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BIOLOGIA MOLECOLARE
Terza versione BIOLOGIA MOLECOLARE cea, f.amaldi, p. benedetti, g. pesole, p.plevani DNA nel nucleo cellula eucariotica DNA adeso alla parete nei procarioti DOGMA CENTRALE prevede che l’informazione fluisca dagli acidi nucleici alle proteine e non viceversa Il flusso di informazione procede soltanto in una direzione: dal dna all’rna, alle proteine DNA Dalla sua prima estrazione dalle bende sporche come nucleina, fino alla definizione di esso come materiale genetico universale e al chiarimento della sua struttura a doppia elica nel 1953 IL DNA E’ IL MATERIALE EREDITARIO: CIASCUN CROMOSOMA E’ UNA SINGOLA MOLECOLA DI DNA E I GENI SONO SEQUENZE DI DNA il dna non svolge un ruolo attivo In tutti gli organismi le basi dell’ereditarieta’ sono contenute nel GENOMA,una lunga sequenza di dna che fornisce la serie completa di informazioni ereditarie CROMOSOMA: unita’ discreta (modalita’ con la quale la cellula divide il dna nelle cellule figlie) del genoma, contenente molti geni e’ un'unica molecola duplex, e’ visibile come unita’ nella divisione cellulare GENE STRUTTURALE: gene che codifica un prodotto di RNA o un polipeptide che non e’ regolatore DNAsequenza di nucleotidi RNA sequenza di nucleotidi POLIPEPTIDE sequenza di amminoacidi IL DNA E’MATERIALE GENETICO DI BATTERI, VIRUS E CELLULE EUCARIOTICHE 1)Esperimento di Griffith Principio trasformante trasferimento di un componente dei batteri S patogeni permetteva ai batteri R non patogeni di costituire la parete polisaccaridica ed evadere la difesa immunitaria dell’ospite (proteina ?)
- Poi l’esperimento di Avery,Mcleod e Mccarty da la risposta finale e’ il dna il principio trasformante (solo il dna era in grado di operare la trasformazione) 3)Esperimento di Chase e Hershey usano il batteriofago e un isotopo radioattivo dello zolfo e del fosforo dimostrano che il materiale genetico di un virus che infetta i batteri (batteriofago T2) era il DNA STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI 1953 Watson e Crick si sono basati su: ▪ Analisi di diffrazione dei raggi X di Rosaline Franklin ▪ Struttura alfa elica delle proteine di Pauling ▪ Confutazione ipotesi tetranucleotide Levene
STRUTTURA DEL DNA
➢ E’ una lunghissima sequenza di coppie di basi organizzate in una struttura a doppia elica simile ad una scala a chiocciola ➢ Le basi sono disposte quasi perpendicolarmente rispetto all’asse della doppia elica ➢ Puo piegarsi e ruotare come un’elica, formare gobbe, arrotolare, inclinare,oscillare, allungare.. STRUTTURA PRIMARIA DNA= acido desossiribonucleico, deriva dalla denominazione di un acido riscontato nel timo di vitello RNA=acido ribonucleico, fu trovato nel lievito Gli acidi nucleici sono una lunga catena o polimero di subunita’ ripetitive, chiamate NUCLEOTIDI
- Zuccheri a cinque atomi di carbonio
- Basi azotate NUCLEOTIDE
- Gruppo funzionale fosfato i nucleotidi usati per la sintesi del dna, sono TRIFOSFATI ZUCCHERI A 5 ATOMI DI CARBONIO Ribosio RNA Desossiribosio DNA Entrambi i pentosi hanno un ossigeno nell’anello,mentre il C 5 e’ fuori dall’anello si differenziano per la presenza del gruppo OH al C 2 del ribosio, assente nel desossiribosio (importante per la funzione) questo gruppo OH conferisce instabilita’ alle molecole di RNA il DNA ha un H in quella stessa posizione e quindi e’ piu stabile BASE AZOTATA
- Contengono azoto
- Hanno proprieta chimiche di una base sostanza che accetta uno ione H+ o un protoine Purine Adenina, guanina (due anelli, uno purinico e uno imidazolico) Pirimidine timina, citosina e uracile (rna) (struttura ad anello singolo) in posizione 5 nella timina c’e’ un gruppo metilico, nell’uracile no la citosina ha un NH2 nel C Nell’rna sono presenti numerose base modificate: INOSINA base che si trova nei ribonucleotidi, simile all’adenina ed e’ molto presente nell RNA transfer
POLINUCLEOTIDE: e’ una lunga catena di nucleotidi collegati zucchero- fosfato 5’-3’ che formano un’ossatura da cui sporgono le basi una estremita ha un gruppo P 5’libero una estremita ha un gruppo OH 3’ libero E’ acido dal al dna la carica negativa questa carica lo porta a rimanere nel nucleo ,perche’ c’e’ una repulsione di cariche negative con la membrana plasmatica I nucleotidi si uniscono a formare un polimero, sono legati da legami fosfodiesterici tra l’OH al 3’ e il gruppo fosfato legato al 5’ del nucleotide successivo ( 5’ – 3’) con liberazione di una molecola di PIROFOSFATO da questa impalcatura protrudono lateralmente le basi azotate si forma un impalcatura, uno scheletro, in cui si alternano zuccheri e gruppi fosfato (questa struttura va a comporre le assi della scala chioli) Le estremita’ della catena sono distinte e hanno proprieta’ chimiche diverse:
- 5’ e’ il C dello zucchero a cui e’ attaccato il Po
- 3’ e’ il C dello zucchero a cui e’ attaccato il gruppo funzionale OH Il filamento ha una polarita’: (5’3’) ▪ Da una parte c’e’ un nucleotide che ha il carbonio 5’ libero ( porta un gruppo fosfato), mentre il carbonio 3’ e’ impegnato nel legame fosfodiesterico con il nucleotide adiacente ▪ Dall’altra la molecola polimerica termina con un nucleotide che ha il carbonio 5’ impegnato nel legame fosfodiesterico con quello adiacente mentre il carbonio 3’ e’ libero (porta un gruppo OH) NOMI DERIVATI DALLE BASI del dna BASE NUCLEOSIDE NUCLEOTIDE Adenina 2’-deossiadenosina 2 - deossiadenosina 5 monofosfato Citosina 2 - deossicitidina “ Guanina 2 - deossiguanosina Timina 2 - deossitimidina “ LUNGHEZZA DEL DNA Per esprimere la lunghezza di una sequenza di acido nucleico si usa il numero dei nucleotidi o delle coppie di basi Un Dna puo’ raggiungere centinaia di milioni di nucleotidi Oligonucleotidibreve catena di DNA a singolo filamento
REGOLA DI CHARGAFF
- La percentuale di A e’ sempre uguale alla percentuale di T
- La percentuale di C e’ sempre uguale alla percentuale di G(A = T, C = G) STRUTTURA A DOPPIA ELICA ➢ 3,4 nm distanza delle basi ➢ 34 nm misura di un intero giro di elica che comprende 10,5 coppie di basi ➢ Diametro della molecola di DNA, 2 nm l’elica presenta un’ASIMMETRIA dovuta alla posizione delle molecole di desossiribosio ai lati delle basi, questa asimmetria genera due solchi di diverse dimensioni: Solco minore 12 A Solco maggiore 22 A: ha molti atomi che possono essere donatori o accettori di legami idrogeno L’alfa elica delle proteine ha la dimensione giusta per interagire con il solco maggiore Quasi tutte le proteine che si legano in modo specifico al DNA hanno domini ad alfa elica che riconoscono le sequenze esposte nel solco maggiore Entrambi sono molto importanti per il RICONOSCIMENTO DELLA SEQUENZA DEL DNA La molecola di DNA ha un peso molecolare molto alto la densita’suggerisce che l’elica contiene 2 catene polipeptidiche Il diametro costante rivela che le basi sono rivolte all’interno e che una purina e’ sempre appaiata con una pirimidina per questioni di spazio le due catene sono antiparallele le 2 catene polinucleotidiche sono appaiate tra loro secondo la REGOLA DELLA COMPLEMENTARIETA’ C + G (triplo legame H) tanto > saranno questi legami e maggiore stabilita’ avro’ A + T (doppio legame H) la stabilita’ della doppia elica e’ data anche dalla forza di repulsione dell’acqua MODELLO DI WATSON E CRICK
- Doppio filamento le basi complementari si trovano in filamenti opposti e sono legate da legami idrogeno
- La doppia elica del DNA ha una struttura regolare, destrosa
- Le basi azotate si legano tra di loro e evitano che la loro componente idrofobica sia esposta all’esterno a contatto con l’acqua, quindi e’ rivolta verso l’interno
- L’informazione del DNA e’doppia
▪ Dalla sequenza di nucleotidi nel DNA l’effetto idrofobico dipende dall’impilamento e quindi dalla Sovrapposizione di coppie di basi adiacenti quanto due coppie sono sovrapposte dipende dalla Particolare sequenza di nucleotidi A causa appunto delle interazioni di impilamento tra le basi e ai gradi di flessibilita’ che hanno i legami chimici dei nucleotidi, il parallelismo tra due coppie non e’ mai perfetto Questo impilamento impone uno scivolamento laterale (slide) di una coppia di basi rispetto all’altra o un avvitamento (twist). La soluzione prescelta dal DNA è la seconda. Le basi appaiate sono piatte e si impilano l’una sull’altra per mezzo di una torsione elicoidale (ogni base ruota 36 gradi intorno all’asse) Questo impilamento elimina lo spazio libero tra le basi escludendo l’acqua dall’interno della doppia elica Nucleo idrofobico: basi impilate
- Zuccheri e fosfati (idrosolubili) si orientano esternamente: i gruppi P polari interagiscono con l’ambiente polare
- L’energia dell’impilamento delle basi fornisce stabilità chimica alla doppia elica Gli orbitali π degli anelli aromatici delle basi tendono a formare legami deboli che stabilizzano l’elica. Esistono tre variazioni del parallelismo tra le basi:
- TWISTe’ l’angolo tra due coppie di nucleotidi rispetto all’asse della doppie elica
- ROLL inclinazione, dovuta alle forze di repulsione tra due coppie di nucleotidi
- TILT l’angolo che si forma rispetto all’asse dello scheletro zucchero-fosfato queste influenzano il DNA che puo’ diventare curvo in basi alla ripetizione di particolari sequenze inoltre grazie alla doppia elica, si ha una protetta conservazione dell’informazione genetica ed e’ possibile individuare e correggere errori e rotture che possono prodursi nel genoma SCANALATURA PRINCIPALE ❖ Scanalatura principale (solco maggiore) 22Å(2,2nm) ❖ scanalatura secondaria (solco minore) 12Å(1,2nm) La spaziatura zucchero-fosfato non è uniforme perché le eliche appaiate sono antiparallele Importante per interazioni sequenze specifiche DNA-proteine:
- gli atomi N e O delle basi sono accessibili, possono reagire con le catene laterali degli aa
- La maggior parte dei fattori di trascrizione si lega nella scanalatura principale I legami glicosidici non sono diametralmente opposti e ciascuna coppia di basi ha un lato più esteso che delimita il solco maggiore e un lato meno esteso che delimita il solco minore Questo crea una asimmetria.
TIPOLOGIA DI DNA
➢ DNA A
▪ Destroso ▪ Le coppie di basi hanno una maggiore angolatura e ce ne sono di piu’ a giro (11) ▪ non e’ presente in lunghe sezioni della cellula ▪ si riscontra nel DNA duplex in condizioni artificiale ii bassa umidita’ ma anche in vivo nei duplex di RNA e in eteroduplex di RNA/DNAduplex di DNA e RNA ▪ si forma se si riduce l’umidita’ relativa in cui si trova la fibra di DNA ➢ DNA B ▪ destroso, le basi sono quasi perpendicolari rispetto all’asse ▪ poiche’ l’interno della cellula e’ costituito di acqua e ha una concentrazione salina bassa e’ la forma predominante in vivo ▪ e’ una struttura media perche’ subisce variazioni ➢ DNA Z ▪ ha una struttura a zig zag ▪ e’ stabile in condizioni fisiologiche se si aggiungono gruppi metilici alle citosine ▪ e’presente in porzioni ricche in GC ▪ ha un ruolo nella regolazione di espressione genica e ci sono gruppi di proteine con cui Interagisce ▪ e’generato da un cambiamento di orientamento del legame glicosidico tra guanina e desossiribosio ▪ inoltre lo zucchero e la base si trovano in conformazione syn (mentre nel DNA B in “anti”) l’alternanza tra conformazioni anti e conformazioni syn di nucleotidi contigui causa l’andamento a zig zag DENATURAZIONE O FUSIONE REVERSIBILE DEL DNA E’ lo svolgimento e la separazione dei filamenti di dna. Si verifica quando si rompono i legami idrogeno in vivo avviene molto velocemente Puo essere indotta in vitro aumentando la temperaturai legami fosfodiesterici restano intatti con l’aumento dell’agitazione termica, si supera la forza dei legami idrogeno, delle interazioni idrofobiche e delle altre altre forze Aumenta l’assorbimento alla luce UV a 260 nm del 40% Le basi impilate fanno diminuire l’assorbanza (assorbanza data dall’anello aromatico delle base) Abbassando la temperatura il dna si rinatura si puo ibridare anche un dna di diversa fonte, ma complementare (sonde) se ce una porzione complementare due filamenti si possono appaiare anche se hanno origine diversa APPAIAMENTO BASI avviene sia nel DNA duplex che in interazioni intra e intermolecolari in RNA (o DNA) a singolo filamento.
❖ STRUTTURA CRUCIFORME
❖ STRUTTURA TRIPLA ELICA
1) SCIVOLATA
▪ si viene a creare quando sono presenti nel doppio filamento, delle sequenze (in tandem) ripetute brevi si puo creare un’ansa a singolo filamento di una unita’ contenente la sequenza ripetuta che viene compensata da un’analoga ansa nell’altra catena ▪ questi tratti sono siti di riconoscimento per le proteine ▪ nello studio del dna per trovare questi regioni si sono usate delle NUCLEASI che tagliano il dna nel legame fosfodiesterico (alcune tagliano internamente, altre esternamente ▪ le sequenze sono palindromi 2)CRUCIFORME ▪ quando ci sono sequenze ripetute e invertite , si formano appaiamenti intramolecolari e assume una struttura cruciforme Ripetizioni invertite : quando in un duplex di DNA o (RNA) sono presenti due copie della stessa sequenza in orientamento opposto se sono adiacenti sono detti PALINDROMI : sequenza di DNA duplex identica su entrambi i filamenti se letti nella stessa direzione 5’3’ ▪ quando si formando piccole bolle a singolo filamento causata da superavvolgimento negativo che puo essere stabilizzato da strutture cruciformi ▪ le sequenze ripetute appaiate intramolecolarmente costituiscono due “steli”, mentre le basi che separano le due sequenze ripetute formano due “anse” ▪ sono state trovate nei plasmidi e batteriofagi e possono formarsi durante replicazione e trascrizione STRUTTURA A FORCINA ▪ quando le sequenze ripetute si trovano nel dna a singolo filamento o nell’rna ▪ caratterizza per esempio l’rna transfer ▪ e’ formata da uno stelo a doppia elica e un’ansa a singolo filamento 3)TRIPLA ELICA
- si forma a livello di tratti di purina-pirimidina, dove sono presenti almeno 20-30 bp
- nel solco maggiore ci puo’ essere una terza catena polinucleotidica composta da pirimidine, complementare alla sequenza puriniche con cui interagisce
questa catena ha una polarita’ 5’3’ uguale a quella delle purine e quindi inversa rispetto alla sequenza pirimidinica della doppia elica in questo tratto le basi si affacciano verso l’interno Formando legami idrogeno detti di Hoogsten Le purine formeranno legami H sia con le pirimidine Del duplex sia con quelle della molecola extra
- e’ favorito dalla presenza di una simmetria ripetuta speculare
- in condizioni fisiologiche questo accoppiamento avviene facilmente tra A-T,ma avviene raramente perche le coppie G-C necessitano un protonamento a livello dell’azoto della citosina la troviamo nei telomeri ATASSIA DI FRIEDRICH ▪ Malattia rara, il deficit genetico comporta una perdita progressiva di coordinazione muscolare volontaria e ingrossamento del cuore ▪ E’ causato da un’espansione della tripletta, GAA, questa espansione e’ localizzata in una regione che solitamente non codifica (introne) ▪ Questo tratto ripetuto puo’ adottare conformazione a triplex e viene inibita la trascrizione della frataxina coinvolta nella regolazione del trasporto del ferro mitocondriale 4)DNA CURVO ▪ due coppie di basi che si susseguono non sono perfettamente parallele tra loro, ma fanno un piccolo angolo ▪ A:T adiacenti hanno tendenza a piegarsi verso il solco minore ▪ G:C adiacenti hanno tendenza a piegarsi verso il solco maggiore ▪ Queste deformazioni tendono ad elidesi,ma se piu A:T si susseguono con periodicita di 10 bp, si produce la curvaturaqueste curvatura si formano nell’avvolgimento dei nucleosomi ▪ Le curvature possono trovarsi a monte e a valle di siti promotori e possono avere rilevanza funzionale
LO SVOLGIMENTO LOCALE DEL DNA E’ ALLA BASE DI NUMEROSI MECCANISMI FONDAMENTALI ED
ATTIVITA’ FUNZIONALE CHE COINVOLGONO IL DNA
a) Se si sottoavvolge di un giro completo a sinistra e si risalda,il cerchio e’ sotto tensione che porta a superavvolgimento negativo (sinistroso) spontaneo ristabilendo il numero di giri totale originale dell’elica b) Un attorcigliamento eccessivo della doppia elica porta a un superavvolgimento positivo (destroso) aggiunta di un giro completo a destra e si risalda un superavvolgimento negativo a sinistra ripristina il numero totale di giri originali dell’elica ❖ Il dna superavvolto e’meno stabile e si puo verificare una parziale denaturazione localizzata Il superavvolgimento negativo puo scaricare la tensione in diverse modalita’:
- Separazione dei filamenti (denaturazione di regioni ricche in A+T)
- Formazione di strutture cruciformi (in corrispondenza di palindromi)
- Struttura Z (in corrispondenza di regioni di alternanza Pu/Pi) tutte queste modificazioni sono mediate da enzimi: le topoisomerasi,vanno a tagliare il legame fosfodiestereo il superavvolgimento positivo si trova in particolari organismi termofili, che vivono a temperature elevatela sua funzione biologica e’ quella di evitare che il DNA si denaturi con troppa facilita’ ANALISI DEL DNA DNA TOPOISOMERASI UMANE Topoisomeri: Molecole di DNA circolari covalentemente chiuse di uguale lunghezza, ma che differiscono s solo per il numero di legame i topoisomeri che differiscono anche per un solo numero di legame possono essere risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio Ci sono dei reagenti che si intercalano nel DNA e che possono cambiarne la topologia: ❖ Il BROMURO DI ETIDIO se esposto a raggi ultravioletti e’ una molecola planare che si intercala tra le basi Effetti dell’intercalazione:
- La molecola di DNA si allunga perche’ due coppie di basi adiacenti devono allontanarsi per far posto alla molecola di etidio
- Una volta che l’etidio e’ all’interno della doppia elica, per le interazioni di impilamento diminuisce il twist di 26 gradi
- L’etidio si lega molto meglio a un DNA negativamente superavvolto Topoisomerasi: sono enzimi che effettuano un taglio transiente sul DNA, mediante una tirosinasi lega allo scheletro fosfato tramite il suo gruppo OH
dopo la manipolazione topologica che riduce o aumenta il numero di legame, il gruppo OH libero del filamento tagliato, attacca il legame tra tirosina e DNA ripristinando la continuita della doppia elica l’intero processo di modificazione topologica usa l’energia libera contenuta nel DNA superavvolto Le DNA topoisomerasi si differenziano tra loro per il meccanismo d’azione con il quale cambiano la topologia del DNA, esistono due principali meccanismi: ▪ Taglio per rotazione controllata : l’enzima introduce una singola rottura e permette la rotazione su se stesso del filamento intatto per un numero variabile di giri fino a che l’attrito tra il DNA e l’enzima induce la rilegazione del filamento tagliato ▪ Taglio per passaggio del filamento (strand passage) : si crea una rottura singola o a doppio filamento sul DNA, il filamento o la doppia elica passa attraverso la rottura che poi sara’saldata TOPOISOMERASI I (sono monomeri) ➢ Non ha bisogno di ATP ➢ Taglia un singolo filamento del DNA al 5’, taglia il legame fosfodiesterico ➢ Provocano un attacco ossidrilico del OH della tirosina del sito attivo al gruppo P del dna, formando un legame covalente fosfotirosina tra enzima a dna (TRANSESTERIFICAZIONE) ➢ Avvolge le estremita’ rotte, che non restano libere ma sono ad esse legate covalentemente a. l’enzima lega il DNA e apre la doppia elica b. uno dei due filamenti del DNA viene tagliato c. il filamento integro di DNA passa attraverso l’apertura del primo filamento d. il filamento tagliato viene rilegato
❖ Negli eucarioti il DNA non e’circolare ma si possono formare strutture superavvolte in porzioni di DNA bloccati da un reticolo di proteine (nei cromosomi) TOPOISOMERASI E FARMACI ANTICANCRO Numerosi farmaci anticancro in regimi chemioterapici sono diretti contro la topoisomerasi I o II Es la camptotecina (derivato dalla corteccia di Camptotheca acuminata) e analoghi sono diretti contro la topoisomerasi tipo I per cancro ovaie e colon Azione:
- inibitori di un passaggio del ciclo catalitico
- veleni – il DNA tagliato resta intrappolato come intermedio stabile- la rottura può diventare permanente
- Tali farmaci colpiscono maggiormente le cellule tumorali perché queste crescono più rapidamente e contengono livelli più alti di topoisomerasi
- Spesso le cellule tumorali hanno sistemi di riparo difettosi, quindi sono suscettibili ai danni al DNA
- Colpiscono le cellule normali che crescono rapidamente, globuli bianchi, follicoli piliferi, cellule rivestimento tratto gastroenterico (pazienti in chemioterapia: nausea, diarrea STRUTTURA RNA ❖ Si e’ scoperto che ha anche funzioni catalitiche, e’multitasking ❖ E’ una catena di subunita costituita da ribonucleotidi uniti da legami fosfodiesterici ❖ Ogni nucleotide ha uno zucchero, una base azotata e gruppo fosfato ❖ Fondamentale per trasmettere l’informazione genetica (trascrizione, genomi a RNA) ❖ - ha una grande versatilita’ funzionale e strutturale le funzioni variano soprattutto in base alla struttura secondaria e terziaria sono i meccanismi di trasmissione dell’informazione genetica trascrizione e traduzione e la loro regolazione ❖ Un database raccoglie motivi della struttura secondaria e terziaria ❖ ha una struttura modularia, combinazione di unita’ funzionali ❖ il peculiare ripiegamento e’ alla base della reattivita’ chimica ❖ e’ coinvolto in essenziali processi cellulari
Ci sono 3 livelli di struttura Primaria: la sua sequenza Secondaria: e’ la struttura che si forma quando il singolo filamento di ripiega a formare strutture a doppio filamento Terziaria: struttura tridimensionale NUCLEOTIDI Lo zucchero e’ il Ribosio e’presente un OH in piu in 2’ questo lo rende piu’reattivo rispetto allo zucchero del dna) perche’ OH tende a far un attacco nucleofilo sullo scheletro zucchero-fosfato degli acidi nucleici e inoltre permette al’'RNA di avere funzioni catalitiche Inoltre crea ingombro sterico che impedisce all’RNA di assumere una conformazione stabile a doppia elica di tipo B L’RNA e’ una catena a singolo filamento ma e’ in grado di formare Tratti a doppia elica con una conformazione simile al DNA A Questo ha un solco minore piu’ largo e accessibile mentre il solco maggiore e’ piu’ stretto
- Questo favorisce interazioni di legami idrogeno con il solco minore
- Rende possibile la formazione di complessi stabili con proteine nel solco maggiore ADENINA, GUANINA, CITOSINA, URACILE (la timina a differenza ha un gruppo metilico) STRUTTURA SECONDARIA i legami idrogeno che si formano tra base complementari formano il ripiegamento , si formano forcine/steli/giunzioni/gemme QUESTO PERCHE’ le basi possono ripiegarsi liberamente intorno al legame fosfodiesterico e ai legami con il ribosio le basi possono appaiarsi in modo non canonico (coppia G-U E G-A, appaiamenti di Hoogsten)
Le coppie di basi non convenzionali e le triplette sono mediatori importanti dell’autoassemblaggio- interazioni con proteine e ligandi MODIFICAZIONI delle BASI AZOTATE Le modificazione di basi aumentano la possibilita di impegnare legami idrogeno in modo non canonico Piu di 50 basi modificate (metilazione, ristrutturazione anello purinico) Esempi: ▪ Inosina – I ▪ Pseudouridina ubiquitaria ▪ 7 metilguanosina ▪ Diidrouridina MOTIVI COMUNI DI STRUTTURA TERZIARIA
- I grandi RNA sono costituti da domini strutturali che si assemblano e ripiegano in modo indipendente
- La loro stabilita’ dipende da: presenza di GC (rispetto a GU e AT) numero di basi di uno stelo numero di nt per forcina (<5 e >10 richiede maggiore energia) numero di nt non appaiati (protuberanze)
- basati su formazione di legami idrogeno e impilamento di basi
- le basi non appaiate delle anse e protuberanze interagiscono in modo non canonico a lunga distanza
- Anche i 2’ OH sono coinvolti nelle interazioni
- Le cariche negative sono neutralizzate da legami con proteine basiche o attacco di ioni metallici mono e/o divalenti MOTIVO A PSEUDONODO si forma quando un segmento di RNA che ha gia’ formato un’ansa in una regione si ripiega, e i nucleotidi contenuti nell’ansa interagiscono con i nucleotidi di una regione vicina del filamento Si viene quindi a formare una seconda regione a doppia elica che dopo una torsione si impila sull’altra mediante impilamento coassiale(virus vegetale a RNA) Prima si forma lo stelo 1 poi il 2 e si ha una rotazione di entrambi Questo tratto a doppia elica puo’ impegnarsi in legami idrogeno con altre regioni della molecola formando tratti a tripla elica
La telomerasi umana ha un motivo di questo generesi forma una struttura a tripla elica stabilizzata da triplette di basi Discheratosi congenita e’provocata da mutazione allo pseudonodo del RNA della telomerasi MOTIVO A MINORE Delle adenosine della catena dell’RNA possono interagire specificamente con il solco minore di strutture di RNA a doppia elica mediante legami di van der Waals ➢ Frequente nelle grandi molecole ➢ rRNA e ribozimi tipo I ➢ Hanno la funzione di stabilizzare:
- contatti tra le eliche di RNA
- interazioni tra anse ed eliche
- conformazione di giunzioni e ripiegamenti molto stretti ➢ Es. si forma nell’interazione tra adenina al 3’ del tRNA con il 23SrRNA MOTIVO A TETRAANSA Presenza di motivi UUUU stabilizzano la struttura stelo-ansa a causa dello speciale impilamento delle basi dell’ansa Es. Dominio P4-P6 degli introni tipo I MOTIVO ANSA A TETRA LOOP
- Ci sono piu’ basi coinvoltela struttura e’ stabilizzata dalle interazioni idrofobiche di impilamento
- Le basi al vertice dell’ansa sono esposte all’esterno Es. GC-UGUU-GU MOTIVO A CERNIERA LAMPO DI RIBOSI Si forma quando, in un ripiegamento di una lunga regione a doppia elica, due solchi minori si trovano in contatto e il 2 OH’ di un’elica interagisce con: ▪ l’ossigeno 2 di una base pirimidinica o ▪ con l’azoto 3 di una purina, dove e’ rappresentato il dominio P4-P6 del’introne di gruppo I
- Mediano le interazioni tra eliche dell’RNA MOTIVO A PIEGA K
- Anse interne asimmetriche
- stretta curva dell’ossatura fosfodiesterica in corrispondenza della protuberanza di 3 nucleotidi
- si verifica quando ci sono coppie GC e GA che fiancheggiano l’ansa
