Biologia molecolare e applicata, Dispense di Biologia

Scarica Biologia molecolare e applicata e più Dispense in PDF di Biologia solo su Docsity! Processo nel quale la sequenza di dna viene trascritta in RNA complementare. Rna ha un solo filamento, e l'uracile al posto della timina. L'rna polimerasi non necessita di un primer e può iniziare la sintesi ex-novo. Abbiamo dunque filamento stampo: letto da rna pol in direzione 3'-5' • filamento codficante: composto dalle stesse basi complementari dell'rna sintetizzato in • direzione 5'-3' INIZIO segnale d'inizio -> PROMOTORE si trova nel filamento stampo, a monte del nucleotide +1; il promotore non viene trascritto. Alla sequenza -10 troviamo la TATA box, che rappresenta il punto d'inizio della denaturazione della doppia elica Enzima dell'RNA polimerasi è composto da: - enzima core = presenta tasca in cui passa il dna durante la denaturazione - sito di entrata per i ribonucleotidi - sito di uscita per rna sintetizzato RNA polimerasi poi si complessa con il fattore sigma, e insieme formano l'oloenzima -> permette di stabilizzare l'rna pol sul promotore. Il fattore sigma si deve poi staccare in maniera graduale per permettere la fase di allungamento, una volta che il legame con il promotore sarà stabile. Esistono diverse tipologie di fattore sigma, nei procarioti quello che riconosce il promotore dei geni housekeeping è il sigma70. ALLUNGAMENTO All'interno dell'rna pol si forma una piccola bolla di trascrizione, di circa 17 nucleotidi, in cui rna e dna si incrociano. Anche l'RNA polimerasi ha un meccanismo di correzione degli errori, meno efficace di quello della dna polimerasi; l'enzima sosta più a lungo sui nucleotidi errati, questo tempo gli permette di riconoscere e correggere l'errore. Il processo è dispendioso energeticamente e spesso impreciso, causando circa 1 su 10.000 errori. TERMINAZIONE Nei procarioti ci sono due meccanismi per terminare la trascrizione Terminazione intrinseca: i geni trascritti possiedono sequenze complementari che • permettono la formazione di una forcina ( con molti legami G-C) seguita da una sequenza meno stabile (con molti legami A-T), che portano al rilascio della molecola di rna. Terminazione rho-dipendente: Rho è una proteina ad attività elicasica che riconosce • il filamento nascente e vi scorre alla stessa velocità della polimerasi; quando la pol rallenta a causa della struttura a forcina, rho raggiunge il sito attivo e l'impatto causa il distaccamento della molecola di RNA. Nei procarioti trascrizione e traduzione sono accoppiate e avvengono nel citoplasma, questo permette di risparmiare tempo e salvaguardare le molecole di rna. I procarioti sono caratterizzati dai geni policistronici -> sequenze che codificano per più proteine a livello di un unico promotore. TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI I geni eucariotici sono monocistronici e discontinui, possiedono quindi sequenze codificanti (esoni) e sequenze non codificanti (introni). Sono divisibili in 3 diverse classi: Classe I = trascritti da rna polimerasi I; codificano per rRNA 5.8S, 18S e 28S. • Classe II = trascritti da rna polimerasi II; codificano per mRNA quindi proteine • Classe III = trascritti da rna polimerasi III; codifcano per tRNA e rRNA 5S • Geni di classe II Inizio trascrizione al nucleotide +1. Primo segmento ad essere trascritto -> 5'UTR (untranslated region) Troviamo poi il codone d'inizio AUG, la regione 3'UTR ed il sito di terminazione. Sono presenti molte sequenze regolatrici non in prossimità del gene che possono funzionare da enhancer o da silencer. Trascrizione è regolata anche da fattori di trascrizione generali (GTF) sono importanti per il corretto posizionamento della rna pol sul promotore, in particolare: - TFIID si lega a tata box - TFIIA e TFIIB si legano al precedente e ricoprono il promotore - RNA pol accompagnata da TFIIF si posiziona correttamente Ci sono poi dei fattori di trascrizione specifici, distanti dal promotore e quasi sempre a monte, che agiscono da induttori o repressori della trascrizione. RNA pol possiede una coda peptidica, CDT terminale, che subisce una serie di fosforilazioni che inducono il richiamo di fattori per la maturazione. In particolare subisce delle fosforilazioni a livello delle serine. Complesso mediatore = fa da ponte tra gli elementi distali (fattori specifici) e la struttura a livello del promotore; questo complesso è estremamente importante e si è conservato dal punto di vista evolutivo. Per iniziare la trascrizione si ha il separamento dei due filamenti tramite idrolisi dei legami idrogeno e utilizzo ATP. Le regioni UTR svolgono un fondamentale controllo nella trascrizione. In particolare nei procarioti: - troviamo la sequenza di Shine-Dalgarno nella regione 5'UTR, a monte del codone di inizio AUG -> permette l'ancoramento del ribosoma all'mRNA, nei procarioti quindi, solo le sequenze AUG precedute da questa sequenza sono riconosciute come codoni d'inizio. Negli eucarioti - il codone AUG si trova all'interno della sequenza di consenso di Kozak selezione codone -> vicinanza al cappuccio al 5' dell'mRNA. INIZIO Reclutate nel citoplasma le molecole necessarie alla sintesi proteica: - tRNA iniziatore - anticodone complementare a metionina - metionina - subunità maggiore e minore del ribosoma - GTP nei procarioti e GTP e ATP negli eucarioti - fattori d'inizio 1- subunità minore del ribosoma si lega al filamento di mRNA 2- subunità scorre sul filamento fino al codone d'inizio AUG 3- subunità si lega all'amminoacil-tRNA-iniziatore 4-si aggiunge la subunità maggiore e si formano i tre siti caratteristici ALLUNGAMENTO Il ribosoma progredisce sul filamento di mRNA, nel sito A si colloca la successiva tripletta. Si lega all'anticodone corrispondente e si stabilizza; Tripletta nel sito A si lega a metionina nel sito P grazie a enzima peptidil-transferasi; si consuma GTP e metionina si stacca da tRNA d'inizio. TERMINAZIONE quando il ribosoma si imbatte in un codone di stop si ha l'impossibilità di appaiare un anticodone corrispondente; i codoni di stop richiamano invece dei fattori di terminazione - RF1 per UAA e UAG - RF2 per UAA e UGA Questi fattori impediscono legame con mRNA e apportano modifiche per smantellare il complesso traduzionale. REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI Regolazione genica -> succedersi di eventi che permettono ad un gene di esprimere o reprimere un prodotto finale Nei procarioti ci sono due tipi di geni: - geni housekeeping = sempre espressi e non regolati - geni regolati = consentono adattamento della cellula alle modificazioni dell'ambiente Il fattore sigma aiuta rna pol a riconoscere il promotore, e avviene in due livelli - livello primo = capacità di tutti i geni di reclutare rna pol sui promotori - livello secondo = diverse subunità sigma intervengono per regolare geni diversi MODELLO DELL'OPERONE Operone: regione di cromosoma batterico costituito da promotore -> vi si lega l'RNA polimerasi • operatore -> vi si lega il repressore • gene regolatore con il proprio promotore -> favorisce o interferisce con la • trascrizione uno o più geni strutturali • Le vie metaboliche principali possono essere: cataboliche: ad induzione da substrato, modalità di regolazione positiva • anaboliche: a repressione da prodotto finale, modalità di regolazione negativa • Gli enzimi che catalizzano queste vie sono regolate in modo coordinato, attivati o repressi in modo simultaneo. Nei batteri il 50% dei geni è regolato in modo positivo. Controllo negativo = repressore inibisce l'espressione genica legandosi all'operatore e impedendo lo scorrimento della rna pol Controllo positivo = necessari attivatori che accendano il gene Esistono due tipi di sequenze di dna CIS AGENTI: siti di dna cui funzione è essere riconosciute, agiscono dove sono state • prodotte TRANS AGENTI: agiscono su sequenze di dna diverse da quelle dove sono state • prodotte Modello di base -> gene regolatore produce mrna che produce proteina regolatrice(elemento trans) che va a riconoscere un sito bersaglio (elemento cis), la loro interazione avrà un effetto positivo o negativo sulla trascrizione. segueilpromotore OPERONE LAC (lattosio) Operone inducibile Costituito da 3 geni strutturali beta galattosidasi • permeasi • transacetilasi • A monte dell'operone troviamo il gene regolatore, con il suo promotore, che sintetizza un repressore L'operone lac non è normalmente espresso, a meno che sia presente un induttore, il lattosio, che alza il livello dei tre geni sopracitati. Il repressore si lega all'operatore impedendo la trascrizione dei geni, il presenza del lattosio perô il repressore viene disattivato. La regolazione di questo gene è dipendente però anche dal glucosio, fonte preferenziale per i procarioti Il glucosio effettua un controllo positivo sull'operone lac Il glucosio può inibire la sintesi degli enzimi dell'operone lac grazie a una proteina allosterica CAP che interagisce con il cAMP. Il cAMP è dipendente dal glucosio, più glucosio = meno cAMP Quindi se è presente il glucosio ma non il lattosio: - presenza del glucosio inibisce la formazione di cAMP, questo porta l'induttore a rimanere inattivo e quindi rna pol non si lega alla sequenza; anche se si legasse sarebbe attivo il repressore quindi in ogni caso non c'è trascrizione dei geni. - presenza sia di glucosio che di lattosio glucosio rende basso il cAMP, mentre il lattosio inattiva il repressore; rna pol lega la sequenza con bassa efficienza, si ha quindi un basso livello di sintesi dei geni. - presenza solo di lattosio assenza del glucosio alza la concentrazione del cAMP e l'attivazione degli attivatori, inoltre il repressore è disattivato; si ha dunque una massiva trascrizione dei tre geni OPERONE TRIPTOFANO (TRP) Operone reprimibile Costituito da dna con 5 geni strutturali contigui: triptofano E,D,C,B,A; un promotore e un operatore. In più c'é il gene regolatore con il suo promotore -> quando espresso si produce un repressore nella sua forma inattiva. SE è presente il triptofano -> repressore si attiva In assenza di triptofano il gene trascrive il suo repressore inattivo non in grado di legarsi all'operatore -> RNA pol scorre e sintetizza mRNA policistronico Il triptofano agisce da co-repressore perchè attiva il repressore legandovicisi. ATTIVAINDUTTORI Associati ai geni eucariotici troviamo GENI DI CONTROLLO: sequenze in cis riconosciute da elementi trans (attivatori o repressori). Di solito i geni di controllo si trovano a monte del promotore, ma possono anche essere all'interno delle regioni introniche. I fattori di regolazione possono essere: - Enhancers ( prevalenti in eucarioti) - Silencers - Insulators Una sequenza attivatrice contiene al suo interno diversi elementi di controllo, ognuno contiene una sequenza di dna che funziona da sito di legame per uno specifico fattore di trascrizione. I silencer sono sequenze di DNA che riducono efficienza trascrizione deacetilando le code istoniche Enhancer -> generalmente distali, a volte anche su un altro cromosoma -> assumono conformazione per permettere al promotore di avvicinarsi alle transcription factory. Quindi enhancer attiva promotore -> si può interporre un insulator che blocca la trascrizione. Ad esempio promotore insulina -> possiede una serie di sequenze cis riconosciute da • un fattore trascrizionale; alcuni elementi sono in tutte le cellule, altre solo nelle cellule beta pancreatiche -> gene si attiva solo quando tutti gli elementi si legano al proprio fattore trascrizionale -> motivo per cui il gene dell'insulina si trova solo nelle cellule beta pancreatiche. Come vengono riconosciute le sequenze in cis? le sequenze si trovano tra i nucleosomi e sono identificate da una DNA binding domain a cui sono legati attivatori o repressori per attivare o reprimere la trascrizione -> il segnale deve poi essere propagato dalle proteine di lettura tramite il complesso lettura- scrittura. Complessi scrittura attuano modifiche dopo essere stati richiamati, modifiche lette da complesso di lettura del nucleosoma successivo -> diffusione ad onda. Soprattutto quando il gene da attivare è lontano, gli enhacer richiamano i fattori di attivazione e i rimodellatori della cromatina che legano il mediatore -> ponte tra regione del dna enhancer e promotore. La struttura della cromatina è molto dinamica, per tanto può modificarsi autonomamente o mediante complessi di rimodellamento che richedono ATP. In ogni caso ci sono nel genoma stesso sequenze che favoriscono o meno l'occupazione nuclesomica, infatti è stato dimostrato che nei geni più altamenti trascritti, i fattori di trascrizione si localizzano in regioni povere di nucleosomi -> genoma stesso organizza il proprio packaging. Per terminare la propagazione tornano in gioco gli insulators; possono agire in modi molto diversi: - insulator impedisce fisicamente la propagazione interponendosi tra il dna - complesso insulator ricopre le strutture nucleosomiche per impedire modifiche - singolo insulator che inibisce la propagazione tramite segnale chimico. Gli insulator possono comunque impedire a priori l'interazione enhancer-promotore; oppure se troviamo un enhancer interposto tra due promotori diversi, gli insulators possono bloccare uno solo dei due. La regolazione dell'espressione genica avviene quindi su diversi livelli e può essere definita multidimensionale. - lineare se elementi regolatori sono contigui al gene da esprimere - bidimensionale se sono contigue ma più lontane - tridimensionale se lo stimolo è molto lontano e l'interazione è permessa da distribuzione cromatinica nel nucleo - quadridimensionale se i geni sono su cromosomi differenti Controllo a distanza della regolazione genica • - Geni dello sviluppo Determinano l'accrescrimento in senso assiale dell'organismo nei primissimi stadi di sviluppo; sono marcati al loro interno da una sequenza abbastanza corta chiamata homebox, e vengono quindi chiamati geni omeotici. Questi rappresentano dei fattori di trascrizione in grado di agire in modo combinatorio e sequenziale per definire l'espressione di diversi gruppi di geni in modo specificatamente regolato. Questi geni sono caratterizzati dalla colinearità, infatti l'ordine in cui sono disposti nei singoli cluster corrisponde all'ordine in cui verranno espressi -> al loro interno hanno il segnale per accendere il gene successivo e determinare un effetto a cascata. - Posizione dei geni Determina un ruolo fondamentale -> geni vicino a regioni eterocromatiniche possono essere disregolati. Un esempio è la distrofia facio-scapolo-omerale cui gene si trova sul cromosoma 4 -> normalmente inattivo e metilato -> per errore si attiva e produce proteina tossica per le cellule muscolari. - Controllo per competizione Si prende l'esempio dell'emoglobina Emoglobina è formata nell'adulto da due catena alpha e due catene beta; ma la sua struttura cambia durante lo sviluppo. >emoglobina embrionale: due catene epsilon + due catene xi > emoglobina fetale: due catene alpha + due catene gamma Queste catene sono associate a diversi cluster vedianchegenetica Nel cromosoma 16 troviamo il cluster alpha like ( catene alpha e xi); Nel cromosoma 11 troviamo il cluster beta like (tutte le altre catene) La differenza tra le diverse emoglobine è la diversa affinità per l'ossigeno. La disposizione dei geni nei cluster segue l'ordine con cui si manifestano. Questi geni possono essere espressi in modo sequenziale perchè sono espressi in tessuti diversi: - sacco vitellino - fegato - midollo osseo Distalmente ad ogni cluster di geni troviamo la LCR (locus control region) -> presenta elementi in cis che interagiscono con elementi trans a seconda di dove questi sono espressi. -> a seconda di come interagiscono si formano strutture di dna in grado di accendere o spegnere determinati geni. Espressione viene detta regolata per competizione -> tra LCR ed elementi embrionali, fetali e adulti. MECCANISMI DI REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALI Promotori alternativi, splicing alternativi, rna editing.. • Per uno stesso gene si possono avere diverse isoforme - tessuto specifiche: in base al promotore usato dalla cellula - sviluppo specifiche - diversa localizzazione cellulare - cambio di funzione: domini di legame che necessitano attivatore in un tessuto e repressore in un altro. Repressione dello splicing • Trascritto primario presenta sequenze ESS o ISS (exon/intron splicing silencer) a cui si possono legare delle proteine in grado di inibire lo spliceosoma -> il trascritto primario non subisce lo splicing -> si ottiene un mRNA con introni Attivazione dello splicing • Splicing avviene nel momento in cui il trascritto presenta un attivatore (exon/intron splicing enhancer) Splicing alternativo • vengono eliminati anche alcuni esoni. esempio nel gene della troponina -> produce un trascritto primario con 5 esoni -> si possono ottenere 2 mRNA maturi, uno senza l'esone 3 e uno senza il 4, perchè sono mutalmente esclusivi. Poliadenilazione alternativa • Più segnali di poliadenilazione in una stessa sequenza, tessuto specifici; esempio nella calcitonina che ne presenta 2 -> uno viene usato da delle cellule tiroidee per la produzione della calcitonina; l'altro da cellule del sistema nervoso. Le proteine chaperon hanno un ruolo importante nel trafficking proteico -> possono corregge i ripiegamenti errati delle proteine; Se il procedimento non riesce, la proteina deve essere degradata a livello del proteasoma dopo il processo di ubiquitinazione-> in caso contrario avremo accumuli patogeni. MODIFICHE POST-TRADUZIONALI Nel reticolo, la proteina può subire diverse modifiche Formazione di ponti disolfuro -> necessari per il corretto ripiegamento, tendono a • formarsi spontaneamente; la protein disulfide isomerasi rompe i ponti non corretti Folding • Glicosilazione • consiste nell'attacco di oligosaccaridi nella porzione rivolta verso il lume del reticolo per far si che venga poi esposta verso l'esterno della cellula; ci sono due classi di enzimi che svolgono il processo - N-linked: agiscono su asparagina creando un legame con uno zucchero già molto ramificato -> sintetizzato sul versante citosolico del reticolo e poi legato al dolicolo, molecola in grado di effettuare il flip-flop all'interno del lume del reticolo. - O-linked: agiscono su serina, idrossilina e treonina creando legame ossidrilico; i singoli zuccheri vengono legati uno alla volta. Le modifiche agli zuccheri vengono completate a livello del Golgi. Tagli proteolitici • Molte sostanze prodotte in forma inattiva vengono attivate tramite i tagli proteolitici. Un esempio ne è l'insulina, quale taglio avviene dentro al reticolo -> due tagli eliminano una grossa porzione centrale, le due restanti vengono unite da ponti disolfuro. Assemblaggio -> in caso di proteine multimeriche • TRASFERIMENTO AL GOLGI Il trasporto è regolato principalmente da vescicole: - vescicole anterograde: dal reticolo al Golgi - vescicole retrograde: per proteine che necessitano di essere processate nel Golgi ma che devono poi tornare al reticolo. Il riconoscimento di queste proteine avviene mediante la sequenza KDEL, riconosciuta da un recettore specifico in grado di portarla al Golgi e tornare indietro. Nel Golgi continua il processo di glicosilazione e inoltre avviene il marchio per le proteine destinate ai lisosomi -> mannosio-6-fosfato Tutti i passaggi vescicolari vengono regolati da proteine specifiche, in particolare: - Clatrina-> per passaggio da Golgi all'esterno della cellula - COP1 e COP2 -> nei passaggi anterogradi e retrogradi rispettivamente Una volta svolta la loro funzione vengono eliminate o riciclate, per far si che la vescicola si fonda con la membrana Nella struttura della vescicola sono inoltre presenti delle membrane cargo proteins e membrane cargo receptors -> riconoscono e legano ciò che deve essere trasportato Le proteine Snare riconoscono invece il punto d'attracco. - Proteine lisosomiali Come già detto la maggior parte di queste proteine viene veicolata al Golgi tramite il marchio di mannosio6fosfato, ma una piccola parte tramite un segnale lisosomiale. I lisosomi sono essenziali per la degradazione di proteine; quindi all'interno dei lisosomi sono necessari numerosi enzimi -> funzionano solo a basso pH (circa 5) Se i lisosomi non funzionano si possono avere le cosiddette patologie da accumulo lisosomiale. Riguardo le proteine marcata con M6P nel cis-golgi, passano nel trans golgi e sono riconsciute da un recettore, si formano vescicole rivestite da clatrina e prima di arrivare ai lisosomi si abbassa il pH all'interno della vescicola per permettere il distacco e il successivo riciclo del recettore; la vescicola si fonde poi con il lisosom - Proteine nucleari Le proteine che devono andare al nucleo passano attraverso la membrana nucleare; le uniche cose che possono passarci liberamente sono acqua, sali e molecole molto piccolo. Gli altri elementi, fattori di trascrizione, di duplicazione o cromatinici, hanno bisogno di specifici segnali. La proteina necessaria è la proteina Ran (una GTP-asi) -> lega il GTP (si trova nel nucleo) e lo trasforma in GDP (si trova nel citosol). Per funzionare Ran necessita di altre due proteine: Ran-GAP= si trova nel citosol e attiva funzione gtpasica di Ran Ran-GEF= si trova nel nucleo Quindi GDP puó essere trasformato in GTP sono nel nucleo grazie a ran-gef; mentre il passaggio da GTP e GDP viene effettutato grazie a Ran-GAP. Una volta che la proteina è stata veicolata nel nucleo, bisogna avere un segnale per rilasciarla dal recettore. Ran-GTP prende il posto della proteina legandosi al recettore e uscendo dal nucleo -> a questo punto interviene Ran-GAP per trasformare il GTP in GDP -> Ran-GDP non riesce a rimanere attaccato al recettore nucleare e si stacca lasciando il recettore libero per il ciclo successivo. Lo stesso discorso vale per le proteine che dal nucleo devono andare al citoplasma, con processo inverso. La proteina Ran avrà dunque un sito per legare gtp o gdp, un punto di legame con il recettore e uno con la proteina da trasportare. - Proteine mitocondriali I mitocondri hanno membrana esterna ed interna, spazio intermembrana e matrice mitocondriale. Proteine mitocondriali vengono sintetizzate dai ribosomi -> proteina completata nel citosol -> subisce già ripiegamento -> come passa nei canali? Sono necessarie le proteine chaperon hsp70 che mantengono la proteina distesa. Il peptide segnale che indica che la proteina deve andare al mitocondrio si trova all'estremità N-terminale. Per aprire il canale interviene la proteina TOM, presente sulla membrana mitocondriale esterna e due proteine TIM, presenti sulla membrana interna. TOM riconosce peptide segnale -> si appaia a TIM e forma un canale -> nella matrice mitocondriale il peptide segnale viene tagliato -> o si ferma o se deve procedere nella membrana interna un secondo peptide segnale verrà riconosciuto dalla proteina OXA. - Perossisomi Perossisomi hanno funzione di detossificazione e di degradazione degli acidi grassi. Processamenti sbagliati porteranno a patologie da accumulo -> organelli aumentano di dimensioni e perdono funzionalità -> rompendosi liberano enzimi di degradazione che possono portare alla morte della cellula. L'ingresso delle proteine in questi organelli è simile a quello dei mitocondri, ma il peptide segnale si trova all'estremità C-terminale. >Patologie correlate Si conoscono circa 500 patologie legate a misfolding e accumulo, di cui alcune possono essere ereditarie. Nell'Alzheimer ad esempio si ha la formazione di fibrille all'interno dei neuroni e di placche amielodi, grossi aggregati proteici extracellulari perchè non ci sono enzimi in grado di digerirli. Anche il morbo di Huntingon (patologia da espansione di tripletta) è causato da una mutazione che causa un elevato numero di glutammine che si aggregano a livello dei neuroni. Ossido nitrico diffonde liberamente tramite le membrane e raggiunge le cellule del muscolo liscio -> qui agisce su guanilato ciclasi che trasforma GTP in GMP-ciclico -> agisce su protein chinasi G che determina il rilascio della muscolatura liscia. Effetto sulla pressione arteriosa -> bassa produzione di NO, tono muscolare più elevato, maggior resistenza nei vasi -> ipertensione. PATHWAY DI RISPOSTA AI FATTORI DI CRESCITA Sulla superficie cellulare sono presenti dei recettori ad attività chinasica coinvolti in questa risposta. I recettori seguono due vie principali: Via di ras • Via PI3K • Sono vie che trasmettono segnali di proliferazione e sopravvivenza e devono per questo essere perfettamente regolate, in caso contrario si andrà incontro a proliferazione tumorale. Per i vari fattori di crescita ci sono diverse classi di recettori, ma tutti possiedono una componente che riconosce il ligando ed una componente ad attività chinasica che induce la trasduzione. VIA PI3K Va a fosforilare i lipidi di membrana, questo attiva altre chinasi che modificheranno il processo trascrizionale. VIA DI RAS La proteina Ras si trova vicino al recettore, questa proteina è inattiva se legata ad GDP e attiva quando legata al GTP. Può svolgere il processo da sola in modo molto lungo, oppure utilizzare altre molecole. All'arrivo del ligando e successiva dimerizzazione del recettore si ha la fosforilazione della porzione chinasica. La fosforilazione viene riconosciuta da GRB2 che vi si attacca da un lato, mentre dall'altro si lega a proteina Sos che interagisce con Ras e favorisce scambio da GDP a GTP. Successivamente per disattivare ras bisogna staccare un gruppo fosfato -> importante per interrompere stimolo della proliferazione. Una volta attiva invece, Ras interagisce su RAF attivandola. RAF induce attivazione a cascata di chinasi finche una chinasi non trasloca nel nucleo (MAPK) e fosforila dei fattori di trascrizione. Esistono tantissime forme di MAP chinasi. EXTRAcitosolica intracitosolica Ras quindi porta a proliferazione, crescita e migrazione cellulare. Per questo Ras è stato uno dei primi oncogeni scoperti, perchè la sua forma mutata da luogo a trasformazione tumorale. Esistono anche dei recettori senza una propria attività chinasica, ma legati ad una chinasi, un esempio ne sono i recettori per le citochine. Quando il ligando interagisce con il recettore, la chinasi si attiva e lo fosforila, ma fosforila anche dei fattori trascrizionali nel citosol -> si attivano e migrano nel nucleo attivando altri fattori. Agiscono in questo caso su geni che rispondono a dei processi infiammatori. Caso simile per i recettori di Epo, che vanno ad agire però sui geni dei globuli rossi. PATHWAY DI WNT Le wnt sono una famiglia di proteine che regolano proliferazione e differenziamento. Sulla membrana cellulare ci sono due recettori, Frizzled e Lrp. Se non è presente il ligando (Wnt) le due porzioni sono separate. - A livello del citosol troviamo un complesso proteico contenente la beta-catenina, che viene fosforilata e per questo indirazzata al proteasoma per la degradazione. - Se è presente il ligando che attiva il recettori, viene richiamata l'axina dal complesso proteico del citosol -> beta catenina non viene fosforilata ne degradata e passa nel nucleo, dove attiva dei geni inducendo il distacco fattore di repressione che li silenziava. PATHWAY DI NOTCH Legata al processo di differenziamento in organi dove sono presenti cellule con funzioni diverse a stretto contatto tra di loro. Molto studiato a livello dell'intestino. Una cellula presenta sulla superficie la molecola Notch, quale porzione intracitosolica interagisce con Delta, espressa dalla cellula vicina. Delta viene espressa solo quando la cellula vicina ha attivato un differenziamento specifico. Quando Notch interagisce con Delta, la parte intracitosolica di Notch viene tagliata e trasmigra nel nucleo per agire come fattore di trascrizione. - TRASFORMAZIONE TUMORALI Sono diversi i fattori che possono essere coinvolti nei processi di trasformazione tumorale delle cellula - iperproduzione di fattori di crescita - iperpresenza di recettori - mutazioni dei recettori - infezioni virali oncogene Possono essere coinvolte anche alterazione dei fattori trascrizionali, dei fattori di riparazione del DNA.. I tumori per crescere necessitano anche di una forte vascolarizzazione. Alcuni fattori di crescita bersaglio delle terapie sono: EGF (epidermal-growth factor): sono stati creati anticorpi in grado di bloccare questi • fattori. (micro -> prodotto dalle ghiandole del Brunner nella sottomucosa del duodeno) Anche i recettori di EGF sono stati trovati spesso mutati e sono sempre attivi. Responsabile è un virus che porta questo recettore e lo inserisce nelle cellule; questo consente all'organismo di riconoscere che la cellula è infetta, ma spesso la prolferazione tumorale è molto più veloce rispetto alla capacità della cellula di eliminare. GF legati al sistema emopoietico: stimolano produzione di globuli bianchi • PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION Metodo in vitro che consente l'amplificazione selettiva di porzioni di DNA o RNA, fino a 10^6 volte. Si basa sull'uso di una dna polimerasi che duplica il dna. Sono necessari: - filamento stampo singolo di dna - primer - nucleotidi trifosfato - conoscere la sequenza del dna che si vuole amplificare, almeno 20 nucleotidi. 1- Denaturazione del DNA apertura della doppia elica riscaldando il filamento a 94gradi. 2- Annealing si abbassa la temperatura gradualmente e si appaia il primer al filamento stampo 3- Allungamento Polimerizzazione avviene a 72 gradi grazie all'utilizzo di una Taq-polimerasi Al primo ciclo la dna pol trascrive tutto il filamento, dal secondo in poi da vantaggio alla sequenza di interesse. Ad ogni ciclo il numero di molecole di dna raddoppia; resa teorica: Y=n*2^N n: molecole di partenza N: numero di cicli di PCR La resa effettiva è sempre diversa -> dna pol perde efficienza dopo alcuni cicli, può esserci contaminazione --> FASE PLATEAU. ORGANIZZAZIONE DEL GENOMA Le copie di geni formano le famiglie: Famiglie di geni ripetuti: copie identiche che codificano per lo stesso elemento (rRNA • e istoni) Famiglie geniche classiche: geni con somiglianza ma specializzati (es.globine) • possono essere organizzati in clusters o essere interspersi nel genoma Superfamiglie geniche: copie con una certa omologia di sequenze amminoacidiche piu • che nucleotidiche. - Geni paraloghi: originano dal medesimo gene ma danno origine a specie diverse (es. da globina mioglobina e citoglobina) - Geni ortologhi: geni con la medesima funzione in specie diverse (mioglobina nell'uomo e nel topo) DUPLICAZIONE GENICA Mutazione tale per cui una polimerasi copia due volte lo stesso tratto di DNA; se il genoma trova in questo un vantaggio evolutivo le mantiene; se non trova vantaggi una delle due copie accumula mutazioni. Le mutazioni possono portare il gene a specializzarsi oppure a silenziarsi -> PSEUDOGENE, gene con caratteristiche codificanti non più funzionale. Oltre ad errori della dna polimerasi anche errori di ricombinazione possono portare a duplicazione genica. In condizioni normali durante il crossing-over due cromosomi omologhi si scambiano regioni, senza produrre duplicazioni. Avere copie molto simili di sequenze, può portare ad un errore del crossing-over (es. appaia beta e delta globina invece che beta e beta) Vediamo un esempio con il gene Alu - le sequenze Alu sono sequenze SINE (short interspersed element) e rappresentano il 10% del genoma. Alu è specifica dei primati. Probabilmente deriva dalla retrotrasposizione di un gene trascritto da RNA pol III. Un cromosoma paterno possiede in ordine: gene Alu(1), gene emoglobina e un altro gene Alu (2); lo stesso per il cromosoma materno. Eventi scorretti di crossing over possono appaiare erroneamente Alu1 paterno con Alu2 materno o viceversa. TRASPOSIZIONE Distacco di un tratto di dna e reinserimento in un altro. Ci sono 3 tipi di trasposizione Senza guadagno di sequenze • Tratti di dna si spostano e si inseriscono in un nick; questo non porta a duplicazione; è un evento che si verifica in tutti i genomi perchè esistono tratti con maggior probabilità di trasporsi, i trasposoni-> hanno a valle determinate sequenze riconosciute da proteine che le vanno a tagliare. A DNA • Trasposizione in seguito a duplicazione, un tratto duplicato erroneamente viene lasciato libero e si inserisce da un'altra parte; in questo caso si avrà un'organizzazione interspersa A RNA, retrotrasposizione • Tipologia più frequente, mRNA subisce processi di maturazione e prima di arrivare al citoplasma incontra una trascrittasi inversa -> rna farà da stampo per dna, si formerà ibrido, rna degradato, dna copiato da dna polimerasi -> copia vagante nel nucleo che andrà in posizioni casuali del genoma. Distinzione tra le ultime due tipologie: - nella trasposizione a dna troveremo una copia con tutti gli elementi presenti nel gene di partenza - nella t. a rna la copia non avrà ne promotore ne introni Quindi le copie originate da retrotrasposizione solitamente non sono espresse, perchè non hanno il promotore. L'eccezione succede nel momento in cui la copia si inserisce a valle del promotore di un altro gene -> RETROGENE La maggior parte delle volte però produce pseudogeni. Gli pseudogeni si dividono quindi in: - Tipo I non processati -> derivano da trasposizione a DNA, in genere non vengono trascritti. - Tipo II processati -> derivano da retrotrasposizione e si trovano interspersi nel genoma. >Casi di retrotrasposizione dal rna pol III: creano geni processati perchè se trascritti da rna polimerasi III presentano il promotore interno, dunque il gene può esprimersi. Un esempio sono le sequenze Alu (ripetute, intersperse e non codificanti) Analizzando il dna si è visto che molti retrogeni provengono da geni localizzati sul cromosoma X che codificano per proteine importanti in entrambi i sessi. Durante la gametogenesi maschile il cromosoma X si inattiva per un breve tempo, ma i geni hanno trovato vantaggio a retrotrasporsi per non avere mancanze. >Esempi - Le proteine HLA di classe I, importanti per il riconoscimento del self e del non-self, sono un esempio di famiglia genica classica con geni specializzati. - Anche le globine sono una famiglia genica classica; i geni alpha (c.16) e i geni beta (c.11) hanno in comune la LCR che funziona da enhancer, attraverso associazione con diverse proteine attiva i promotori dei singoli geni. Alpha e beta sono tra loro però superfamiglia in quanto si trovano su diversi cromosomi. RARO perchèsilenziato Organizzazione degli rRNA sono ripetuti e organizzati in cluster; ci sono circa 6000 geni che codificano per l'RNA. RNA è molto versatile, si trova nella sintesi proteica, nella telomerasi, nella regolazione genica e nel silenziamento (miRNA)... Anche i geni RNA possono essere singoli o in copie. Gli rRNA sono organizzati in 5 grossi cluster a livello dei 5 cromosomi acrocentrici; su ogni cluster ci sono unità trascrizionali ripetute che comprendono spaziatori interni + geni codificanti Altre classi di geni per RNA - snRNA: small nuclear RNA; riconoscono e processano gli introni - snoRNA: small nucleolar; maturazione rna ribosomiali - miRNA: microRNA; ruolo nel silenziamento genico - long non-coding RNA (>100 nucleotidi); il primo scoperto è stato XIST insieme TSIX, coinvolti nell'inattivazione del cromosoma X Le sequenze ripetute in cluster prendono il nome di satelliti. - dna satelliti classici sono ricchi in A e T, di piccole dimensioni e altamente ripetuti - beta satelliti sono ricchi in G e C e più lunghi - mini satelliti: si trovano a livello dei telomeri, sono corti e poco ripetuti; a volte si trovano anche negli introni -> creano uno spazio per possibili mutazioni, diminuendo la possibilità che colpiscano gli esoni - micro satelliti: piccolissimi cluster che si trovano in tutto il dna dacollegareacitogenetica Ad esempio alcune sinpasi usano il glutammato -> liberato dalla vescicole presinaptiche che si fondono con la membrana pre-sinaptica -> il glutammato viene rilasciato nello spazio sinaptico e si lega alla membrana post-sinaptica -> apertura del canale del sodio -> depolarizzazione e poi apertura del canale del magnesio; Grazie a questo avviene il rilascio di calcio -> vescicola post sinaptica si fonde con membrana e aumentano i recettori per il GABA. Mutazioni a carico dei canali nel SNC sono spesso associate ad epilessia -> mutazione nel canale del sodio creano anomalo flusso di calcio ed eccessivo rilascio di GABA. Anche a livello cardiaco possono esserci mutazioni -> la ripolarizzazione dopo l'entrata del calcio deve essere molto veloce per la successiva contrazione cardiaca -> ritardo in questa ripolarizzazione causa la sindrome del QT lungo che porta aritmie cardiache. Alterazioni dei canali sono state anche associate alla sindrome del colon irritabile ->alterano la funzionalità della muscolatura liscia nell'apparato gastroenterico e quindi della peristalsi. MECCANISMI DI TRASPORTO ATTIVO Può essere primario (usa energia da fosforilazione atp) o secondario (sfrutta energia di gradiente di concentrazione creato da trasporto attivo primario). Le pompe ATPasiche si dividono in: CLASSE P: più semplici, caratterizzate da subunità alpha che utilizza ATP e subunità • beta regolatoria. Trasporta ioni H+, sodio, potassio e calcio. Queste pompe sono presenti a livello della membrana plasmatica, nel trasporto del calcio a livello del reticolo e nelle cellule dello stomaco CLASSE V e F: implicate solo nel trasporto di ioni H+ • La classe F sintetizza ATP e si trova sulla membrana mitocondriale interna; La classe V porta H+ a gli organelli che necessitano di abbassare il pH. CLASSE ABC: classe eterogenea, alcune garantiscono la sopravvivenza batterica ad • agenti esterni, sono pericolose per l'uomo in quanto costituiscono la resistenza agli antibiotici - Pompa calcio (Ca2+ atpasi) Trasporta calcio dal citosol al REL o dal citosol all'esterno della cellula; va contro gradiente. La pompa presenta due siti ad alta affinità nella sua parte citosolica, dove la concentrazione di calcio è molto bassa; in questo modo si legano due ioni calcio e l'atp andrà a fosforilare la pompa -> cambio comformazionale che consente il passaggio del calcio nel reticolo. A questo punto anche i siti di legame cambiano diventando a bassa affinità in modo tale da rilasciare il calcio. La pompa è formata da un'unica catena polipeptidica con 10 domini transmembrana. - Pompa Na/K La pompa sposta 3 molecole di Na+ all'esterno e 2 molecole di K+ all'interno; entrambe quindi contro gradiente. Sul versante citosolico presenta un sito di legame per l'ATP e dei siti per gli ioni - il sito per il sodio è interno (x spostarlo all'esterno) e sono ad altà affinità (perchè Na> all'esterno) - il sito per il potassio é a bassa affinità (perchè K> all’interno) Entrambi i siti cambieranno affinità una volta avvenuto il passaggio per rilasciare gli ioni. - Torniamo alle pompe ABC Possiedono una regione in grado di legare ATP, e hanno per questo due siti di legame. Tra le pompe ABC si trova la classe MDR (multi drug resistance); Presenti nelle cellule batteriche veicolano il passaggio di sostanze attraverso i doppi strati lipidici, o come pompe o tramite flip-flop. Negli eucarioti si trovano a livello delle cellule epatiche: secernono sali biliari e lipidi • trasportano sostanze fuori da epatocita • -> fondamentali per funzione di detossificazione del fegato. Queste pompe hanno anche la capacità di secernere all'esterno un farmaco assorbito, questo è un problema nei chemioterapici, infatti si è notato che nei pazienti con alta resistenza ai farmaci era presente un aumento di queste pompe ABC. Tutte le proteine ABC presentano 12 domini transmembrana e 2 siti di legame per l'ATP. > fibrosi cistica La proteina mutata nella fibrosi cistica CFRT fa parte della categoria abc, è infatti un trasportatore del cloro. La pompa CFTR agisce solo quando fosforilata da una PKA, attivata a sua volta da un aumento di cAMP. (vedi parte genetica). krimaneliberonelcitosol diventaad altaaffinitàdopocambiocomtorperchesispostanotuor IL CICLO CELLULARE Sequenza ordinata di eventi che porta alla duplicazione della cellula Interfase • - Fase G1: crescita di dimensioni; 1 cromosoma = 1 cromatide Fase preparatoria, grande sintesi proteica e duplicazione degli organelli. È la fase più variabile in durata. - Fase S: duplicazione materiale genetico; duplicati anche gli istoni. Si formano multiple forche di replicazione; prima si duplica eucromatina e poi eterocromatina. - Fase G2: 1 cromosoma = 2 cromatidi; vengono prodotte le proteine per la condensazione della cromatina e si effettua la sintesi della tubulina per il fuso mitotico. Fase M: mitosi e citocinesi quindi divisione nucleare e citoplasmatica • Cellule possono dividersi in: - cellule senza più capacità di dividersi (neuroni, globuli rossi) - cellule che possono essere indotte a dividersi (epatociti) - cellule che continuano a dividersi (oogoni, c.epiteliali) Durata del ciclo cellulare dura da 30 minuti a diversi mesi Indice mitotico -> frazione di cellule in mitosi in un determinato momento; (usato ad esempio con i tumori) Dalla fase G1 si può infatti passare alla fase G0, permanente o transitoria. In questa fase si mantengono caratteristiche della cellula ma senza proliferazione cellulare. Ad ogni passaggio del ciclo ci sono dei punti di controllo per evitare che entrino cellule con danni al DNA. Prima della fase S controllo se cellula abbastanza grande, ambiente favorevole e integrità dna Alla fine della fase S controllo per aver duplicato tutto il dna una sola volta. Alla fine della fase G2 ulteriore controllo integrità dna. Ultimo controllo alla fine della mitosi, per controllare che tutto il materiale sia stato equamente ripartito tra le cellule figlie. - Come si è capita l'esistenza dei checkpoint? Fusione cellula in fase S e in fase G1 -> proteine in fase S passano in fase G1 e la portano avanti; se ci sono proteine di blocco invece si blocca fase di sintesi Quindi alla fine si è scoperto che ci sono proteine che consentono di passare alla fase successiva, diverse per ogni fase. Anche durante lo sviluppo del sistema nervoso interviene l'apoptosi, serve rapporto 1:1 tra neurone pre-sinaptico e cellula post-sinaptica. Stessa cosa avviene durante l'embriogenesi. Anche durante allattamento materno dove si ha aumento della ghiandola mammaria, apoptosi interviene una volta finito l'allattamento. Anche la prostata va incontro a involuzione quando calano i livelli di testosterone, Bisogna avere un bilancio tra le proteine apoptotiche e anti-apoptotiche, cioè tutti i fattori di crescita. Processi che mandano in apoptosi: - mancanza segnali positivi -> come per i fattori di crescita - presenza segnali negativi -> come perdita della funzionalità mitocondriale -Via estrinseca Segnale esterno su recettore sulla membrana cellulare, prima caspasi 8 che attiva altre caspasi e porta alla morte cellulare. La caspasi 8 attiva la caspasi precursore tramite taglio; le ultime caspasi che tagliano dna e organelli sono chiamate caspasi effettrici. -Via intrinseca in caso di danno mitocondriale, rilascio di citocromo C nel citoplasma -> segnale di grave danno -> attivazione caspasi 9 e altre caspasi e morte cellulare I VIRUS I virus sono parassiti intracellulari obbligati, necessitano di una cellula per potersi replicare. I virus vengono detti polifiletici in quanto non derivano da un antenato comune. Il loro genoma può essere costituito da dna o da rna. Sono acellulari e non hanno citoplasma Virione-> quando il virus è assemblato, avviene soltanto fuori dalla cellula ospite In genere sono specifici per le cellule che infettano. STRUTTURA - Genoma: RNA o DNA, doppia elica, singolo filamento, circolare o lineare - Capside: involucro proteico formato da capsomeri (genoma+capside = nucleocapside) - Envelope: membrana fosfolipidica con glicoproteine, componente accessoria Virus difettivi: si replicano soltanto in presenza di altri virus. Il genoma virale codifica per: Proteine funzionali o precoci: permettono di replicarsi, sono le prime ad essere • sintetizzate Proteine strutturali o tardive: costituenti capside ed envelope • Proteine per alterare la cellula ospite • MORFOLOGIA Complessità del genoma virale rispecchia quella del virione. I capsomeri che lo proteggono hanno due diverse conformazioni: - Simmetria elicoidale: capsomeri si avvolgono ad elica attorno al genoma, quindi acido nucleico a stretto contatto con le proteine virali. Tutti i virus con capside a simmetria elicoideale posseggono envelope - Simmetria icosaedrica: ci sono due tipi di capsomeri, pentoni ed esoni; tipica degli adenovirus I virus a RNA possono essere a polarità positiva, in cui rna usato direttamente come mrna, oppure a polarità negativa dove rna fa da stampo per un mrna. CICLO VIRALE Eclissi: entrata delle particelle virali nelle cellule e disassemblamento virione • Fase latente: curva a zero, replicazione acido nucleico • Fase di maturazione: assemblaggio del genoma • Fase esponenziale: rilascio della progenie all'esterno della cellula • Il ciclo può essere LITICO o LISOGENICO Il ciclo litico porta alla lisi della cellula; nel ciclo lisogeno il dna virale si integra con il genoma della cellula ospite e rimane latente per un periodo piu o meno lungo, fino ad punto in cui si riattiva e da inizio al ciclo litico. L'infezione virale può avere vari esiti: - produttivo -> cellule permissive, rilascio progenie virale - abortivo -> cellule non permissive, non hanno componenti per la replicazione virale - restrittivo -> cellule transitoriamente permissive, infezione latente Classificazione di Baltimore Si basa su natura e polarità del genoma virale Classe I : DNA a doppio filamento • Classe II: DNA a singolo filamento • Classe III: RNA a doppio filamento • Classe IV: RNA a singolo filamento polarità positiva (coronavirus) • Classe V: RNA a singolo filamento polarità negativa • Classe VI: RNA a singolo filamento con transcrittasi inversa (HIV) • Classe VII: DNA doppio filamento con gap • PRIONI = Proteinaceous infective only particle Agenti patogeni sprovvisti di acido nucleico, molto resistenti e in grado di convertire proteina sana in patogena. Colpiscono soprattutto il sistema nervoso (neuropatia spongiforme). Gene PRNP codifica per proteine prionica, su cromosoma 20, coinvolta in trasporto ioni in SNC Forma sana possiede piu alpha eliche che beta foglietti, forma patogena il contrario. RETROVIRUS • Divisi in 3 famiglie - oncovirus: trasformazione tumorale - lentivirus: causano progressiva compromissione sistema immunitario - spumavirus: per patologie animali Il virione possiede envelope e due catene di RNA a polarità positiva; i retrovirus posseggono transcrittasi inversa. Il loro genoma ha 3 geni: - gag per proteine strutturali - env per envelope - pol per enzimi virali Inoltre possiedono la sequenza packaging che permette assemblaggio virione e le sequenze terminali LTR che contengono promotore virale. La transcrittasi inversa sintetizza dna partendo da rna e degrada rna in filamento ibrido (RNAsi H) ESTRANSCRITASIINVERSA ORGANISMI MODELLO PER LO STUDIO DEL DIFFERENZIAMENTO C.Elegans -> nematode piccolo e trasparente, permette di visualizzare tutte le fasi dello sviluppo. Primo organismo pluricellulare a cui è stato sequenziato il genoma Drosophila -> modello più utilizzato in genetica, breve ciclo vitale e rapido sviluppo, struttura semplice, trasparente. Zebrafish -> il più semplice vertebrato; 80% dei geni coinvolti in patologie umane ha un suo equivalente in zebrafish Differenziamento del sistema nervoso • SNC deriva da ectoderma, si origina la placca neurale che si ripiega a formare il tubo neurale; le cellule della cresta neurale migrano a formare SNP, denti, cellule C e scheletro cranio-facciale. Differenziamento dell'epitelio intestinale • Deriva da endoderma ed è costituito da un unico strato di cellule; epitelio organizzato in pieghe per aumentare la superficie di assorbimento. Le cellule staminali intestinali si trovano alla base delle cripte di Lieberkuhn, le cellule prodotte dovranno poi migrare in superficie. Nell'intestino abbiamo 4 diversi tipi di cellule differenziate: enterociti, mucipare caliciformi, enteroendrocrine e cellule del Paneth -> forniscono nicchia per cellule staminali e producono segnali per mantenerle indifferenziate. Per il mantenimento è essenziale il segnale WNT, dove il segnale è assente si ha differenziamento. Nei tumori intestinali sono presenti mutazioni che attivano segnale wnt erroneamente. A livello intestinale è importante anche il pathway di Notch, recettore presente sulle cellule che se attivato inibisce le cellule staminali vicine. Quindi con Notch attivato si avrà differenziamento delle cellule staminali ad enterociti, con Notch disattivato a secretorie. Differenziamento del midollo osseo • Nel midollo troviamo sia cellule emopoietiche sia cellule mesenchimali. Le mesenchimali sono multipotenti in grado di differenziare in condrociti, osteoblasti, fibroblasti e adipociti. Sono circa lo 0.01% delle cellule nel midollo. Il fattore fondamentale per il loro differenziamento è la matrice nel quale sono immersi -> pathway di HIPPO Proteine fondamentali YAP e TAZ forniscono informazioni al nucleo sulle caratteristiche della matrice -> su matrice molle aumentano, su matrice dura inducono proliferazione cellulare. controlla Differenziamento delle cellule emopoietiche • Dalle staminali emopoietiche derivano cellule staminali linfoidi e mieloidi. Cellule della linea mieloide sono granulociti, monociti ed eritrociti; Cellule della linea linfoide sono i linfociti T e B. Le cellule staminali vengono generate tardi nello sviluppo (x le emopoietiche); le prime cellule progenitrici (no staminali) si formano nella regione mesonefro-gonade-aorta, ed in particolare queste cellule derivano dall'endotelio dei vasi -> transizione endoteliale emopoietica, processo particolare che avviene solo nell'embrione, che consente che cellule dell'endotelio differenzino in cellule del sangue. TERAPIA GENICA Modificazione del patrimonio genetico di una cellula somatica a scopo terapeutico. Consiste nel somministrare un gene corretto, spegnere o sostituire un gene difettoso. La terapia cellulare somministra invece cellule sane o curate; esistono anche le terapie farmacologiche ed enzimatiche che però non correggono il difetto alla radice. La terapia genica viene utilizzata in malattie genetiche, autoimmuni, degenerative e tumori. Ci sono due approcci di terapia genica: In vivo: introduzione di un'informazione genetica nel paziente mediante un vettore; • attuata nei casi in cui le cellule non possono essere messe in coltura (cervello,cuore) Ex vivo: si prelevano cellule o tessuti dal paziente, si trattano e si rimpiantano. È un • metodo più lungo e dispendioso ma spesso più efficace. A seconda del difetto da correggere ci sono diverse strategie di terapia: - Approccio additivo -> aggiungere copia del gene sano, usato per alcune immunodeficienz - Sospensione di un gene -> si silenzia un gene mutato inserendo dei miRNA; utilizzato in situazione da accumulo tossico come la corea di Huntington - Editing del genoma -> si fornisce gene sano tramite ricombinazione omologa; grazie a tecnologia CRISPR-Cas9 che permette di tagliare una parte del genoma che viene poi corretto e riparato. Ci sono diversi tipi di vettori, virali o non virali Vettori non virali • Dna nudo incapsulato in lipidi Pro -> assenza di risposta infiammatoria Contro -> bassa efficienza di trasduzione, vettore rimane spesso nel luogo di iniezione Metodo usato per i vaccini covid Vettori virali • - Retrovirus PRO si integrano con genoma ospite hanno elevata efficienza di infezione CONTRO difficili da controllare, possono dare effetti indesiderati incapaci di infettare cellule quiescenti Per creare un vettore retrovirale bisogna assicurarsi di eliminare tutto ciò potenzialmente pericoloso -> si tolgono i geni gag,pol,env e si sostituiscono con il gene d'interesse ed il suo promotore; Talvola si inserisce un altro gene env per modificare il tropismo del virus. Il virus si integra senza trascrittasi inversa perchè possiede la proteina trascrittasi inversa prodotta da plasmide helper. - Vettori lentivirali PRO stessi vantaggi dei retrovirus ma possono anche infettare cellule quiescenti CONTRO stessi dei retrovirus In questi vettori non ci sono gli stadi di latenza e replicazione, ma solo di rilascio. Il vettore dell'HIV è uno dei più usati: si divide genoma di HIV in tre plasmidi vettori - costrutto transfer che contiene gene terapeutico con il suo promotore - costrutto packaging - costrutto envelope dove si può agire per cambiare il tropismo - Adenovirus PRO infettano anche cellule quiescenti possono contenere grandi geni non hanno rischio di mutagenesi CONTRO effetto transitorio forte risposta immunitaria - Adenovirus associati PRO si integrano e non sono patogenici possono integrarsi in modo specifico nel cromosoma 19 bassa risposta immunitaria CONTRO non possono accogliere geni di grandi dimensioni bassa produzione di cellule infettanti Quindi la risposta adattiva necessita di tempo per attuarsi (7-15gg), ma la seconda volta che si incontra l'antigene la risposta è più veloce e più potente. Nella seconda risposta avremo molti IgG, nella prima molte IgM. Quindi anticorpi IgG indicano una vaccinazione o un'infezione passata con avvenuta risposta. (anticorpi di memoria) Gli anticorpi sono glicoproteine costituiti da 4 catene polipeptidiche - due catene pesanti di circa 400 aa - due catene leggere di circa 200 aa I primi 100 aa all' N'terminale sono estremamente variabili, e sono le porzioni che riconoscono l'antigene -> regione variabile Ci sono anche regioni ipervariabili. La regione costante della catena pesante è diversa a seconda della classe dell'anticorpo: - IgM catena mu; - IgG catena gamma; - IgA catena alpha; - IgE catena epsilon; - IgD catena delta; Le catene leggere sono solo di due tipi: - kappa - lamda Immunoglobulina M (IgM) • Terza più abbondante nel siero; Sono i primi anticorpi che si producono al primo contatto con l'antigene (prodotte anche dal neonato) Sono pentameriche tenute insieme da ponti disolfuro e catena peptidica J chain Dato che sono molto grandi non passano negli spazi intercellulari ne attraversano la placenta; si trovano circolanti. In forma monomerica è il recettore presente sul linfocita B che lo attiva riconoscendo l'antigene; la plasmacellula poi produce IgM pentamerica. Sono molto efficienti nell'attivare il complemento. Immunoglobulina G (IgG) • Sono la maggior parte delle Ig (80%); Sono piccole quindi passano negli spazi interstiziali e nella placenta; alla nascita ne abbiamo già un corredo materno, con vita media di 6 mesi. Attivano il complemento e interagiscono con i recettori sulle cellule fagocitarie (batterio rivestito da IgG viene fagocitato=opsonizzazione) Vengono prodotte in grandi quantità al secondo incontro con l'antigene e costituiscono la memoria immunitaria (IgG responsabili di attivazione complemento in eritroblastosi fetale) Immunoglobuline A (IgA) • Molto abbondanti, uniche secrete nelle secrezioni come muco, saliva, lacrime e latte materno in forma dimerica -> catena J chain che unisce i monomeri permette trasporto endocitotico dal versante plasmatico al secretorio (superficie apicale) Immunoglobuline D (IgD) • Anche queste presenti su linfocita e svolgono funzione di recettore, non si trovano circolanti. Immunoglobuline E (IgE) • Sono legate ai fenomeni allergici, riconoscono antigene e si legano ai mastociti causandone degranulazione tramite rilascio di istamina. Risposta immediata vasodilatatrice ma non attacca antigene. - Cellule memoria non hanno le IgM sulla superficie, avranno G, D o E a seconda di quale tra queste producono. Epitopo può essere lineare o discontinuo (vicini a causa della struttura tridimensionale della proteina) -> in modo da avere la porzione proteica in grado di incastrarsi nelle cavità formate dall'anticorpo (sito legame). Il sito di legame dell'anticorpo è formato dalla regione ipervariabile di entrambe le catene. Isotipo: classe immunoglobuline • Idiotipo: idiotipi diversi riconoscono antigeni diversi, nella stessa classe di anticorpi • Allotipo: stessa classe generata da linee cellulari diverse. • Meccanismo di riconoscimento Le regioni variabili permettono di riconoscere gli antigeni; Si hanno migliaia di recettori diversi per antigeni diversi. I meccanismi di riconoscimento sono simili per linfociti B e T e consistono nella possibilità di combinare dei segmenti genomici. Nella catena leggera abbiamo due regioni in grado di ricombinare: Variable (V) e Joining (J). Nella catena pesante tre (V,D e J). In realtà ci sono anche 3 geni che codificano per l'anticorpo completo: - Locus K per catena leggera k - Locus lamda per catena leggera lamda - Locus unico per le catene pesanti I vari segmenti della catena leggera lamda creano circa 700 diverse possibilità di ricombinazione; quelli della catena K circa 400. Dopodiche una qualsiasi di queste ricombinazioni si ricombina a sua volta una combinazione della catena pesante. Per poter effettuare il meccanismo di taglia e cuci servono regioni che indicano i punti di interesse -> RSS (recombination signal sequences). Queste sequenze permettono la formazione di un'ansa nel dna che permette il taglio. Il taglio viene effettuato da Rag-1 e Rag-2 dopo aver riconosciuto RSS. Questi enzimi non lasciano le estremità libere ma formano una forcina, per riunirle servirà aprire il doppio filamento e le forcine, ma non sono enzimi precisi, quindi tagliano la forcina in maniera casuale. Quindi si possono aggiungere nucleotidi per avere sequenze complementari (palindromi), questo aumenta variabilità delle catene peptidiche ma causa anche rischio di alterare la cornice di lettura. Oltre ai palindromi si possono anche aggiungere nucleotidi casuali. Questo fenomeno viene detto flessibilità di giunzione produttiva o non produttiva. Non produttivo si intende quando la catene diventa non funzionale per codone di stop o frame shfit. La ricombinazione è a step successivi, prima catena pesante, poi leggera k e poi leggera lamda. Se dopo tutti questi passaggi i due alleli non sono funzionali il linfocita va in apoptosi. Nel momento in cui invece si produce una catena funzionale, tutti gli altri alleli vengono silenziati (esclusione allelica). Quindi funziona solo allele della catena pesante e allele della catena leggera riarrangiati. Tutti questi meccanismi avvengono prima dell'incontro con l'antigene. Il linfocita esprime IgM e IgD sulla superficie. Quando incontrano l'antigene attuano altre modifiche Ipermutazione somatica • Dopo alcuni giorni compaiono mutazioni di dna sulle regioni ipervariabili, aumentano ad ogni esposizione con l'antigene; questo meccanismo tende a generare linfociti B che hanno affinità maggiore per il proprio antigene. Le varianti sono comunque sottoposte a selezione positiva o negativa. Avviene nei centri germinali in seguito alla stimolazione dei linfociti B. Ipermutazione scatenata da citidina deaminasi che trasforma Citosina in Uracile; inoltre l'uracil-dna-glicosilasi vede uracile e lo rimuove creando un buco -> possibili appaiamenti sbagliati. - Cambio della classe di anticorpi Serve un nuovo processo di ricombinazione grazie a segnali di switching; il processo è irreversibile. È diverso dalla ricombinazione VDJ perchè tutti i cambi della catena pesante sono produtttivi ed il processo è regolato da segnali esterni dai linfociti T. Vengono eliminate dalla regione del dna le porzioni che codificano per mu e delta e rimangono le altre porzioni, tramite splicing. Quindi gli esoni modificati si trovano all'estremità 3'. Una volta che hanno accesso al circolo sanguigno possono dare metastasi in qualsiasi organo. Rallentamenti dei flussi nei vasi favoriscono le cellule tumorali che riescono ad aderire alle pareti dei capillari e fuoriuscire tramite fenestrazioni; gli organi più colpiti da metastasi sono il fegato e i polmoni. Ci poi tumori con particolari tropismi, soprattutto per il tessuto osseo. Composti chimici, radiazioni.. sono cancerogeni perchè alterano la struttura del DNA direttamente o indirettamente. Virus oncogeni trasformano le cellule che infettano dal momento che portano dei geni quali prodotti interferiscono con i controlli della crescita cellulare. La tumorigenesi è un processo multi-step, le alterazione influenzano soprattutto gli oncogeni che portano ad aumento proliferazione e gli oncosoppressori. Tali alterazione portano queste cellule ad avere un vantaggio sulle altre. Mutazione su oncogeni è gain of function, su oncosoppressori è loss of function. Per oncogeni basta quindi la mutazione di un solo allele per avere la proliferazione (m.dominante); allo stesso modo per gli oncosoppressori sono invece necessari entrambi gli alleli mutati (m.recessiva). L'accumularsi di mutazione può causare passaggio da tumore benigno a maligno; dopo varie mutazioni si arriva a neoplasia progressiva, carcinoma e metastasi. Nel tumore al colon la prima mutazione riguarda l'APC nel complesso proteico della via di WNT e le cellule continuano a proliferare, questo porta a una mutazione di Ras. Andando avanti con la proliferazione si ha la perdita di p53 (entrambi gli alleli) e dopo di questo il tumore diventa estremamente invasivo. ONCOSOPPRESSORI Esempi sono p53 (guardiano del genoma) ed Rb Si dividono in due categorie Gatekeeper: diretto controllo sul ciclo cellulare, regolano in maniera negativa la • proliferazione e in maniera positiva l'apoptosi. Per mutazione bisogna avere inattivazione di entrambi gli alleli - inibitori crescita - inibitori trasduzione segnale - soppressori Caretaker: intervengono soprattutto nel controllo dell'integrità del genoma e nella • riparazione dei danni del dna. Con entrambi gli alleli inattivati non si ha un vantaggio selettivo della crescita, ma si genera instabilità genomica e conseguente incremento delle mutazioni. Due importanti caretaker sono BRCA-1 e BRCA-2, geni mutati nel carcinoma mammario. I meccanismi di inattivazione degli oncosoppressori comprendono delezioni, mutazioni, virus e mutazioni epigenitiche come un ipermetilazione del promotore. Alterazioni di p53 si trovano nel 50% dei tumori umani in fase avanzata, infatti viene associato a prognosi sfavorevoli. Nel gene le mutazioni possono avvenire in qualsiasi punto. Rb può essere bloccato da proteine virali e lasciare sempre libero E2F; È stato evidenziato nel retinoblastoma -> tipo famigliare e tipo sporadico. In forma familiare compare nei bambini piccoli in entrambi gli occhi, forma autosomica dominante. Per avere il tumore è necessaria però una perdita di entrambi gli alleli, cioe una mutazione sull'allele non passato dal genitore. La forma sporadica compare negli adulti ed è generalmente monolaterale; anche qui sono necessarie due mutazioni su due alleli per sviluppare la malattia. Il virus del papilloma può agire sia su Rb che su p53. ONCOGENI Possono essere introdotti da virus o derivare da mutazioni di normali geni. Sono normalmente chiamati proto-oncogeni e svolgono funzioni legate alla proliferazione cellulare, spesso attivi nelle fasi di sviluppo e poi silenziati. Possiamo avere mutazioni nella sequenza regolatoria o nei promotori dei proto- oncogeni -> prodotta proteina normale ma in quantità elevata. Una mutazione o delezione porta invece alla produzione di una proteina alterata. Si può anche avere un riarrangiamento che porta ad una traslocazione della sequenza regolatoria. -> traslocazione cromosomica può creare una nuova proteina (proteina di fusione) con caratteristiche intermedie tra oncogene e un altro gene. Dunque possiamo avere mutazioni quantitative o qualitative. Oncogeni sono - fattori di crescita e recettori - proteine trasduzione - Cdk cicline Meccanismo di trasduzione alterato è molto spesso associato a trasformazione tumorale. Mutazione puntiforme di Ras sufficiente a causare il tumore, cosi come mutazioni a carico dei recettori, che diventano autonomi e attivano via trasduzione anche in assenza del ligando. Proto-oncogene può diventare oncogene anche per amplificazione -> aumento esponenziale delle copie del gene che possono anche portare all'allungamento dei cromosomi. Oppure creano i double minutes: porzioni di dna extra-cromosomiche contenenti soltanto oncogeni. Quindi in questo caso la mutazione non è nel gene ma risulta dalle troppe copie dello stesso. Dopo mutazione ed amplificazione c'è un altro modo per attivare un oncogene, la traslocazione -> spostamento della porzione di dna che interessa gli oncogeni. Uno dei casi riguarda Myc -> traslocazione tra cromosoma 8 dove c'è Myc e il cromosoma 14, entrambi nella porzione telomerica; questo porta a traslocazione bilanciata. Nella regione del cromosoma 14 troviamo il gene per la catena pesante delle immuno- globuline -> oncogene viene spostato dalla sua regione vicino a un promotore attivo (quello delle Ig) solo nelle cellule dei linfociti B (uniche a cui serve la catena pesante Ig). Nelle cellule B si avrà un aumento esponenziale di Myc -> proliferazione -> leucemia. Differenti tipi di leucemie dipendono dalle cellule colpite. - Leucemia mieloide cronica è abbastanza frequente e rappresenta il 15% delle leucemie, colpisce in età adulta. Con l'utilizzo della sola chemioterapia convenzionale l'aspettativa di vita era di 4 anni. Colpisce i precursori dei granulociti. Nel 1960 viene scoperto un riscontro a livello cromosomico -> un cromosoma 22 più corto nei soggetti affetti. Questo origina da traslocazione tra cromosoma 9 e 22 (cr.Philadelphia). Il cromosoma Philadelphia si trova anche in una piccola percentuale di affetti di un'altra leucemia. I geni interessati sono il gene BCR (su 22, normalmente espresso) e il gene ABL (da Abelson, colui che lo ha scoperto, su 9), un oncogene di cui esiste una forma virale molto simile presente in un retrovirus (scoperta avvenuta in seguito all’iniezione di questo virus in topi che hanno sviluppato poi un tumore). Si forma quindi una funzionale proteina di fusione -> tirosin-chinasi che modifica molte proteine; Ha anche una porzione che va a legare l'actina. Normalmente questa chinasi viene prodotta ripiegata su se stessa, con il sito attivo chinasico bloccato; in forma patologica la porzione che blocca il sito attivo non è presente. Normalmente inoltre la proteina ABL si trova in un complesso proteico con proteine del citoscheletro e proteine transmembrana. Il modello attuale per controllare la malattia è la biologia molecolare; È stato sviluppato un farmaco, Imatinib, grazie alla scoperta del trascritto di fusione e della proteina che attiva tutti i meccanismi di proliferazione cellulare. Il principio del farmaco consiste nel creare un substrato che si inserisce nella nicchia in modo definitivo, per impedire il legame della proteina di fusione e quindi la sua proliferazione. La sopravvivenza dei pazienti arriva nell'80% dei pazienti a 10 anni o più. I vettori devono avere replicazione autonoma con origine di replicazione, regione con siti di restrizione, regione per inserimento del dna e troviamo anche gene per resistenza all'antibiotico. I plasmidi possono contenere circa 5-10Kb. Enzimi di restrizione aprono il plasmide circolare e poi tagliano porzione da dna da inserire (gli stessi enzimi che hanno tagliato il plasmide) ->cosi il pezzo di dna presenta estremità complementari a quello del plasmide; Dopo si aggiunge DNA ligasi e si ottiene il dna ricombinante, ovviamente non i tutti i plasmidi. Come riconoscere i plasmidi con inserto da quelli senza? Si inseriscono tutti nella cellula batterica, i plasmidi si duplicano. Si avranno cellule senza plasmide, con plasmide normale e con plasmide ricombinante. Si aggiunge antibiotico: sopravvivono solo le cellule con il plasmide, sia ricombinante che non; in questo modo escludiamo le cellule che non hanno incorporato il plasmide. I plasmidi presentano anche il gene per beta-galattosidasi -> un particolare substrato diventa blu quando incontra questo enzima. Questo gene viene inserito nel punto di taglio del plasmide -> in presenza del dna inserito questo gene non è in grado di trascrivere (dna ha spaccato enzima Lacz) e non sarà blu ma bianco. Analisi dei cloni: Si prelevano tutte le colonie bianche e si analizzano. Per far entrare il dna nelle cellule eucariotiche è piu complicato. Si utilizzano i liposomi -> doppio strato fosfolipidico sferico in cui il dna viene posizionato; in grado di interagire con la membrana plasmatica. Il clonaggio può essere utile per produrre proteine ricombinanti usate in laboratorio o in terapia, come ad esempio l'insulina. Purificazione della proteina: importante perchè cellula con dna interesse contiene anche altre proteine che vanno tolte. Alla proteina da purificare viene attaccata un'altra proteina GIST che si attacca al glutatione a sua volta attaccato ad una colonna con biglie di agarosio. Mix di proteine (da purificare) viene messo sulla colonna -> mano a mano le proteine escono dalla colonna, prima quelle leggere e poi le pesanti -> attaccata sulla colonna rimane solo la proteina ricombinante grazie al GIST. Poi si separa proteina tramite taglio. Animali trans-genici Topo knock-out: si elimina un gene • Topo knock-in: si manipola gene sostituendo wild type con mutato • Topo condizionale knock-out/in: dna modificato ma modificazione attivata solo quando • l'animale è esposto a determinate sostanze somministrate postparto, per evitare che il topo muoia prima di nascere a causa del gene mutato. per topi knock-out si utilizzano i vettori di inserzione (dna simile a quello da modificare, rende gene non funzionale) con i knock-in vettori di sostituzione (si usa ricombinazione omologa). Si creano eterozigoti e si fanno accoppiare per avere omozigoti. Primo topo transgenico nel 1982. Si può creare anche modificando cellule staminali embrionali e iniettandole nella blastocisti, il topo sarà chimerico. Corso di laurea in Medicina e Chirurgia – Biologia #38 – Prof.ssa Donatella Barisani – Microarrays Microarrays Prof.ssa Donatella Barisani - 19/05/2022 - Sbobinatore: Elisabeth Poli , Revisore: Giovanni Gambale I microarrays sono stati fondamentali nel cambiare il modo di approcciarsi non sono alla biologia molecolare, ma anche alla pratica clinica poiché hanno permesso, grazie alla miniaturizzazione, di contenere un numero grandissimo di informazioni in strutture molto piccole (2 mm x 2mm) partendo da un campione molto limitato. Questo sviluppo è stato reso possibile grazie a un’evoluzione della biologia molecolare dal punto di vista metodologico, della scienza dei materiali (poiché sono stati creati supporti adatti per posizionare le molecole di interesse) e della bioinformatica, che con lo sviluppo di nuovi software ha consentito una lettura più facile e rapida dei dati. Prima dell’invenzione dei microarray per valutare l’espressione genica veniva utilizzata una tecnica, simile a quella del southern blotting, che prevedeva l’utilizzo di campioni molto grandi. Partendo da un pezzo operatorio si potevano ottenere un numero di informazioni relativamente elevato, ma utilizzando campioni ottenuti da biopsie endoscopiche il materiale a disposizione risultava essere troppo scarso e si riuscivano a ottenere informazioni riguardanti massimo 2/3 geni. Successivamente, con l’arrivo della PCR e soprattutto della PCR quantitativa, è stato possibile ottenere molte più informazioni, ma i microarray sono stati realmente rivoluzionari perché hanno permesso di ottenere da una biopsia piccolissima dati di espressione di circa 40 mila geni. Cosa sono i microarray e come funzionano I microarray sono dei supporti (se si lavora con gli acidi nucleici sono supporti in vetro) simili ai vetrini istologici, dove vengono posizionati oligonucleotidi o proteine. Il primo step per creare un chip (microarray) consiste nel selezionare un supporto sul quale posizionare un oligonucleotide, una proteina o un carboidrato. Successivamente su questo chip viene depositata la molecola che si è interessati a studiare e si osserva se avvengono dei match tra la molecola e il supporto (se si lavora con RNA o DNA avviene l’ibridazione). Si passa quindi al lavaggio del vetrino, per rimuovere il materiale che non si è legato, e all’analisi dei dati ottenuti. I chip a RNA permettono di verificare se un gene è espresso oppure no, mentre quelli a DNA (quindi con gli Single Nucleotide Polymorphism) permettono di capire se quel SNP è presente o manca a causa di una delezione di quella regione cromosomica. Esistono molti tipi di microarray che differiscono dal punto di vista chimico (vengono prodotti specificatamente in base alla loro funzione): - microarrays per il DNA (studio dei single nucleotide polymorphism) - microarrays per l’RNA (sono utili per capire quali geni sono espressi) - microarrays per micro-RNA - microarrays per proteine (che studiano l’interazione proteina-proteina) - microarrays per esoni Microarrays per proteine Corso di laurea in Medicina e Chirurgia – Biologia #38 – Prof.ssa Donatella Barisani – Microarrays La luce viene orientata attraverso una maschera di metallo con dei fori, in modo da selezionare quali gruppi protettivi colpire. Quando viene colpita la regione si libera lo spazio per l’attacco del nucleotide di interesse. Si prosegue allo stesso modo per i nucleotidi successivi, spostando di volta in volta la maschera andando a selezionare quali spazi per l’inserzione di un dato nucleotide si vogliono liberare. Questo processo viene svolto a strati perpendicolari, con un’estremità legata al vetrino e un’estremità libera. Su un vetrino di 2 x2 cm si riescono a posizionare oligonucleotidi per circa 20 geni. A questo punto si posiziona il DNA prelevato dal campione e marcato con un marcatore fluorescente in un liquido sopra il chip creato e avviene l’appaiamento tra gli oligonucleotidi del chip e il DNA complementare posto nel liquido. Dopo il lavaggio del vetrino il chip viene posto davanti a un laser e si procede con la rilevazione del segnale. Mediante l’utilizzo di un software apposito l’immagine creata dalla rilevazione della fluorescenza vengono normalizzati, filtrati e rappresentati in uno schema Corso di laurea in Medicina e Chirurgia – Biologia #38 – Prof.ssa Donatella Barisani – Microarrays Analisi dei risultati Hierarchical clustering. Questo tipo di approccio consente di raggruppare in dei cluster i geni che hanno pattern di espressioni simili in base a delle condizioni sperimentali che si sono caratterizzate in precedenza e questo potrebbe suggerire che vengono regolati dagli stessi fattori o che fanno parte di uno stesso pathway. A ogni riga del grafico corrisponde un gene e a ogni colonna corrisponde o un paziente o una condizione sperimentale. I colori danno informazioni riguardo l’espressione del gene, in rosso indica un aumento dell’espressione e in verde una riduzione dell’espressione. Si può osservare che in alcune cellule, sottoposte a stimolo, si ha il blocco di alcuni geni che fino a un certo periodo dopo lo stimolo rimangono totalmente silenti, si ha poi un aumento dell’espressione per poi tornare ai livelli di partenza Nel caso di alcuni tumori questo tipo di analisi è stata molto importante per identificare i pattern di espressione specifica che sono stati correlati allo sviluppano di recidive dopo l’intervento. Questo ha permesso di regolare il follow-up dei pazienti in modo più efficace per ognuno dei pazienti I dati ottenuti da ricerche utilizzando questo tipo di approccio poi sono stati portati in clinica nel follow up. Un altro metodo di analisi dei risultati è il principal component analysis. In questo grafico i pazienti dell’esperimento sono stati raggruppati in tre aree diverse in base al profilo di espressione questo significa che a priori, in base all’espressione, è possibile capire che tipo di leucemia ha il paziente e questo permette di avere un corretto trattamento della malattia. Nel grafico ciascuna delle tre zone identifica un tipo di leucemia differente: leucemia mieloide acuta(rosso), linfoide acuta derivante da cellule T (blu), linfoide acuta derivante da cellule B(verde), sono raggruppate in posti diversi. Microarray per esoni I chip per gli esoni sono utili per lo studio degli splicing alternativi che spesso possono essere coinvolti nello sviluppo dei tumori, nel caso in cui questi splicing alternativi riguardano gli oncogeni e gli oncosoppressori. Chip a DNA Corso di laurea in Medicina e Chirurgia – Biologia #38 – Prof.ssa Donatella Barisani – Microarrays Sono chip che valutano i single nucleotide polymorphism (SNPs) impiegati per nei Genome- Wide Association Studies (GWAS) Nell’utilizzo dei chip a DNA si riscontrano due problematiche: • Il DNA è una molecola molto stabile Gli array si basano sull’ibridazione tra l’oligonucleotide del substrato e il frammento di DNA/RNA introdotto, nel caso dei SNPs i vari frammenti differiscono per un solo nucleotide in molecole costituite da circa 25 nucleotidi questo ne consegue che l’appaiamento avviene in ogni caso tra i due frammenti e di conseguenza si rileva sempre la fluorescenza. Nei primi microarray sviluppati questo problema non si poneva perché venivano usati gli mRNA che sono molto diversi tra loro. Non c’è rischio che disegnando un oligonucleotide questo riconosca entrambi gli mRNA che invece si crea nel caso del DNA. Questa prima problematica è stata risolta grazie a una tecnica sviluppata da un gruppo di ricercatori nel 2000. Dato che era necessario discriminare per un solo nucleotide non ci si poteva basare sull’ibridazione si sono basati su ciò che veniva fatto con la PCR. La DNA polimerasi ha bisogno di primer e dell’estremità OH libera per partire con la sintesi. Per avere la sintesi il match tra l’ultimo nucleotide del primer e lo stacco (cioè quello che devo amplificare deve essere perfetto altrimenti la DNA polimerasi non riesce a partire. Questo concetto è stato utilizzato per permettere le analisi poli-macroarray per quanto riguarda il singolo nucleotide polimorfico. Reazione di allungamento del primer su microarrays di oligonucleotidi I ricercatori hanno pensato di creare un vetrino e di posizionare su di esso la sequenza con il singolo nucleotide polimorfico; hanno disposto gli oligonucleotidi in modo che l’ultimo nucleotide è quello dove c’è la variazione. Per creare gli oligonucleotidi hanno usato la variante A e la variante B. Successivamente hanno preso il DNA del paziente al quale non attaccano niente e lo hanno fatto ibridare con gli oligonucleotidi; quindi il soggetto potrà avere un DNA perfettamente complementare agli oligonucleotidi che finiscono con la B, mentre per quello che finisce con la A potrebbe non essere perfettamente complementare perché l’ultimo nucleotide è diverso. Arrivati a questo punto non si ha modo di sapere la risposta perché non è stato marcato il DNA e quindi fanno avvenire una reazione della polimerasi direttamente sul vetrino mettendo su di esso la polimerasi e un nucleotide marcato. La polimerasi può funzionare solo se c’è il match perfetto tra uno dei due nucleotidi ( A o B ) e il DNA del paziente. ILLUMINA SNP Assay Alcuni ricercatori partendo dal progetto citato sopra lo hanno modificato, smaterializzando il microarrays. Hanno inventato delle micro biglie di vetro sulle quali hanno attaccato i due oligonucleotidi che terminano o con la variante A o con B. Queste biglie vengono identificate con un codice a barre laser presente su di esse. Il concetto è il seguente ogni biglia al suo interno ha due varianti, nel liquido si attacca il DNA del paziente e con la polimerasi si inserisce Corso di laurea in Medicina e Chirurgia – Biologia #38 – Prof.ssa Donatella Barisani – Microarrays CRISPR CAS-9 è stato utilizzato per una terapia genica ex vivo nei pazienti affetti da talassemia e anemia falciforme. Con la terapia genica non si crea una catena beta perfetta ma si ha un quadro meno grave riattivando l’emoglobina fetale formata da due catene α e 2 catene ɣ ,ma non ha la catena β che manca nella β- talassemia ed è mutata nell’anemia a cellule falciformi. Nell’HbS in presenza di bassa tensione di ossigeno a causa della mutazione puntiforme in posizione 6 degli amminoacidi si ha la variazione della struttura della catena β e la polimerizzazione dell’emoglobina che tendono a formare delle vere e proprie fibre (talvolta vanno quasi a cristallizzare). Come consequenza si ha una variazione di forma degli eritrociti che non sono più flessibili e quindi vengono distrutti al passaggio nella milza portando ad un quadro anemico. Corso di laurea in Medicina e Chirurgia – Biologia #38 – Prof.ssa Donatella Barisani – Microarrays Nella β-talassemia si hanno delle catene β che non vengono prodotte oppure sono instabili e vengono immediatamente degradate. Quindi c’è uno sbilanciamento tra il rapporto delle catene α e delle catene β per cui si ha un'aggregazione anomala di catene α e la morte per apoptosi dei precursori dei globuli rossi. Nella β-talassemia si ha una eritropoiesi inefficace quindi il nostro organismo cerca di compensare aumentando la sintesi dei globuli rossi anomali. La conseguenza è l'espansione del midollo osseo con danni ossei importanti e splenomegalia (la milza rimuove i globuli rossi anomali) e danno epatico da deposizione di ferro (come se fossero anemici). Questi pazienti sono trasfusione-dipendenti e sono trattati con terapie per calare il ferro e per ridurre i danni secondari prodotti da questo. Domanda: “L’aspettativa di vita per chi è colpito da talassemia è per tutti uguale?” “La sopravvivenza non è uguale per tutti perché ci sono vari tipi di talassemia. Ci sono quel le che sono chiamate talassemia major e quelle che sono chiamate talassemia minor. Dipende dal tipo di difetto genetico, dipende da quanto è grave lo sbilanciamento tra le catene α e le catene β. Se lei ha un residuo di catena β di produzione (mutazione nel 3’ non tradotto) ha chiaramente una prognosi migliore mentre se lei non ha assolutamente produzione di catene β non è proprio messo bene. Tutti i pazienti sono comunque trasfusione-dipendenti.” Adesso si farà riferimento a due lavori in cui due gruppi indipendenti hanno utilizzato un approccio per cercare di aumentare la produzione di emoglobina fetale in questi soggetti per migliorare la loro sintomatologia. Si sono basati su andare a inibire la proteina chiamata BCL 11A che blocca la sintesi delle catene ɣ e che permette invece l’interazione della locus control region (LCR) con la catena β per dare origine alla produzione dell’emoglobina adulta. Avevano già visto che esistono in realtà dei polimorfismi di questa proteina BCL 11A dove, a seconda del polimorfismo, si può avere una produzione di emoglobina fetale più o meno alta. Se si ha tanta proteina BCL 11A si ha una produzione di emoglobina fetale alta e questo è un vantaggio sia in caso di talassemia che di anemia falciforme. Corso di laurea in Medicina e Chirurgia – Biologia #38 – Prof.ssa Donatella Barisani – Microarrays Per questo hanno preso delle cellule ematopoietiche staminali e dopo averle messe in vitro hanno usato approcci diversi: -nel primo lavoro è stato silenziato BCL 11° con i miRNA. -nel secondo lavoro è stata impiegata la metodica CRISPR CAS-9 per l’inattivazione di BCL 11A. Alla prima sperimentazione sono stati sottoposti 6 pazienti sickle cell (non talassemici) che sono stati seguiti per un tempo di circa un anno e mezzo. Questi pazienti avevano già avuto degli eventi vaso occlusivi o addirittura ictus. I risultati sono stati notevoli e in alcuni pazienti dopo il trattamento l’emoglobina fetale è arrivata quasi al 40%. In questo caso non si agisce sul DNA ma a valle introducendo un plasmide che produce il miRNA, il quale si attacca all’RNA di BCL 11A e lo degrada. Nel secondo lavoro la metodica CRISPR CAS-9 è stata usata in due soggetti: uno con una talassemia e l'altro con l’anemia a cellule falciformi. Somministrano ai pazienti, anche in questo caso, un farmaco che determina il rilascio delle ematopoietiche stem peripheral cell cioè delle staminali del sangue periferico. Dopo aver provocato a livello del DNA delle staminali la rottura del doppio filamento si vuole effettuare un knock-out quindi una non homologous end joining. E’ stato eseguito prima un enorme lavoro in vitro per essere sicuri e CRISPR CAS-9 agisse solo a livello di BCL 11A, dal momento che erano stati identificati ben 223 siti di possibile interazione.