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DNA RNA proteine
L’ESPRESSIONE GENICA
DAI GENI ALLE PROTEINE
L’ipotesi un gene-un enzima La prima ipotesi sul ruolo dei geni fu formulata dai biologi statunitensi George Beadle e Edward Tatum, i quali inattivavano un gene danneggiandolo e cercavano di dedurne la funzione osservando il fenotipo dell’individuo mutante. Nelle loro ricerche utilizzarono un organismo modello, la muffa del pane Neurospora crassa: che esposero ai raggi x in modo da danneggiarne il DNA. Il passaggio successivo fu esaminare le cellule di N. crassa ricercando i mutanti. (uno dei mutanti non poteva più produrre un composto chiamato piridossina; l’analisi di uno di questi mutanti rivelò che quest’incapacità era dovuta a un difetto in un gene) Questi risultati portarono Beadle e Tatum a formulare l’ipotesi un gene-un enzima: secondo i due ricercatori ciascun mutante non poteva sintetizzare un particolare composto perché, a causa di un difetto genetico, era privo dell’enzima necessario per produrlo. L’ipotesi un gene-un polipetide Esperimenti successivi non solo hanno confermato la validità dell’ipotesi un gene-un enzima, ma hanno anche chiarito che i geni contengono le informazioni per sintetizzare tutte le proteine prodotte da un organismo, e non solo gli enzimi. Poiché in molti casi una proteina è formata da diverse catene polipeptidiche, l’ipotesi un gene- un enzima è stata modificata nell’ipotesi un gene- un polipeptide. IL DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE L’ipotesi di Crick: il DNA come codice Secondo la visione di Crick, la sequenza delle basi del DNA funzionano come un codice. La sua idea era che il DNA fosse soltanto una molecola con la funzione di immagazzinare informazioni. Diverse combinazioni di basi del DNA potevano specificare i 20 amminoacidi; questa informazione poteva anche essere copiata, grazie all’appaiamento delle basi complementari, e trasmessa fedelmente da una generazione all’altra. L’RNA messaggero Poiché il DNA è racchiuso all’interno del nucleo, mentre i ribosomi si trovano nel citoplasma, Jacob e Monod ipotizzarono che una molecola di RNA a singolo filamento, che chiamarono RNA messaggero o mRNA, trasportasse l’informazione del DNA ai ribosomi. L’enzima che impiega il DNA per la sintesi di una molecola complementare di RNA è l’RNA polimerasi. Anche l’RNA polimerasi impiega come stampa un filamento di DNA, ma non necessita di un primer. Il dogma centrale Una volta accettata l’ipotesi dell’mRNA, Crick formulò un insieme di basi che divennero noti con il nome di “dogma centrale della biologia molecolare”. Esso riassume il flusso dell’informazione dal DNA alle proteine e afferma che il DNA codifica un flusso che è unidirezionale. Secondo il dogma centrale, quindi: I geni sono costituiti da sequenze di DNA che codificano per i diversi prodotti proteici utilizzati dalla cellula; La sequenza delle basi del DNA specifica la sequenza delle basi in una molecola di RNA; L’RNA specifica la sequenza degli amminoacidi in una proteina.
Il legame tra genotipo e fenotipo Il genotipo di un organismo è determinato dalla sequenza delle basi del suo DNA, mentre il suo fenotipo è un prodotto delle proteine che esso sintetizza. Le eccezioni al dogma centrale Benchè il nucleo del dogma centrale sia tuttora considerato valido, scoperte recenti hanno messo in luce alcune eccezioni a questo schema: molti geni codificano per molecole di RNA che non hanno la funzione di mRNA, cioè sono trascritte dal DNA ma mai tradotte in proteine. Questi RNA hanno la funzione di controllare numerosi aspetti del fenotipo. In alcuni casi le informazioni fluiscono in senso inverso, dall’RNA al DNA. È il caso del gruppo di virus a cui appartiene l’HIV. Il genoma dell’HIV è costituito da due filamenti identici di RNA. Quando questi virus infettano una cellula, un enzima virale chiamato trascrittasi inversa sintetizza una versione a DNA dei geni virali, costituita da RNA. IL CODICE GENETICO Il codice genetico è un sistema di corrispondenza tra la sequenza dei nucleotidi nel DNA o nell’RNA e la sequenza degli amminoacidi in una proteina. Il fisico George Gamow avanzò l’ipotesi che ciascuna “parola” del codice genetico fosse formata da 3 basi (4^3 =64 diversi amminoacidi). La ridondanza del codice genetico Poiché il codice a triplette poteva specificare 64 amminoacidi, Gamow ipotizzò che il codice genetico fosse ridondante, cioè che uno stesso amminoacido potesse essere codificato da più di una tripletta di basi. Una tripletta di amminoacidi che codifica per un particolare amminoacido è detta codone.
Genotipo (DNA)mRNAproteinefenotipo
DNARNA
RNA DNA
Trascrittassi inversa
sintesi del DNA, ma hanno un gruppo -OH legato all’atomo di carbonio in seconda posizione anziché solo un atomo di H. L’RNA polimerasi catalizza una reazione che forma un legame fosfodiestere tra l’estremità 3’ della catena di mRNA in crescita e il nuovo ribonucleotide. Progressivamente viene trascritto, cioè è “letto” dall’RNA polimerasi: Il filamento che viene letto dell’RNA polimerasi ha direzione 3’5’ ed è indicato come filamento stampo; L’altro filamento è il filamento complementare o filamento codificante ed è identica alla sequenza dell’RNA che viene sintetizzato a partire dal filamento stampo, con l’unica differenza che nel DNA è presente la timina al posto dell’uracile. L’inizio della trascrizione Il processo di trascrizione è suddiviso in 3 tappe: Inizio Allungamento Terminazione La tappa di inizio è un importante punto di controllo dell’intero processo di trascrizione. Nei batteri la proteina sigma si lega all’RNA polimerasi formando con essa un oloenzima. Il legame con la proteina sigma indirizza l’RNA polimerasi verso la sequenza specifica del DNA da cui dovrà partire la trascrizione. Questa sequenza è denominata promotore. Il DNA che è localizzato nella direzione in cui l’RNA polimerasi si sposta durante la trascrizione è definito DNA a valle rispetto al promotore, quello localizzato in direzione opposta si chiama DNA a monte. Dopo che l’oloenzima si è legato a un promotore, l’RNA polimerasi apre la doppia elica del DNA, separa i due filamenti e inizia ad aggiungere ribonucleotidi; una volta avviata la trascrizione, la proteina sigma viene rilasciata e l’RNA polimerasi continua la sintesi del filamento di RNA. Le tappe di allungamento e terminazione Non appena l’RNA polimerasi abbandona la regione del promotore, ha inizio la tappa di allungamento, durante la quale progressivamente l’enzima legge lo stampo di DNA e aggiunge ribonucleotidi all’estremità 3’ del filamento in crescita. Anche l’RNA polimerasi è dotata di attività di correzione di bozze. La tappa di terminazione conclude la trascrizione. Nei batteri, la trascrizione si arresta quando l’RNA polimerasi trascrive una sequenza di DNA chiamata segnale di terminazione. Le basi presenti nella sequenza del segnale di terminazione vengono trascritte in un frammento di RNA che si ripiega su se stesso formando una breve doppia elica, tenuta insieme dall’appaiamento tra basi complementari. Questa struttura a forcina causa un indebolimento delle interazioni tra l’RNA polimerasi e il trascritto di RNA, provocando il distacco dell’enzima. LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI Le tappe della trascrizione dei batteri sono molto simili a quelle degli eucarioti ma: Gli eucarioti possiedono non una, ma ben 3 diverse RNA polimerasi, denominate pol I, pol. II e pol. III, ciascuna delle quasi produce solo un tipo specifico di RNA. I promotori del DNA eucariote sono più grandi e spesso includono una particolare sequenza ricca di coppie di basi timina-adenina (TATA box). Le RNA polimerasi eucariote riconoscono i promotori con l’ausilio di un gruppo di proteine chiamate fattori generali di trascrizione. I fattori di trascrizione si assemblano sul promotore, richiamando l’RNA polimerasi nel sito di inizio della trascrizione. Negli eucarioti la trascrizione si verifica nel nucleo, mentre la traduzione nel citoplasma. Nei batteri la traduzione può avvenire anche quando la trascrizione non è finita. Nei batteri quando la trascrizione ha termine il risultato è un mRNA maturo, mentre gli RNA trascritti nelle cellule eucariote devono essere prima sottoposti a consistenti modifiche. I geni degli eucarioti
sono inizialmente copiati in RNA non funzionali, definiti trascritti primari. Nel caso dei geni che codificano per proteine, il trascritto primario è un pre-mRNA. Il trascritto primario richiede poi varie modifiche, fino alla generazione dell’RNA maturo e funzionale. Lo splicing dell’RNA Nei geni le sequenze nucleotidiche effettivamente codificanti per le proteine non sono continue, ma sono intervallate da regioni di DNA non codificante. Le sequenze non codificanti vengono poi rimosse per ottenere l’mRNA maturo. Le regioni di un gene che vengono inizialmente trascritte, ma non sono rappresentate nell’mRNA finale, sono chiamate introni, mentre le regioni che sono trascritte e che permangono nell’mRNA maturo finale sono dette esoni. Gli stessi termini sono impiegati anche per indicare le regioni del trascritto primario che vengono eliminate (introni) o mantenute (esoni). La rimozione degli introni dal trascritto primario di RNA avviene mediante splicing. Il taglio degli introni è realizzato da speciali complessi molecolari, costituiti da RNA con attività catalitica e da proteine, che formano uno spliceosoma. Dopo l’eliminazione degli introni, gli esoni vengono saldati insieme. Altre modifiche del pre-mRNA: il cappuccio in 5’ e la coda di poliA Oltre allo splicing, altri due processi intervengono per modificare un pre-mRNA e trasformarlo in mRNA maturo.
- Non appena l’estremità 5’ di un pre-mRNA eucariote emerge dalla RNA polimerasi, appositi enzimi aggiungono un “cappuccio” formato da un nucleotide G modificato. Il cappuccio in 5’ facilita il legame dei ribosomi all’mRNA durante la successiva traduzione e protegge l’estremità 5’ dall’azione delle ribonucleasi, gli enzimi che degradano l’RNA.
- Una RNA polimerasi specializzata, che non richiede uno stampo, aggiunge all’estremità opposta del trascritto una “coda” formata da circa 100-250 nucleotidi A, detta coda di poliA. Anche la coda di poliA è necessaria affinché i ribosomi possano iniziare la traduzione e protegge l’estremità 3’ dell’mRNA dagli attacchi degli enzimi. A ulteriore protezione del trascritto, ai lati della regione codificante dell’mRNA maturo si trovano 2 regioni non tradotte (UTR) che contribuiscono a stabilizzare l’mRNA e a regolare la fase successiva di traduzione. LA TRADUZIONE Per sintetizzare una proteina, la sequenza delle basi di una molecola di mRNA deve essere convertita nella sequenza di amminoacidi di un polipeptide. Questo processo è chiamato traduzione e i ribosomi ne sono la sede. A ciascuna molecola di mRNA si legano simultaneamente diversi ribosomi, dando origine a strutture dette poliribosomi, i quali aumentano notevolmente la velocità del processo di sintesi proteica e il numero di copie di una proteina che possono essere sintetizzate a partire da una singola molecola di mRNA. L’ipotesi dell’adattatore Crick ipotizzò l’esistenza di una molecola di adattatore in grado di trasportare gli amminoacidi e di mantenerli “in posizione” durante la sintesi proteica, legandosi al tempo stesso con i codoni dell’mRNA. Alcuni anni dopo, l’adattatore fu identificato in un tipo di RNA detto RNA transfer o RNA di trasporto (tRNA). Quando un tRNA è legato a un amminoacido, viene definito amminoacil-tRNA. La struttura dei tRNA Le sequenze dei tRNA sono relativamente brevi (75-95 nucleotidi). In alcune regioni, l’instaurarsi di legami a H tra basi complementari genera “bracci”, in cui il filamento dell’RNA è ripiegato su se stesso, intercalati da anse in cui non vi è appaiamento. Complessivamente, la struttura della molecola assomiglia a un trifoglio.
Gli archebatteri compiono questi processi con modalità che assomigliano a quelle degli eucarioti L’inizio della traduzione La traduzione si articola in 3 tappe: l’inizio, la fase di allungamento e la terminazione. I passaggi sono piuttosto simili nei batteri e negli eucarioti. L’allungamento della catena polipeptidica All’inizio della tappa di allungamento, i siti E e A del ribosoma sono vuoti. L’mRNA si lega alla subunità ribosomiale minore tramite l’appaiamento di una sua specifica sequenza con una sequenza complementare nell’rRNA della subunità minore e con l’aiuto dei fattori di inizio. Questa regione è detta sito di legame per il ribosoma o sequenza di Shine-Dalfarno Il primo amminoacil-tRNA si lega al codone di inizio. Questo amminoacil-tRNA trasporta una forma modificata di metionina, la N.formilmetionina (f-Met). Il tRNA caricato con f-Met si lega al codone di inizio AUG sull’mRNA. Anche la subunità maggiore del ribosoma si lega, completando l’assemblaggio del ribosoma. Il tRNA caricato con f-Met viene a trovarsi nel sito P. la traduzione può avere inizio Ingresso dell’amminoacil-tRNA: un nuovo tRNA carico entra nel sito A, dove il suo anticodone si appaia al codone dellmRNA. Formazione del legame peptidico: l’amminoacido legato al tRNA nel sito P viene unito, in seguito alla formazione del legame peptidico, all’amminoacido del tRNA posizionato nel sito A. il ribosoma agisce quindi come un ribozima, cioè un enzima la cui attività catalitica è svolta dall’RNA e non da una proteina. Traslocazione: il ribosoma avanza di un codone lungo l’mRNA. Il tRNA legato alla catena polipeptidica si sposta nel sito P e il sito A rimane vuoto. Per potersi realizzare, la traslocazione richiede l’intervento di una proteina chiamata fattore di allungamento, che scinde una molecola di guanosina trifosfato (GTP) liberando l’energia necessaria a questo passaggio.
La tappa di terminazione L’arrivo di un amminoacil-tRNA nel sito A, la formazione del legame peptidico e la traslocazione si ripetono per ciascun codone dell’mRNA, fino a quando il ribosoma non raggiunge un codone stop. LE MODIFICHE POST-TRADUZIONALI DELLE PROTEINE Al termine le proteine non sono ancora completamente formate e funzionali, infatti subiscono una serie di modifiche post-traduzionali, che si svolgono in sedi diverse della cellula: Il ripiegamento del polipeptide: la funzionalità di una proteina dipende dalla sua forma. Benchè il ripiegamento possa avvenire spontaneamente, è frequente guidato e accelerato da proteine dette chaperon molecolari. Le modifiche chimiche: le proteine degli eucarioti subiscono numerose modifiche chimiche dopo la loro sintesi. nel reticolo endoplasmatico ruvido e nell’apparato di Golgi vengono aggiunti piccoli gruppi alle molecole (nel processo di glicosilazione), con la formazione di glicoproteine e lipoproteine. l’aggiunta di un gruppo fosfato nel processo di fosforilazione, catalizzato da enzimi chiamati chinasi. Il fattore di rilascio si lega al codone di stop: quando il ribosoma raggiunge un codone di stop, un fattore di rilascio occupa il sito A e scinde il legame tra il tRNA nel sito P e la catena polipeptidica. Vengono liberati il polipeptide e i tRNA scarichi. Le subunità del ribosoma si separano e sono pronte a legarsi al codone di inizio di un altro mRNA.
Traslocazione: dopo la rottura, un frammento di cromosoma può saldarsi a un cromosoma diverso. Spesso si verifica la rottura di due diversi cromosomi e i frammenti di DNA vengono scambiati; in questo caso si parla di traslocazione reciproca. o Un esempio di traslocazione reciproca negli esseri umani è il cosiddetto cromosoma Philadelphia, una forma anomala del cromosoma 22 prodotta da uno scambio di segmenti tra il cromosoma 22 e il cromosoma 9. Il cromosoma così mutato provoca alcune forme di leucemia. o Se invece un gamete n-1 viene fecondato da un gamete normale n, lo zigote risultante sarà 2n-1. Questa condizione è chiamata monosomia, perché è presente un’unica copia di uno dei cromosomi, ed è solitamente incompatibile con la sopravvivenza e lo sviluppo dell’embrione. In generale la presenza di un numero anomali di cromosomi nelle cellule è indicata come aneuploidia e rappresenta la principale causa di aborto spontaneo. Alcune forme di aneuploidia riguardano i cromosomi sessuali. La presenza di un solo cromosoma X nelle cellule causa la sindrome di Turner. Le donne affette da questa sindrome sono solitamente sterili, non hanno il ciclo mestruale e non sviluppano le mammelle. La presenza di un cromosoma X in più in individui di sesso maschile causa la sindrome di Klinefelter. I sintomi che includono riduzione della fertilità e delle dimensioni degli organi genitali. LE MUTAZIONI DEL CARIOTIPO Esistono mutazioni che modificano il cariotipo, cioè il numero complessivo di cromosomi nelle cellule di un individuo. Queste alterazioni includono la poliploidia, se il cambiamento riguarda un intero assetto di cromosomi, o l’aneuploidia, in cui l’alterazione numerica riguarda una parte del corredo cromosomico. La poliploidia è una condizione in cui si possiedono più di due cromosomi di ciascun tipo- può presentarsi quando durante la meiosi tutte le coppie di cromosomi omologhi non si separano e vengono prodotti gameti diploidi. Se un gamete diploide durante la fecondazione si fonde con un gamete aploide oppure con un diploide può nascere un organismo triploide o tetraploide. Quando una sola coppia di cromosomi omologhi non si separa correttamente durante la meiosi, vengono prodotti gameti con un cromosoma in più o in meno. Se un gamete n+1 viene fecondato da un normale gamete n, lo zigote risultante sarà 2n+1, questa condizione è detta trisomia. o La trisomia più nota è quella del cromosoma 21, che causa la sindrome di Down. o La trisomia 12 provoca la sindrome di Patau. o La trisomia 18 provoca la sindrome di Edwards. I neonati affetti difficilmente superano i primi mesi di vita
