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Biologia Generale

Nicolò Pernicone

Lezione 17/10/2022

Prof. Paola Rizzo

GLI ESPERIMENTI FONDAMENTALI DELLA BIOLOGIA

IL DNA E’IL DEPOSITARIO DELL’INFORMAZIONE GENETICA

ESERCITAZIONI VIRTUALI

Il Dna e l’RNA possono essere estratti da cellule procariotiche e eucariotiche, il materiale di partenza

sono: batteri, diversi tessuti biologici sia animali o vegetali, cellule derivate dai diversi tessuti

biologici, liquidi biologici.

Da notare la differenza tra i tessuti cellulari: le biopsie prelevate da un organismo o da cellule coltivate

in laboratorio, quest’ultime sono linee cellulari ottenute ad esempio da un tumore coltivate in piastre.

Per isolare il DNA o l’RNA dalle cellule occorre metterle in una soluzione tampone contenente

detergente, il più usato è l’SDS ovvero sodio dodecile solfato. Esso lisa le membrane delle cellule e

otteniamo il materiale genetico. Diversamente accade avendo una biopsia da un tessuto, all’interno

di una matrice extracellulare costituita da proteine, utilizzando semplicemente un tampone di lisi non

riusciamo ad accedere alle cellule e lisarle. Occorre aggiungere la proteinasi k (un enzima) così da

poter lisare le cellule.

In tubo di 50ml al lisato si aggiungeva una miscela di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico.

Unendo al fenolo il lisato cellulare nelle identiche quantità, essendo un solvente organico apolare a

differenza della soluzione acquosa di lisato cellulare, miscelando i due composti si verrà a creare un

anello all’interfaccia tra fenolo e acqua contenente le proteine denaturate.

Nelle strutture di laboratorio, tramite una centrifuga velocità moderata separiamo le fasi velocemente.

Il tubo di 50 ml è suddiviso:

1. Superiore: contiene gli acidi nucleici.

2. Interfase: contiene proteine denaturate (molecole che hanno ancora una porzione polare e

apolare).

3. Inferiore: contiene lipidi e proteine con amminoacidi idrofobici.

Per recuperare il DNA si usa una metodica chiamata “precipitazione del DNA o RNA”, alla soluzione

acquosa vengono aggiunti dei Sali sodio acetato, si aggiunge 2,5 volumi di etanolo. Il DNA

all’esterno presenta delle cariche negative che consentono di interagire con l’acqua, saturando con i

Sali e aggiungendo etanolo l’RNA precipita ovvero non instaura più legami con l’acqua (non è più in

soluzione), recupero il DNA e L’RNA (non essendo più solubili a causa dell’eccesso di ioni dovuti

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Biologia Generale Nicolò Pernicone Lezione 17/10/ Prof. Paola Rizzo GLI ESPERIMENTI FONDAMENTALI DELLA BIOLOGIA IL DNA E’IL DEPOSITARIO DELL’INFORMAZIONE GENETICA ESERCITAZIONI VIRTUALI Il Dna e l’RNA possono essere estratti da cellule procariotiche e eucariotiche, il materiale di partenza sono: batteri, diversi tessuti biologici sia animali o vegetali, cellule derivate dai diversi tessuti biologici, liquidi biologici. Da notare la differenza tra i tessuti cellulari: le biopsie prelevate da un organismo o da cellule coltivate in laboratorio, quest’ultime sono linee cellulari ottenute ad esempio da un tumore coltivate in piastre. Per isolare il DNA o l’RNA dalle cellule occorre metterle in una soluzione tampone contenente detergente, il più usato è l’SDS ovvero sodio dodecile solfato. Esso lisa le membrane delle cellule e otteniamo il materiale genetico. Diversamente accade avendo una biopsia da un tessuto, all’interno di una matrice extracellulare costituita da proteine, utilizzando semplicemente un tampone di lisi non riusciamo ad accedere alle cellule e lisarle. Occorre aggiungere la proteinasi k (un enzima) così da poter lisare le cellule. In tubo di 50ml al lisato si aggiungeva una miscela di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico. Unendo al fenolo il lisato cellulare nelle identiche quantità, essendo un solvente organico apolare a differenza della soluzione acquosa di lisato cellulare, miscelando i due composti si verrà a creare un anello all’interfaccia tra fenolo e acqua contenente le proteine denaturate. Nelle strutture di laboratorio, tramite una centrifuga velocità moderata separiamo le fasi velocemente. Il tubo di 50 ml è suddiviso:

Superiore: contiene gli acidi nucleici.
Interfase: contiene proteine denaturate (molecole che hanno ancora una porzione polare e apolare).
Inferiore: contiene lipidi e proteine con amminoacidi idrofobici. Per recuperare il DNA si usa una metodica chiamata “precipitazione del DNA o RNA”, alla soluzione acquosa vengono aggiunti dei Sali sodio acetato, si aggiunge 2,5 volumi di etanolo. Il DNA all’esterno presenta delle cariche negative che consentono di interagire con l’acqua, saturando con i Sali e aggiungendo etanolo l’RNA precipita ovvero non instaura più legami con l’acqua (non è più in soluzione), recupero il DNA e L’RNA (non essendo più solubili a causa dell’eccesso di ioni dovuti

dai Sali ed etanolo) utilizzando di nuovo la centrifuga con una velocità superiore di 10.000 volte all’accelerazione di gravità. Successivamente il “pellet” che si viene a creare in fondo al tubo corrisponde al DNA o RNA, aspiriamo il liquido sopra esso e “risospendiamo” il DNA con l’acqua (non essendoci i Sali è di nuovo solubile). Inserendo il DNA nei buchi del gel d’agarosio lo immergiamo nel tampone e azioniamo il generato di corrente. Il DNA ha cariche negative e migra sotto l’azione del campo elettrico, per notare questo processo usiamo un colorante il bromuro di etilio intercalandosi tra le basi del DNA e RNA, assorbendo luce nell’ultravioletto emettendola nel visibile. In una camera buia con una lampada uv, coprendo il volto dalla luce uv veniva scattata una foto, così da poter osservare un acido nucleico (elettroforesi di DNA genomico frammentato con gli enzimi). Questa analisi si usava per le molecole di RNA essendo una molecola molto meno resistente del DNA, degradandosi molto facilmente. Ai giorni nostri tutto questo processo si svolge in un’ora, la fase iniziale è la stessa, la parte del fenolo, cloroformio, centrifugata e precipitazione non si svolgono più. Mettiamo il lisato su una colonnina all’interno di una centrifuga (dove è presente una membrana alla quale si legano gli acidi nucleici) aggiungiamo l’acqua e alla colonnina rimane legato l’RNA, aggiungendo nuovamente acqua e centrifugando otteniamo l’acido nucleico. QUANTO DNA O RNA ABBIAMO OTTENUTO? Per misurare la quantità ottenuta si sfrutta la proprietà fisica del DNA e RNA, ovvero di assorbire luce nell’ultravioletto, ad una specifica lunghezza d’onda 260-280 nm.

genoma, perché tutti le sequenze sono uniche e non ripetute al contrario del DNA di una cellula eucariotica. Esistono 3 classi di DNA: a sequenza unica, sequenza mediamente ripetute, sequenza altamente ripetuta, denaturando per quest’ultime sarà facile trovare la coppia complementare. La grandezza del genoma e la sua complessità Sull’asse delle ordinate è riportata la dimensione del genoma misurata tramite il numero delle basi (l’uomo misura genoma 3x10^9 basi), nel grafico più in basso si trova l’organismo più è piccolo il genoma (esempio il virus). Guardando la grandezza del genoma di un mammifero è minore rispetto a quello di una pianta, dovuto al fatto che non tutto il DNA contenuto in una cellula è DNA codificante, non esiste correlazione tra la complessità di un organismo e le dimensioni del suo genoma. Prendendo in considerazione invece le frazioni non ripetitive ovvero i geni (nell’uomo sono circa 25.000) è associata la complessità. Centrifuga gradiente di densità Prendendo il cloruro di cesio in quantità 6 mol aggiunto in un tubo di 50 ml, utilizzando la centrifuga, il cloruro di cesio sedimenterà grazie alla forza centrifuga, la diffusione lo porterà nella parte superiore. Creando un gradiente nel quale sul fondo della provetta è presente una densità maggiore di cloruro di cesio rispetto alla parte superiore. Andando ad aggiungere del DNA, al termine della centrifugata, esso si disporrà nel gradiente in base alla propria densità. Nel DNA che contiene azoto sarà più sotto rispetto ad un DNA fisiologico con densità minore. Questa procedura serve per capire come il DNA replica. I ribosomi 18- 20 s ad esempio, rappresentano la modalità di come essi interagiscono con un gradiente di saccarosio. Il gradiente di cloruro di cesio in un tubo, concentrato in alto e diluito in basso, il DNA che contiene azoto 15 si colloca in fondo alla provetta, mentre il DNA dell’azoto 14 lo troviamo nella parte superiore. Uno degli esperimenti più importanti della biologia per dimostrare che la replicazione del DNA è di tipo semiconservativa.

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