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Metabolismo
Glicolisi
Biochimica
Sommario
● Metabolismo in generale ● Glicolisi in generale ● Reazioni ● Regolazione ● Rendimento energetico ● Destini del piruvato ● Glicolisi di altri zuccheri ● Paradosso di Warburg ● Gluconeogenesi
Metabolismo in generale
Tutti gli organismi viventi devono operare trasduzione energetica per sopravvivere, ovvero trasformare il cibo per ricavarne energia chimica e in parte anche calore, aumentando l’energia libera del sistema che non arriverà mai all’equilibrio, è un sistema aperto. Attraverso l’ossidazione delle macromolecole introdotte tramite la dieta, che avviene in presenza d’ossigeno, si è in grado di generare energia metabolica. Quindi, la respirazione cellulare è un processo redox in cui gli elettroni vengono trasferiti da glucosio a ossigeno per dare: H2O, CO2 e ATP. Il metabolismo è l’insieme di reazioni chimiche anaboliche e cataboliche. Il catabolismo è degradativo e produce energia (reazioni esoergoniche ossidative) mentre l’anabolismo è sintetico e richiede energia (reazioni endoergoniche riduttive). Le vie cataboliche servono a formare equivalenti riducenti ad esempio NADPH, NADH o ancora FADH.
Questi permetteranno di formare ATP nella fosforilazione ossidativa. L’energia di questa molecola è racchiusa nel legame fosfoanidridico. L’idrolisi dell’ATP libera energia che era contenuta nel legame anidridico di circa - calorie. Spesso nelle reazioni metaboliche che usano ATP o ADP come substrato, si trova il magnesio che scherma le cariche negative che potrebbero disturbare la reazione. L’ATP non rappresenta riserva energetica ma permette subito di utilizzare energia, è quindi una molecola disponibile e ogni molecola di ATP è consumata in 1 minuto, inoltre un uomo a riposo consuma 40 kg di ATP in 24 ore. Accoppiamento energetico : in realtà nel catabolismo si possono trovare reazioni leggermente endoergoniche ma queste sono sempre congiunte a reazioni altamente esoergoniche proprio perché alla fine della via catabolica il ΔG deve essere negativo. Glicolisi in generale La glicolisi è un processo citoplasmatico di degradazione del glucosio libero in acido piruvico, che avviene in due particolari condizioni: ● aerobiosi : la glicolisi citoplasmatica sarà seguita dalla fase mitocondriale, nella quale l’acido piruvico entrerà nel ciclo di Krebs, dove verrà ossidato in anidride carbonica ed acqua. ● anaerobiosi : avverrà la successiva trasformazione da piruvato ad acido lattico o etanolo È un processo regolato e catalizzato da vari enzimi che si trovano nel citoplasma della cellula dove si svolge. Fu messa in evidenza nei lontani anni 30 da quattro ricercatori i quali videro che, in seguito all’eliminazione del fosfato si aveva la fermentazione quindi definirono che c’era qualche cosa che captava fosfato. Questo portò, negli studi successivi, a capire quali fossero quegli enzimi che partecipassero al processo che ad oggi sono noti come chinasi e deidrogenasi. Strategia chimica alla base:
- fosforilazione del glucosio e conseguente riproduzione dei prodotti fosforilati
● Meccanismo allosterico : ATP e ADP sono effettori allosterici ● Riconoscimento indotto per il glucosio : quando il substrato interagisce con l’enzima, questo cambia conformazione (si apre o si chiude) e l’esochinasi avvolge il glucosio con un meccanismo indotto. L’esochinasi ha vari isoenzimi , ovvero enzimi che applicano la stessa catalisi ma con un profilo amminoacidico diverso. Delle esochinasi esistono diverse forme, una in particolare si trova nel fegato, l’esochinasi 4 o anche chiamata glucochinasi. Queste differiscono per la Km (segnale di affinità misurata in concentrazioni), in quanto la glucochinasi ha una Km di 10 -2, mentre l’esochinasi ha una Km di 10-5/-6. L’espressione della glucochinasi è stimolata dall’insulina quando c’è un alto contenuto di glucosio a livello del fegato, segnale mandato da GLUT 2, sensore per le cellule pancreatiche di Langerhans. In particolare la glucochinasi diventerà attiva solo quando la proteina regolatrice dell’esochinasi (che la mantiene segregata a livello nucleare) si staccherà e quindi l’esochinasi potrà passare a livello del citosol per svolgere la sua funzione. Nell’esochinasi oltre alla regolazione di tipo allosterica, è presente una diversa regolazione delle sue forme isoenzimatiche. In particolare, l‘esochinasi-1 e l’esochinasi-4, le forme presenti rispettivamente nel muscolo e nel fegato, risentono entrambe della concentrazione del prodotto. L’esochinasi-1 è regolata in particolare inibita dalle concentrazioni del prodotto di reazione, mentre la glucochinasi non risente delle concentrazioni del substrato. Infatti, il glucosio-6-fosfato nel muscolo serve per la contrazione muscolare perché effettua subito la glicolisi per produrre ATP. Viceversa, nel fegato il glucosio-6-fosfato, in parte servirà per la glicolisi, ma soprattutto verrà trasformato in glicogeno. Infatti, quando è presente una richiesta di glucosio, avendo la fosfatasi il fegato libera subito glucosio. Quindi la glucochinasi, o esochinasi 4, non risente del prodotto di reazione ma semplicemente dalla concentrazione di glucosio. In particolare, quando la concentrazione ematica di glucosio è bassa la glucochinasi, viene trattenuta mediante un legame con una proteina regolatrice che la blocca all’interno del nucleo; se la concentrazione di glucosio è alta, si libera la glucochinasi perchè questo va a legarsi alla proteina regolatrice che quindi si stacca.
2. Glucosio-6-P <—> Fruttosio-6-P La reazione è catalizzata da una fosfoesoso isomerasi. Avviene tramite un meccanismo acido base in cui avrà l’apertura dell’anello del glucosio da parte dell’acido. L’acido che dona un protone ed una base che strappa il protone e che poi verrà restituito. In seguito, si avrà la formazione intermedia di un enediolato, per terminare con la successiva chiusura dell’anello sotto forma fruttosio, dove nel C1 porta CH2OH ed H. 3. Fruttosio-6-P + ATP —> Fruttosio-1,6-bisP + ADP Si tratta della vera reazione di controllo della glicolisi. È catalizzata dalla fosfofruttochinasi e consiste nel trasferire un gruppo fosfato dall’ATP al fruttosio. Si tratta di un dimero formato da due eliche, e possiede oltre ai siti di legame per i substrati anche siti regolatori ai quali si legano attivatori o inibitori allosterici. Infatti questo enzima è regolato da molecole che tendono ad influenzare la glicolisi per contenerla o per mandarla avanti. In particolare è regolata da: ● Positivamente da ADP e AMP ● Negativamente da citrato e ATP. Se il contenuto di ATP è alto la reazione non deve andare avanti; in questo modo il glucosio-6-fosfato nel fegato andrà a formare glicogeno. Infatti l’enzima a basse concentrazioni di ATP raggiunge subito il platau mentre ad alte concentrazioni di ATP assume un andamento sigmoide e raggiunge il platau più lentamente. Se la concentrazione di citrato è alta lo stato energetico della cellula è soddisfatto e non c’è bisogno di formare altro glucosio. ● Positivamente da fruttosio-2,6-bisfosfato
5. Diidrossiacetonefosfato <—> Gliceraldeide-3-P L’enzima che catalizza la reazione è una trioso fosfato isomerasi che passa attraverso un intermedio enediolico, in cui un acido dona un protone e la base se lo riprende. **Fase di rendimento energetico
- Gliceraldeide-3-P + Fosfato inorganico + NAD+ <—> 1,3-bifosfoglicerato + NADH** La reazione è catalizzata da una gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi , GAP, perché è una ossidoriduzione. Il gruppo aldeidico della gliceraldeide-3-fosfato viene ossidato per dare un’anidride tra un gruppo carbossilico e l’acido fosforico, detto acil fosfato, che ha un’alta energia libera standard di idrolisi. Il coenzima di questa deidrogenasi è il NAD, che passa dalla sua forma ossidata a quella ridotta. Al sito attivo della deidrogenasi c’è una cisteina che gioca un ruolo attivo in questa catalisi. Il gruppo aldeidico dalla gliceraldeide reagisce con il gruppo -SH della cisteina; questo legame forma un prodotto tioemiacetalico. Una volta attaccata entra in gioco il NAD, formando un aciltioestere intermedio, il gruppo emiacetalico si è ossidato ad acil- e il NAD si è ridotto a NADH.
A questo punto il P inorganico può sostituire il legame tioestere (che contiene energia) per formare l’1,3-bisfosfogligerato. L’energia di questo legame è circa -3 kcal/mol,ancora più alto di un legame dell’ATP che è -7 kcal/mol. Questa energia verrà ceduta all’ADP per formare ATP e 3-fosfoglicerato nella reazione successiva.
7. 1,3-bifosfoglicerato + ADP —> 3-fosfoglicerato + ATP L’ADP verrà trasformato in ATP grazie al fatto che l’1,3-bifosfoglicerato ha un’energia di idrolisi del gruppo fosfato più elevata dell’ATP. L’enzima che catalizza la reazione è una fosfoglicerato chinasi. La formazione di ATP per trasferimento di un gruppo fosforico da un substrato come l’1,3-bisfosfoglicerato è detta fosforilazione a livello del substrato. 8. 3-fosfoglicerato <—> 2-fosfoglicerato La reazione è catalizzata da una fosfoglicerato mutasi , che porta ad un intermedio che è il 2,3–bisfosfoglicerato, presente anche nell’emoglobina per mantenerne la struttura tesa. Nel feto è importante che i livelli di questo intermedio rimangano bassi in modo che possa catturare più ossigeno. L’istidina precedentemente fosforilata della mutasi è in grado di cedere il gruppo fosforico al gruppo -OH in posizione 2 del 3-fosfoglicerato. C’è poi la formazione dell’intermedio 2,3-bifosfoglicerato e interviene di nuovo l’istidina in grado di captare il gruppo fosforico in posizione 3, per dare come prodotto di reazione il 2-fosfoglicerato. 9. 2-fosfoglicerato —> fosfoenolpiruvato + H2O
● PKR nei globuli rossi; ● PKM1 nei tessuti cardiaci e cerebrali. ● PKM2 nei tessuti in via di differenziamento. La piruvato chinasi è: ● Inibita da ATP e acetil-CoA ● Attivata dal fruttosio-1,6-bisfosfato Regolazione della glicolisi I tre punti di controllo della glicolisi sono le reazioni catalizzate da: ● Esochinasi ● Fosfofruttochinasi- ● Piruvato chinasi Tutti gli eventi di regolazione sono importanti per non produrre cicli futili che dissipano energia sotto forma di calore. Oltre a questo controllo a livello enzimatico ne esiste uno globale da parte degli ormoni. Resoconto energetico ● Iniziale consumo di 2 molecole di ATP ● Successiva formazione di 4 molecole di ATP e di 2 molecole di NADH , equivalenti riducenti che potranno andare incontro a fosforilazione ossidativa per dare esistono tessi ATP. Nelle reazioni sequenziali della glicolisi, tre tipi di trasformazione sono particolarmente importanti: ● La degradazione dello scheletro carbonioso del glucosio nel composto non saccaridico piruvato ● La fosforilazione di ADP ad ATP da parte di un composto ad alta energia che si forma durante la glicolisi ● Il trasferimento di atomi di idrogeno o elettroni al NAD+, generando NADH
Tutti i 9 intermedi glicolitici sono fosforilati; i gruppi fosforici hanno tre funzioni: ● Gli intermedi fosforilati non possono uscire dalla cellula perché la membrana plasmatica non presenta trasportatori per gli zuccheri fosforilati. ● I gruppi fosforici sono essenziali nei processi enzimatici di conservazione dell’energia metabolica. ● Il legame del gruppo fosforico al sito attivo di un enzima produce un’energia libera di legame che contribuisce ad abbassare l’energia di attivazione e aumenta la specificità della reazione catalizzata dall’enzima. Destini del piruvato Le due molecole di piruvato prodotte: ● In condizione aerobiche andranno incontro al ciclo di krebs ● In condizioni anaerobiche andranno incontro a fermentazione , che può essere: ○ Alcolica : il piruvato potrà diventare acetaldeide e poi etanolo. È svolta da due enzimi: la piruvato decarbossilasi che trasforma il piruvato in acetaldeide, la quale a sua volta viene parzialmente trasformata in etanolo mediante l’alcol deidrogenasi con produzione di NAD+. ○ Lattica : la lattato deidrogenasi catalizza la riduzione del piruvato a lattato usando NADH, e riformando NAD+ per la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. L’accumulo di lattato nei muscoli dopo un eccessivo sforzo fisico, provoca i cosiddetti crampi. Il lattato è presente anche a livello del tessuto nervoso prodotto dagli astrociti come fonte di scambio con i neuroni perché hanno una richiesta energetica molto elevata. Viene anche prodotto nel tessuto cardiaco in seguito ad un evento infartuale.
Se la galattochinasi o la uridiltrasferasi mancano, il galattosio ristagna ad esempio nella retina dove attraverso una riduttasi viene trasformato in galattitolo che può essere uno dei precursori per la formazioni della cataratta. Una malattia molto importante legata alla carenza di questi enzimi è la galactosemia in particolare è legata a una carenza di galattosio-1-fosfato uridiltrasferasi che porta all’accumulo di galattosio-1-fosfato e può essere contrastata da una dieta povera di galattosio. Il galattosio entra nella glicolisi solamente come galattosio-UDP che sarà legato a una catena oligosaccaridica permettendogli di legarsi ad alcune proteine. Il galattosio può essere convertito attraverso una reazione di sintesi in lattosio, questa reazione in particolare nella ghiandola mammaria è catalizzata da una proteina che è la galattosil-trasferasi che si coniuga e si associa con una lattalbumina. Solo quando questi due enzimi si associano si ha la formazione di lattosio, e queste due proteine si associano quando è richiesto la produzione di latte dalla ghiandola mammaria, quindi nel periodo di lattazione, sotto controllo ormonale. Il fruttosio deriva in gran parte dalla digestione del saccarosio a livello intestinale, ma in piccola parte anche dalla frutta e dal miele. Le differenze che lo contraddistinguono dal galattosio è il fatto che mentre quest’ultimo può partecipare alla struttura delle glicoproteine, il fruttosio molto meno o quasi per niente, nonostante abbiano una stessa funzione al livello energetico. Inoltre, il fruttosio non dipende mai dalle concentrazioni dell'insulina. Anche il fruttosio viene degradato, e per entrare al livello della glicolisi dovrà prima essere fosforilato secondo l'organo dove deve entrare.
Ad esempio nel muscolo il fruttosio viene trasformato in fruttosio 6-fosfato con una esochinasi, nel fegato invece, la fruttochinasi trasformerà il fruttosio in fruttosio 1-fosfato. Questo fruttosio 1-fosfato andrà incontro ad una reazione con l'aldolasi B, la quale formerà due composti chiave per la seconda fase della glicolisi. Quindi l'aldolasi B attacca il gruppo carbonilico del fruttosio con un amminogruppo della lisina per formare una base di Schiff. Quest'attacco permetterà una ricomposizione dei legami facilitando la liberazione della gliceraldeide, con formazione in seguito di diidrossiacetone fosfato. Questo comporta che la gliceraldeide con cui la glicolisi va avanti, dovrà essere ritrasformata in gliceraldeide 3-fosfato mediante una chinasi con dispersione di una molecola di ATP. Il diidrossiacetone fosfato, come nella glicolisi, verrà convertito nella 3-fosfogliceraldeide-P. Quindi il fruttosio può andare incontro a diverse vie: ● Può decidere di seguire la via glicolitica semplice, quindi attraverso un esochinasi trasformarsi a fruttosio 6-fosfato; ciò che accade nel muscolo, perché abbiamo bisogno subito di energia e perché possiede l’esochinasi che fosforila anche il fruttosio ● Può decidere sempre attraverso una chinasi di trasformarsi in fruttosio 1-fosfato come avviene nel fegato Sicuramente una dieta ricca in fruttosio porterebbe in parte ad un accumulo di fruttosio 1-fosfato perché le due reazioni (la fosfofruttochinasi e l’aldolasi) hanno una cinetica un po’ diversa. Questo ha come conseguenza il fatto che viene sequestrato più fosfato e quindi non si ha abbastanza rigenerazione di ATP. Ovviamente quando si ha un basso contenuto di ATP, a livello energetico cellulare, le pompe sodio potassio ad esempio, ne possono risentire. Si può andare incontro anche a due tipi di patologie abbastanza benigne: ● la carenza fruttochinasi, forma rara e benigna con perdita di fruttosio nelle urine ● la carenza aldolasi B, rara ed ereditaria, dovuta ad un deficit della aldolasi che porta alla intolleranza al fruttosio. Differenze metaboliche fruttosio-glucosio (nel fegato) ● Il fruttosio non è sotto il controllo dell'insulina, mentre il glucosio che viene fosforilato dalla glucochinasi lo è
Nelle cellule proliferanti normali la PKM2 converte fosfoenol-piruvato in piruvato, in quelle tumorali la PKM2 passa dalla forma tetramerica a quella dimerica, che va a finire a livello nucleare come modulatore dell’espressione enzimatica. La via della glicolisi fa da sostegno anche ad altri composti utilizzati anche in diverse vie metaboliche, quindi l’aumento della glicolisi può dipendere dal fatto che i mitocondri sono danneggiati, o dal fatto che esiste qualche meccanismo regolatorio in cui viene meno l’apoptosi (meccanismo mitocondriale), o anche dal fatto che la glicolisi sostiene la formazione di prodotti che servono a sostenere i vari compartimenti cellulari. Ultimamente è stato scoperto che esiste un’esochinasi mitocondriale che sostiene ancora di più la glicolisi, trasformando il glucosio in glucosio-6-fosfato. Quindi, riassumendo, anche in presenza di un alto livello di ossigeno, le cellule tumorali impiegano la glicolisi ad alta velocità. Warburg disse in uno dei suoi seminari che questo scambio tra la via mitocondriale e la glicolisi potrebbe essere tra le prime cause del cancro. Durante la glicolisi, inoltre, il fruttosio 1,6-bisfosfato (prodotto a partire dal fruttosio) si associa a una proteina Ras, che, quando è mutata, partecipa alla formazione di cellule tumorali e partecipa alla crescita del tumore. La PET (tomografia a emissione di positroni) permette di ottenere immagini dei processi funzionali all’interno del corpo attraverso il marcatore fluorodesossiglucosio. Se l’attività del marcatore aumenta, nelle cellule c’è una attività assimilabile a quella di una cellula tumorale. Il marcatore è maggiore nelle cellule con una attività metabolica più intensa. Gluconeogenesi
L’ATP è necessario produrre glucosio a partire da materiale non glucidico, attraverso un meccanismo detto gluconeogenesi. L’obiettivo è quello di riformare glucosio al bisogno , ad esempio in un digiuno prolungato, per sostenere il cervello o i muscoli. Si può partire ad esempio dall’alanina che può essere trasportata nel fegato dove viene trasformata in piruvato con una transaminazione. Glutammato + Piruvato <—> Alanina + Alfachetoglutarato Le funzionalità del fegato, difatti, vengono analizzate chimicamente, innanzitutto, saggiando le transaminasi come l’alanina-piruvico transaminasi o glutammico-ossalacetico transaminasi. La quantità di transaminasi presenti sono indice della funzionalità epatica. Un altro composto da cui si può partire per ottenere glucosio è il lattato, che viene formato quando il muscolo è sotto sforzo (tramite fermentazione) e che può essere trasportato al fegato per sintetizzare glucosio. È impossibile ripercorrere in maniera inversa gli step della glicolisi partendo dal piruvato, dal momento che alcuni enzimi non sono capaci di catalizzare le reazioni inverse (il loro ΔG le definisce irreversibili, e sono proprio quelle che producono o utilizzano ATP). Sicuramente questi saranno l’esochinasi, la fosfofruttochinasi1 e la piruvatochinasi, per cui le reazioni in cui intervengono devono essere raggirate, rimpiazzate da altre strategie metaboliche che necessitano enzimi diversi. ● Piruvato + ATP + HCO3- —> Ossalacetato + ADP + Pi + GTP —> Fosfoenolpiruvato + GDP + CO La reazione della piruvato chinasi viene superata adottando due strategie: la carbossilazione del piruvato in ossalacetato attraverso la piruvatocarbossilasi (con biotina) e la trasformazione dell’ossalacetato in fosfoenolpiruvato
glucosio 6-fosfato in glucosio, il quale successivamente verrà rilasciato nel flusso sanguigno. La deficienza congenita dell’enzima glucosio-6 fosfatasi determina la comparsa del Morbo di Von Gierke che provoca: ● Accumulo di glicogeno nel fegato e nei reni ● Grave ipoglicemia per mancato rilascio del glucosio dal fegato ● Diminuzione del rilascio di insulina in seguito all’ipoglicemia ● Elevata mobilizzazione degli acidi grassi per alterazione ormonale (aumento dei NEFA e dei corpi chetonici) ● Incapacità del fegato di convertire lattato in glucosio ● Accumulo di acido lattico nel sangue che induce decalcificazione delle ossa (osteoporosi)
