Esperimento di genetica del 1997, il caso della “clonazione della pecora Dolly”, permise di
ottenere un animale uguale alla madre, in quanto i loro corredi genetici erano identici.
Il termine clonaggio viene invece usato per identificare la replicazione di un frammento di DNA
in molteplici copie uguali, utilizzando un microrganismo ospite: esso viene “preso in prestito”
per poterne utilizzare l’apparato di replicazione del DNA.
Il gene d’interesse viene prima di tutto isolato dalla “fonte naturale”, ovvero dall’organismo
che lo possiede: per fare ciò è possibile utilizzare la tecnica chiamata PCR (polymerase chain
reaction) che permette di ottenere moltissime copie soltanto di questo gene, riuscendo a
“ignorare” le regioni precedenti e successive ad esso. Successivamente il frammento di DNA
viene inserito all’interno di un vettore, un plasmide o un cromosoma sintetico (o di origine
naturale), che ne permetta la replicazione: questo processo prende il nome di ligazione.
Una volta ottenuto il vettore completo esso deve essere incorporato nell’ospite con un metodo
chiamato trasformazione, nel caso in cui l’ospite sia un procariota come E.coli o un eucariota
unicellulare come S.cerevisiae, o trasfezione, nel caso di cellule eucariotiche superiori, come
quelle umane.
Per identificare e far crescere soltanto le cellule che hanno ricevuto il vettore, vengono
utilizzati marcatori di selezione pre-inseriti nel vettore, ovvero geni che forniscono un fenotipo
particolarmente visibile o che permettono la sopravvivenza in certe condizioni ambientali.
Classici marcatori di selezione sono quelli che conferiscono la resistenza a un antibiotico, per il
quale l’ospite utilizzato è sensibile: solo le cellule trasformate (o transfettate) saranno in grado
di vivere in un terreno contenente quell’antibiotico.
A questo punto le cellule vengono lasciate in crescita, durante la quale replicheranno anche il
vettore di clonaggio, cedendolo anche alle cellule figlie. Siamo poi in grado di degradare le
cellule e recuperare soltanto il vettore contenente il gene d’interesse che ora risulta essere
moltiplicato in numero di copie.
In alternativa è possibile clonare il gene all’interno del vettore utilizzando direttamente la PCR,
al fine di velocizzare il processo.
La tecnica del clonaggio può essere usata anche per la creazione di una collezione di cellule,
generalmente batteriche, o vettori che rechino frammenti di DNA estranei (eterologhi) che
nell’insieme rappresentano tutto il DNA con certe caratteristiche.
Questa “raccolta” viene chiamata libreria genomica nel caso in cui il DNA da cui si è partiti
costituisse il genoma di un organismo in tutte le sue parti.
Per costruire una libreria non è strettamente necessario aver portato a termine in precedenza il
sequenziamento del genoma, poiché la sua suddivisione nei vari frammenti avviene in maniera
casuale. In questo modo si ha la certezza che in media tutto il DNA sia equamente
rappresentato nei plasmidi, e di conseguenza nei ceppi che con essi sono stati trasformati o
trasfettati.
Le librerie possono essere anche di altro tipo, come le librerie a cDNA, che rappresentano
soltanto i geni trascritti, e le librerie di espressione, costruite in modo che il ceppo ospite
sintetizzi la proteina codificata dal gene (o dai geni) presenti nel frammento eterologo. La
libreria può essere inoltre utilizzata per la ricerca (screening) di una particolare sequenza fra
tutte quelle presenti.
