Matati trane - “gRnici coma veLtore uso gli spermaro?oi (HA duo transfeti ari con AD ONA esogeno prima cha questo entri a contatto cOn N Liquido seminale, aLtrimanti non prendono 40 DIVA) > Animali come “hiioreattori " € stata creata uno into di pecore Transoeni- - (NL chi producono un ormone proteico net Rane, Ho 2 vantaggi | iQ A° € Cha La proteina gi trova qua' in un ambiente favorevole , 2° posso {aoKmenta reuuperarta con da mungitura . cettute STAMINALI EMBRIONALI (ES) è Cellule ricavare dalla BIastocisti , si (E una fase embrionata) tratta ci cellula pluriporenti dale quali st puo: ottenere qualsiasi tessuro /organisma. Pertanto dalla biastocisti posco isolare Qa Singole comule e metterle in coltura £ camutt ES) . E possibile transfettare queste calt con iP DIVA di interesse. per poi re-impiantarQe In un altra, blastocisti + Lt calt inserito Vengono mantenute e partecipano aMa formazioni del Nuovo organismo. Otiengo così certe CHIMERE portanti xp DNA etogena. > Questo. tecnica. puo' essere ucata. per contenere topi AfansqeniGi portanti interi geni allo scopo di Studiare malate coma L'Alahgimor. È Storto inserito 40 gene codificante La B-APP (responsabife dut'insorgenta UL’ AIR. NIUL'LOMO , i) ARI cOduficA gia: per Lt prodotio tossico > BrAPP, derivante da Splicing atternatilo , perché ner topo non e Normaameante presente) E sraro sfrumato uno YAC di 600kb (cromosomi arti fiato du Liguito , no Leoni perch troppo picco Lt) che comprendi 19 gene PPP i (» 40016) e a) promotore (40066) ; La restantt parte comprenole i L'origine du fepiica zone di Lievito , un cantromaro, du Marcatori € Sa Sq. teroMmaricha. Questo DIVA d stato Inserito nil curuti ES, 4 cloni ottenuti Qi anaixto con Southern e solo quei © verranno inouutioti nata. biastouish e daranno origina topi afferi da Alzhumer, PLashidi + organTIti culto pianta coinvolti nur deposito cli energia € SINTEKN du MitaboXti | * Leucoplasti .3 sintesi omido e proteint (incolore) *Cromoplasti » (gialli Loss) sintesi carotenotai cloroplasti » (edi) contengono La corofilla., fanno fotontegi Tutti 4 piasheli si sviluppano cla piccoli organi dr, call MOristembiicha non mature (ou non differenziate) chiamati PIOTOPLASTIDI CLOROPLASTI : Forma. Clissoidole, presentano una doppia membrana. (Aivisa dallo spatto intermambrana).La me e put permeabile all'HO Mentre La ML € ricco. di proteine 4{aSportatfica, AI SUO Interno & FIEMPITO du SITONA è Materiale semi-RLiquublo ricco in endimi, { cloroplasti hanno un Loro qenoma. (DNA), contenuto nato Siftomoa, ASSIEME A. SPECIALI ribosomi (OS, di tipo Americo) e RNA (possiedono Eri famtori UGUaAL'A queru bameric + fattori cli terminagTone, AMunGa- MENTO ECC... Infatti La sintes proteica. nu dioroplasti € inipito dagli SEESSÌ AntitmObiCI chi go bloccano net Batteri). Nero srroma. sono presenti anche a fitacoidi interconnase; tfa doro artaverso 9 Qumen. La Luca ViIAgGIA come pacchetti discreti dui enLigra (4 fotoni) e viens assorbita dotta cloro uta presenti nu tacca, chi emure e- , ottenuti doal'acque,, IL novi mento dugti eRettroni artermina 42 movimanto dugu Fit autiaverso Le membrane che circondano 1 + ilaccd: con formatwoni dl un faune elettrochimico cha porta ato produzo - “nr di ATPNUMO siroma. TOTIPOTENTA + Ne pianti, ques sIOGI ARSssuto PUO iQiacate. 2 pianto, intera. Lo stadio differenziati di tessuti vegetani E reversibil e puo! essere MANI Polato iN VITO variando a) fapporto cli QUxiNA e cirochinina, dui ormani vegetali. 1 Auxina_= differenziamento raicola (radici) Tatochinino = differenziamento vegeratmo laermage;) TRASFORMAZIONE PIANTE - L'Espianto di foglia vieni ifagtato con enzimi cha nr rarouzzano lo parete tengo coR7 cata nudi”, £ protopiag , Che possono essere tioSformati con A DINA eSoggno . Lo prot ferazona cal portera' atto {ormarone dl calo che porca» ditferenz ian a. qermogtuo (Aatochinina) o verso Lo cui Lupro di due: (TauxInA) . CHengo Infniti cloni di pianta tue uguoti + HiCFOpropagaguona ( perché NONUSO dI S.M9, dunque n nuuton TRASFORMAZIONE PESTOPLASTI | 1) PEG + Provoca. Ro. fusione Aa Mambrana du’ protoplosh fauLurando L'ingresso dqul DIA. 2) Eletropofaro na 3) Hicro-mnie Zone [su pro toplash grandi) Sistema di celerona : Mafcatore dommnanti (Wes. ) Geni Reporter : CAT, LUC, GFP, gus B-Glucuronidasi , idralivaa Xu fuberando un aerivaro endatico chi gi Quio-Ox € oricgina. 19 colore indaco) METODO RIOLISTICO | Hutodo Fisico : Bombardo con Hutoproieriti rivectit di DIVA 4J teseuto bersagtuo ; RL call duettamenti cotti muoiono PSISCONTA circostanti vengono trasformate. E' efficienti 2 lo porro Usate con quallziaga speore. TRASFORMAZIONE CLOROPLASTI è Tramili matodo bieco, devo usare un vetrore portanti : » Marcatore di segsrone (patta spectino muicna) - Gene d'interesse con Ur seo. omalloght ., integraluona. per ricombinazione Promotore batterico Induco Na formazione dat calto e No faceto differenziare a aemogtio 2? X otrengo germogli bianchi (NO intearoRiona (R'Antimotico precenta nel terreno ha. DIOCCALO La SINteri PrOtTEICO MIU CLOfOPiaStri (On COnsequenti digeneratuone dal cloropia to) 3 cono GAMoyu Verdi hO avuto INTEGIORIONI Vantaggio © Alti Livelli di .eprecoione. svantaggio : La PrOKGina «i accumula N dorepiasto. SIZE. RNA 8) Ribosomi batterici —» Sub. Haqmore 50S Tit 4OS SUb. Hinore 30 S 16€ RNA . ,208 Ribosomi Eucanotio: , Sub.Maggore 60s S Ss Vrewa 80S Sub. Minor 40S 45185 + CENA AGROBACTER.: Trasformazione diretta delta piante per trasferimento du petti. di DNA ala coltita. veggtala + Proliferarione incontrollata. (Tumore del colletto Aigrabacker presenta. x piasmidio Ti (induttore del tumore) di cu ne fa parte una regioni. chiamata T-DNA (T=tfasformante) Lunga da 12-24 kt La regioni dal T-DNA e delimitata. da : Confina bx e Confina Sx (Sono Qa regioni riconosalute durante A) trasferimento du T-DVA alla qu veretale Tra. £ 2 confini sono presenti Le seguente codificonti per | ° Auxina e Citochinina > Zormoni vegetali, La Roro presenza Non controllati causa sdifferenziomento e proliferotione incontrollata > tamott sOpina 4 prodotto di condensatione tra un aa + chitoacido /zucchero Ne esistono 20 € Ogni crppo di AGrObaActer ni produci solo Uno... (servono per db processo du CONiILGRILONI d tiasferimanto di porzioni di DNA da una. corr a all'altro. EFamite contato CM call) IL restante pRasmidio codufico per: Geni vir 4 codificano por protene necrssarie per far awenire 0 tasferimanto ° Catabolismo Opina > sistema entimatco per i cotabolismo dilla cpina N®: La regiona du T-DNA compresa tia Confina Dx e Sx € quela che viena Frasferito Nei Cotti VEREtONOA. Quando Lo pianta. subisce una Qaziona . NASTRO ACETORIRINCONE € IDROSSIACETOSIRINGONE , cha AIRIVONO Ad SISTEMA. Sensore cut Balterto, cha per chemiotasgi si muove verso No pianta. AGIOPACKEr presento. Un re ctmore PA L'amtosiringone , costituito da: virA e Vir@& (gli unici 2 prodotti dec geni vir costitutivi ), VirA3 E 4 vero E PIOPrio YRCUTOE , Quando Viene attivato si amtofosforilo, e fosforiQa anchi Vira, ch attiva Sa tHascrizig -n2 dagli alli geni vir. IL contatto harero - culi equars € stabi Rivrabo Madiante un meccanismo du adesioni > proteina codificore dat agna chv present SL pra smidio-Tì. TI Plasmidio-Ti non veni taguato, Ma vieni generata. una copio. a singato Fillamento atflla regioni Lompreso Ero. confina Dx e Sx, chi por verra! tfasferita alla Ut vegcroti. n AGROINFERIONE | La differenzo. principati sia nat fatto chi dD DNA che watlio trasferire non contiena Solo 4) gene di Mo interesse na anche una. portione coduficante per un virus veggtala (virus dat monico du tabacco), cro' che accads € Chi dopo 3) tiasferimanto , 40 virus vena attivato e va ad inferare tutte fe cult circostanti portando con se 40 gene di mio interesse » ottengo come risuttato un aupificotione ALLa Seguenta der qena (si possono procturre fino a ScOmR di proteina. liga Foglia in Fguwrn) Vantaggi * veloce, OUENGO. granoli quantita: di PIELEINA., non sn ha contomi - “nazione da Parla di Virus animali (cosa cha potrebbe accadere facendo esprimere quasti proteina in call du MAMMI ero), inottr e. non i parla di OMGS NOn ottengo una. pianta tfansqenica, varto salo ad Infertare una Pianta Gia' adutta e Ja uso a scopo produttivo , dopo oli Cha viene Aimnata.. inottre se si fanno esprima dute proteina du Orig vITOLE che costituiscono ib coapade Si formano angli aggregati virus-lke-Particlas 4 particetta virale chi non tono infette (perch non contengono fo) cproma viragQe) ma sono pur foutmunte purificabili € motto Pur antggniche rispetto ama. ProLena, solubile. Arcuni esempi du piante tansgenicha : e Piante in cui € srata fata esprimere Una tossina, normatmenti prode fia da batterio in moda da indurre fa resistenza ai bruchi. e Kais ton 80 > Hours OGM can 20 capaata: di resistere ast'atacco degl INSETN. (nutds pianti € stata introdotta una motacala tossica per gru insetti ) o fiori ChL fecistono pù a lungo dopo essere stati recigr e Fruzic, che mata pui Lentament. ottenuti inibendo La sintesi au ernfina ormoni due MATtUuraziona . Produzona en end : S-Adeno Umttionina, ACC Sntast* intermedio ACC essidasa ——_ 9, ehilene + Ammoniaca SOBRIA, i Li chitebututica @ far esprimere L'Acc dtamminasi pamerica. chi converte l'intermadio in ALITO A-ChIEOBULIFTICO , COST Nom hO pur 0 subsifato per ottenere al prodotte funace. DINIDILONE AUll'ACC SINtAST USANTIO RIvA-Antisenso, chi inibisce L'espressione quica è IX ° Pomodori a Lenta maturazione > espressione adull' fiva-antisento contio L'enzima. che idrolitto Le pectina a che fondono 40 frutto moro. L'enima Mon vene prodotto, ib pomodoro Moturo. put Rantauente. > Fiori con colorazuona duversa. : 19 colore dii fiori € owterminaro da particala ft molacol£, basta alterate Na via Biofntenca. duello. produzione dil figmanto. o Pranti come vaccino , 3 probematnthe : 7) PossibiQa digradarioni dillo proteino. duran la digestione 2) Non tuti X frutti vanno bena : parare bingra cuoca. , fomodoro TiCcO IN ACqQUa, e SCArsO in proteina , put promamenti Lo, banana 3) Dosaggio, non posso calcolare per cani frumo prodotto, 4) dosaggio di proteina. presenti. HITOCONDRI : Organelil delle aQnuata aumcarioricha , d0rivano da un procasso du oncdosimblasi in cut eubameri sono stati incorporati nall'antenato Qucariotico . | mitocondui sono OfgaAngIli dall'aspetto Ulindrico chi presenta. “NO una membrana. mitocondriola esterna. e una Interna. cha si ripiega a dare La cesta mitoconduioli e presenta gli enTIMI ciMo respira rioni All’interno si tfovo La matrica , chiamata stfomo. Che contenga: ° genoma. mitocondriale o Npparato HOascri zON0La ( EVA pal) » Sistema. di procassamanto (RibonuctrasiP per La MAKurartone de 1 RIA-5 ip genoma. codifica per Una stri cu' LENA cha Lengono Usati per fare. La Gintega proteica mitocondriols ) * Ribosomi mitocondriosi (di tipo batterico, + da querti ret pscntagna) GENOMA HITOCONORIALE : DNA ds circolox® (15-20kb) chi codifica. per: T PIOECINI dui compieSsgi dillo respiraztona (non sinterittano tuta Lo, proteina. ma solo qualche Sua Subunita) — RNA - YRNA TI filamanto con maggnor parere coditicamte eu fiovento 4, querto compumentare & x) fiomento L. IL genoma mitocondriale © cosi grande, Anche St codifica. per pochi proteina perche € ricco di introni di tipo amtocatalitico (non hanno xo splicrosoma. ) + gr Introni vengono rimossi dia un meccanismo di auto catalligi che richiede aluni prote codificate dall'INTroNL Stesso. Tutti 1 MITOCONArI Presentano RNApoL smi o querta fagicha (unica catena. palipepharca. cli 400-4720100. ; querre 10: DOMErichea presentano 2Subunita x piccola e 2subunito: B grandi con disposizione a cheta di Granchio) PERCHE con un genoma cost piccolo Una polimtrasi fagica. € piu Semplici da sintetitrare e Lorora pur velocamenti BATTERI ENCOSIMBIONTI che vivono in cale Cutasioheni d ES: AFIDI > PATASSThI Ue pianti chi si Nut fono dg succo tuceherino dille piante, Gu dA i nuGSsSArIi ska SIpravvienzo. veangona GFINTRRITRO MI dol pameri endosimbiornh PFESENTI NEMIe Ct Aiil'appafato diggrenti AM INSeito, cha Prenciono x NOM du patterouta, I DNA di questi batteri ha climengioni n {60kb> GENOMA INcuffiuenti per codificare funguoni essenrialti {uf genoma iocmerico put PICCOLO € di 400-500 Eb) percuoi gli entimi chi mancano at pamterio Alrivano Ae Callule QUL' INSUO . INTRONI Di AUTOSPLICING * 1 differenziano in SINTRONI DI TIPO + NuogsSitano du un nudlerofde guaninico (GMP, &DP, &TP) chi Lepa. L'estfemuta» INtTONICA GPPosta unendo L 7 esoni . L'iNtione conheni ol So interno un astro gene che Codufica. per una chaperonina > rarwraS Cha Si associo. AUL' RNA € na Mantiene La siruKura secondaria corretta e INTRONI DI TIPO2 3 SFSUTANO Lo sressomeccanismo dll intione nucleare»: < (intermedio a faccio) ma non usano Îo spiiccosoma.. In questo coso € un NuUloSiAI adenInicO A reogue con e'estfemuta» sronica. fino o ricongiunge L 2 2S0NI, Anch'essi presentano strutture Secondarie € codificano per Maturosi arcoSsarie per 40 Cunztonamento . (ln'attra caratteristica du genoma mitocandriole è L'uno cl un codice gerutico Aifrerente ES! UGA e UGG cocuficano per JD Tp ; NeL codice genetico normale UGG codifica per 0 Tp ; mantie UGA È Un codone. di Stop! IL PROCESSAMENTO du ERNA È mediato dalla RibonuctoasiP che riconosca La struttura. secondaria. e taguo I'RNA in Corrispondenia du S' ut ELMA AGEnsrarclo tanti {rammenh, Gili_RNA mitocondriale : o NO COp di F-MhLguanosina e NO sequenza non cactificanti al S'LHA iniiAno direttamanti con 1) codone AUG o L'estremita' 3' porta uo codone du stop UAA chi spesso <ì genara. solo con l'aacco auta coda Poti-A 9 Che CONVErte. Lunghi motuoote cli RNAdS SIRNA, 14 SIRNA si puo‘ ucare per tronsfertare 2% cit ed indurre Enock=down (e CI STESSO ProcLurra! sienA tfaruti DIVER, quindi posso sfruxmase UN COSPiutto plasmiduto © vio) RIBOUMA : Hagccota di RNA con funatoni enzimatica. Numoerori Ribodimi _ SONO in gfado du operate a) tagio dl Legaue {asfoduerterico, 4 ripo ra pur CEROSCIUTO € quetto chi catolivtà La formazwni au deggui pepricica, ) { fiborimi ENO In grado du auto cata iare La Noro stessa cintesi = AUKOSplIUNE RIBOHMA A TESTA DI MARTELLO : E 0 Put piccolo, meduo. ui taguio di malzcale I cu RNA. Le “teste du martetto" possiedono SQ. consento che portano Ma, formorwone di strutture 1° specifica ; inotere questi seg. OnservaKe hanno Sii taglio Specifici e possano interagiate non solo att'interno Aula stecsQ melicota di RNA (auto-tagrio) ma anche ta 2 duverse magrooìa che vengono distinte in fomentò subertato € fulamento di taglio - IL taglio avviene PEr ISOMLFI ZAR MONL > fiarrangiauento cul legame fosfoduiesStarico. RIBOHMA HRIRPIN : Ribotima, dalla struttura. Secondario. malto compusso, Cha coarolizta 49 ProcRSSAUENTO dille! RNA OSsenATAQA ‘per La replicoatone, ai MOARCOte dll RIVA satellità , nel quale È incorporano. Queste tarzuoni sono ouutoprocestne — la moltcato va a riarranghnare La sua stessa ctiuttura., INGEGNERIA GENOMICA : ModificoRone mirata arl genoma di eucarioti modianTi L'USO di Nuctraci sito-SPECIFiche, OPPOrtURAMENtE. ingegneriatate : — ZINC FINGER. Nucleaze — TALE Nuclease — CRISP_CASq Nucdlaase Tutte e 3 Ls mitodo logie sono in grado di senuar® rarture a Aoppio fiquento ENI PUO! andare in conto a 2 distini cUvVereI: 7) Genero un DSB senza inserire nascuna SEQUENTYAI <i innesco a) sistema du riparortoni. cli + NYE) = perdura de Una piccota porzione dra, reqrona SALAMOIA, perco' gi ho ALe ions ai uno regiona +0 — grande dui DNA (mutazioni per AULzLona, Oni GeEnIrOL MENTI INGUIVO Al qnt) 2) Genero un DSB € intfodiuco un piasmidi chi porta una sequenza omologa si verifico un quento di ricombinoatonae : La veg. OMaLaGa viene usato, per riparare 29 DEB e nt ricutto. un'inserzione dui qualco®, una mutrattoni SPECTLO } oppure posso COmegRgRIE UNO MUFAZLONI + nseratoni quuwt. oppure posso inserire un Gens reporter (GFP ad esempio) -QuinayY posso indurre sta KEnocd-Our che Enock-IN Questo meccanismo avviene con frequenza talmente atta chi non occorre Un sistema di SULYUONL. . pn: 5 . turodk Sistemi cui taglio specifico: Ai — Enzimi di festrizioni 4 non € particotarmenti speafito, su Un intero genoma riconosta MmOLtiScIMI SITI dl taquo. n Homing Nucktase 4 servono per (Nsenre una. requona in corrispond& na du uno <Q. bErSAgLIO | (ES: sistema. Cre- Lox) - CRISPR- associated Nuclaase ZEN : 2inc-Finger » comini proteici cha Mgano una eq. specifica du DNA, scoperti nur Farmore trascrionale TF3A eucariotito Ill ENApal3. TESA contiene 9zF caratterizzate dallo Simur: CyS-XXX-015- (2X- His-Hig. TE3A contienn9 du queste ripetizioni e molti atomi di Fico + Le 7Gfs e Li His csordunano gl 2n°% BINFAHT ri muovendo Lo at+ La proteina non e Put in grado di Aeqaue i0 ONA L'interazione Spe cifica con 40 TNA e data dagli aa chi costitui ssono L'4-Elca nere. posiatoni -4 (aa prima dun'x-elico) 2,3 e6. Ciascuna 3F riconosta una tripurta. (Sbazi) perc si © pensato du mettere insieme PIÙ 2F unite allo nudeasi For1 secondo Lo schtmQ - BEF-FokA AMegano un fUOUento, 32F-Tor7 Legano cd {iouerto e de Vv TE . i [Gio Abp Compumentare. For13 meclio. La rottura del doppio filamento TEO La 200 di taglio» acr di' 8-I bari Di Po obabiitta’ cd ticvare Co. sequenza. srecItIta. di appratauento Abasi prima. e basi copo af SITO dl tagtio € % 18 5 Perao* non sono matti 1 citi specific: a cut pn AGOSTA compusso (perche dI rischio emquatto di taguiare. anche altre foson di NON INEIEsCE ) L'espressione aeutte 24 ALue essere +(ansiente > adttrrmanti viene corhnuamante Cspressa. e continua a creore CQistoni. CITTITTO UN plasmide batterico quatcati SE 2 COMPIISST Chi RF possono essere su un unico plasmicla 0 su due plasuici separati. E' anchi stato pensato cli trantfcitare clircktomente ‘a Ci con a MENA coclificanta Per CL 2F, entra netta cus, formtrarun po du proteina e poi verfa* digradato. (in questo modo sono sicuro chi a'efferto sia Manent) Gli aa essentiali per dl riconoscimento cile basi sono : -1,3,6, per poter ingegnanztare. Li IF 20 problema. STA MULL'AG In pogrzLont 7 chi riconosce Le Bast in Posizione, clilto. tripittta. SUCCRSSIVA, posta Sul fauento opposto Quuhdu MON € pocsibili far. Mutagenagi Sito Ugento 632 - _ NS AL NUM posiQioni -1,3,6 =D NON Funaona GOT ARCIT- 3 GA 3 C cala -<' = Posso usare CPEN ache preveda da qentraaione di un poet di plasmidi portanti Combinazioni casuoti di 2F € per selratone si recuperano tolo quali di interesse. Come faccio a aeree se Nr LF funzionano ? Si esegue un knock-0ur (taglio ps8 senta ingerire nulla) , per Latre fa mutazioni (Aitiaiond) prendo x cloni ed eseguo una PER uso digli aligont chi appaiano a cavasto dil Sito di 1agl'o Infin® eseguo un gel in au corico : un contraUlo non trattato e 40 coupon trattato =v se ottengo ta stessa panda cir controllo =n0 tagtio ; se chenzo 2 banca = S taglio TALEN : Deriva da batteri chi'infettano. LL piant® NA non tfaSferiscono DNA, trasferiscono una proteina. in graio di Ligare 40 DNA (attivatore +ascrizonoQe) in questa. proteina ciascun cuminio riconosta Abast + ali ao cha danno specifica) di riconoscimento Sono in posizione A22 13, can biando quesh aa Si curia 20 SPECIFICO). L'idra era queta di Struttare quash domini per i riconoscimento srfattio du SCQUEMA e Cegarei a for1 (coue primo) svantaggno : si tratta du' proteina morto GOL —p ciascuna. subuni ta‘ € di 24aa, se voglio Ligare 40 basi sono 0aa + AIMINI Centerm + domini RK — Proteina. mosto grossa. |