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La cellula batterica
Dimensioni, forma e aggruppamento
La cellula procariotica è di forma sferica o cilindrica. La sua lunghezza varia da frazioni di μm a qualche μm. forma nome sferica o quasi sferica cocchi cilindrica bacilli corti cilindri coccobacilli cilindrica con estremità sottili bacilli fusiformi curvata lungo asse maggiore vibrioni, spirilli ramificata actinomiceti raggruppamento (cocchi) nome a due a due diplococco in ammassi irregolari stafilococco in catenelle streptococco raggruppamento (bacilli) avviene sempre lungo l’asse minore della cellula diplobacillo streptobacillo
Composizione chimica
- Acqua: rappresenta l’ 8 0% del peso totale della cellula; fa da solvente e da mezzo di movimento. Una parte è legata alle componenti cellulari o è inclusa negli idrati, sali inorganici che la contengono;
- componenti inorganiche: potassio, sodio, magnesio, calcio, ferro, zinco, fosforo, zolfo;
- componenti organiche a basso PM;
- componenti caratterizzanti: macropolimeri.
Colorazioni
procedimento caratteristiche evidenziate coloranti colorazioni semplici i batteri vengono messi a contatto tutti con lo stesso colorante morfologiche cristalvioletto fucsina basica fucsina fenicata violetto di genziana blu di metilene blu di Loeffler (blu di metilene in soluzione alcalina) colorazioni differenziali impiego di più coloranti in tempi successivi differenze di colorazione tra specie batteriche diverse, individuazione di strutture intracellulari colorazione di Gram colorazione di Ziehl- Neelsen
Vengono generalmente utilizzati coloranti organici con nucleo benzenico , costituiti da:
- un gruppo cromoforo, che ne determina il colore;
- un gruppo auxocromo , che migliora l’efficacia del cromoforo facendolo legare al substrato. Le soluzioni coloranti sono a base alcolica, ma vengono utilizzate in soluzioni diluite 1:10 o 1:100, nelle quali il colorante svolge la sua azione subendo una dissociazione elettrolitica. Tecnica generale a. Sterilizzazione e raffreddamento dell’ansa; b. prelievo del materiale e preparazione della sospensione microbica : per ottenere una buona osservazione, la carica microbica dev’essere non molto elevata; c. pulizia del vetrino portaoggetti con alcool 90° e deposizione su di esso di una goccia di sospensione; d. distensione della goccia o suo strisciamento; e. essiccamento del preparato all’aria o a calore blando su becco Bunsen; f. fissazione del preparato: a. con il calore su becco Bunsen, dalla parte opposta a quella sulla quale è stato disteso il preparato; b. tramite sostanze fissanti : alcool etilico (20 minuti), alcool metilico (2-3 minuti), soluzione in parti uguali di alcool-etere (10 minuti); g. colorazione e sua asciugatura mediante carta o calore blando; h. osservazione al microscopio con obiettivo ad immersione. Colorazione di Gram È stata messa a punto, originariamente, nel tentativo di differenziare Klebsiella pneumoniae dagli pneumococchi. Attraverso questa colorazione, effettuata a freddo :
- i batteri Gram-positivi trattengono in genere il primo colorante, anche dopo decolorazione blanda con alcool etilico o acetone;
- i batteri Gram-negativi , provvisti di uno strato lipidico esterno, perdono il primo colorante alla decolorazione ed assumono il secondo. Tecnica 1. Colorazione con **cristalvioletto per 2-3 min;
- lavaggio** con acqua senza asciugatura; 3. mordenzatura della colorazione (trattamento di 1 minuto con liquido di Lugol , soluzione di iodio e ioduro di potassio in acqua); 4. lavaggio con acqua senza asciugatura; 5. trattamento con decolorante (alcool etilico, acetone) per 20 secondi; 6. colorazione con fucsina diluita o safranina per 1-2 min.
Caratteristiche necessarie alla colorazione delle spore
- Fissazione energica;
- trattamenti preliminari del preparato (es. cloroformio, acido cromico) per modificare la permeabilità delle spore;
- utilizzo di mordenzanti fisici (calore);
- utilizzo di decoloranti (acidi, solfito sodico, alcool assoluto). Colorazione di Schaeffer-Fulton 1. Applicazione della tecnica generale ; 2. colorazione con soluzione acquosa di verde malachite al 5% per 30 secondi. Lavaggio senza asciugatura; 3. colorazione di contrasto con soluzione acquosa di safranina 0,5% per 30 secondi. Lavaggio con asciugatura; 4. osservazione : a. le spore appariranno in verde-azzurro ; b. le forme vegetative appaiono con una sfumatura tendente dal rosa al bruno. Colorazione di Giemsa Consente di colorare le cellule eucariotiche ed è impiegata per:
- differenziare le strutture cellulari ;
- individuare microrganismi a localizzazione intracellulare;
- la conta differenziale dei leucociti. **Tecnica
- Deposizione di una goccia di sangue** al bordo del vetrino e striscio ; 2. aggiunta di liquido di May-Grünwald sino a ricoprire il vetrino. Attendere 3 minuti; 3. fissaggio dello striscio, in quanto i coloranti sono in soluzione di alcool metilico; 4. diluizione del colorante aggiungendo acqua distillata in pari quantità. Attendere 3 minuti → l’eosinato di blu di metilene si dissocia in eosina (acido) + blu di metilene (basico); 5. inclinare il vetrino, scolarlo e cospargerlo con una soluzione di Giemsa e acqua distillata 1:10. Lasciare agire per 10-20 minuti; 6. lavaggio con acqua, asciugatura all’aria e osservazione. Esame microscopico a fresco La microscopia a fresco prevede l'analisi di campioni biologici non fissati e non colorati , mantenuti vivi. I campioni vengono generalmente sospesi in una goccia di soluzione fisiologica, per rispettare l’equilibrio osmotico della popolazione cellulare, e coperti con un vetrino coprioggetti. Questa tecnica consente di osservare:
- motilità e morfologia del microrganismo;
- il nucleo , i vacuoli o i granuli intracellulari, anche se con risoluzione non elevatissima;
- i processi dinamici in corso nella cellula (divisione cellulare, fagocitosi, risposta a stimoli esterni) e le correnti citoplasmatiche ;
- le interazioni microrganismo-cellula ospite.
Esame con inchiostro di china a fresco (Burri) o dopo colorazione La tecnica è simile ad un esame a fresco, ma la sospensione batterica viene mescolata ad una soluzione diluita con inchiostro di china. La metodica è utile per evidenziare la capsula batterica, che si renderà visibile per mezzo di un alone negativo che spicca su fondo nero. L’osservazione microscopica si può attuare con contrasto di fase e osservazione a fresco. Altre colorazioni
- Colorazione negativa: colorazione di un sottofondo con colorante acido ( nigrosina ). Viene utilizzata quando un organismo (o una sua struttura) non viene colorato facilmente;
- colorazione dei flagelli: utilizza un mordenzante (precipitazione dei sali dell’acido tannico) per evidenziare la struttura flagellare, altrimenti invisibile (diametro di 12- 1 3 nm).
Cromosoma batterico
Le cellule batteriche non hanno un nucleo ben definito : il materiale genetico è immerso nel citoplasma ed è costituito da un materiale filamentoso costituito da DNA di solito circolare che, nel complesso, viene definito nucleoide. La struttura nucleare del batterio è, quindi, assimilabile a quella di un cromosoma ( cromosoma batterico o cromonema ). Il DNA batterico non è legato a istoni , ma complessato labilmente a proteine acidiche. Molto spesso, una cellula batterica possiede non uno ma più cromosomi (due, in media), in quanto la replicazione del materiale cromosomico e la divisione cellulare non avvengono simultaneamente. Oltre al cromosoma possono essere presenti i plasmidi , molecole di DNA circolari più piccole del cromosoma, dotate di una relativa autonomia replicativa e che codificano per alcuni caratteri fenotipici (e patogenetici) del batterio.
Citoplasma e inclusioni citoplasmatiche
- Sono occasionalmente presenti granulazioni citoplasmatiche con funzione di riserva: accumuli di glicogeno, polimeri dell’acido beta-idrossibutirrico, polisaccaridi o polifosfati. I granuli di polifosfati presentano il fenomeno della metacromasia , ovvero si colorano in rosso se messi a contatto con il blu di toluidina;
- sono assenti correnti citoplasmatiche e vacuoli ;
- sono presenti ribosomi , bersaglio di alcuni antibiotici come le tetracicline, gli aminoglicosidi ed i macrolidi. I ribosomi batterici sono formati da RNA (60%) e proteine (40%) e sono costituiti da una subunità maggiore (50S) ed una minore (30S). I ribosomi batterici sono spesso collegati alle membrane del reticolo endoplasmatico, a formare l’ ergastoplasma.
Membrana citoplasmatica
- È organizzata in un bilayer fosfolipidico simmetrico, dello spessore di 80 Å, composto per il 40% da lipidi e per il 60% da proteine, oltre ad una piccola quota glucidica;
- la composizione in lipidi è relativamente semplice: sono presenti principalmente acidi grassi ramificati e derivati dal ciclopropano, mentre sono rari gli acidi grassi polinsaturi e assenti (a parte nei micoplasmi) gli steroli;
- la quota glucidica è bassa, ed è legata alla componente lipidica sotto forma di glicolipidi e glicosfingolipidi.
Struttura del peptidoglicano La parete cellulare è costituita dal peptidoglicano , un grosso polimero caratteristico della cellula procariotica.
- L’unità strutturale del peptidoglicano è formata da due carboidrati azotati, N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico , uniti da un legame β,1- 4 che può essere facilmente scisso dal lisozima ;
- al gruppo carbossilico dell’acido muramico è legato un tetrapeptide formato dagli amminoacidi: L-alanina, acido D-glutamico, L-lisina , D- alanina. La L-lisina è sostituita dall’ acido mesodiaminopimelico nei Gram- eccetto che nelle spirochete. L’acido mesodiaminopimelico si lega alla D-alanina mediante un legame peptidico diretto;
- i polimeri lineari che si formano sono collegati trasversalmente tramite le loro catene amminoacidiche mediante legami peptidici che si stabiliscono: a. nei Gram- (A) , tra l’acido mesodiaminopimelico in posizione 3 di un tetrapeptide e la D- alanina terminale del tetrapeptide adiacente; b. nei Gram+ (B), tra l’aminogruppo della lisina in posizione 3 di un tetrapeptide e la D-alanina terminale del tetrapeptide adiacente per mezzo di un ponte pentaglicinico. Sintesi del peptidoglicano 1. Sintesi dei precursori (N-acetilglucosamina e acido muramico) all’interno del citoplasma. La sintesi si completa durante il loro trasporto verso la membrana citoplasmatica; 2. estensione delle singole unità strutturali in corti polimeri; 3. formazione di legami crociati di transpeptidazione tra i polimeri lineari; 4. inserimento all’interno della parete cellulare.
Questi processi sono catalizzati dalle PBP ( Penicillin Binding Proteins ), che legano covalentemente la penicillina, le cefalosporine ed altri antibiotici β-lattamici, tutti antibiotici che esercitano la loro azione antibatterica proprio legandosi alle PBP e inibendo la sintesi del peptidoglicano.
1. All’interno del citoplasma, una molecola di NAG-P (N-acetilglucosamina fosfato) si lega ad una molecola di UTP (uridintrifosfato) dando origine ad una molecola di UDP-NAG (uridina difosfato-acetilmuramil-pentapetide) con liberazione di un radicale fosforico. Alla UDP-NAG si lega una molecola di PEP (fosfo-enolpiruvato), portando alla formazione di una molecola di UDP-NAG-piruvato. Questa reazione è catalizzata dalla fosfo-enolpiruvato transferasi , enzima inibito dalla fosfomicina. Il piruvato viene ridotto ad acido lattico con formazione di una molecola di NAM (acido N- acetilmuramico) che, ancora legato all’UDP, funge da accettore per alcuni amminoacidi che, in ordine di frequenza, sono: L-alanina, acido D-glutamico, L-lisina, D-alanina. La D- alanina si produce in una reazione differente, cui prendono parte: - una D-alanin-racemasi che trasforma L-alanina in D-alanina; - una D-alanil-D-alanil-sintetasi che catalizza la produzione del dipeptide. Entrambi questi enzimi sono inibiti dalla cicloserina; 2. il NAM-pentapetide , liberato dall’UDP che cede un altro radicale fosforico, lascia il citoplasma legandosi ad un vettore lipidico della membrana citoplasmatica, rappresentato da undecaprenil-fosfato o bactoprenolo. Il legame del NAM-pentapeptide al vettore lipidico avviene in contemporanea con il trasferimento di un legame fosforico all’UDP (formazione di undecaprenil-difosfato) e la liberazione di UMP. Al NAM-pentapeptide legato al vettore viene aggiunta una molecola di N-acetilglucosamina, con formazione di una unità basale peptidoglicanica completa. A questo punto sono polimerizzate una serie di unità basali complete, le quali sono legate trasversalmente tramite l’intervento delle PBP 1A e 1B , che agiscono in contemporanea ad enzimi transglicosilanti ed enzimi transpeptidanti ; 3. i corti polimeri di peptidoglicano sono liberati dall’undecaprenil-difosfato (reazione inibita da vancomicina e teicoplanina) e trasferiti all’esterno della membrana cellulare , ove viene rimossa una molecola di D-alanina. L’energia liberata viene utilizzata per l’ inserimento di frammenti polimerici nei siti di allungamento della parete (in corrispondenza di tagli effettuati da PBP di tipo 4), ad opera di PBP di tipo 2 e 3 (inibite da β-lattamici). L’undecaprenil-difosfato viene, infine, defosforilato da una fosfatasi (inibita dalla bacitracina) e riciclato per il trasporto di un’altra molecola di precursore. Nucleotide di Park. Corrisponde alla molecola di UDP-NAM-pentapeptide , nella quale gli ultimi due amminoacidi costituiscono un dimero D-alanina-D-alanina. Nel precursore, il tetrapeptide si trova sotto forma di pentapeptide e l’idrolisi del dimero fornisce l’energia necessaria per la formazione dei legami crociati. La sintesi del nucleotide di Park avviene nel citoplasma.
- Nei batteri Gram- , la neosintesi del peptidoglicano ha il compito di garantire l’ allungamento della parete (durante la fase di crescita della cellula) o la formazione dei setti (durante la divisione cellulare);
- nei batteri Gram+, la neosintesi del peptidoglicano ha anche il compito di mantenere un adeguato spessore della parete cellulare.
- Il peptidoglicano è ricoperto da una struttura particolarmente ricca in carboidrati e lipidi; gli arabinogalactani legano al peptidoglicano gli acidi micolici , acidi grassi a lunga catena ramificata cui sono legati glicolipidi fenolici ;
- i glicolipidi fosfoinositido-mannani e lipo-arabino-mannani sono legati alla membrana;
- le strutture periferiche dei micobatteri sono responsabili dell’ acido-resistenza : i micobatteri, anche uccisi, sono difficilmente penetrabili dai coloranti usati in batteriologia e, una volta colorati, resistono alla decolorazione, anche quando realizzata con acidi minerali forti. Questa caratteristica si traduce, nella fisiologia del micobatterio, in un rallentamento degli scambi selettivi di nutrienti e, dunque, della duplicazione cellulare.
Involucri esterni dei Gram-
- La parete cellulare dei Gram- è formata solo dal peptidoglicano (mancano gli acidi teicoici) ed è da 10 a 25 volte più sottile di quella dei Gram+;
- non riesce a contrastare il transito delle molecole idrofobiche , potenzialmente dannose per la membrana plasmatica; presenta, per questo, una seconda membrana cellulare esterna dalla struttura bilaminare ma dall’ organizzazione asimmetrica: - il suo foglietto interno presenta normali fosfolipidi ; - il suo foglietto esterno presenta il lipopolisaccaride batterico ( LPS ), che rappresenta, per i Gram-, la porzione endotossica, piogena, pirogena ;
- gli scambi con l’ambiente esterno sono garantiti da canali ( porine ) che permettono la diffusione passiva di composti idrofili (zuccheri, amminoacidi e ioni) di dimensioni inferiori a 600 - 700 dalton. Le molecole di più grandi dimensioni passano attraverso proteine carrier , che sono però una minoranza del totale. Le endotossine sono termostabili (resistono alle alte temperature) ed hanno effetti pleomorfi e indiretti , ovvero agiscono su tessuti e apparati anche distanti, attraverso l’intervento di mediatori. LPS tipici Struttura
- Porzione lipidica : è costituita dal lipide A, che rappresenta la componente endotossica vera e propria. È un glicolipide formato da glucosamina fosforilata ed esterificata con una serie di acidi grassi da 12 a 16 atomi di carbonio, che forma lo strato lipidico che interagisce con il foglietto interno. In un LPS tipico vi sono 6 catene di acidi grassi ;
- core della molecola: corta catena di zuccheri a struttura praticamente costante in tutti i Gram- e caratterizzata dalla presenza di acido chetodeossioctonico (KDO) e di un eptoso. Il core può essere distinto in due porzioni: - inner core , che contiene KDO ed eptosi; - outer core , che contiene gli zuccheri semplici (glucosio, galattosio, fruttosio);
- antigene O: è una lunga catena di zuccheri (fino a 40) formata dalla ripetizione di subunità tri-, tetra- o pentasaccaridiche di zuccheri non comuni (il che conferisce una configurazione antigenica altamente specifica ). Le varie catene polisaccaridiche sono strutture polari che legano cationi bivalenti (Mg^2 +) formando dei ponti tra le catene che rendono più compatto il rivestimento polisaccaridico del batterio. Negli LPS tipici, gli acidi grassi sono saturi , costituiti da 12-14 atomi di carbonio e non hanno ramificazioni (es. l’acido β-idrossimiristico). Lo zucchero è sempre rappresentato da due glucosamine, unite tra loro mediante legame β-1,6 glicosidico. Batteri caratterizzati da LPS tipici
- Enterobatteri quali E. coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Proteus mirabilis ;
- batteri con localizzazioni extraintestinali: Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Bordetella bronchiseptica ;
- batteri con localizzazioni intestinali ma non enterobatteri: Vibrio cholerae, Campylobacter, Aeromonas salmonicida, Plesiomonas shigelloides, Actinobacillus actinomycetemcomitans ;
- batteri che vivono nell’ambiente, nel suolo e nell’acqua : Stenotrophomonas maltophilia e Burkholderia cenocepacia , che causano infezioni soprattutto nel soggetto immunodepresso. Tra i batteri con LPS tipici vi sono, comunque, alcune differenze:
- il LPS degli enterobatteri ha una struttura asimmetrica per la disposizione degli acidi grassi sulle molecole di glucosamina. Una lega due gruppi fosfato e due acidi grassi, l’altra un gruppo fosfato e quattro acidi grassi;
- il LPS delle Neisserie ha una struttura simmetrica , in quanto entrambe le molecole di glucosamina sono legate a tre molecole di acidi grassi e due gruppi fosfato. LPS atipici Chemotipi a. Chemotipo rugoso (R, rough ): manca del polisaccaride O perché non ha gli enzimi che lo possano sintetizzare. Le colonie assumono un aspetto rugoso in quanto questo LPS è costituito prevalentemente da lipidi; b. chemotipo liscio (S, smooth ): ha un polisaccaride O molto lungo , i cui zuccheri attirano acqua e rendono liscio l’aspetto delle colonie.
Tossicità del lipide A alta tossicità E. coli, N. meningitidis, Flavobacterium meningosepticum bassa tossicità Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila. Porphyromonas gingivalis possiede un acido grasso in meno, per cui la potenza tossica dell’LPS diminuisce di circa 10-100 volte. Il suo lipide A, inoltre, è monofosforilato, il che abbassa ulteriormente di 100-1000 volte la tossicità tossicità assente Aquifex pyrophilus Gli acidi grassi a catena dispari sono assenti in tutti i LPS ad eccezione dei batteri anaerobi Gram- (2 acidi grassi a 17 atomi di C e 1 acido grasso a 15 atomi di C). Meccanismo d’azione del LPS La patogenicità del LPS non è dovuta ad una sua azione diretta, ma all’azione del sistema reticolo- endoteliale, che funge da mediatore degli effetti di LPS. TNF , prodotto dai macrofagi in risposta all’azione del LPS, è il principale mediatore dello shock endotossico. L’interazione LPS-macrofagi è mediata dall’unione del LPS alla proteina macrofagica di membrana CD1 4 , che ne rappresenta il recettore fisico. Le LBP si combinano all’LPS e lo veicolano sui macrofagi, catalizzandone il trasferimento sul CD14. CD14, tuttavia, non ha una porzione transmembranaria che gli permetta di raggiungere il citosol e di entrare in contatto con molecole coinvolte nella trasduzione del segnale, per cui interviene TLR- 4 ( Toll-like Receptor- 4 ): venendo in contatto con LPS-CD14, permette la trasduzione dei segnali di attivazione macrofagica e la liberazione delle citochine effettrici dell’azione endotossica (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8). TLR-4. Il complesso LPS-CD14 interagisce con TLR-4 e con la proteina accessoria MD- 2 , associata a TLR-4 e fondamentale per il riconoscimento del LPS da parte di TLR-4. Il legame del LPS induce la dimerizzazione di TLR- 4 - MD- 2 , formando un complesso attivo che avvia la trasduzione del segnale. Questa coinvolge i recettori TIR, TOLLIP, IRAK , che andranno poi ad attivare le MAP- chinasi e il fattore di trascrizione nucleare NF-κB , in grado di attivare i geni che codificano per peptidi ad azione antimicrobica.
TLR-2. Oltre a TLR-4, che è un omodimero, può intervenire anche TLR- 2 , eterodimero che può essere associato a TLR-1 o a TLR- 6. Anch’esso attraversa la membrana e innesca la trasduzione del segnale che porta all’espressione di geni che codificano per alcuni mediatori della risposta infiammatoria. TLR-2 ha un’elevata affinità per gli LPS, soprattutto atipici , ma anche per gli acidi lipoteicoici dei Gram+, per il peptidoglicano della parete cellulare e per lipoproteine presenti in diverse specie batteriche. I TLR, più in generale, si distinguono in: a. TLR citoplasmatici : TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9. La maggior parte ha affinità per prodotti propri di virus ed acidi nucleici; b. TLR di membrana : TLR-1, TLR-2, TLR-6, TLR-4, TLR-5. TLR-4 lega LPS tipici ( E. coli, Neisseria ), mentre TLR-2 lega LPS atipici ( Legionella pneumophila, Bartonella henselae ). TNF e IL-1. Rappresentano i principali mediatori rilasciati dai macrofagi attivati dopo il legame con il LPS. TNF è una citochina politropa che, insieme a IL-1, agisce da pirogeno endogeno attivando la via dell’acido arachidonico , con produzione di prostaglandine che aumentano la permeabilità vascolare. Ha un’ azione mitogena sui linfociti, aumentando la produzione di interferon-γ , aumenta il catabolismo proteico , rallenta il metabolismo del ferro , stimola l’ ipoglicemia e induce, nel fegato, produzione di β 2 - microglobulina e altre proteine della fase acuta. Un’altra conseguenza del rilascio di TNF e IL- 1 è l’attivazione della via alternativa del complemento : si formano grandi quantità di C3a e C5a, fattori proinfiammatori che innescano:
- i meccanismi dello shock emodinamico;
- l’attivazione dell’azione procoagulante dei linfomonociti, che facilita l’ aggregazione piastrinica e l’ attivazione del fattore XII di Hageman , iniziatore della cascata coagulativa. I risultati possono essere: a. CID (coagulazione intravascolare diffusa); b. ARDS (sindrome da distress acuto respiratorio); c. MOF (insufficienza multiorgano). Il danno diretto dall’endotossina, può essere, infine, aggravato dalla risposta del sistema immunitario alla stessa , soprattutto quando l’organismo è esposto ad elevate dosi di LPS, come avviene nelle sepsi da Gram-. Metodiche di estrazione del LPS
- Estrazione di Boivin : sfrutta una miscela estrattiva di acido tricloroacetico con contaminante proteico al 10%. L’acido disintegra le cellule ed il principio attivo della miscela estrae LPS dal marasma;
- estrazione di Westphal-Jann : miscela estrattiva di acqua/fenolo con contaminante proteico al 2-3%;
- estrazione di Galanos : sfrutta una soluzione estrattiva di fenolo-cloroformio-etere di petrolio con contaminante proteico al 0,1-1%. Tecnica particolarmente indicata per i ceppi rough ricchi di lipidi, perché è costituita da solventi lipofili;
- estrazione di Morrison : sfrutta una miscela estrattiva di butanolo con contaminante proteico al 40%. Viene utilizzata per LPS molto antigenici e per l’allestimento dei vaccini;
Strato superficiale cristallino (strato S) Riveste la membrana esterna ed è costituito da più subunità proteiche disposte in tetrameri, pentameri o esameri, spesso identiche e a volte legate ad alcuni carboidrati. Le sue funzioni non sono del tutto note: sembra intervenire nell’ adesione alle superfici mucose.
Glicocalice
Il glicocalice è il prodotto della secrezione di materiali polisaccaridici viscosi che rimangono adesi alla superficie esterna della cellula e conferiscono al batterio :
- proprietà adesive, e dunque la capacità di colonizzare determinate nicchie ecologiche;
- proprietà antifagocitarie;
- una componente fondamentale del biofilm, che favorisce la persistenza dell’infezione;
- la resistenza ad alcuni antibiotici , se questi polisaccaridi sono presenti in grandi quantità. Morfologia Il glicocalice può organizzarsi in due conformazioni: a. capsula, altamente organizzata e fortemente adesa. È costituita da uno strato S, uno strato intermedio ed uno strato mucoso. Non è necessaria alla moltiplicazione del batterio, ma alla sua sopravvivenza all’interno dell’ospite; b. strato mucoso o slime , struttura meno organizzata e meno adesa, più lassa e diffusa rispetto alla capsula. Composizione della capsula
- Levani: polimeri del fruttosio ( Streptococcus salivarius );
- destrani: polimeri del glucosio ( Leuconostoc );
- polisaccaridi complessi ( Streptococcus pneumoniae );
- poliribitolfosfati ( Haemophilus influenzae);
- poli-D-glutammato, un peptide omopolimerico, in Bacillus anthracis. Metodi di identificazione
- Batteri capsulati : colorati con inchiostro di china , si identificano con un alone bianco che si forma attorno alle colonie, in quanto l’inchiostro non riesce a penetrare la capsula;
- glicocalice : a. colorazione negativa alla nigrosina : colora lo sfondo ed il batterio stesso ma non viene assorbita dalla capsula; b. reazione di rigonfiamento capsulare di Neufeld : il batterio viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici per gli antigeni capsulari. Se avviene un legame antigene-anticorpo, si verifica un rigonfiamento della capsula, probabilmente dovuto ad un aumento dell'idratazione della capsula mediato dagli anticorpi.
