Chimica Analitica Strumentale x Robotti, Appunti di Chimica analitica strumentale

Scarica Chimica Analitica Strumentale x Robotti e più Appunti in PDF di Chimica analitica strumentale solo su Docsity! Chimica Analitica Strumentale Pag. 1 di 54 CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sono divise in quattro grossi gruppi: 1. Spettroscopiche: studiano l'interazione tra radiazione luminosa e molecole/ioni; 2. Cromatografiche: sono tecniche separative che analizzano le sostanze lungo un percorso; 3. Spettrometria di massa: le molecole vengono ionizzate e frammentate per ottenere informazioni sulla struttura, separandole in base al rapporto massa/carica.; 4. Elettrochimiche: utilizzano metodi chimici basati su reazioni elettrochimiche. Tecniche spettroscopiche. Le tecniche spettroscopiche si basano sull'interazione della luce con la materia, dove ciascuna lunghezza d'onda è associata a un'energia specifica. Se la lunghezza d'onda è piccola, la frequenza è alta e quindi anche l'energia è alta, comportando un'interazione maggiore con il campione. Al contrario, lunghezze d'onda maggiori corrispondono a energie minori. L'energia e la frequenza sono direttamente proporzionali, mentre l'energia e la lunghezza d'onda sono inversamente proporzionali. Lo spettro elettromagnetico utile per le tecniche analitiche include lo spettro visibile, l'UV (ultravioletto, con energia maggiore) e gli infrarossi (con energia minore). Lo spettro visibile e l'UV causano salti energetici degli elettroni di valenza (gli elettroni più esterni), mentre gli infrarossi provocano vibrazioni molecolari. L'infrarosso più vicino al visibile è chiamato IR vicino (near NIR), dove i salti energetici sono convoluti e possono essere utilizzati come impronta digitale. Ci sono due tipi principali di spettroscopia: 1. Spettroscopia molecolare in soluzione: qui le molecole sono trattate in provetta. 2. Tecniche elementari: l'analita è trasformato in elemento tramite un atomizzatore (come una fiamma, un fornetto o plasma, ossia un gas ionizzato al 5% tramite radiofrequenza e una scintilla iniziale, in un ambiente senza ossigeno e ad alte temperature). Queste tecniche possono essere utilizzate in assorbimento, fluorescenza e altre modalità. L'assorbimento avviene quando un campione viene irradiato con radiazione luminosa che viene assorbita, risultando in una radiazione emergente di intensità ridotta. Nelle molecole, gli elettroni fanno salti tra livelli energetici quantizzati, come da E0 a E1 o E2, con E1 (meno energia, ΔE più basso) che è più probabile e produce un picco più alto. Il detector misura i fotoni che emergono dal campione. Pag. 4 di 54 campione è particolare (si trova in forma atomica ed eccitata, ad altissima temperatura), si ha poi il selettore di lunghezze d’onda ed il rilevatore. La chemiluminescenza avviene in reazioni esotermiche, dove una specie eccitata emette radiazioni durante il suo decadimento, producendo luce. Le sorgenti luminose possono essere continue o a righe: per misurare uno spettro a bande si utilizza una lampada continua, mentre per uno spettro a righe si preferisce una sorgente a righe. La lampada a deuterio, ad esempio, emette uno spettro continuo grazie alla sua alta pressione, coprendo ampie bande nell'UV con tempi di vita lunghi e stabilità eccellente. Viene spesso combinata con lampade a filamento di tungsteno per coprire anche il visibile. Sorgenti. Le sorgenti luminose a righe, come le lampade a vapori di mercurio, producono linee spettrali ben definite quando sono a bassa pressione, grazie al ridotto numero di collisioni tra atomi. Tuttavia, alcune versioni ad alta pressione possono emettere uno spettro continuo, anche se sono meno comuni nelle applicazioni analitiche più semplici. • Sorgenti continue o a righe: scegliere tra sorgenti continue o a righe dipende dal tipo di spettro che si intende misurare: per uno spettro a bande si usa una lampada continua, mentre per uno spettro a righe è necessaria una sorgente a righe. Ad esempio, la lampada a deuterio emette uno spettro continuo poiché opera a pressioni molto elevate. Questa lampada copre un ampio spettro nell’ultravioletto, offre una lunga durata e una stabilità eccellente. Viene spesso utilizzata insieme a una lampada a filamento di tungsteno per coprire anche la gamma visibile. La struttura di una lampada a deuterio prevede un bulbo contenente deuterio; quando avviene una scarica, si forma un arco elettrico che eccita il deuterio gassoso, portandolo ad emettere lunghezze d’onda; • Sorgenti discontinue: includono le lampade a vapori di mercurio. A bassa pressione, queste lampade emettono linee spettrali a causa del numero limitato di collisioni, mentre alcune versioni ad alta pressione possono emettere uno spettro continuo, sebbene siano poco utilizzate per analisi più semplici. Selettori di lunghezze d’onda. Permette di creare una retta di calibrazione assorbanza/concentrazione e per far sì che questa sia lineare ci vuole un’unica lunghezza d’onda per poter avere più sensibilità e selettività. Ce ne sono di due tipi: • Quelli più semplici sono i filtri (dischetti che bloccano alcune lunghezze d’onda e fanno passare solo quella desiderata): Pag. 5 di 54 § Filtro ad interferenza: è un dispositivo tra due lastre di vetro in cui ci sono due pellicole metalliche semiriflettenti e uno strato di dielettrico (fluoruro di calcio o fluoruro di magnesio, i filtri vengono scelti in base allo spessore del dielettrico), la radiazione arriva su una faccia del dispositivo, passa attraverso la lastra di vetro, attraversa la pellicola semiriflettente, metà viene riflessa e metà prosegue, passa il dielettrico, va sulla seconda pellicola in cui succede la stessa cosa ed esce la lunghezza d’onda che ha dato interferenza costruttiva, che dipende dallo spessore dielettrico. Sono quelli che danno performance migliori: sono molto alti quindi fanno passare molta radiazione che giunge al campione in modo potente. § Filtri ad assorbimento: sono meno costosi, sono vetri colorati o c’è un gel colorato all’interno di due lastre di vetro. Le prestazioni sono peggiori: passa meno luce e la banda passante è più ampia. • Monocromatori: possono essere a reticolo o a prisma, ed è più performante dei filtri. Sono costituiti da una scatola in cui si ha una fenditura d’ingresso e una d’uscita dove entra una radiazione policromatica ed esce una radiazione monocromatica grazie ad un elemento disperdente che viene ruotato e separa le lunghezze d’onda. Nel monocromatore si ha sempre una fenditura d’entrata e la luce è policromatica finché non arriva al reticolo dove si ha diffrazione e le lunghezze d’onda sono separate, si usa uno specchio che le porta sulla fenditura d’uscita. Quello che cambia è la rotazione del reticolo per misurare le varie lunghezze d’onda, è un procedimento più lungo ma più preciso. Nel prisma si ha la rifrazione, anche qui per avere diverse lunghezze d’onda si ruota il prisma e le fenditure rimangono fisse. Trasmittanza: quantità di radiazione trasmessa, è il rapporto tra l’intensità della lunghezza d’onda che emerge (I) e quella che viene inviata (I0). Banda passante: misura della purezza spettrale della luce trasmessa, è l’ampiezza della curva a metà altezza. Pag. 6 di 54 Nel policromatore non si ha la fenditura di uscita, viene utilizzato per strumenti a flusso, è più veloce perché non bisogna fare le rotazioni ma è meno sensibile, si fa una fotografia istantanea. § Prestazione monocromatori: reticolo e prisma hanno la stessa funzione ma in modi diversi, il reticolo separa in modo equispaziato (il delta tra le lunghezze d’onda è sempre lo stesso); il prisma separa in modo diverso: nell’UV separa molto di più del reticolo, nel visibile invece sono tutte più vicine. Si usa quello di quarzo. Quello da utilizzare dipende in che zona bisogna lavorare (se nell’UV o nel visibile); § Contenitore del campione: dev’essere trasparente alla radiazione utilizzata, nel visibile possono essere di plastica o di vetro, nell’UV il quarzo; § Rivelatore: conta i fotoni, il rivelatore ideale dev’essere altamente sensibile, deve avere un elevato rapporto segnale/rumore, deve avere una risposta costante in ampio intervallo di lunghezza d’onda (fotoni gialli, rossi, blu contati allo stesso modo), un tempo di risposta rapido, deve avere segnale di uscita basso in assenza di illuminazione. • Fototubo a vuoto: si ha un catodo ricoperto da materiale fotoemettitore e colpito da un fotone, questo trasmette elettroni ad un anodo. Il materiale fotoemettitore può essere: a sensibilità elevata (bioalcalini), sensibile al rosso (multialcalini), sensibili all’UV o a risposta piatta. • Tubi fotomoltiplicatori: il concetto è lo stesso ma gli elettroni non vanno direttamente all’anodo ma a una serie di dinodi (circa 9, sono elettrodi addizionali), si guadagna in segnale e si aumenta la sensibilità. • Fotodiodi: il diodo si basa su un silicio cristallino (semiconduttore), il silicio drogato n ha un surplus di elettroni aggiungendo un elettrone, il silicio drogato p ha un elettore in meno (ossia una buca a disposizione). Nel fotodiodo questi due diodi vengono messi vicini, in polarizzazione diretta la regione p viene attaccata al + e la regione n col -, qui si annullano le cariche Pag. 9 di 54 Cuvette. I contenitori del campione sono cuvette ovvero parallelepipedi con la base di 1 cm in modo che il cammino ottico sia unitario e più semplice da calcolare, con due facce lisce opposte molto parallele per evitare rifrazione e due facce opache per impugnarlo e con dei cavi all’interno. Per il visibile si usa la plastica mentre per l’UV il quarzo. Possono essere: • Cuvette a campionamento: usate per misurazioni ripetute su aliquote diverse dello stesso campione. Il campione entra nella cuvetta, viene misurato, e poi viene sostituito con una nuova aliquota. Questo approccio è utilizzato, ad esempio, nell'HPLC, dove si effettuano misure a tempi discreti; • Cuvette a flusso: Qui la soluzione scorre continuamente attraverso la cuvetta. Le misure possono essere effettuate mentre il flusso continua, registrando l'assorbimento della luce a diverse lunghezze d'onda. Questo tipo di cuvetta permette di acquisire un'intera gamma di dati spettrali in un breve intervallo di tempo. Sono anche smontabili per facilitare la pulizia. Cuvette in semimicron: Sono utilizzate quando il volume di campione disponibile è molto ridotto. Queste cuvette hanno un volume interno minore, ma mantengono il cammino ottico di 1 cm, garantendo la stessa sensibilità e precisione nelle misure. Pag. 10 di 54 Legge di Lambert-Beer: è fondamentale in spettrofotometria e descrive come l'assorbanza di una soluzione è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto e alla lunghezza del cammino ottico. La trasmittanza è la frazione di radiazione luminosa che passa attraverso una soluzione e si calcola come il rapporto tra la potenza della luce che esce dalla soluzione (P) e la potenza della luce che entra nella soluzione (P0): T = P/P0. Un valore di trasmittanza più basso indica che la soluzione ha assorbito più luce, mentre un valore più alto significa che meno luce è stata assorbita. L'assorbanza è una misura di quanto una soluzione assorbe la luce. Più alta è l'assorbanza, maggiore è l'assorbimento di luce da parte della soluzione ed è correlata alla trasmittanza tramite la relazione A = -log(T) = -log(P/P0). Questo significa che l'assorbanza è il logaritmo negativo della trasmittanza. Inoltre, l’assorbanza è proporzionale alla concentrazione (c) del soluto, alla lunghezza del cammino ottico (b) e al coefficiente di estinzione molare (!): A = c * b * !. Per determinare la concentrazione di un analita sconosciuto, si utilizza un grafico di calibrazione, dove l'assorbanza (A) è tracciata in funzione della concentrazione (c). La pendenza (coefficiente angolare) di questa retta rappresenta l'assorbività molare (ε) se il cammino ottico (b) è di 1 cm. Un'alta pendenza indica una maggiore sensibilità del metodo, poiché piccole variazioni di concentrazione producono grandi variazioni di assorbanza. Deviazioni dalla Linearità: • Deviazioni strumentali: Quando lo strumento non è perfettamente calibrato o ci sono interferenze, come radiazioni parassite, il segnale può non seguire più la linearità prevista dalla legge di Lambert-Beer. • Deviazioni chimiche: Queste si verificano quando la sostanza in soluzione subisce reazioni chimiche (come dissociazione, associazione o reazioni col solvente), che alterano l'assorbimento della luce a diverse lunghezze d'onda rispetto a quelle dell'analita puro. Se la retta di calibrazione non è lineare, bisogna innanzitutto verificare se la concentrazione è troppo alta o se ci sono deviazioni chimiche che alterano l'assorbimento. Pag. 11 di 54 Misure di assorbimento. Quando si parla di misure di assorbimento, si tratta di determinare quanta luce viene assorbita da una soluzione rispetto a un solvente di riferimento. In pratica, si confronta la potenza della luce che passa attraverso la soluzione contenente l'analita (la sostanza da analizzare) con quella che passa attraverso il solo solvente. • Rapporto di Assorbimento: Si misura il rapporto tra la potenza che emerge dalla soluzione e quella che emerge dal solvente. Questo rapporto viene espresso come logaritmo: log(Psolvente/Psoluzione). Questo logaritmo è chiamato assorbanza. • Trasmittanza: È il rapporto tra la luce che emerge dal campione e quella che viene inviata., mentre § 100% di Trasmittanza: Una trasmittanza del 100% significa che tutta la luce passa attraverso il campione senza essere assorbita. Si ottiene accendendo la lampada dello spettrofotometro senza posizionare nulla nel percorso ottico, nemmeno la cuvetta. Questo rappresenta il segnale massimo. § 0% di Trasmittanza: lo 0% indica che tutta la luce viene assorbita (massimo assorbimento). Si ottiene chiudendo l’otturatore, bloccando completamente la luce dalla lampada. Se lo strumento non dà questi valori corretti, c'è un problema di funzionamento. Determinazioni quantitative. - Determinazione della Lunghezza d'Onda di Massimo Assorbimento: Si misura l'assorbanza a diverse lunghezze d'onda per identificare quella in cui l'assorbimento è massimo. La lunghezza d'onda a cui l'assorbanza è massima è la più sensibile per la misura, poiché a questa lunghezza d'onda si mantiene la linearità con la concentrazione. Se ci sono interferenti, si può scegliere il secondo massimo di assorbimento. - Costruzione della Retta di Calibrazione: Si misura l'assorbanza di soluzioni standard con concentrazioni note dell'analita. Si costruisce un grafico dell'assorbanza in funzione della concentrazione, ottenendo una retta di calibrazione che segue la legge di Lambert-Beer. - Determinazione della Concentrazione Incognita: Una volta che si ha la retta di calibrazione, si può misurare l'assorbanza di una soluzione con concentrazione incognita e, utilizzando la retta di calibrazione, si può calcolare la concentrazione dell'analita. Pag. 14 di 54 monocromatore di emissione misura le lunghezze d'onda emesse. Per accelerare il processo di analisi spettrale, si utilizzano strumenti chiamati policromatori. Questi strumenti separano le diverse lunghezze d'onda della luce. Quando una soluzione viene analizzata in una cuvetta, la luce che passa attraverso essa contiene un mix di lunghezze d'onda. Ogni porzione della soluzione assorbe e riemette luce a lunghezze d'onda diverse. La luce emessa viene poi misurata a 90° rispetto alla direzione della luce incidente. Poiché la luce emessa dalla soluzione è un mix di lunghezze d'onda (luce policromatica), è necessario un altro policromatore, il policromatore di emissione, per separare queste lunghezze d'onda. Questo dispositivo utilizza una superficie bidimensionale di diodi per ottenere una "mappa spettrale", che mostra le diverse lunghezze d'onda emesse. Da questa mappa si seleziona il massimo di emissione a una specifica lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione, ottenendo così uno spettro di luminescenza globale, che rappresenta sia lo spettro di ingresso (eccitazione) che quello di uscita (emissione). Fluorescenza vs Assorbimento: La fluorescenza è generalmente più sensibile e selettiva rispetto all'assorbimento. Non tutte le molecole sono fluorescenti, e quindi le interferenze da altre sostanze sono meno comuni. Se una molecola non è naturalmente fluorescente, è possibile renderla fluorescente mediante una reazione chimica che introduce un gruppo funzionale fluorescente. • Metodi Diretti: Questi metodi misurano direttamente la fluorescenza di molecole che sono effettivamente fluorescenti. • Metodi Indiretti: Questi metodi si basano sulla diminuzione della fluorescenza causata dalla presenza di un analita che interferisce con una molecola fluorescente nota. Fosforescenza: è una forma di luminescenza che si ottiene generalmente raffreddando il campione a temperature molto basse, come con azoto liquido. Questo metodo è spesso utilizzato per analizzare acidi nucleici, enzimi e idrocarburi. La fosforescenza ha una durata di emissione più lunga rispetto alla fluorescenza. Chemiluminescenza: è un'emissione di luce generata da una reazione chimica esotermica, cioè una reazione che rilascia calore. In questo processo, due specie chimiche, come un composto luminoso e l'ossigeno, reagiscono e producono luce Pag. 15 di 54 come sottoprodotto. La luce emessa viene poi misurata tramite spettroscopia. Un reaction coil è un contenitore trasparente che facilita questa reazione esotermica. Poiché la reazione è limitata e si esaurisce nel tempo, si osserva un massimo di emissione che poi diminuisce, rendendo necessario l'uso di un policromatore per analizzare le lunghezze d'onda emesse. CROMATOGRAFIA La cromatografia è una tecnica analitica ampiamente utilizzata in laboratorio per separare e identificare i componenti di una miscela. La base di questa tecnica è la separazione degli analiti attraverso due fasi immiscibili: • Fase Stazionaria: questa fase è fissa e può essere solida o liquida. La sua funzione è quella di interagire con le sostanze da separare, offrendo numerosi siti attivi per l'interazione con gli analiti; • Fase Mobile: questa fase è fluida e può essere un liquido, un gas o un fluido supercritico. Scorre attraverso la fase stazionaria, trasportando gli analiti lungo il sistema cromatografico. Gli analiti interagiscono diversamente con le due fasi in base alla loro affinità chimica. Gli analiti che hanno una maggiore affinità per la fase stazionaria rimangono più a lungo in essa, mentre quelli più affini alla fase mobile si muovono più rapidamente e raggiungono la fine del sistema cromatografico prima. Esistono due metodi cromatografici: • Cromatografia su Colonna: in questo metodo, la fase stazionaria è contenuta in una colonna e la fase mobile scorre attraverso di essa. Gli analiti vengono introdotti all'inizio della colonna e si separano man mano che si spostano lungo di essa in base alla loro affinità per le due fasi. Gli analiti più affini alla fase mobile escono dalla colonna prima, mentre quelli più affini alla fase stazionaria escono più tardi. Alla fine della colonna, un rivelatore misura la quantità di analiti in uscita. Questi dati vengono rappresentati in un cromatogramma, che mostra l’intensità del segnale (quantità di analiti) rispetto al tempo. I picchi nel cromatogramma indicano la presenza e la quantità degli analiti. Picchi stretti e alti nel cromatogramma indicano una buona separazione e un’elevata efficienza della cromatografia. Tempi di eluzione più lunghi tendono a produrre picchi più larghi, il che può indicare una separazione meno efficace; Pag. 16 di 54 • Cromatografia su Carta: questo metodo utilizza un foglio di carta come fase stazionaria e un solvente come fase mobile. È una tecnica più semplice rispetto alla cromatografia su colonna. In sintesi, la cromatografia è una tecnica fondamentale per la separazione e l'analisi dei componenti di una miscela, utilizzando due fasi immiscibili per ottenere separazioni precise e dettagliate. Nella retta di calibrazione si fanno 4 standard e come segnale si utilizza l’area dei picchi, dopodiché è possibile conoscere la concentrazione incognita dell’analita. La cromatografia può essere classificata in base allo stato fisico di fase stazionaria e mobile: • Cromatografie liquide (LC, fase mobile liquida): si distinguono tra: § Liquido-solido (adsorbimento): in cui il liquido interagisce con i siti attivi sulla superficie solida; § Liquido-liquido (ripartizione); § Scambio ionico: in cui nella superficie della fase stazionaria ci sono cariche + o -); § Permeazione ed esclusione dimensionale: si ha separazione per dimensione e conformazione tridimensionale, utile per macromolecole; • Gascromatografie (GC, fase mobile gassoso): gas-liquido (si usa pochissimo, è un meccanismo di ripartizione) e gas-solido (adsorbimento). Ci sono anche cromatografie che sfruttano un mix di questi meccanismi, come: Tecniche più diffuse: Thin Layer Chromatography (TLC) su strato sottile, usata come tecnica qualitativa più che quantitativa; High Pressure Liquid Chromatography (HPLC); High Pressure Thin Layer Chromatography (HPTLC) tecnica qualitativa; Ion Chromatography (IC); Gas Chromatography (GC). La fase stazionaria, che può essere applicata su una superficie o riempire una colonna, deve avere una superficie molto grande per garantire un'efficace interazione con gli analiti. La separazione si basa sul ritardo selettivo, che deriva dalle diverse interazioni degli analiti con la fase stazionaria rispetto alla fase mobile. Questo processo porta alla formazione di zone o bande in cui l'analita è più concentrato, con la concentrazione massima che si trova sempre al centro della banda. Esistono due teorie principali per spiegare il comportamento della cromatografia: la teoria dei piatti e la teoria dinamica. 1. La teoria dei piatti, ispirata ai concetti della distillazione e dell'estrazione in controcorrente, considera la cromatografia come un sistema statico in equilibrio. In questa teoria, la colonna cromatografica viene immaginata Pag. 19 di 54 • HPLC: Colonne generalmente più corte, quindi i picchi sono relativamente più bassi. In sintesi, l’HPLC è più efficiente con colonne più corte e una maggiore influenza della velocità di flusso, mentre la GC presenta una maggiore lunghezza della colonna e una maggiore importanza della diffusione longitudinale e dei parametri associati. Per ottimizzare la cromatografia e separare due picchi vicini si possono usare i seguenti parametri: 1. Fattore di Capacità (K’): • Calcola la ritenzione relativa dell'analita rispetto al tempo morto (t0); • K’ è definito come K’=(tr−t0)/t0 , dove tr è il tempo di ritenzione; • Valori troppo bassi (K’<2) indicano una scarsa interazione con la fase stazionaria; valori troppo alti (K’>10) possono rendere i picchi troppo larghi e difficili da interpretare; • K’ è indipendente dalla velocità di flusso e dalle condizioni sperimentali. 2. Fattore di Asimmetria: • Misura la simmetria del picco confrontando le altezze delle metà del picco (CB/AC); • Un valore di 1 indica un picco simmetrico. Valori maggiori di 1 indicano "tailing", mentre valori minori di 1 indicano "fronting"; Pag. 20 di 54 • Tailing può derivare da saturazione della fase stazionaria o adsorbimento irreversibile. Fronting può essere causato da sovraccarico del campione. 3. Selettività: • Indica la capacità della colonna di separare due analiti. È il rapporto tra i fattori di capacità dei due analiti; • Se i picchi sono molto vicini, la separazione è più difficile e potrebbe essere necessario migliorare l'efficienza cromatografica. 4. Efficienza Separativa: • Misurata dal numero di piatti teorici (N). Maggiore è N, migliore è l'efficienza; • L'efficienza aumenta con una colonna più lunga, un flusso ottimale e una buona qualità della colonna. 5. Risoluzione: • Misura il grado di separazione tra due picchi. Ottimale quando la distanza tra i picchi è almeno 6 σ, che garantisce una separazione sufficiente e una risoluzione basata sulla linea di base; • La risoluzione dipende da K’, selettività ed efficienza. Migliorare l'efficienza rende i picchi più stretti, mentre migliorare la selettività aumenta la distanza tra i picchi. Pag. 21 di 54 GASCROMATOGRAFIA La cromatografia gas-liquido (GC) è una tecnica analitica utilizzata per separare e analizzare composti volatili. In questa tecnica, la fase mobile è un gas inerte, solitamente elio, che funge da carrier trasportando gli analiti attraverso una fase stazionaria liquida all'interno di una colonna. È un caso unico di cromatografia in cui l'interazione avviene esclusivamente con la fase stazionaria, mentre il gas non interagisce con i composti, ma li trasporta lungo la colonna. Componenti del Sistema. • Forno: Il cuore del sistema è il forno, dove è collocata la colonna. Il forno permette di controllare la temperatura, eseguendo rampe termiche che influenzano la volatilità degli analiti, facilitando la loro separazione; • Iniettore: L'analita viene introdotto nel sistema tramite un iniettore, che è una camera riscaldata in cui il campione viene rapidamente volatilizzato. L'iniettore è dotato di un setto di gomma che, perforato dalla siringa, si richiude automaticamente per mantenere l'isolamento. È fatto di acciaio e rivestito internamente da un liner di vetro estraibile e lavabile; • Colonna Cromatografica: è il componente dove avviene la separazione. Può essere di due tipi principali: § Capillare: con parete rivestita di fase stazionaria, oppure con un supporto rivestito che contiene la fase stazionaria; § Impaccata: meno comune, con fase stazionaria all'interno di una matrice solida. Le colonne capillari più usate sono in silice fusa, che permette un'ottima trasmissione del calore e una certa flessibilità, ma con una capacità di campione limitata; • Detector: Alla fine della colonna, il detector misura i composti separati. Esistono vari tipi di detector, come il detector a termo-conducibilità, che Pag. 24 di 54 analiti allo spazio di testa. Spesso si aggiunge NaCl o un altro sale inerte per aumentare la forza ionica della soluzione. Questo processo, noto come salting out, rende la fase liquida meno ospitale per le molecole volatili, che quindi passano più facilmente alla fase gassosa. • Prelievo dello Spazio di Testa: Una volta stabilito l'equilibrio, lo spazio di testa viene prelevato con una siringa e iniettato nella GC. Se il sistema è dinamico, l'equilibrio si rigenera continuamente: il vial può essere dotato di un'uscita da cui gli analiti vengono convogliati verso una trappola adsorbente, che li raccoglie e li trasferisce direttamente all'iniettore della GC. • Metodo Purge and Trap: Un metodo correlato è il purge and trap, che assomiglia allo spazio di testa dinamico, ma con una differenza chiave: l'aria o un gas inerte (come l'azoto) viene insufflato direttamente nella soluzione, creando bolle che aiutano gli analiti a passare nello spazio di testa (purging). Gli analiti vengono quindi raccolti in una trappola adsorbente. Anche in questo metodo, la temperatura è controllata per garantire la volatilizzazione efficiente degli analiti. Questo metodo è molto utilizzato per campioni con analiti estremamente volatili. Rilevatori. • Rilevatore a Ionizzazione di Fiamma (FID): § Funzionamento: Analizza i campioni separati da una colonna cromatografica utilizzando una fiamma di idrogeno. Gli analiti iniettati nella fiamma ionizzano, producendo elettroni che generano una corrente elettrica misurabile. § Sensibilità e Applicazioni: Sensibile a molecole organiche, ma non a quelle inorganiche. Fornisce un segnale di corrente (10^-12 A) che rappresenta l'intensità dell'analita, ma non offre informazioni specifiche su molecole o classi di molecole. Pag. 25 di 54 § Calibrazione e Identificazione: Il segnale è misurato come area sotto il picco del cromatogramma. Per identificare gli analiti, si usano standard o altre tecniche complementari. • Rilevatori a Spettrometria di Massa: § Funzionamento: Lavora accoppiato a un cromatografo in fase gas (GC) e opera in altovuoto. Le molecole provenienti dalla colonna del GC vengono ionizzate e separate in base al rapporto massa/carica in uno spettrometro di massa. § Struttura e Funzionamento: Comprende una sorgente di ioni, un analizzatore di massa e un rilevatore (come l'elettromoltiplicatore). Gli ioni vengono separati e contati, producendo uno spettro in cui l'asse x rappresenta il rapporto massa/carica e l'asse y l'intensità degli ioni. § Risoluzione e Identificazione: La risoluzione può essere alta o bassa a seconda delle prestazioni dell'analizzatore. Gli spettri ottenuti vengono confrontati con quelli di standard per identificare gli analiti. Lo spettro può mostrare diversi frammenti e isotopi che aiutano nella caratterizzazione dei composti. Sorgenti Ioniche nella Spettrometria di Massa. • Zona di Altovuoto: § GC (Cromatografia Gas): Le sorgenti ioniche sono situate in una zona di altovuoto per prevenire l'interferenza delle molecole di gas ambientale e per mantenere un ambiente controllato in cui gli ioni possono viaggiare senza collisioni con molecole indesiderate; § HPLC (Cromatografia Liquida): Le sorgenti ioniche non sono nella zona di altovuoto; l'analisi avviene in condizioni atmosferiche o con una pressione relativamente alta rispetto alla GC. • Funzionamento delle Sorgenti Ioniche: § Ionizzazione e Energia Cinetica: Le sorgenti ioniche devono ionizzare il campione e generare un fascio di ioni con la stessa energia cinetica per ottenere un profilo massa/carica accurato. Se non viene mantenuta questa omogeneità, il profilo può risultare distorto; § Efficienza: § Ionizzazione: Anche basse concentrazioni di molecole devono essere ionizzate in modo efficiente; Pag. 26 di 54 § Collimazione: È essenziale che il fascio ionico abbia una dispersione di energia minima per mantenere l'accuratezza della misurazione; § Rapporto Segnale/Rumore: Deve essere elevato per garantire un segnale chiaro e ridurre il rumore di fondo; § Effetto Memoria: Non deve esserci contaminazione da ioni precedenti quando il campione cambia, per evitare influenze residue; § Stabilità degli Ioni: Gli ioni devono essere stabili nel tempo, evitando ioni metastabili che potrebbero frammentarsi e distorcere i picchi. • Tipi di Sorgenti Ioniche: § Hard (Dura): (esempio: Impatto Elettronico (EI) nella GC): § Caratteristiche: Trasferiscono molta energia alla molecola, risultando in una significativa frammentazione e generando numerosi frammenti. § Applicazione: Utilizzato per ottenere dettagli dettagliati della struttura della molecola. § Soft (Morbida): (esempio: Ionizzazione Chimica (CI) nella GC): § Caratteristiche: Trasferiscono meno energia, riducendo la frammentazione e producendo principalmente ioni molecolari. § Applicazione: Preferito per ottenere spettrogrammi più semplici, con pochi frammenti. • Tecniche di Ionizzazione: § Impatto Elettronico (EI): § Funzionamento: Un filamento di tungsteno emette elettroni ad alta energia (70 eV) che colpiscono le molecole del campione, strappando elettroni e formando ioni positivi. § Risultato: Crea frammentazione significativa, utile per identificare strutture dettagliate e comparare con spettrogrammi di riferimento. § Ionizzazione Chimica (CI): § Funzionamento: Un gas reagente (come metano o ammoniaca) viene introdotto nella sorgente ionica. Questo gas reagente Pag. 29 di 54 Per ottimizzare la separazione, si possono utilizzare gradienti di polarità nella fase mobile. In una fase inversa, ad esempio, si inizia con una fase mobile più acquosa e si aumenta gradualmente la quantità di solvente organico, come acetonitrile, per far uscire gli analiti più tardi nella corsa. Nella fase normale, si parte con solventi non polari e si aumenta gradualmente la polarità aggiungendo modificanti organici. Campi di applicazione delle diverse tecniche. Le tecniche di separazione molecolare variano a seconda delle proprietà delle molecole. Per molecole di grandi dimensioni si usano tecniche di esclusione dimensionale come la permeazione o la filtrazione su gel, a seconda della loro solubilità. Molecole ioniche richiedono scambio ionico o fase inversa, mentre per quelle medio-piccole idrosolubili ioniche si può usare il scambio ionico o la fase inversa, a seconda della solubilità in vari solventi come THF, metanolo o esano. La derivatizzazione è una tecnica che modifica chimicamente le molecole prima dell'analisi cromatografica. Serve a rendere le molecole visibili ai detector o a migliorarne le proprietà analitiche, come la polarità o la volatilità. Questa reazione deve essere efficiente e stabile, ed è spesso utilizzata nella cromatografia gasosa e in altre tecniche analitiche. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE CHIRALE La separazione degli enantiomeri può essere realizzata attraverso diverse tecniche: • Fase Stazionaria Chirale: In questo approccio, si utilizza una fase stazionaria chirale (come una colonna con supporto chirale) che interagisce selettivamente con i diversi enantiomeri. Gli enantiomeri si legano in modo differente alla fase stazionaria a causa delle loro differenze nella configurazione spaziale. Questo porta a una separazione basata sulla differenza di affinità tra gli enantiomeri e la fase stazionaria. • Additivi Chirali nella Fase Mobile: In alternativa, si possono aggiungere additivi chirali alla fase mobile. Gli enantiomeri si legano a questi additivi chirali, formando complessi che interagiscono in modo diverso con la fase stazionaria della colonna. La differenza nella formazione di questi complessi permette di separare gli enantiomeri. • Cavità Chirali: Un'altra tecnica implica l'uso di cavità chirali, dove la struttura della cavità è progettata per ospitare specificamente uno degli enantiomeri. Questi sistemi chirali sono progettati per formare complessi stabili con uno degli enantiomeri e meno stabili con l'altro, facilitando così la separazione. Pag. 30 di 54 ESCLUSIONE DIMENSIONALE La cromatografia a gel si basa sulla separazione delle molecole per dimensione e forma attraverso una fase stazionaria porosa. Questo processo è fisico e non coinvolge interazioni chimiche tra le molecole e la fase stazionaria. La separazione avviene in base alla capacità delle molecole di penetrare nei pori della fase stazionaria. Molecole di piccole dimensioni, che possono entrare nei pori, passano più velocemente attraverso la colonna, mentre le molecole più grandi, che non possono penetrare nei pori, vengono trattenute più a lungo. Fase Stazionaria. La fase stazionaria è composta da particelle di polimero o silice con pori di dimensioni controllate: • Polimero: Grani di polimero come polistirene o acrilati sono usati per creare una rete porosa. • Silice: Anche la silice può essere usata per formare una fase stazionaria con pori di dimensioni specifiche. Il grado di cross-linking dei polimeri (legami tra le catene polimeriche) determina la porosità della fase stazionaria e, di conseguenza, la gamma di dimensioni molecolari che possono essere separate. Le particelle possono essere progettate per avere un range di dimensioni dei pori, adattandosi a diverse applicazioni. Volume di Ritenzione. • Volume Morto (V0): Volume della fase mobile che non è accessibile ai soluti e non comprende i pori della fase stazionaria. Rappresenta il volume che le molecole più grandi devono attraversare senza entrare nei pori. • Volume dei Pori (Vp): Volume totale dei pori nella fase stazionaria. È il volume disponibile per le molecole che possono penetrare nei pori. Il volume di ritenzione (VR) per un soluto è dato da: VR = V0 + KVp dove K è la frazione di pori accessibili al soluto. Frazione di Pori Disponibili (K). • K = 0: Per molecole troppo grandi per entrare nei pori, quindi solo il volume morto V0 è disponibile. • K = 1: Per molecole molto piccole che possono accedere a tutti i pori, quindi VR è V0 + Vp. • 0 < K < 1: Per molecole di dimensioni intermedie, che accedono parzialmente ai pori, quindi VR sarà una combinazione di V0 e una parte di Vp. Picchi Cromatografici Pag. 31 di 54 • Picco A: Corrisponde al volume di ritenzione delle molecole più grandi, che non penetrano nei pori e sono eluite rapidamente. Questo picco rappresenta il limite di esclusione totale. • Picco D: Rappresenta il volume di ritenzione delle molecole più piccole, che entrano in tutti i pori e sono eluite più lentamente. Questo picco rappresenta il limite di permeazione totale. • Regione Selettiva: Tra i picchi A e D si trova la regione in cui avviene la separazione delle molecole di dimensioni intermedie. In questa regione, la cromatografia a gel è in grado di risolvere molecole con dimensioni molecolari diverse. Curva Cromatografica. • Volume di Ritenzione vs. Segnale: Mostra i picchi corrispondenti a molecole di diverse dimensioni. La curva può mostrare un picco di esclusione totale (per molecole troppo grandi) e un picco di permeazione totale (per molecole troppo piccole), con una curva centrale che mostra la separazione delle molecole intermedie. • Volume di Ritenzione vs. Peso Molecolare: La curva mostra come il volume di ritenzione varia con il peso molecolare del soluto. Le molecole con peso molecolare maggiore escono prima (vicino a V0), mentre le molecole con peso molecolare minore escono più tardi (vicino a V0 + Vp). La curva può essere traslata verso l'alto o verso il basso a seconda della gamma di dimensioni dei pori della fase stazionaria. CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO La cromatografia ionica è una tecnica analitica usata per separare molecole cariche in base alla loro affinità per una fase stazionaria e una fase mobile. Nel processo, le molecole cariche vengono separate a seconda della loro carica e del tipo di resina utilizzata nella colonna cromatografica. Esistono due tipi principali di resine: • Le resine a scambio cationico sono caricate negativamente e scambiano cationi (ioni positivi) con la fase mobile; Pag. 34 di 54 4. Rivelatori: • Rivelatore UV-visibile: Utilizza una cella di quarzo e può avere sorgenti a lunghezza d’onda fissa (254 nm) o variabile. Si possono usare lampade a vapori di mercurio per visualizzare doppi e tripli legami, oppure lampade a deuterio (UV) e tungsteno (visibile) per misurazioni a lunghezza d’onda variabile. La fase mobile deve essere trasparente all'UV. • Diode Array (DAD): Il metodo migliore per l'analisi UV-visibile, dove si misurano tutti gli spettri a tutte le lunghezze d’onda contemporaneamente, offrendo una "fotografia istantanea" dell’assorbanza. Utilizzano una radiazione policromatica dispersa dopo la cella di rilevamento ed inviata al Diode Array. • Rivelatore a Fluorescenza: Il detector è posizionato a 90° rispetto alla sorgente di luce. Utilizza coppie di lunghezze d’onda (eccitazione e emissione) per misurare la fluorescenza del campione. È utile per rilevare composti fluorescenti e spesso è usato in combinazione con rivelatori UV- visibile per una maggiore completezza. • Spettrometro di Massa: Rilevatore universale che offre un'analisi dettagliata degli analiti. È molto sensibile e fornisce vantaggi significativi nella caratterizzazione dei composti. • Rivelatori Elettrochimici e ad Indice di Rifrazione: Offrono modalità di rilevamento alternative con caratteristiche specifiche. Gli elettrochimici misurano la conduttanza e sono utilizzati per soluzioni ioniche o di elettroliti, mentre gli ad indice di rifrazione sono universali e adatti per diverse tipologie di analiti. 5. Struttura e Materiali: Pag. 35 di 54 • Tubicini: I tubi collegati alla colonna sono in acciaio per resistere alla pressione. I materiali devono essere compatibili con i solventi e resistenti alla corrosione. • Cromatografo Modulare: Composto da moduli separati per la pompa, la colonna, il detector, e il controllo della temperatura. I comparti sono termostatati per mantenere condizioni costanti e possono essere collegati in modo modulare. 6. Dettagli Tecnici sui Rivelatori: • Minima Deriva della Linea di Base: Il rivelatore deve avere una bassa deriva, evitando segnali sempre crescenti che indicano saturazione. • Minimo Rumore di Fondo: Deve mostrare basse fluttuazioni casuali nel segnale per garantire misurazioni precise. • Elevata Selettività e Sensibilità: Il rivelatore deve essere in grado di distinguere e rilevare anche tracce minime di analiti. • Ampio Range Dinamico: Deve coprire almeno un range di 10^5 per gestire concentrazioni variabili. • Minimo Volume Morto e Stabilità: Il rivelatore non deve introdurre rimescolamenti o essere sensibile a variazioni di concentrazione della fase mobile, temperatura e flusso. Inoltre, deve essere non distruttivo, permettendo l'uso di più rivelatori in serie se necessario. SPETTROMETRIA DI MASSA La spettrometria di massa è una tecnica analitica usata per determinare la massa e la struttura delle molecole. Ecco un riassunto dei punti principali: 1. Identificazione della Massa: • Massa Nominale: Massa arrotondata all’intero, utile ma meno precisa. • Massa Accurata: Misurata con alta risoluzione fino alla quarta decimale, per una identificazione più precisa. Pag. 36 di 54 2. Informazioni sui Frammenti: • I frammenti della molecola, generati attraverso ionizzazione, forniscono dettagli sulla struttura molecolare, simile a un puzzle dettagliato. • Tecniche MS/MS (o MS2 – spettrometria di massa tandem) permettono ulteriori esperimenti per chiarire la struttura, separando e analizzando i frammenti in modo più dettagliato. 3. Componenti del Sistema: • Sorgente Ionica: Produce ioni positivi e negativi. • Analizzatore di Massa: Separa gli ioni in base al loro rapporto massa/carica. • Rilevatore: Misura gli ioni separati. 4. Introduzione del Campione: • GC (Cromatografia Gas): Per analiti gas e liquidi poco polari che devono essere derivatizzati. • LC (Cromatografia Liquida): Per sostanze poco volatili, non derivatizzate. • Infusione Diretta: Introduzione diretta del campione senza separazione preliminare. 5. Tecniche Targeted: Analisi di standard specifici scelti per identificare determinati analiti. 6. Sorgenti Ioniche: • Hard: Immettono molta energia, generano molti frammenti ma spesso non lo ione molecolare. • Soft: Trasferiscono meno energia, generano lo ione molecolare con pochi frammenti. 7. Interfacce LC e GC: Le interfacce LC sono generalmente più delicate rispetto a quelle GC, con variazioni nella durezza delle tecniche impiegate. Per realizzare una ionizzazione in vuoto partendo da un ambiente liquido (solvente), si utilizzano tecniche come ESI (Electrospray Ionization) e MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization). Entrambe le tecniche sono usate per analisi di massa, ma operano in modo diverso: 1. ESI (Electrospray Ionization): Pag. 39 di 54 Analizzatori di massa. Gli analizzatori di massa sono componenti centrali della spettrometria di massa, essenziali per separare gli ioni in base al loro rapporto massa/carica (m/z) e produrre uno spettro caratteristico. Questo spettro visualizza il rapporto m/z sull'asse x e l'intensità delle rilevazioni sull'asse y, spesso rappresentato come una serie di righe. Gli analizzatori di massa devono lavorare in condizioni di altovuoto per preservare gli ioni e garantire misurazioni accurate. • Tipi di analizzatori di massa: § Quadrupolo: è costituito da quattro barre di acciaio lunghe circa 25 cm e con diametro di 1 cm, disposte a coppie opposte. Una coppia è collegata a un potenziale di corrente continua positivo (+) e l'altra a uno negativo (-). A questo potenziale continuo si sovrappone una corrente alternata con uno sfasamento di 180°, che cambia ciclicamente il segno delle barre. § Funzionamento: Gli ioni passano attraverso lo spazio tra le barre, subendo una forza che li fa oscillare secondo un movimento elicoidale. Solo gli ioni con il giusto rapporto m/z riescono a raggiungere il rilevatore, mentre gli altri collidono con le barre e vengono eliminati. Variando i potenziali, il quadrupolo può scansionare e selezionare ioni con diversi rapporti m/z. § Caratteristiche: È un analizzatore molto diffuso grazie alla sua robustezza e semplicità, anche se ha una risoluzione relativamente bassa rispetto ad altri tipi di analizzatori. § Trappola ionica: è costituito in un elettrodo centrale a forma di ciambella, affiancato da due elettrodi a forma di calotta. Questi elettrodi creano un campo elettrico che intrappola gli ioni in orbite stabili all'interno della trappola. § Funzionamento: Gli ioni vengono introdotti nella trappola e stabilizzati tramite voltaggi applicati. Essi oscillano lungo traiettorie ad otto, disegnando onde all'interno della trappola. Quando si desidera analizzare un particolare ione, si varia il potenziale per destabilizzarlo, facendolo uscire dalla trappola e dirigendolo verso il rilevatore. Variando i potenziali si possono espellere selettivamente gli ioni secondo il loro m/z. Pag. 40 di 54 § Frammentazione: Aumentando la pressione e introducendo un gas inerte come l'azoto, gli ioni possono essere ulteriormente frammentati, permettendo una più dettagliata analisi dei frammenti tramite misurazioni successive. § TOF (Time of Flight): questo tipo di analizzatore misura il tempo che gli ioni impiegano a percorrere una determinata distanza, che dipende dal loro rapporto m/z. Gli ioni vengono accelerati da un campo elettrico e il tempo di volo viene correlato alla loro massa. § Caratteristiche: utilizza un tubo di deriva, solitamente lungo circa 1 metro, in cui gli ioni prodotti vengono accelerati tramite una differenza di potenziale e poi "sparati" lungo il tubo, che non contiene alcun campo elettrico. La velocità degli ioni dipende dal loro rapporto massa/carica (m/z): gli ioni più leggeri, con un rapporto m/z inferiore, viaggiano più velocemente, mentre quelli più pesanti arrivano al fondo del tubo con un leggero ritardo. § Funzionamento: La principale caratteristica del TOF è la sua capacità di misurare il tempo impiegato dagli ioni per percorrere la lunghezza del tubo, che dipende dal loro rapporto m/z, dalla lunghezza del tubo stesso e dal voltaggio con cui gli ioni sono stati accelerati. Questo tipo di analizzatore non ha limiti superiori per il rapporto m/z, rendendolo versatile per una vasta gamma di applicazioni. Tuttavia, la risoluzione del TOF non è molto elevata, poiché gli ioni entrano nel tubo con un pacchetto di energie cinetiche diverse, causando una leggera dispersione nei tempi di arrivo. § Miglioramento della Risoluzione con il Reflectron: La risoluzione del TOF può essere migliorata utilizzando un sistema chiamato reflectron o mirroring. Il reflectron è uno specchio ionico che reindirizza gli ioni lungo il percorso opposto al loro ingresso. Quando gli ioni raggiungono il reflectron, risentono di un campo elettrico che li costringe a tornare indietro. Il campo elettrico nel reflectron è progettato per avere la stessa carica degli ioni: gli ioni con m/z più piccolo penetrano più profondamente nel campo, mentre quelli con m/z maggiore vengono riflessi più rapidamente. Questo processo compensa le differenze nelle energie cinetiche degli ioni, rendendo la "banda" più compatta e, quindi, migliorando la risoluzione. § Applicazioni Specifiche: Il TOF è particolarmente efficace quando utilizzato con sorgenti pulsanti come nel metodo MALDI- Pag. 41 di 54 TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization), ampiamente utilizzato in proteomica per l'analisi delle proteine. Il MALDI-TOF permette l'analisi di grandi biomolecole con alta precisione e sensibilità. Massa Tandem (MS/MS). La spettrometria di massa tandem (MS/MS) consente l'analisi dettagliata delle molecole mediante la frammentazione selettiva degli ioni precursori e l'analisi dei frammenti risultanti. • Analisi nello Spazio con il Triplo Quadrupolo: Anche il quadrupolo può essere utilizzato per analisi tandem (massa/massa) in spettrometria di massa, dove si analizzano ioni precursori e frammenti generati. In uno strumento a triplo quadrupolo, il primo e il terzo quadrupolo funzionano come analizzatori di rapporto m/z, mentre il secondo quadrupolo funge da cella di collisione o trappola lineare. Qui, gli ioni sono selezionati, intrappolati, e frammentati tramite collisioni con un gas neutro (damping gas), prima che i frammenti siano inviati al terzo quadrupolo per la scansione finale. Ecco alcune delle principali modalità operative utilizzate in MS/MS con un sistema a triplo quadrupolo: § Product Ion Spectrum: in questa modalità, il primo quadrupolo viene fissato su un rapporto m/z specifico, selezionando un singolo ione precursore. Questo ione viene quindi inviato alla cella di collisione, dove viene frammentato in più ioni prodotto. I frammenti generati sono poi analizzati dal terzo quadrupolo, che esegue una scansione completa su tutti i rapporti m/z dei frammenti prodotti. Questa modalità consente di osservare tutti i possibili ioni prodotto derivanti da un singolo ione precursore, fornendo un quadro dettagliato della sua frammentazione. È utile per identificare e caratterizzare strutture molecolari complesse. § Precursor Ion Spectrum: in questa modalità, si analizza una serie di ioni precursori generati nella sorgente. Il primo quadrupolo seleziona ogni precursore a turno e lo invia alla cella di collisione per la frammentazione. Il terzo quadrupolo, invece, è fissato su un rapporto m/z specifico, corrispondente a un frammento di interesse. La scansione ripetuta permette di identificare quali ioni precursori producono un frammento con il rapporto m/z desiderato. Questa modalità è utile per identificare i precursori che generano un particolare frammento di interesse, consentendo l'analisi selettiva degli ioni iniziali che contribuiscono alla formazione di quel frammento specifico. Pag. 44 di 54 { ASSORBIMENTO ATOMICO (AAS). L'Assorbimento Atomico (AAS) è una tecnica utilizzata per misurare la concentrazione di elementi specifici in un campione. Ecco una spiegazione più dettagliata del processo: • Principio di Base: § Atomizzazione: Il campione viene riscaldato a temperature elevate per convertire gli elementi presenti in atomi liberi. Questo processo può avvenire attraverso una fiamma o un fornetto di grafite. I metodi di automatizzazione sono: § Fiamma: Raggiunge temperature tra 1700 e 3150 °C e viene utilizzata per atomizzare il campione in modo continuo. § Fornetto di Grafite: Utilizza corrente elettrica ad alta potenza per generare temperature tra 1200 e 3000 °C, permettendo una maggiore sensibilità e richiedendo meno campione rispetto alla fiamma. § Interazione con la Radiazione: Una volta che il campione è stato atomizzato, viene attraversato da una radiazione luminosa specifica, emessa da una sorgente che contiene lo stesso elemento che si sta cercando di determinare. La radiazione ha una lunghezza d'onda specifica, chiamata "riga di risonanza", che è assorbita solo dagli atomi dell'elemento di interesse. • Strumentazione: § Sorgenti di Radiazione: Di solito si utilizzano lampade a catodo cavo, che contengono un catodo fatto dello stesso elemento che si vuole misurare. All'interno della lampada c'è un gas (come Neon o Argon) che, una volta ionizzato, emette radiazione. § Monocromatore: Questo dispositivo isola una singola lunghezza d'onda dalla radiazione emessa dalla sorgente, selezionando quella che è assorbita dall'elemento di interesse. § Rivelatore: Dopo che il campione ha assorbito parte della radiazione, il rivelatore misura l'intensità della luce che non è stata assorbita (trasmittanza). L'assorbanza, che è il logaritmo del rapporto tra Pag. 45 di 54 l'intensità della luce emessa dalla sorgente e quella rilevata, è proporzionale alla concentrazione dell'elemento nel campione. • Quantificazione: § Legge di Lambert-Beer: La concentrazione dell'elemento è calcolata usando questa legge, che lega l'assorbanza alla concentrazione. Più alta è la concentrazione di atomi nel campione, maggiore sarà l'assorbanza. • Limitazioni: § Un Elemento alla Volta: L'AAS può misurare un solo elemento alla volta, poiché la sorgente emette radiazioni specifiche per un solo elemento. § Interferenze: Se altre molecole presenti nel campione assorbono la stessa lunghezza d'onda della radiazione, possono interferire con la misurazione, falsandone i risultati. { SPETTROFOTOMETRO A FIAMMA (FAAS). Lo Spettrofotometro a Fiamma (FAAS) è una tecnica analitica utilizzata per misurare la concentrazione di elementi in un campione. • Principio di Funzionamento: § Atomizzazione con Fiamma: Il campione liquido viene aspirato in modo continuo nella fiamma, che può raggiungere temperature fino a 3000°C. A queste temperature, il campione si trasforma in un gas atomico. § Misurazione del Segnale: Il segnale ottenuto dipende dalla concentrazione dell'elemento e non dalla massa del campione; quindi, la durata della misurazione non influisce sul risultato. • Sensibilità e Utilizzo: § Sensibilità: Il FAAS è meno sensibile rispetto ad altri metodi come l'elettrotermico, ma è più sensibile rispetto ai rivelatori cromatografici. Viene utilizzato per determinare concentrazioni di elementi in µg/L, come ferro, manganese, rame, zinco e piombo. § Speciazione: Il metodo consente anche di determinare le diverse forme chimiche (speciazioni) degli elementi. • Quantificazione: Pag. 46 di 54 § Curva di Calibrazione: La concentrazione dell'elemento viene quantificata attraverso una curva di calibrazione, ottenuta con soluzioni a concentrazione nota. La curva è lineare solo fino a un certo punto; oltre, diventa curva, e in questo caso il campione deve essere diluito per rientrare nel range lineare. • Interferenze: § Interferenze Spettrali: Derivano dalla presenza di specie molecolari nel campione che assorbono la stessa radiazione dell'elemento di interesse. Per risolvere questo problema si utilizza una sorgente a deuterio, che permette di sottrarre l'assorbimento non specifico dal segnale totale. § Interferenze Non Spettrali: Derivano dalle differenze nella composizione dei campioni (densità, viscosità), che possono influire sulla velocità di aspirazione del campione nella fiamma. Si risolve preparando soluzioni standard con una matrice simile a quella del campione (matrix matching). § Interferenze Chimiche: Si verificano quando un elemento nel campione impedisce l'atomizzazione. Si può risolvere aggiungendo lo stesso interferente negli standard o introducendo una specie chimica che libera l'analita. § Interferenze di Ionizzazione: Riguardano elementi facilmente ionizzabili che possono alterare il segnale dell'analita. • Componenti del Sistema: § Combustibile e Comburente: Sono sempre presenti un combustibile (spesso acetilene) e un comburente (aria o ossigeno). Una temperatura più alta migliora la conversione degli atomi e riduce le interferenze. { SPETTROFOTOMETRIA AD ASSORBIMENTO ATOMICO CON ATOMIZZAZIONE ELETTROTERMICA (ETAAS). La Spettrofotometria ad Assorbimento Atomico con Atomizzazione Elettrotermica (ETAAS) è una tecnica analitica avanzata utilizzata per misurare la concentrazione di elementi in campioni con alta sensibilità. Ecco un riassunto dettagliato del processo e delle caratteristiche principali: • Principio di Funzionamento: § Fornetto di Grafite: L’ETAAS utilizza un fornetto di grafite per l’atomizzazione. Un volume specifico di campione, di solito in µl, viene aspirato e depositato in un tubo di grafite. La corrente elettrica è passata attraverso il tubo, riscaldandolo per effetto Joule e causando la vaporizzazione e l'atomizzazione del campione. Pag. 49 di 54 § Il plasma è formato da Argon e non contiene ossigeno. La sua forma è generalmente toroidale (a ciambella), e il campione è vaporizzato e atomizzato mentre passa attraverso il plasma. § La torcia contenente il plasma è in quarzo e ci sono tre flussi di Argon: uno centrale per trasportare il campione, uno esterno per mantenere il plasma, e uno intermedio per confinare il plasma. Le fasi dell’analisi sono: 1. Preparazione del Campione: Eventuale dissoluzione o riscaldamento del campione. I campioni sono liquidi o devono essere portati in soluzione, devono essere compatibili col plasma. 2. Nebulizzazione: § Il campione liquido è aspirato attraverso una pompa peristaltica e trasformato in aerosol da un nebulizzatore, che può essere in vetro o polimero resistente agli acidi. Un flusso di Argon aiuta a formare l'aerosol e a trasportare le gocce più piccole verso il plasma. § I sistemi avanzati utilizzano ultrasuoni per migliorare la nebulizzazione, aumentando la sensibilità di 10-20 volte (nebulizzatore ad ultrasuoni). § Per campioni solidi, si può utilizzare la laser ablation (vaporizzazione tramite laser) o il slurry-sampling (dispersione di particelle solide in un mezzo disperso). 3. Desolvatazione/Volatilizzazione: Rimozione del solvente e trasformazione del campione in vapore. 4. Atomizzazione: § Fiamma (FAES): Atomizzazione tramite fiamma. § Plasma (ICP-AES): Atomizzazione e ionizzazione nel plasma. 5. Eccitazione/Emissione: § Gli atomi e ioni emettono luce a lunghezze d'onda caratteristiche (per ICP-AES). La luce emessa può derivare dall'eccitazione di atomi, ioni a carica singola, e raramente ioni a carica doppia. 6. Separazione/Rivelazione: § Rivelazione: Necessario un monocromatore per disperdere la luce, che può essere: § Sequenziale: Acquisizione di lunghezze d'onda una alla volta. Pag. 50 di 54 § Simultaneo: Acquisizione istantanea di tutto lo spettro. Monocromatori simultanei includono tubi fotomoltiplicatori (PMT), photo diode arrays (PDA), e charge coupled devices (CCD). § PDA: Contiene più detector in uno spazio compatto e misura l’emissione contemporaneamente. § Spettrometro ICP-AES: Composto da sistema di introduzione del campione, torcia ICP, generatore di radiofrequenze, spettrometro ottico, e rivelatori. Le interferenze possono essere: • Spettrali: Rigature spettrali di più elementi possono causare interferenze. Correzioni includono l'uso di un diverso ordine di diffrazione o applicazione di un fattore di correzione. • Non Spettrali: § Interferenze di Trasporto: Differenze nelle proprietà fisiche tra campione e standard. Correzioni includono matrix matching o aggiustamenti standard. § Interferenze di Volatilizzazione: Sostanze che interferiscono con la volatilizzazione dell'analita. Meno problematiche con il plasma rispetto alla fiamma. § Interferenze di Eccitazione: Alte concentrazioni di "easily ionized elements" (Li, Na, K) possono alterare le condizioni di eccitazione e influenzare i segnali degli altri analiti. La selezione delle linee di emissione: • Deve bilanciare sensibilità e assenza di interferenze. Si scelgono righe di emissione che sono sia sensibili sia adatte per la concentrazione dell'analita, evitando saturazione. • L'analisi si basa sull'integrazione dell'area o sulla misurazione dell'altezza dei picchi, con la linea di base tracciata tra due punti ai lati del picco per approssimare il picco a un triangolo. I requisiti logistici e di pulizia sono: • Pulizia e Contaminazione: § La tecnica analizza tracce di elementi (da mg/l a µg/l, quindi ppm-ppb), richiedendo un ambiente molto pulito per evitare contaminazioni. § È obbligatorio usare acidi e basi ultrapuri, oltre ad acqua ultrapura. § I campioni sono spesso trattati con acidi che possono danneggiare i contenitori; si preferiscono quindi plastica rispetto al vetro. • Precisione e Sensibilità: § La tecnica offre alta precisione e accuratezza. Pag. 51 di 54 § La sensibilità varia a seconda dell'elemento: eccellente per metalli alcalino-terrosi e di transizione, inferiore per i non metalli. • Range Dinamico Lineare: Il range è di 6 ordini di grandezza (da 1 ppb a 1000 ppm). Oltre un certo punto, la retta tende a flettersi a causa della saturazione. • Robustezza: Alta robustezza anche con campioni difficili (molto acidi, basici o ricchi di sostanze disciolte). • Efficienza Analitica: § Permette di ottenere molti dati rapidamente. § L'autocampionatore consente di analizzare contemporaneamente tra 60 e 140 campioni. • Generazione di Idruri: § Per elementi con bassa sensibilità o interferenze, si riducono a idruri usando reagenti come NaBH4. § Gli idruri vengono trasportati al plasma tramite un flusso di gas, riducendo le interferenze e semplificando l'analisi. ICP-MS La tecnica descritta è l'ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry), utilizzata per la determinazione di elementi attraverso la ionizzazione di atomi 1. Preparazione del Campione: Il campione viene aspirato tramite una pompa peristaltica e nebulizzato in un flusso di Argon. La nebulizzazione avviene attraverso un nebulizzatore, e il campione nebulizzato viene convogliato alla torcia di quarzo. 2. Ionizzazione nel Plasma: Nella torcia di quarzo, il campione viene degradato da un plasma a circa 6000°C, trasformandosi in atomi e ioni. Il plasma è generato da un flusso di Argon e mantenuto a pressione di circa 10^-7 atmosfere. 3. Separazione degli Ioni: Gli ioni passano attraverso un'interfaccia (conica) che riduce la pressione dal plasma (1 atm) a quella del settore di alto vuoto (10^-7 atm). La pressione variabile viene gestita tramite coni (sampler cone e skimmer cone) e la separazione degli ioni avviene tramite uno spettrometro di massa. Pag. 54 di 54 PREPARAZIONE DI STANDARD IN ANALISI ELEMENTARE • Preparazione degli Standard: § Matrix Matching: Per campioni complessi, si utilizzano soluzioni standard che imitano la composizione o le proprietà fisiche del campione. § Campioni Solidi: La digestione acida elimina la matrice solida; si usa quindi una miscela di acidi simile a quella del campione. • Tipi di Standard: § Multielementari: Contengono gruppi di elementi. § Monoelementari: Contengono un solo elemento, secondo le esigenze. • Preparazione: Gli standard primari possono essere preparati da composti noti. • Scadenza: Gli standard hanno una data di scadenza e devono essere aggiornati. • Calibrazione: Si utilizza una soluzione diluita a partire da uno standard per calibrare l’apparecchiatura. La calibrazione ideale produce una retta con coefficiente di determinazione (R) vicino a 1. • Errori e Correzioni: Una pendenza più alta o più bassa rispetto al reale causa sottostima o sovrastima dei dati. • Verifica: § Controllare la costanza del segnale giorno per giorno. § Utilizzare materiali certificati per garantire l’accuratezza dei risultati. Cifre ! Me"to Cifre di merito 1. Speciazione: In chimica analitica, la speciazione si riferisce alla determinazione delle forme chimiche specifiche, o specie, di un elemento all'interno di un campione. Non è sufficiente conoscere la concentrazione totale di un elemento; è necessario anche capire in quale forma chimica si trova, poiché le diverse specie possono avere proprietà chimiche, fisiche e tossicologiche differenti. 2. Accuratezza (Esattezza e Precisione): § Esattezza (Accuratezza): Misura di quanto il risultato di un'analisi sia vicino al valore vero o accettato. Rappresenta la correttezza della misura. § Precisione: Indica quanto i risultati di misure ripetute di uno stesso campione siano vicini tra loro. La precisione è una misura della riproducibilità e non implica necessariamente che i valori siano vicini al valore vero. 3. Sensibilità: Rappresenta la capacità di un metodo analitico di rilevare piccole variazioni nella concentrazione di un analita. È spesso definita come la pendenza della curva di calibrazione, cioè la variazione del segnale strumentale in funzione della variazione della concentrazione dell'analita. 4. Selettività e Specificità: § Selettività: È la capacità di un metodo analitico di distinguere l'analita di interesse da altre sostanze presenti nel campione. Un metodo selettivo è in grado di misurare l'analita in presenza di interferenze. § Specificità: Indica un livello più alto di discriminazione rispetto alla selettività. Un metodo specifico è in grado di misurare l'analita di interesse in modo univoco, senza alcuna interferenza da parte di altre sostanze. 5. LOD (Limit of Detection) e LOQ (Limit of Quantification): § LOD (Limite di Rilevabilità): È la più bassa concentrazione di un analita che può essere rilevata, ma non necessariamente quantificata con accuratezza, da un metodo analitico. Generalmente è definito come tre volte il rapporto segnale/rumore (S/N).