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LA GLICOLISI
La glicolisi è la via metabolica più importante per la vita in quanto prevede l’utilizzo di glucosio non per produrre energia necessaria ai processi biosintetici per la sopravvivenza. Si tratta di una via metabolica che avviene in tutte le cellule, ma con velocità differenti. In questo processo, una molecola di glucosio viene degradata, mediante una serie di reazioni catalizzate da enzimi, per produrre due molecole di piruvato. Inoltre, durante le reazioni in sequenza, parte dell’energia rilasciata dal glucosio, viene recuperata sottoforma di ATP e di NADH. La demolizione del glucosio è probabilmente il meccanismo biologico più antico che si è sviluppato per ottenere energia dalle molecole organiche. È un processo che nasce in condizioni anaerobie , cioè è un processo di degradazione metabolica in assenza di ossigeno: questo perché i primi organismi viventi comparvero quando l’atmosfera era priva di ossigeno. Come è risultato evidente dal sequenziamento del genoma di una grande varietà di organismi, alcuni archea e microorganismi parassiti sono privi di alcuni enzimi della glicolisi, ma conservano il nucleo centrale della via metabolica, presumibilmente realizzando forme alternative di glicolisi. Ad ogni modo, nel corso dell’evoluzione, la sequenza di reazioni della glicolisi si è completamente conservata. La glicolisi consta di dieci reazioni che possono essere suddivise in due fasi principali. La fase preparatoria è una fase di investimento energetico che converte il glucosio in due molecole di gliceraldeide- 3 - fosfato (G- 3 - P). La fase di recupero energetico è una fase in cui si ha un guadagno energetico e la trasformazione delle due molecole di gliceraldeide- 3 - fosfato in due molecole di piruvato , con conseguente produzione di quattro molecole di ATP e due di NADH. Il piruvato poi può avere tre differenti destini catabolici: In condizioni di ipossia o anaerobiche (condizioni di insufficiente apporto di ossigeno), il piruvato può andare in contro a fermentazione alcolica , che conduce alla formazione di etanolo e anidride carbonica. Sempre in condizioni anaerobiche , il piruvato può andare in contro a fermentazione lattica , cioè un processo di riduzione a due molecole di lattato. In condizioni aerobiche , il piruvato può andare in contro ad ossidazione , che comporta la perdita del suo gruppo carbossilico sotto forma di anidride carbonica e la formazione del gruppo acetilico dell’acetil-coenzima A. Il gruppo acetilico viene poi completamente ossidato ad anidride carbonica nel cosiddetto ciclo citrico. I TRASPORTATORI DEL GLUCOSIO Il glucosio, presente nel lume intestinale, viene assorbito dalle cellule dell’epitelio intestinale grazie a specifici sistemi di trasporto. Questo assorbimento avviene in corrispondenza della membrana apicale delle cellule intestinali ed è garantito dai trasportatori sodio-dipendenti della famiglia SGLT1 , che favoriscono il passaggio di glucosio dai compatimenti extracellulari all’interno delle cellule. Più in dettaglio, si tratta di un trasporto attivo secondario , che consiste nel trasferimento di una o più molecole di glucosio contro gradiente di concentrazione , cioè da regioni a minore concentrazione (compartimenti extracellulari) a regioni a maggiore concentrazione (interno delle cellula). Questo trasferimento di glucosio è accoppiato al trasferimento spontaneo di ioni sodio che, al contrario, avviene secondo gradiente di concentrazione , cioè da regioni a maggiore concentrazione (compartimenti extracellulari) a regioni a minore concentrazione (interno della cellula). Infatti, all’esterno della cellula vi è un’elevata concentrazione di sodio (dovuta all’azione della pompa sodio/potassio-ATPasi (1)) e tende a rientrare spontaneamente nella cellula, portando con sé il glucosio. Dunque, il glucosio sfrutta il gradiente del sodio per poter accedere all’interno della cellula (poiché non lo farebbe spontaneamente). (1) (^) La pompa sodio/potassio ATP-asi è un enzima ATP
- dipendente, che idrolizza l’ATP proveniente dalla trasformazione del glucosio. L’ATP viene utilizzato dalla pompa per estrudere tre ioni sodio all’esterno della cellula e per fare entrare due ioni potassio all’interno della cellula.
Una volta all’interno delle cellule, il glucosio viene trasportato dalle proteine di membrana della famiglia GLUT , che consta di 14 membri, ciascuno costituito da una sola catena di circa 500 amminoacidi. Tra queste proteine vi sono: GLUT1 : proteina di trasporto presente a livello degli eritrociti, del muscolo, della barriera emato-encefalica e della placenta. Presenta un’alta affinità nei confronti del glucosio (Km 1.5 mM) per il trasporto del D-glucosio; ma, se si considera il D-mannosio il trasporto è molto meno efficiente, come anche per il galattosio. GLUT2 : proteina di trasporto espressa maggiormente nel fegato, nelle cellule beta del pancreas e nell’intestino. Presenta una Km (costante di Michaelis) di 17 mM, più alta rispetto al GLUT1 ed in condizioni fisiologiche non è mai saturato dal glucosio, perché ha una bassa affinità. Nel fegato può catalizzare l’entrata o l’uscita del glucosio mantenendo equilibrata la concentrazione di glucosio tra sangue e citosol degli epatociti. Nelle cellule beta del pancreas fa da sensore per la sintesi e secrezione dell’insulina. GLUT3 : proteina di trasporto espressa soprattutto nel cervello, presenta un’affinità simile a GLUT1 ed è di primaria importanza della regolazione della glicemia. GLUT4 : proteina di trasporto insulina-dipendente presente nel tessuto muscolare e nel tessuto adiposo. L’aumento della concentrazione ematica del glucosio, determina il rilascio di insulina. La presenza di quest’ultima, aumenta il numero e la traslocazione del GLUT4 dal citoplasma alla membrana cellulare, fondendosi con essa. In questo modo, la GLUT4 può procedere alla rimozione di glucosio dal sangue, che entra così nelle cellule di questi tessuti; ciò è facilitato anche dalla discreta affinità (Km=2-5 mM). Quando la concentrazione ematica di glucosio si normalizza e l’insulina viene eliminata e le molecole di GLUT4 vengono lentamente rimosse dalla membrana plasmatica e sequestrate per endocitosi in vescicole intracellulari. GLUT5 : catalizza il trasporto intestinale di glucosio e soprattutto di fruttosio. Sono scarse invece le conoscenze di GLUT6 e GLUT7 , con quest’ultimo che ha una struttura simile a GLUT2 ed è espresso nel reticolo endoplasmatico delle cellule epatiche. FASE PREPARATORIA DELLA GLICOLISI La fase preparatoria della glicolisi è una fase di investimento energetico, in cui vengono utilizzate due molecole di ATP (che forniscono energia) per permettere la conversione del glucosio in gliceraldeide- 3 - fosfato. Questa fase comprende cinque reazioni, ognuna catalizzata da uno specifico enzima.
- Fosforilazione del glucosio, ad opera dell’esochinasi.
- Isomerizzazione del G6P, ad opera della fosfoglucoisomerasi.
- Fosforilazione del F6P, ad opera della fosfofruttochinasi-1.
- Scissione del FBP, ad opera della fruttosio 1,6-bisfosfato aldolasi.
- Isomerizzazione DHAP, ad opera della trioso fosfato isomerasi.
Una volta formatosi, il glucosio- 6 - fosfato rimane all’interno della cellula (in quanto non ci sono trasportatori adatti) può essere indirizzato verso tre vie metaboliche, a seconda delle varie esigenze fisiologiche: Può essere trasformato in glucosio- 1 - fosfato , che è la molecola di partenza per la sintesi del glicogeno. Può essere ossidato dall’enzima glucosio- 6 - fosfato deidrogenasi. Si tratta di una tappa compresa nel cosiddetto ciclo dei pentosi , che porta alla sintesi di NADPH e zuccheri (ribosio- 5 - fosfato). Può essere convertito in fruttosio- 6 - fosfato , che è la molecola di partenza della seconda reazione della glicolisi. Dunque, le vie metaboliche sono strettamente interconnesse ed una via è favorita rispetto ad un’altra a seconda delle esigenze metaboliche dell’organismo.
- ISOMERIZZAZIONE DEL GLUCOSIO- 6 - FOSFATO La seconda reazione della glicolisi è l’ isomerizzazione del glucosio- 6 - fosfato. In questa reazione prende parte l’enzima fosfoglucoisomerasi , appartenente alla classe delle isomerasi (ricorda: enzimi che catalizzano il trasferimento di gruppi all’interno di molecole per formare isomeri), che catalizza l’isomerizzazione reversibile del glucosio- 6 - fosfato (un aldosio) in fruttosio- 6 - fosfato (un chetoso). Nell’enzima fosfoglucoisomerasi sono presenti due tipi residui : una base e un acido, che dalla teoria di Bronsted e Lowry, sono rispettivamente delle specie in grado di accettare e di donare un protone H+. L’isomerizzazione può essere spiegata attraverso quattro stradi : STADIO 1 : Il residuo basico dell’enzima deprotona il gruppo ossidrilico OH legato al carbonio 1 del glucosio- 6 - fosfato: in particolare, si rompe il legame ossigeno-idrogeno e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’atomo di ossigeno (che è più elettronegativo) per formare un doppio legame con l’atomo di carbonio 1 (anomerico). Inoltre, dato che il residuo basico acquista un protone, si trasforma nel corrispondente acido coniugato. Contestualmente, si rompe il legame tra il carbonio 1 e l’ossigeno che costituisce l’anello e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’atomo di ossigeno (sempre perché è più elettronegativo) per deprotonare il residuo acido dell’enzima. Quest’ultimo si trasforma nella corrispondente base coniugata. Questo stadio porta all’ apertura dell’anello del glucosio- 6 - fosfato. STADIO 2 : la base coniugata contenuta nell’enzima rimuove l’atomo di idrogeno legato al carbonio 2. In particolare, si rompe il legame idrogeno-carbonio2 e il doppietto elettronico viene utilizzato dal carbonio 2 per formare un doppio legame con il carbonio 1. Invece, l’atomo di idrogeno si lega alla base coniugata, rigenerando il residuo acido dell’enzima. Contestualmente, si rompe il legame pi greco del doppio legame carbonio1- ossigeno e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’atomo di ossigeno per legare l’atomo di idrogeno dell’acido coniugato. In questo modo, si rigenera il residuo basico dell’enzima (in quanto l’acido coniugato cede un protone). Il prodotto di tale stadio è un intermedio chiamato cis-enendiolo , ossia una specie contenente un doppio legame carbonio1-carbonio2 e due gruppi ossidrilici OH, ciascuno legato ad un carbonio impegnato nel doppio legame, che si trovano dallo stesso lato (cis). STADIO 3 : il residuo basico dell’enzima deprotona il gruppo ossidrilico OH legato al carbonio 2 del cis-enendiolo. In particolare, si rompe il legame ossigeno-idrogeno e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’atomo di ossigeno per formare un doppio legame con il carbonio 2. Invece, l’atomo di idrogeno si lega al residuo basico, trasformandolo nuovamente nel corrispondente acido coniugato. Contestualmente si rompe il legame pi greco
del doppio legame carbonio1-carbonio2 e il doppietto elettronico viene utilizzato dal carbonio 1 per legare l’atomo di idrogeno del residuo acido dell’enzima. In questo modo, il residuo acido viene nuovamente trasformato nella corrispondente base coniugata, in quanto cede il proprio protone. Il prodotto di tale stadio è il fruttosio- 6 - fosfato , che si trova ancora in forma emiacetalica aperta. Si tratta di un monosaccaride chetoso, in quanto possiede un gruppo funzionale di tipo chetonico (ricorda: costituito da un gruppo carbonilico C=O legato a due atomi di carbonio). Nota che, nel fruttosio- 6 - fosfato, il carbonio anomerico (stereocentro, cioè un atomo di carbonio legato a 4 gruppi differenti) è il carbonio 2 e non il carbonio 1 (come è nel glucosio- 6 - fosfato). STADIO 4 : avviene la chiusura del fruttosio- 6 - fosfato. La base coniugata contenuta nell’enzima rimuove l’atomo di idrogeno legato all’atomo di ossigeno (quello che sarà il costituente dell’anello). In particolare, si rompe il legame ossigeno-idrogeno e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’atomo di ossigeno per legare l’atomo di carbonio 2 (anomerico). Invece, l’atomo di idrogeno si lega alla base coniugata, rigenerando il residuo acido dell’enzima. Contestualmente, si rompe il legame pi greco del doppio legame carbonio2-ossigeno e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’atomo di ossigeno per legare l’atomo di idrogeno dell’acido coniugato. In questo modo, si rigenera il residuo basico dell’enzima (in quanto l’acido coniugato cede un protone). Questo passaggio determina la chiusura del fruttosio- 6 - fosfato. Questa isomerizzazione ha un ruolo fondamentale , in quanto il riarrangiamento dei gruppi carbonilici e ossidrilici in carbonio 1 e in carbonio 2 è la premessa necessaria alle due tappe successive.
- FOSFORILAZIONE DEL FRUTTOSIO- 6 - FOSFATO La terza reazione della glicolisi è la fosforilazione del fruttosio- 6 - fosfato : è la seconda di fase di innesco in cui viene impiegata una seconda molecola di ATP. In dettaglio, avviene il trasferimento del gruppo fosfato dall’ATP al fruttosio- 6 - fosfato e, precisamente, ad essere fosforilato è il gruppo ossidrilico OH localizzato sul carbonio 1 dello zucchero. Il prodotto di tale reazione è una molecola di fruttosio-1,6-bisfosfato , cioè una molecola di fruttosio che contiene due gruppi fosfato, in corrispondenza del carbonio 1 e del carbonio 6; mentre la scissione idrolitica dell’ATP (che fornisce il gruppo fosfato) determina il rilascio di ADP. Il glucosio- 6 - fosfato e il fruttosio- 6 - fosfato hanno altri possibili destini metabolici, ma il fruttosio- 1,6-bisfosfato è un intermedio esclusivo della glicolisi (non si trova in altre vie metaboliche). Questa reazione è irreversibile nelle condizioni intracellulari ed è la tappa limitante di tutta la glicolisi. Essa è catalizzata dalla fosfofruttochinasi- 1 ( PFK- 1 ), cioè un enzima appartenente alla sottoclasse delle chinasi e alla classe delle transferasi (ricorda: le transferasi sono enzimi che catalizzano reazioni di trasferimento di gruppi funzionali), che catalizza il trasferimento del gruppo fosfato terminale dell’ATP ad un accettore nucleofilo, quale il gruppo ossidrilico localizzato sul carbonio 1 un del fruttosio- 6 - fosfato. La fosfofruttochinasi- 1 necessita di ioni Mg2+^ per la sua attività catalitica ed è soggetta ad una complessa regolazione allosterica (1). In particolare, l’enzima aumenta la sua attività quando lo stato energetico della cellula è basso , mentre diminuisce la sua attività quando lo stato energetico della cellula è alto. Ciò significa che l’attività enzimatica della fosfofruttochinasi- 1 aumenta quando la concentrazione di ATP è bassa , mentre diminuisce quando la concentrazione dei prodotti della demolizione dell’ATP (cioè ADP e AMP) è alta → ATP inibisce , AMP rimuove l’inibizione. (1) (^) La regolazione enzimatica allosterica viene effettuata sui cosiddetti enzimi allosterici ad opera di molecole chiamate modulatori o effettori allosterici. Il legame reversibile e non covalente di un modulatore ad un enzima allosterico, ne induce una variazione conformazionale e di conseguenza, una variazione di affinità per il substrato; per cui, i modulatori interconvertono forme meno attive e forme più attive dell’enzima, agendo come inibitori o stimolatori.
legame ossigeno-idrogeno del gruppo ossidrilico OH e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’atomo di ossigeno per formare un doppio legame con il carbonio 4. Contestualmente, si rompe il legame tra il carbonio 4 e il carbonio 3 e il doppietto elettronico passa interamente sul carbonio 3. Da questo stadio, si libera il primo prodotto della reazione, cioè il gliceraldeide- 3 - fosfato. STADIO 3 : l’atomo di carbonio 3 utilizza il proprio doppietto elettronico per deprotonare il gruppo carbossilico dell’aspartato. Inoltre, viene favorita l’idrolisi della base di Schiff (o meglio del doppio legame carbonio-azoto), con la liberazione del diidrossiacetone fosfato (DHAP) e il ripristino dei residui amminoacidici originari. (1) (^) il carattere elettrofilo del carbonio carbonilico è dovuto alla grande differenza di elettronegatività che vi è tra l’atomo di ossigeno e l’atomo di carbonio: l’ossigeno, essendo più elettronegativo, attira su di sé gli elettroni di legame e assume una carica parziale negativa; il carbonio invece, essendo meno elettronegativo, assume una carica parziale positiva.
- ISOMERIZZAZIONE DEL DIIDROSSIACETONE FOSFATO La quinta reazione della glicolisi è l’ isomerizzazione del diidrossiacetone fosfato. In questa reazione prende parte l’enzima trioso fosfato isomerasi , appartenente alla classe delle isomerasi (ricorda: enzimi che catalizzano il trasferimento di gruppi all’interno di molecole per formare isomeri), che catalizza l’isomerizzazione reversibile del diidrossiacetone (un chetone) in gliceraldeide- 3 - fosfato (un’aldeide). In particolare, la trioso fosfato isomerasi agisce spostando un atomo di idrogeno da un atomo di carbonio ad un altro adiacente, in modo che il trioso può interconvertirsi tra la forma chetonica e quella aldeidica. Il meccanismo è molto simile a quello della fosfoglucoisomerasi della seconda reazione. L’acido glutammico, presente sul sito attivo dell’enzima, interagisce con il diidrossiacetone fosfato, deprotonando il gruppo ossidrilico legato al carbonio 3. Allo stesso tempo un residuo di istidina interagisce con il gruppo carbossilico e si forma un intermedio enendiolico. Quest’ultimo, recuperando il protone dall’acido glutammico, si trasforma in gliceraldeide- 3 - fosfato. Dunque, da una molecola di glucosio (esoso) si ottengono 2 molecole di gliceraldeide- 3 - fosfato (trioso), consumando 2 molecole di ATP (reazione 1 e 3).
FASE DI RECUPERO ENERGETICO DELLA GLICOLISI
La fase di recupero energetico della glicolisi è una fase di guadagno energetico, in cui si ha la conversione delle due molecole di gliceraldeide- 3 - fosfato, prodotte nella fase preparatoria, in due molecole di piruvato , con conseguente formazione di quattro molecole di ATP e due di NADH. La resa netta in ATP per una molecola di glucosio è quindi di due molecole di ATP, poiché due molecole sono state consumate nella fase preparatoria per fosforilare la molecola di esosio in posizione 1 e 6. La fase di recupero energetico comprende cinque reazioni, ognuna catalizzata da uno specifico enzima.
- Ossidazione e fosforilazione della gliceraldeide- 3 - fosfato, ad opera della gliceraldeide- 3 - fosfato deidrogenasi.
- Defosforilazione del BPG, ad opera della fosfoglicerato chinasi.
- Isomerizzazione del 3PG, ad opera della fosfoglicerato mutasi
- Deidratazione del 2PG, ad opera dell’enolasi
- Defosforilazione del PEP, ad opera della piruvato chinasi.
- OSSIDAZIONE E FOSFORILAZIONE DELLA GLICERALDEIDE- 3 - FOSFATO La sesta reazione della glicolisi è l’ ossidazione e la fosforilazione della gliceraldeide- 3 - fosfato e porta alla formazione dell’ 1,3-bisfosfoglicerato (abb. 1,3-BPG), cioè una molecola a tre atomi di carbonio, contenente un legame anidridico ad alta energia tra il carbonio 1 del gruppo carbossilico e il gruppo fosfato. La reazione è catalizzata dall’enzima gliceraldeide- 3 - fosfato deidrogenasi ( GAPDH ) appartenente alla sottoclasse delle deidrogenasi e alla classe delle ossidoreduttasi (ricorda: enzimi che catalizzano il trasferimento di elettroni da una molecola ad un'altra). La gliceraldeide- 3 - fosfato deidrogenasi possiede un sito attivo in cui lega sia una molecola di NAD+^ che il substrato, rappresentato dalla molecola di gliceraldeide- 3 - fosfato. Quest’ultima si lega all’enzima grazie ad un residuo di cisteina. Il meccanismo di azione dell’enzima può essere spiegato in cinque stadi: STADIO 1 : la NAD+^ si lega al sito attivo della gliceraldeide- 3 - fosfato deidrogenasi, tramite il suo anello nicotinammidico. Questo step, attiva il residuo di cisteina in modo che possa legarsi successivamente al substrato, cioè alla gliceraldeide- 3 - fosfato. STADIO 2 : formazione del complesso enzima-substrato. La gliceraldeide- 3 - fosfato si lega al sito attivo dell’enzima grazie alla presenza di un residuo di cisteina. In particolare, l’atomo di zolfo del residuo di cisteina utilizza un doppietto elettronico per legarsi all’atomo di carbonio carbonilico (carbonio 1) della gliceraldeide- 3 - fosfato. Di conseguenza, si rompe il legame pi greco del doppio legame carbonio-ossigeno (gruppo carbonilico della gliceraldeide- 3 - fosfato) e il doppietto elettronico passa interamente sull’atomo di ossigeno che, essendo più elettronegativo (tende ad attirare elettroni), assume una carica negativa. Il prodotto di tale stadio è la formazione di un legame tioemiacetalico tra il substrato e l’atomo di zolfo del residuo di cisteina (tioemiacetale) STADIO 3 : deprotonazione e ossidazione del substrato (tioemiacetale). L’atomo di ossigeno carico negativamente utilizza il proprio doppietto elettronico per formare nuovamente il doppio legame con l’atomo di carbonio 1, rigenerando il gruppo carbonilico. Contestualmente, si rompe il legame tra il carbonio carbonilico e l’idrogeno e quest’ultimo viene trasferito sulla molecola di NAD+, che viene così ridotto a NADH , mentre il substrato viene ossidato. Il prodotto di tale stadio è un tioestere , cioè un composto organico contenente un gruppo carbonilico legato ad un gruppo SR (cioè costituito da un atomo di zolfo legato ad un gruppo R) → legame tioestereo carbonio-zolfo. STADIO 4 : il NADH prodotto lascia il sito attivo dell’enzima e viene sostituito da un’altra molecola di NAD+. La presenza di NAD+^ favorisce l'ingresso nel sito attivo di un gruppo fosfato , che va a fosforilare il substrato (precisamente il legame tioestereo). In particolare, uno dei due atomi di ossigeno carichi negativamente del gruppo fosfato utilizza un doppietto elettronico per formare un legame con l’atomo di carbonio carbonilico del substrato. Contestualmente, si rompe il legame carbonio-zolfo e il doppietto elettronico passa interamente sull’atomo di zolfo, che riacquista una carica negativa, rigenerando il residuo di cisteina originario. In questo modo, si forma l’ 1,3-bisfosfoglicerato che verrà poi rilasciato nello STADIO 5.
8. ISOMERIZZAZIONE DEL 3-FOSFOGLICERATO
L’ottava reazione della glicolisi è l’isomerizzazione del 3 - fosfoglicerato. Questa reazione avviene ad opera della fosfoglicerato mutasi , cioè un enzima appartenente alla classe delle isomerasi (ricorda: enzimi che catalizzano il trasferimento di gruppi all’interno di molecole per formare isomeri), che catalizza lo scambio reversibile del gruppo fosfato tra il carbonio 2 e il carbonio 3 del 3- fosfoglicerato e che richiede lo ione magnesio Mg^2 +. La reazione avviene in due tappe. Un gruppo fosfato legato ad un residuo di istidina dell’enzima viene trasferito all’ossidrile legato al carbonio 2 del 3-fosfoglicerato, formando il 2,3-bisfosfoglicerato. Successivamente, il gruppo fosfato localizzato sul carbonio 3 del 3-fosfoglicerato viene trasferito sul residuo di istidina. In questo modo si forma il 2-fosfoglicerato e l’enzima fosforilato viene rigenerato.
- DEIDRATAZIONE DEL 2-FOSFOGLICERATO La nona reazione della glicolisi è la deidratazione del 2- fosfoglicerato , che viene convertito a fosfoenolpiruvato (PEP) con perdita di una molecola di acqua. Questa reazione è catalizzata, in presenza di uno ione magnesio Mg2+ , dall’ enolasi , cioè un enzima appartenente alla classe delle liasi (ricorda: enzimi che catalizzano reazioni di addizione di gruppi a doppi legami o formazione di doppi legami mediante rimozione di gruppi). La reazione avviene in due stadi. Innanzitutto, il residuo di lisina 345 Lys^345 agisce da catalizzatore basico generale , sottraendo un protone dall’atomo di carbonio 2 del 2-fosfoglicerato. In particolare, l’atomo di azoto del gruppo amminico della lisina 345 utilizza il proprio doppietto elettronico per legarsi all’atomo di idrogeno del carbonio 2 del 2-fosfoglicerato, acquisendo una carica positiva. Contestualmente, nel 2-fosfoglicerato, si rompe il legame carbonio 2-idrogeno e il doppietto elettronico viene utilizzato dal carbonio 2 per formare un doppio legame con l’atomo di carbonio carbonilico. Nel frattempo, si rompe il legame pi greco del doppio legame carbonio-ossigeno del gruppo carbonilico e il doppietto elettronico passa interamente sull’atomo di ossigeno che, essendo più elettronegativo, acquisisce una carica negativa. Il protone legato al carbonio 2 del 2-fosfoglicerato non è particolarmente acido, quindi non si può rimuovere molto facilmente. Tuttavia, nel sito attivo dell’enolasi, il 2-fosfoglicerato interagisce con due ioni magnesio Mg2+ che rendono il protone legato al carbonio 2 molto più acido (abbassando il suo pKa(1)) e più facile da rimuovere. Successivamente, il glutammato 211 Glu^211 agisce da catalizzatore acido generale , donando un protone al gruppo ossidrilico OH legato al carbonio 3 , quello adiacente al carbonio 2. In particolare, l’atomo di ossigeno carico negativamente (NON quello carbonilico, ma l’altro) usa il proprio doppietto elettronico per formare un doppio legame carbonio-ossigeno con il carbonio carbonilico, acquisendo neutralità. Contestualmente, si rompe il legame pi greco del doppio legame carbonio-carbonio, tra il carbonio carbonilico e il carbonio 2, e il doppietto elettronico viene utilizzato dal carbonio 2 per formare un doppio legame carbonio-carbonio con il carbonio 3. A questo punto, si rompe il legame tra il carbonio 3 e l’atomo di ossigeno del gruppo ossidrilico OH e il doppietto elettronico viene utilizzato dall’ossigeno per deprotonare il gruppo ossidrilico del glutammato 211, formando una molecola di acqua. In questo modo, si elimina la molecola di acqua e si forma il fosfoenolpiruvato.
La reazione converte un composto con un potenziale di trasferimento del gruppo fosforico basso (la ΔG’° dell’idrolisi del 2 - fosfoglicerato è pari a - 17,6 kJ/mol), in uno con elevato potenziale di trasferimento (la ΔG’° dell’idrolisi del fosfoenolpiruvato è pari a - 61,9 kJ/mol). (1) (^) Il pKa è il logaritmo inverso della costante di ionizzazione acida Ka, cioè un valore che misura il grado di dissociazione di un acido in soluzione. All’aumentare del valore della costante di ionizzazione acida e al diminuire del valore della pKa, aumenta il grado di dissociazione dell’acido. Pertanto, questi due parametri rappresentano un’indicazione sulla forza dell’acido: all’aumentare del valore della costante di ionizzazione acida Ka e al diminuire del valore della pKa, aumenta la forza dell’acido, cioè tende maggiormente a cedere protoni (e dunque è maggiormente dissociato). Al contrario, al diminuire del valore della costante di ionizzazione acida Ka e all’aumentare del valore del pKa, diminuisce il grado di dissociazione e la forza dell’acido.
- DEFOSFORILAZIONE DEL FOSFOENOLPIRUVATO La decima e ultima reazione della glicolisi è il trasferimento di un gruppo fosfato dal fosfoenolpiruvato ad una molecola di ADP per formare piruvato e ATP. Questa reazione è catalizzata dalla piruvato chinasi , cioè un enzima appartenente alla sottoclasse delle chinasi e alla classe delle transferasi (ricorda: le transferasi sono enzimi che catalizzano reazioni di trasferimento di gruppi funzionali), che catalizza la scissione idrolitica del legame estereo tra il gruppo fosfato e il carbonio carbonilico e il trasferimento del gruppo fosfato dal fosfoenolpiruvato all’ADP. La piruvato chinasi richiede ioni come potassio K+^ e magnesio Mg+. Dalla scissione idrolitica del legame estereo che impegna il gruppo fosfato, si genera la forma enolica del piruvato che, a sua volta, tautomerizza(1)^ immediatamente nella forma chetonica più stabile. La reazione complessiva ha una variazione di energia libera standard fortemente negativa , dovuta in gran parte alla conversione spontanea della forma enolica del piruvato alla forma chetonica. Infatti, ΔG’° = - 61,9 kJ/mol e ciò significa che l’energia libera dei prodotti è minore dell’energia libera dei reagenti. Dunque, in condizioni standard, la reazione procede spontaneamente verso i prodotti ed è esoergonica. Metà dell’energia rilasciata dall’idrolisi del fosfoenolpiruvato viene conservata nella formazione del legame fosfoanidridico dell’ATP (ΔG’° = - 30,5 kJ/mol), mentre la restante parte costituisce la forza trainante che spinge la reazione verso la sintesi dell’ATP. (1) (^) La tautomeria cheto-enolica è una particolare forma di isomeria che comporta il trasferimento di un atomo di idrogeno, accompagnato dallo scambio di un legame covalente singolo con un doppio legame adiacente. Questo tipo di isomeria è mostrata da chetoni (composti organici in cui il carbonio di un gruppo carbonilico C=O è legato a due atomi di carbonio di due gruppi alchilici) che possiedono almeno un idrogeno in α: un atomo di carbonio adiacente al gruppo carbonilico è chiamato carbonio in α e tutti gli atomi di idrogeno ad esso legati sono chiamati idrogeno in α. Il tautomero di un chetone (il suo isomero costituzionale per tautomeria) è un enolo, cioè un composto organico contenente un gruppo ossidrilico OH e un gruppo alchenico C=C ed in particolare l’atomo di ossigeno del gruppo ossidrilico è legato ad uno dei due atomi di carbonio impegnati nel doppio legame. I due tautomeri sono in equilibrio fra loro e differiscono nella localizzazione di un atomo di idrogeno e di un doppio legame. Per i chetoni più semplici,
La fermentazione lattica è una via metabolica tipica di batteri e altri microorganismi. Essa può avvenire anche nel tessuto muscolare, quando il muscolo è interessato ad uno sforzo intenso e negli eritrociti che non possiedono mitocondri (e quindi non possono ossidare il piruvato ad anidride carbonica). In questo processo, il piruvato prodotto dalla glicolisi viene ridotto a L-lattato , per permettere la rigenerazione del NAD+, attraverso la riossidazione del NADH. Questa reazione è catalizzata dalla lattato deidrogenasi LDH , cioè un enzima stereospecifico – cioè forma solo l’isomero L del lattato – appartenente alla classe delle ossidoreduttasi , che catalizza la reazione di ossidoriduzione. Nella glicolisi, la deidrogenazione delle due molecole di gliceraldeide- 3 - fosfato, derivate da una molecola di glucosio, converte le due molecole di NAD+^ in due molecole di NADH. Poiché la riduzione di due molecole di piruvato in due molecole di lattato rigenera due molecole di NAD+, non vi è alcuna variazione netta della concentrazione del NAD+^ e del NADH. In condizioni di anaerobiosi, una cellula muscolare può consumare glucosio più velocemente. L’effetto dell’aumento della velocità di consumo del glucosio in condizioni di anaerobiosi, rispetto alle condizioni di areobiosi, è chiamato effetto Pasteur. Nel tessuto muscolare, in condizioni di ipossia e sotto intenso sforzo, il piruvato prodotto dalla glicolisi può accumularsi come lattato per azione della LDH. Il lattato poi può essere riciclato e trasportato al fegato, dove viene convertito in glucosio, tramite gluconeogenesi (processo attraverso il quale il glucosio viene sintetizzato a partire da precursori non saccaridici), per immagazzinarlo come glicogeno o rimetterlo in circolo come tale ( ciclo di Cori ). FERMENTAZIONE ALCOLICA La fermentazione alcolica è una via metabolica tipica dei lieviti e di altri microorganismi, in cui il piruvato prodotto dalla glicolisi viene ridotto ad etanolo CH 3 CH 2 OH e anidride carbonica CO 2 , per permettere la rigenerazione del NAD+, attraverso la riossidazione del NADH. Questa reazione avviene in due stadi: Nel primo stadio, il piruvato viene decarbossilato ad acetaldeide. In generale, la decarbossilazione è una reazione in cui il gruppo carbossilico di una molecola (in questo caso il piruvato) viene rimosso sottoforma di anidride carbonica. Questo primo stadio è irreversibile ed è catalizzato dalla piruvato decarbossilasi , cioè un enzima che richiede ioni magnesio Mg2+^ e che lega il coenzima tiamina pirofosfato. Nel secondo stadio, l’ acetaldeide viene ridotta ad etanolo ad opera dell’ alcol deidrogenasi , con l’intervento del NADH – prodotto dalla deidrogenazione della gliceraldeide- 3 - fosfato – che viene ossidato a NAD +. Questo stadio è reversibile e l’equilibrio è leggermente spostato verso l’ossidazione dell’alcol. La tiamina pirofosfato (TPP) è un coenzima della piruvato decarbossilasi, che svolge un ruolo fondamentale nella rottura dei legami adiacenti ai gruppi carbonilici. La parte funzionale della tiamina pirofosfato è l’ anello tiazolico e possiede un atomo di idrogeno relativamente acido, legato al carbonio 2. Il distacco di questo atomo di idrogeno produce un carbanione , cioè un atomo di carbonio carico negativamente, che è la specie attiva nelle reazioni TPP-dipendenti. Infatti, in seguito alla rottura del legame tra l’idrogeno e il carbonio 2 dell’anello tiazolico, il doppietto elettronico passa interamente sull’atomo di carbonio, che essendo più elettronegativo, assume un carattere nucleofilo. Dunque, il carbonio 2 diventa una specie ricca di elettroni ed in grado di cedere un doppietto elettronico per formare un nuovo legame. Il carbanione si lega al carbonio carbonilico del piruvato , che a sua volta è un elettrofilo , cioè una specie povera di elettroni ed in grado di acquistare un doppietto elettronico. Il carbanione viene stabilizzato per risonanza
dall’anello tiazolico, il quale permette una maggiore delocalizzazione degli elettroni. A sua volta, una maggiore delocalizzazione elettronica facilita la decarbossilazione , e quindi la perdita di una molecola di CO 2. REGOLAZIONE DELLA GLICOLISI Il processo di glicolisi viene regolato in base alla disponibilità di glucosio e alle esigenze energetiche della cellula, ed ha lo scopo di mantenere costanti i livelli di ATP. Il controllo della glicolisi avviene tramite una regolazione degli enzimi che prendono parte alle uniche tre reazioni irreversibili , cioè l’ esochinasi (reazione 1), la fosfofruttochinasi- 1 (reazione 3) e la piruvato chinasi (reazione 10). L’attività catalitica dell’ esochinasi viene inibita dal prodotto stesso della reazione, ovvero il glucosio- 6 - fosfato. In generale, l’inibizione da prodotto si ha se la concentrazione di quest’ultimo è più elevato rispetto al fabbisogno cellulare. In tal modo, la velocità dell’esochinasi diminuisce e, di conseguenza, anche gli enzimi successivi funzioneranno a velocità ridotte. Quindi la velocità di formazione del prodotto finale sarà conforme alle necessità cellulari. Tra le esochinasi, fa eccezione la glucochinasi o esochinasi IV , che non subisce inibizione da prodotto. La glucochinasi si trova negli epatociti (cellule del fegato) e funziona solo a concentrazioni di glucosio elevate. Infatti, a basse concentrazioni di glucosio, la glucochinasi rimane inattiva e legata alla cosiddetta proteina GKRP (proteina di regolazione della glucochinasi). L’attività catalitica della fosfofruttochinasi- 1 è soggetta ad una complessa regolazione allosterica. In particolare, l’enzima aumenta la sua attività quando lo stato energetico della cellula è basso , mentre diminuisce la sua attività quando lo stato energetico della cellula è alto. Ciò significa che l’attività enzimatica della fosfofruttochinasi- 1 aumenta quando la concentrazione di ATP è bassa , mentre diminuisce quando la concentrazione dei prodotti della demolizione dell’ATP (cioè ADP e AMP) è alta → ATP inibisce , AMP rimuove l’inibizione. Altre molecole importanti per la regolazione della fosfofruttochinasi-1 sono il citrato e il fruttosio-2,6-bisfosfato (da non confondere con il fruttosio-1,6-bifsosfato), che sono rispettivamente un inibitore e un attivatore allosterici. In particolare, se non ci fosse il fruttosio-2,6-bisfosfato, alle concentrazioni fisiologiche di fruttosio- 6 - fosfato, la fosfofruttochinasi- 1 non sarebbe attiva ; bastano piccole concentrazioni per cambiare la cinetica di saturazione dell’enzima, il che fa del fruttosio-2,6-bisfosfato un potente attivatore allosterico. Questo perché, in presenza di fruttosio-2,6-bisfosfato, ATP e citrato (che sono inibitori) sono meno affini all’enzima e aumenta l’affinità per il fruttosio- 6 - fosfato. Il fruttosio-2,6-bisfosfato è sintetizzato per fosforilazione del fruttosio- 6 - fosfato tramite l’enzima fosfofruttochinasi- 2 e viene defosforilato tramite l’enzima fruttosio-2,6-bisfosfatasi- 2. I due enzimi svolgono attività catalitiche opposte e sono presenti su una stessa proteina bifunzionale. Inoltre, sono a loro volta soggette a regolazione da parte di ormoni, quali il glucagone e l’insulina. Il glucagone disattiva la fosfofruttochinasi-2 e attiva la fruttosio-2,6-bisfosfatasi-2. In questo modo diminuisce la produzione di fruttosio-2,6-bisfosfato. L’ insulina attiva la fosfofruttochinasi-2 e disattiva la fruttosio-2,6-bisfosfatasi- 2. In questo modo aumenta la produzione di fruttosio-2,6-bisfosfato. L’attività catalitica del piruvato chinasi viene inibita allostericamente dall’ ATP , dall’ acetil-coenzimaA e dagli acidi grassi a lunga catena, ovvero tutte quelle molecole che segnalano un’abbondante disponibilità energetica.
