Docsity
Docsity

Prepara i tuoi esami
Prepara i tuoi esami

Studia grazie alle numerose risorse presenti su Docsity


Ottieni i punti per scaricare
Ottieni i punti per scaricare

Guadagna punti aiutando altri studenti oppure acquistali con un piano Premium


Guide e consigli
Guide e consigli

BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA, Dispense di Biologia Molecolare

BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA.pdf

Tipologia: Dispense

2012/2013

Caricato il 24/01/2013

Utente sconosciuto
Utente sconosciuto 🇮🇹

4.3

(259)

409 documenti

Anteprima parziale del testo

Scarica BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA e più Dispense in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! LA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA PARASSITOLOGIA VETERINARIA INTRODUZIONE COSA STUDIA LA BIOLOGIA MOLECOLARE? GLI ACIDI NUCLEICI IL DNA: STRUTTURA E FUNZIONI L’RNA: STRUTTURA E FUNZIONI IL DNA RIBOSOMIALE (RDNA): STRUTTURA E FUNZIONI IL DNA MITOCONDRIALE (MTDNA): STRUTTURA E FUNZIONI ‘PRINCIPALI METODICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATTA ALLO STUDIO DEI PARASSITI ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI LA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) SEQUENZIAMENTO ED ANALISI DI SEQUENZA ALTRE METODICHE DI PCR IMPIEGATE NELLA PARASSITOLOGIA VETERINARIA PD ULVUO 0 Luubw w è Ww 15 ALTRE METODICHE IMPIEGATE IN PARASSITOLOGIA VETERINARIA 19 PFGE - 9ULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS 19 SONDE MOLECOLARI 19 DB - Lor BLor 20 SSCP — QNGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM 20 CLONAGGIO 21 IMPIEGO DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLA DIAGNOSI DELLE MALATTIE PARASSITARIE 24 INFEZIONI DA PROTOZOI 24 INFESTAZIONI DA PLATELMINTI 26 INFESTAZIONI DA NEMATODI 27 TASSONOMIA E SISTEMATICA 28 SVILUPPO DI VACCINI RICOMBINANTI 28 DEFINIZIONE DEI PROCESSI EVOLUTIVI A LIVELLO MOLECOLARE: STUDI FILOGENETICI 29 GLOSSARIO 31 APPROFONDIMENTI CONSIGLIATI 33 SD ‘www.bariparasitology.it DD L’RNA: Struttura e Funzioni L’RNA (acido ribonucleico), rispetto al DNA, presenta 2 principali differenze: Lo zucchero è il ribosio; AI posto della timina c'è l’uracile (base pirimidinica) che si lega con l’adenina (base purinica). Si conoscono tre tipi di RNA: I’RNA messaggero (mRNA): trasferisce le informazioni dal DNA localizzato nel nucleo al citoplasma dove avviene la sintesi proteica; I'RNA transfer (RNA): recluta gli aminoacidi per inserirli nella proteina neosintetizzata che viene composta durante la sintesi proteica; I'PRNA ribosomiale (RNA): costituente principale dei ribosomi. I ribosomi sono i componenti essenziali nella sintesi proteica. Sono organelli cellulari costituiti da rRNA e proteine e sono formati da una subunità piccola 408 (*S” è l’unità di misura indicante la velocità di sedimentazione) e una subunità grande da 60S, che si possono unire per formare un unico complesso ad alto peso molecolare da 805. La subunità grande contiene gli rRNA 285, 5.85 e 58 oltre a circa 50 proteine, mentre la subunità piccola contiene IYRNA 188 e circa 30 proteine. Il DNA ribosomiale (rDNA): struttura e funzioni L':DNA codifica per le tre componenti strutturali dell’rRNA (188, 5.88, 288) che sono presenti nei ribosomi di tutti gli eucarioti. La sua funzione nei meccanismi biologici essenziali alla cellula fa si che la struttura dei geni dell'DNA sia, in alcune parti, altamente conservata in tutti i metazoi. Nella maggior parte degli eucarioti i geni dell’"DNA si presentano in sequenze ripetute ed il numero di copie varia a seconda dell'organismo; inoltre le diverse copie dell’rDNA possono essere presenti in più loci distinti oppure in un unico locus. All’interno di ogni unità di trascrizione sono presenti due principali regioni codificanti per le subunità 188 e 288 di rRNA e una regione più piccola codificante per la subunità 5.85. Inoltre vi è uno spazio di trascrizione interna (Intemal Transcribed Spacer- ITS) che prende il nome di ITS-1 (compreso tra le sequenze 18S e 5.88) e di ITS-2 (compreso tra le sequenze 5.8 e 285). vw ‘www.bariparasitology.it -600 bp Queste differenti regioni hanno un alto grado di variabilità intra- ed interspecifica: mentre le regioni 5.88, 188 e 28S (codificanti) presentano sequenze altamente conservate, le regioni ITS-1 e ITS-2 (non codificanti) presentano un rilevante polimorfismo intra- e interspecifico: queste ultime regioni infatti sono excise dall’RNA in un processo di splicing post-trascrizionale e quindi, non codificando per un prodotto genico, sono soggette ad elevata variabilità di sequenza. Questa variabilità rende particolarmente interessante lo studio e la caratterizzazione molecolare di queste regioni per la differenziazione di specie di parassiti e per scopi evoluzionistici. Inoltre, la loro localizzazione tra regioni conservate (188 e 285) permette l’impiego di primers universali; aspetto utile quando si intraprendono ricerche di base. A causa della loro evidente divergenza evoluzionaria con un alto grado di variazioni intraspecifiche e intraindividuali le regioni ITS-1 e ITS-2 complicano l’impiego di tecniche di biologia molecolare per la diagnostica di specie, per cui per questo scopo si preferisce l'impiego di regioni maggiormente conservate (ad esempio di rDNA). AI contrario, la caratterizzazione molecolare dell’ITS1 e dell'ITS2 può rivelarsi molto utile negli studi di genetica di popolazione. Infatti, talvolta alcune popolazioni parassitarie mostrano eterogeneità elevata in sequenza e/o lunghezza, che riflette “variazioni di popolazione”. 6 ‘www.bariparasitology.it Il DNA Mitocondriale (mtDNA): Struttura e Funzioni Il miDNA è presente all’intemo dei mitocondri, organuli deputati alla fosforilazione ossidativa (i.e. insieme di reazioni biochimiche che producono energia sotto forma di ATP). In ogni mitocondrio si trovano da 2 a 10 copie di mDNA. Il miDNA differisce strutturalmente dal DNA nucleare in quanto è formato da una singola macromolecola circolare della lunghezza di circa 16.5 Kb (1 Kb:1000 bp). Comprende circa 37 geni (il numero di geni è variabile a seconda delle specie): - 22 geni codificano per i RNA; - 2 geni codificano per gli RNA; - 13 geni codificano per i complessi enzimatici che partecipano alla fosforilazione ossidativa (in particolare la Citocromo Ossidasi I e la ID): Il mtDNA è formato da 2 filamenti: strand H (da “Heavy” = pesante) che comprende 28 dei 37 geni mitocondriali e strand L (da “Light” = leggero) che comprende i rimanenti 9. L'unica sequenza (circa 1Kb) non codificante è detta D -Loop (o Control Region - CR) nei vertebrati, AT-Rich Region (talora detta CR) negli insetti. La presenza della catena di trasporto degli elettroni con la sua capacità di produrre radicali liberi e la presenza di limitati sistemi di difesa, rendono il DNA mitocondriale facilmente danneggiabile: con un tasso di mutazione di circa 10 volte maggiore di quello nucleare. Ciò fa sì che le diverse copie di mIDNA possano differire tra loro anche all'inemo di uno stesso individuo fermo restando che essendo di derivazione matemna non ci sono crossing-over tra gli stessi. Il miDNA si presta molto bene a studi di biologia molecolare: è facile da isolare ed è presente in alto numero di copie. In particolare è stato ben caratterizzato soprattutto il gene codificante per la 7 ‘www.bariparasitology.it La PCR è estremamente specifica e sensibile: permette, infatti, l'amplificazione e l'identificazione di tratti genomici propri di un determinato agente patogeno (alta specificità) anche a partire da campioni biologici contenenti un numero esiguo di molecole bersaglio (alta sensibilità). Il substrato per l'amplificazione (template) è rappresentato da un frammento di DNA a doppia catena (@SDNA). Le metodiche attuali consentono di amplificare regioni di DNA lunghe fino a 10 Kb a partire da una concentrazione iniziale di 1 nanogrammo di DNA. La PCR consente di amplificare sequenze di DNA provenienti sia da organismi unicellulari che da cellule aploidi o diploidi di organismi pluricellulari. È possibile amplificare il DNA anche se non è chimicamente puro, fermo restando l’assenza di inibitori della reazione. Risultati attendibili possono ottenersi impiegando la PCR anche su campioni contenenti DNA degradato come tessuti fissati in formalina o conservati in paraffina. I migliori risultati ovviamente si ottengono con campioni contenenti DNA integro, la cui presenza fomisce un template di qualità idonea per una PCR attendibile. La PCR si basa sul susseguirsi di 3 reazioni che avvengono a diverse temperature nella stessa provetta, con reagenti termostabili. Il volume totale della reazione nella provetta è di 25-100u1: in aggiunta al campione (template) la PCR necessita di una DNA polimerasi, di 2 primers specifici, di oligonucleotidi (ANTP®), di un sistema buffer (Tris-HCI e MgCIL), e di acqua bidistillata per portare a volume. La DNA polimerasi che si utilizza correntemente è la Dna Polimerasi 7rag, enzima termo-resistente isolato dal batterio Yhermophilus aquaticus. I primers forward e reverse, generalmente di lunghezza compresa tra 18 e 25 bp, dovrebbero avere un contenuto di G+C non inferiore al 50-60% e non devono essere formati da basi complementari per evitare che si appaino (dimerizzino) tra loro. Essi vengono sintetizzati da ditte specializzate in base alla sequenza di DNA alla quale si devono appaiare: il forward ha una sequenza identica alla sequenza 5°-3° del DNA template, mentre il reverse presenta una sequenza complementare (cioè è costituito da una sequenza di basi nucleotidiche complementari a quelle della sequenza target e con una direzione opposta, ad es. la seq. del primer reverse CGGTCAAGTO si appaia alla seq. del DNA template GACTTGACCG). Ldeossiribonucleotidi trifosfati (ANTPs) fomiscono le basi azotate per la sintesi del DNA. Il buffer di reazione è composto da Tris - HCI e da MgCI2: il Tris - HCI tampona il pH della soluzione, mentre gli ioni Mg” sono cofattori fondamentali per l’attività della polimerasi. Per ogni ciclo si susseguono 3 reazioni: Denaturazione del template: avviene a 92-96°C per 1’, temperatura in grado di rompere i legami idrogeno che uniscono le due eliche del DNA. Se il filamento di DNA è particolarmente ricco di G+C può essere necessaria l'aggiunta di glicerolo ed un incremento del tempo di denaturazione. 10 www.bariparasitology.it Ibridazione o annealing: avviene solitamente a 50-60°C per 20”-1'. Ciascun primer si appaia all’estremità 3” del filamento del DNA template, definendo così il tratto di DNA da amplificare. Estensione: avviene a 72°C per un tempo variabile in base alla lunghezza del frammento da amplificare: generalmente va da un minimo di 30°” fino a 1-2°. La DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA in direzione 5°-3° a partire dall’estremità libera del primer appaiato alla sequenza bersaglio: il DNA di nuova sintesi risulta essere complementare alla sequenza del filamento denaturato. Le 3 reazioni si susseguono in un numero variabile di cicli (generalmente 30-35) all'interno della stessa provetta, I cicli di amplificazione sono automatizzati ed avvengono in uno strumento detto termociclizzatore: Sequenceto 5 7 ODIIIIZINZIA ampli pr] Heat to separato $ Cooladd primers cari 5 + 3700000 € Y Asd Ta potimeraso = + n — ——_ } Hal to separati Cool add primere From these, get 3 e EEEEEEZSI = ———gpamplfications afthe specific sm 3 (9101 Sequence u ‘www.bariparasitology.it Poiché il DNA sintetizzato in ogni ciclo funge da stampo per la sintesi del cielo successivo, la successione dei cicli comporta un aumento esponenziale del numero di copie di DNA: ad esempio, 20 cicli comportano un’amplificazione di circa un milione di volte. Il DNA amplificato viene sottoposto a “corsa elettroforetica” (60-100 V) in gel di agarosio (1 - 2% di agarosio in tampone TBE): il DNA carico negativamente per la presenza dei gruppi fosfato migra dal polo negativo al polo positivo. Successivamente il gel viene immerso e colorato in una soluzione di etidio bromuro che si interpone fra le eliche del DNA e lo rende fluorescente ai raggi UV di un transilluminatore. Per esempio nella figura riportata di seguito si osserva la corsa su gel di agarosio (1.4% di prodotti di amplificazione. La prima “lane” 0 “pozzetto” a sinistra contiene il marker (cioè un DNA costituito da frammenti di peso molecolare noto), che consente di determinare la lunghezza (espressa in base pairs - bp) del frammento di DNA che si ottiene dall’amplificazione. Una maggiore intensità della banda di DNA è indice di una maggiore quantità dello stesso (espressa in nanogrammi - ng). Sequenziamento ed analisi di sequenza Il sequenziamento del DNA consiste in una reazione di PCR modificata in cui viene inserito un reagente in più, cioè una miscela di 4 terminatori marcati con quattro diversi fluorocromi e il cui template è rappresentato dal prodotto di PCR purificato. Un terminatore è un di-deossi-nucleotide (dANTP), cioè un nucleotide con un atomo di ossigeno in meno in posizione 3°. 12 ‘www.bariparasitology.it ALTRE METODICHE DI PCR IMPIEGATE NELLA PARASSITOLOGIA VETERINARIA Le reazioni di amplificazione messe a punto per la diagnosi delle malattie parassitarie utilizzano come bersaglio sequenze di DNA parassita-specifiche appartenenti a geni codificanti per proteine di superficie, antigeni somatici, prodotti enzimatici ovvero sequenze appartenenti al rDNA. A seconda del template, possono essere usati primers altamente conservati (come nel caso del DNA) oppure primers disegnati su sequenze codificanti specie-specifiche. In campo medico umano e veterinario la PCR viene impiegata per lo studio di alterazioni genetiche e per la diagnosi molecolare utilizzando come template: - sequenze alterate che possono indurre malattie neoplastiche e/o malattie genetiche; - sequenze non patologiche che possono essere impiegate per studi di genetica delle popolazioni e nell’ambito della medicina legale. Nel campo della parassitologia veterinaria, la PCR viene utilizzata nell’identificazione dei parassiti, nell’epidemiologia e nella diagnosi delle malattie, nello studio della farmacoresistenza e dei geni che codificano per proteine impiegate nei vaccini e negli studi di sistematica. L'applicazione della PCR in parassitologia non è però scevra da problemi ed inconvenienti; nonostante il template sia ottenibile da uova, larve ed adulti, non è sempre facile ricavare DNA puro ed in quantità sufficiente. Questo è dovuto alla spessa cuticola esterna dei parassiti ed alla precipitazione di flocculi polisaccaridici durante l’estrazione del DNA, in grado di inibire l'amplificazione enzimatica. La scelta del template dipende dallo scopo che si vuol perseguire. Ad esempio, gli introni e le regioni non codificanti sono, rispetto alle regioni codificanti, più soggette nel tempo a subire mutazioni; viceversa, geni associati a particolari finzioni sono scarsamente soggetti a subire mutazioni spontanee, in quanto sovente correlati alla sopravvivenza dell'organismo. Se l'utilizzo della PCR è mirato all’identificazione di specie, il template deve presentare variazioni intraspecifiche significativamente inferiori rispetto alle variazioni interspecifiche. Se il template deve avere markers per l’identificazione dei diversi ceppi, deve esserci un significativo livello di variazioni di sequenze fra le specie oggetto di studio. Il DNA ribosomiale (DNA) è un target impiegato per l’identificazione di specie e/o di markers ceppo specifici: le sequenze di DNA presentano omogeneità elevata soprattutto intraspecifica piuttosto che interspecifica. Una volta individuato il template, se non sono disponibili dati in bibliografia, è necessario disegnare i primers specifici, in senso 5°>3°. I primers oligonucleotidici sono disegnati su regioni di DNA specie - specifiche e vengono utilizzati a scopi diagnostici. Alcune sequenze dell'rDNA sono utilizzabili a scopi identificativi e diagnostici. Per la caratterizzazione dell':DNA e del miDNA, è 15 www.bariparasitology.it possibile utilizzare primers altamente conservati, specifici per le sequenze di un certo numero di parassiti o per intere popolazioni parassitarie. I più importanti tipi di PCR sono di seguito elencati: La nested - PCR è basata su due reazioni di amplificazione consecutive: la seconda amplificazione è effettuata mediante una coppia di primers più interni rispetto ai primers della prima reazione. La seconda coppia produce così un amplificato (di dimensioni inferiori) d'alto valore diagnostico, ma solo se il risultato della prima amplificazione è specifico. La multiplex - PCR prevede invece l'utilizzo simultaneo di due o più coppie di primers che amplificano due o più tratti di DNA bersaglio appartenenti allo stesso parassita od a parassiti differenti. La PCR può essere usata come metodica a se stante oppure può essere associata a tecniche più complesse. Nella PCR - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) l'amplificazione mediante PCR è seguita da digestione con le endonucleasi (enzimi di restrizione, es. Hinf, Hind II, Hinc II, EcoRI, Nsp I) in grado di tagliare il DNA in siti specifici detti “siti di restrizione”, dando origine a segmenti di DNA di lunghezza caratteristiche che fingono da markers genetici specie- specifici. Il taglio degli enzimi di restrizione può essere di 2 tipi e può generare estremità sfalsate “sticky ends” o piatte “blunt ends”: EcORI sito di taglio 57---G|,AATTC---3” 3/---CeTTAA|G---5” CII sito di taglio 57---GT Py|PuAC---37 37---CAPuPy TG---5” NspI sito di taglio 57---PuCAT G|py---3/ 3/---Py|,GTACPu---5” 16 www.bariparasitology.it La RFLP di amplificati ottenuti con la PCR permette l'identificazione di parassiti (particolarmente impiegata per gli elminti) tassonomicamente vicini e simili morfologicamente, in quanto consente di rilevare anche lievi variazioni (polimorfismi) nel tratto di DNA amplificato. L’AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) è stata applicata per identificare variazione genetiche di piante, funghi, animali e batteri e per la diagnosi di patologie, in medicina legale ed in genealogia. Il metodo si basa sull’uso di enzimi di restrizione per la digestione del DNA genomico, seguito dal legame di * dei frammenti di restrizione. I adattatori complementari al doppio filamento all'estremità 3°- diversi frammenti di restrizione vengono poi amplificati usando due primers complementari agli adattatori e poi sono visualizzati su gel di poliacrilammide. L’AFLP ha la capacità di individuare simultaneamente vari polimorfismi in differenti regioni genomiche, ha un'alta sensibilità e riproducibilità, ha la capacità di amplificare tra 0 e 100 frammenti alla volta e non necessita di conoscere la sequenza da esaminare dato che vengono utilizzati enzimi di restrizione “universali”, cioè in grado di tagliare qualsiasi DNA genomico. Una limitazione potrebbe essere dovuta al fatto che viene realizzata in tempi piuttosto lunghi o per l’alto livello di variazioni individuate, quindi può essere di difficile interpretazione. La RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ovvero l'amplificazione random di sequenze anonime di DNA, utilizza brevi sequenze oligonucleotidiche come innesco per la Taq polimerasi. La reazione viene effettuata in condizioni di bassa stringenza, cioè ad una temperatura di appaiamento del primer molto bassa. In tal modo i primers possono appaiarsi anche a sequenze di DNA non esattamente complementari alla propria e possono perciò innescare la reazione di polimerizzazione da parte della Taq polimerasi in più punti del genoma bersaglio. In questo modo alla fine della reazione di amplificazione si otterrà non un singolo frammento amplificato, ma una serie di frammenti il cui numero e la cui lunghezza varierà da ceppo a ceppo. La RAPD è semplice e veloce, ma non offte riproducibilità pari a quella della PCR standard. Il pattem di bande prodotte può essere influenzato da diversi fattori quali, la qualità del DNA, la specificità dei primers, la concentrazione del template, la co-migrazione in gel di agarosio di frammenti non-omologhi (cioè della stessa lunghezza ma di sequenza diversa) e l’uso di differenti termociclizzatori determinando, quindi, una scarsa riproducibilità. Nonostante queste limitazioni, diversi studi hanno mostrato che la RAPD può essere utilizzata per l’identificazione e la differenziazione di specie e ceppi di un range di parassiti, includendo protozoi e elminti. Nel corso degli anni tramite la RAPD si è ottenuta la definizione di markers specifici per una ampia gamma di ceppi e specie di parassiti protozoi e metazoi. La Reverse Line Blot (RLB) è una metodica che si basa sull’appaiamento di sonde specifiche con dei prodotti di PCR. Il metodo consente, in un singolo saggio, di ibridare i campioni con diverse sonde oligonucleotidiche senza l’impiego di sostanze radioattive. Le sonde vengono legate 17 www.bariparasitology.it In parassitologia veterinaria, le sonde sono utilizzabili per la diagnosi di malattie che si presentano con sintomatologia spesso simile, come ad esempio la Babesiosi, la Theileriosi e l’Anaplasmosi dei bovini. DB- Dot Blot Il Dot Blot è una metodica in cui le sonde molecolari sono messe a contatto diretto con il campione biologico in esame. Il Dot Blot può essere utilizzato sia su campioni di DNA sia su campioni di RNA. In entrambi i casi, gli acidi nucleici del campione di partenza vengono filtrati sottovuoto direttamente sulla membrana, la quale viene esposta alla sonda marcata radioattivamente. Un'eventuale ibridazione viene quindi determinata tramite autoradiografia. Il dot blot permette una maggiore velocità d'esecuzione e la contemporanea analisi di un maggior numero di campioni. Questa è una metodica soprattutto quantitativa che permette di determinare, per esempio, il numero di copie di un certo gene presenti in un determinato genoma o la quantità di un certo RNA cellulare. SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism La SSCP sfrutta la separazione elettroforetica della singola elica di DNA che, in assenza della complementare, è altamente instabile ed assume particolari conformazioni tridimensionali a seconda della composizione in basi (basi diverse conferiscono una diversa struttura secondaria e quindi una differente mobilità elettroforetica). In questo modo è possibile discriminare filamenti di DNA che differiscono anche per una sola base. Per una risoluzione ottimale si processano frammenti lunghi 150 - 300 bp. Nella doppia elica, invece, la mobilità dipende dalla lunghezza del frammento e non dalla composizione in basi. 20 www.bariparasitology.it Clonaggio Per clonaggio si intende creare ‘copie identiche’ (& CLONI) di un frammento di DNA che possono essere sfruttate per sintetizzare artificialmente delle proteine (insulina, aldosterone etc.). Il frammento di DNA da clonare viene isolato e tagliato con un opportuno enzima di restrizione. Il gene isolato viene inserito in un vettore di clonaggio, cioè una molecola di DNA naturale o artificiale: un plasmide, un cosmide o, nel caso di clonaggio di un frammento più grande, un BAC (cromosoma artificiale batterico), un PAC (cromosoma artificiale plasmidico) o uno YAC (cromosoma artificiale di lievito). Questi vettori si diversificano principalmente in base alle dimensioni del frammento da clonare: Plasmidi: 0.1 — 10Kb Fagi: 8-22Kb Cosmidi: 32 - 45 Kb BAC e PAC: 75 - 300 Kb YAC: 100 - 2000 Kb Un vettore di clonaggio deve avere determinate caratteristiche: - siti unici di restrizione vicini o all’intemo di marker genetici la cui espressione viene alterata dall’inserzione di DNA estraneo; - un'origine di replicazione “ori” a partire dalla quale si replica tutta la molecola di DNA (sia quella inserita sia quella del vettore) all’inteno della cellula ospite; - un marcatore (generalmente un fattore di resistenza ad un antibiotico, come l’ampicillina) che consente successivamente la selezione, su opportuni terreni di crescita, delle cellule che hanno acquisito il frammento. Amp VETTORE DI CLONAGGIO 2 www.bariparasitology.it Il vettore di clonaggio deve essere digerito con lo stesso enzima utilizzato per il frammento di DNA da clonare (in modo da produrre delle estremità complementari). L’inserzione del frammento nel vettore avviene mediante gli enzimi topoisomerasi e ligasi producendo un “vettore ricombinante” o “molecola chimerica”. Per clonare un gene dobbiamo quindi inserirlo in un vettore di clonaggio ed introdurre il “costrutto” risultante in un ospite capace di replicarlo. Le cellule ospiti nelle quali si inserisce il vettore ricombinante sono cellule batteriche, batteriofagi o fagi e vengono trasformate o trasfettate per consentire l'assorbimento del vettore: & = Queste cellule vengono poi coltivate su opportuni terreni selettivi al fine di selezionare solo quelle contenenti il costrutto. 0000 Sr Pisemid vectors T tragments t0 be clonedì 0000 I Transform E. coli cells wi d ‘www.bariparasitology.it modesta. Per la sua importanza come agente zoonosico, negli ultimi anni l’attenzione dei ricercatori si è rivolta soprattutto a Toxoplasma gondii: per la diagnosi di Toxoplasmosi nell’uomo sono state allestite reazioni di PCR i cui risultati vanno sempre messi in correlazione con i dati clinici, sierologici ed, eventualmente, immunoistochimici in quanto la positività potrebbe essere correlabile ad uno stato di premunizione per infezioni pregresse. In medicina veterinaria 7. gondii, come causa di aborto nei piccoli ruminanti, è stato studiato tramite nested-PCR e reazioni di PCR in grado di individuare il protozoo nel cervello, nella placenta e nei cotiledoni dei feti abortiti. Con la PCR è possibile anche individuare 7 gondii in campioni biologici di cani e gatti: umore acqueo, liquido cerebrospinale, sangue. Anche la diagnosi di Neosporosi può essere conseguita mediante la PCR. Inoltre, poiché 7. gondii e Neospora canimum non sono ben distinguibili morfologicamente e vi può essere cross-reattività all'esame sierologico, la PCR che consente di ricercare entrambi i protozoi contemporaneamente distinguendoli. La diagnosi di Babesiosi e Theileriosi si consegue con l'osservazione al microscopio ottico di strisci di sangue (Babesia) o di biopsie linfonodali (Theileria), colorati con il metodo di Giemsa e MayGrunwald-Giemsa. Tuttavia, la diagnosi di certezza e l’identificazione della specie parassitaria responsabile possono presentare notevoli difficoltà; ad esempio gli animali che superano la fase acuta divengono portatori asintomatici di un numero molto scarso di parassiti che non è possibile individuare con l'osservazione microscopica. L'attenzione della comunità scientifica si è rivolta soprattutto alla Babesiosi dei bovini (le specie più importanti sono 8. bovis e B. bigemina) e degli equini (8. equi e B. caballi) e alla Theileriosi dei bovini (le specie più importanti sono 7° ammulata e T: parva). Sono state messe a punto reazioni di multiplex-PCR in grado di individuare contemporaneamente 8. bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale, diagnosi che può essere perfezionata dall’applicazione del dot-blot. Reazioni di PCR sono utilizzabili per la diagnosi delle infezioni sostenute da 7° anmulata, da T. parva e da entrambe le specie. E' stata disegnata una sonda B. bovis-specifica in grado di individuare il protozoo nel sangue intero con sensibilità molto alta; sono state disegnate sonde specifiche per l’identificazione contemporanea di sei specie di Theileria mentre è stata messa a punto una RLB in grado di esaminare molti campioni per individuare contemporaneamente tutte le specie di Babesia e Theileria dei bovini. Per quanto riguarda la Babesiosi degli equini, in molti Paesi Europei, il test ufficiale è la FdC, caratterizzata però da bassa sensibilità. La PCR è in grado di individuare i cavalli infetti che risultano negativi ai test sierologici. La diagnosi di Criptosporidiosi si effettua tramite l'osservazione (a forte ingrandimento) al microscopio ottico di strisci fecali colorati con il metodo di Machiavello, di Ziehl-Neelsen 0 di Giemsa ovvero con la sedimentazione, previa concentrazione con soluzione di Telemann. Sono utilizzabili anche l’ELISA e l’IF, che però non consentono l’identificazione di specie. Con l'osservazione diretta si può formulare diagnosi di 25 www.bariparasitology.it certezza solo nei casi di infezioni acute, in cui si ritrovano numerose oocisti o sporocisti, fino a 500.000/gr. Anche l’ELISA e l’IF sono attendibili solo se effettuate con infezione acuta in atto. La PCR presenta sensibilità molto elevata (fino a 80-90 forme cistiche/gr.), permettendo quindi di individuare anche i soggetti eliminatori asintomatici. L'applicazione della PCR nella diagnosi delle infezioni da Cryptosporidium è molto importante anche in medicina umana per le implicazioni di questa patologia come zoonosi: sono state, infatti, messe a punto PCR in grado di differenziare gli stipiti umani e animali di Crypfosporidium parvum e Cryptosporidium da Cyclospora, che sono protozoi con diversa sensibilità ai farmaci. La diagnosi di Giardiosi si può conseguire con l'osservazione diretta al microscopio di strisci di materiale fecale o di campioni arricchiti con ZnSO;, colorati con liquido di Lugol. A causa dell’eliminazione irregolare di cisti è però necessario effettuare la ricerca nelle feci per tre gg. consecutivi (infatti un solo esame può permettere di individuare solo il 50% dei campioni positivi). E' stato inoltre dimostrato che l’IF e l’ELISA, test spesso utilizzati, possono dare risultati falsi negativi (bassa sensibilità) e falsi positivi (bassa specificità). La PCR è in grado di individuare ed amplificare tratti di DNA Giardia-specifici, distinguendo anche ceppi patogeni ed apatogeni e cisti vitali e non vitali. La ricerca di cisti e trofozoiti di Entamoeba Ipstolitica è possibile sia con l'osservazione al microscopio di strisci fecali colorati con Fe- ematossilina sia con esami colturali. Per la diagnosi possono essere utilizzate anche l’ELISA e la FdC. La PCR è in grado di individuare E. /nstolifica distinguendo anche in questo caso ceppi patogeni da ceppi apatogeni. La diagnosi di Coccidiosi aviare si consegue con l'esame microscopico delle feci, per evidenziare le oocisti o con l'esame del raschiato della mucosa intestinale, per individuare gli schizonti. Per le differenze patogenetiche che caratterizzano le diverse specie di coccidi, é spesso necessario ottenere l’identificazione di specie e non sempre le differenze morfologiche (forma e dimensioni), sono ben individuabili. E possibile utilizzare la RAPD, dotata di elevata sensibilità e specificità, in grado di rilevare e differenziare otto specie di Fimeria dei polli. Infestazioni da Platelminti Le forme larvali di Echinococcus nultilocularis multilocularis e di E. gramulosus gramulosus, cestodi che hanno come ospiti definitivi i canidi (cane, volpe, lupo), possono infettare l’uomo con conseguenze spesso fatali; è pertanto di fondamentale importanza la prevenzione di queste infezioni e quindi l’identificazione degli animali parassitati. Tuttavia la diagnosi di infezione da Echinococcus spp. nell’ospite definitivo non è sempre agevole: infatti, per le ridotte dimensioni delle proglottidi, anche infezioni massive possono passare inosservate, le uova non sono differenziabili da quelle di 6 www.bariparasitology.it altri cestodi e le tecniche immunodiagnostiche nonostante possiedano una buona sensibilità, sono spesso aspecifiche. Per la diagnosi di infezione da E. multilocularis multilocularis questi ostacoli sono superabili mediante la PCR, che è in grado di individuare un solo uovo in 4 gr. di feci oppure tramite la nested-PCR molto sensibile e specifica Mediante PCR-RFLP e RAPD è possibile differenziare E. gramulosus granulosus da Echinococcus spp., distinguendone anche i diversi ceppi. È stata disegnata una sonda specifica per Taensa solium, che consente di distinguere le uova da quelle di T. saginata, identiche morfologicamente. La diagnostica molecolare ha trovato applicazione anche nello studio di alcune infestazioni da Trematodi: con la RAPD è possibile, ad esempio, identificare le diverse specie di Schistosoma. Infestazioni da Nematodi La diagnosi di Strongilosi gastrointestinale dei ruminanti e di Strongilosi intestinale degli equini si consegue di norma con l’esame microscopico di campioni fecali, previa flottazione. Le uova degli strongili non sono però distinguibili morfologicamente le une dalle altre (ad eccezione di quelle di Nematodirus spp., che sono notevolmente più grandi di quelle di altri strongilidi): per V’identificazione di specie è necessario ricorrere a prove colturali. La biologia molecolare consente di identificare le specie di nematodi Strongylida lavorando anche su un singolo uovo. Oggetto di studio approfondito è stata l’identificazione dei tricostrongilidi, mediante RAPD e PCR-RFLP. Ad esempio la PCR consente di differenziare le uova di Ostertagia ostertagi da quelle degli altri nematodi gastrointestinali dei bovini, di identificare, e quindi di distinguere, Haemonchus contortus e Trichostrongylus columbriformis e di individuare i ceppi di Teladorsagia circumcinta resistenti o suscettibili ai benzimidazolici. Sono state disegnate sonde che differenziano tre specie del genere Haemonchus. La PCR-RFLP permette di identificare 22 specie di strongilidi di bovini, ovini, caprini e suini. L'identificazione degli strongili e dei piccoli strongili (small strongles) degli equini è possibile con PCR-RFLP applicata su sequenze dell’"DNA di qualunque stadio parassitario (adulto, larva, uovo) ovvero con l'amplificazione e il sequenziamento di tratti di rDNA , che sono stati caratterizzati per 28 diverse specie. La diagnosi di Filariosi cardiopolmonare e sottocutanea dei piccoli animali si consegue con diverse metodiche basate sul rilievo di microfilarie nel sangue. Tuttavia, se la microfilariemia è bassa, non è sempre possibile individuare le larve e, inoltre, per identificare con precisione la specie del parassita può essere necessario ricorrere a particolari accorgimenti (es., test della fosfatasi acida). La PCR è in grado di individuare una singola microfilaria in un campione ematico, distinguendone anche la specie (Dirofilaria immitis, D. repens). 27 www.bariparasitology.it a) b) a) b) Numerosi metodi sono stati proposti per la determinazione degli alberi filogenetici; essi possono essere classificati in due soli tipi principali: metodo di massima parsimonia (metodo direttamente basato sulle sequenze) metodi basati su matrici di distanza (UPGMA; NI; metodi indirettamente basati sulle sequenze) Metodo di Massima Parsimonia: Questo metodo è stato introdotto per l’analisi delle sequenze aminoacidiche da Eck e Dayhoff (1966) ma può essere usato per l’analisi delle sequenze nucleotidiche (Fitch, 1977). Il principio della massima parsimonia consite nella identificazione dell’albero filogenetico che richiede il minor numero possibile di sostituzioni che spieghino le differenze tra le untià tassonomiche in esame. Il metodo della massima parsimonia è un metodo essenzialmente qualitativo in quanto consente la determinazione della topologia dell’albero che descrive le relazioni filogenetiche tra le sequenze omologhe in esame. Metodi basati su matrice di Distanza (UPGMA (Sokal e Michener, 1958) e NJ (Saitou e Nei, 1987): la distanza evolutiva (solitamente il numero di sostituzioni nueleotidiche e aminoacidiche calcolate con metodi appropriati a partire dai valori osservati in modo da considerare le sostituzioni multiple o convergenti) viene determinate tra tutte le possibili coppie di unità tassonomiche. La matrice delle distanze risultante viene successivamente utilizzata per la determinazione dell’albero filogenetico. Fondamentale per tutti i metodi è la valutazione statistica degli alberi filogenetici ottenuti. L’accuratezza è strettamente dipendente dall’allineamento multiplo di sequenze considerate e da alcune tecniche di campionamento che permettono di testare la topologia dell’albero filogenetico, infatti, al fine di valutare la significatività delle misure effettuate per mezzo dei vari metodi per lo studio dell'evoluzione molecolare viene solitamente utilizzata la metodologia di simulazione denominata Bootstrap (Felsenstein, 1985): nel caso dell'analisi di sequenze, consiste nell’estrarre colonne da un campione di sequenze allineate, con reinserimento dei dati estratti, fino ad ottenere un set di dati della stessa dimensione di quello originale. Generalmente vengono considerati significativi solo valori di bootstrap superiori al 50%. 30 www.bariparasitology.it GLOSSARIO AMPLIFICAZIONE: aumento del numero di copie di una sequenza di DNA. APPAIAMENTO: formazione di legami idrogeno fra due sequenze complementari di DNA con produzione di molecole a doppio filamento. COPPIA DI BASI (bp): due basi azotate legate in un doppio filamento di DNA in modo complementare (Adenina-Timina, Guanina-Citosina). DENATURAZIONE DEL DNA: rottura dei legami idrogeno esistenti tra le coppie di basi azotate. DNA (acido desossiribonucleico): acido organico, formato da due filamenti a doppia elica, composti da unità costitutive dette nucleotidi. I due filamenti sono uniti da legami idrogeno che si formano tra le basi azotate. DNA RIBOSOMIALE (DNA): insieme dei geni codificanti per l’RNA costituente i ribosomi GRNA). ENZIMI DI RESTRIZIONE (endonucleasi): enzimi in grado di tagliare gli acidi nucleici in siti specifici. GENE: segmento di DNA codificante per uno o più prodotti biologici funzionali o strutturali (proteine). GENOMA: patrimonio genetico di un organismo, contenente le informazioni necessarie per lo svolgimento dei meccanismi biochimici della vita. IBRIDAZIONE: formazione di legami idrogeno fra sequenze complementari di DNA e RNA con formazione di tratti a doppio filamento. MARKER GENETICO: combinazione di basi azotate (sequenza di DNA) specie-specifica, individuabile con le tecniche di biologia molecolare. NUCLEOTIDE: singolo elemento costitutivo del DNA e dell’RNA, formato da una base azotata, uno zucchero a cinque atomi di carbonio e da un gruppo fosfato. PRIMER: singolo filamento di DNA, formato da 18-25 basi, complementare ad una delle estremità di un tratto di DNA che viene replicato in vitro mediante PCR. REPLICAZIONE: formazione, a partire da una singola molecola di DNA, di due molecole identiche fra loro ed alla molecola parentale. RNA (acido ribonucleico): acido organico, a singolo filamento, composto da unità costitutive, dette nucleotidi. SEQUENZA: insieme di basi azotate che si susseguono in un ordine specifico per ogni tratto di DNA. 31 www.bariparasitology.it SEQUENZA CODIFICANTE: tratto di DNA contenente le informazioni necessarie per la sintesi di un prodotto biologico. SEQUENZA NON CODIFICANTE: tratto di DNA, coinvolto in meccanismi regolatori, che non contiene informazioni per la sintesi di prodotti biologici funzionali. SEQUENZIAMENTO DEL DNA: determinazione della sequenza di un tratto di acido desossiribonucleico. SONDA: singolo filamento di DNA marcato radioattivamente ovvero con sostanze cromogene, in grado di appaiarsi solo con un tratto di DNA complementare. TEMPLATE: sequenza di acido nucleico che viene individuata per essere amplificata nel corso della PCR. 32 www.bariparasitology.it