I primi marcatori molecolari: i marcatori biochimici | Slide di Biologia Molecolare

I primi marcatori molecolari: i marcatori biochimici

L'analisi quali-quantitativa dei composti proteici ha costituito un primo strumento ai fini degli studi

genetici a livello molecolare.

L’analisi di proteine strutturali è stato un primo approccio; benchè diverse classi

proteiche possano essere valutate in diversi organi vegetali, l'elettroforesi delle proteine del seme è

stato il metodo più usato.

Nei cereali si è applicata l’analisi della frazione alcool-solubile delle proteine del seme

(prolamine).

L'elettroforesi su gel di poliacrilamide viene in genere preferita all'amido, in quanto solo la maggiore

risoluzione consentita da questa tecnica permette la 'lettura' del complesso modello di bande

prodotte sul gel.

L’elettroferogramma di un gel di proteine è il risultato dell'espressione di diversi geni, per cui,

dipendendo direttamente dalla costituzione genetica, può essere considerato come marcatore del

genotipo che lo presenta.

La complessità dei fenotipi proteici (20-50 bande presenti) ha costituito un limite per l'applicazione

di quest'analisi come marcatore puro, in quanto non è possibile seguire con esattezza le frequenze o

la segregazione dei molti geni codificanti per questi composti.

D'altra parte, questa stessa complessità, fornisce un valido strumento ai fini della caratterizzazione e

dell'identificazione varietale (fingerprinting): l'elettroferogramma delle proteine può essere infatti

considerato come l'impronta digitale di una cultivar ed utilizzato per la discriminazione tra

popolazioni geneticamente simili.

Marcatori biochimici:

Isoenzimi: insieme delle differenti forme molecolari di proteine enzimatiche codificate da geni

ubicati in loci diversi, ma che catalizzano la stessa reazione metabolica; si tratta di forme alternative

di un enzima, dette isoforme.

Alloenzimi: varianti di proteine enzimatiche che catalizzano la medesima reazione metabolica, ma

che sono tuttavia codificate da forme alleliche di uno stesso gene, potendosi pertanto riferire ad un

singolo locus.

Isoenzimi e alloenzimi

Un’altra classe di marcatori biochimici sviluppata e utilizzata per analisi genetiche è quella degli

alloenzimi, varianti di proteine rilevate attraverso la migrazione differenziale su gel di amido

sottoposto ad un campo elettrico.

A partire dalla fine degli anni sessanta questa classe di marcatori è stata ampiamente utilizzata per

numerosi lavori riguardanti soprattutto la genetica delle popolazioni.

Tuttavia i metodi basati direttamente sulle variazioni a livello del DNA, disponibili a partire

dalla metà degli anni ottanta, hanno ormai sostituito la tecnica degli alloenzimi.

In ogni organismo, il numero delle forme enzimatiche con una determinata azione catalitica è

generalmente basso; il polimorfismo presente in queste proteine può essere facilmente evidenziato

tramite elettroforesi, qualora le diverse molecole enzimatiche presentino diverse proprietà

cinetiche. Il polimorfismo isoenzimatico può essere dovuto principalmente a due fattori:

l'espressione di

geni diversi in diversi loci del genoma (famiglie multigeniche) o l'espressione di alleli diversi

all'interno dello stesso locus. Quest'ultimo tipo di polimorfismo risulta il più utile ai fini delle analisi

genetiche, perciò il termine 'isoenzimi', inteso in senso stretto, indica appunto la presenza di

polimorfismo enzimatico intralocus; per tale accezione il termine 'alloenzimi' sarebbe senz'altro più

rigoroso.

Ad esempio l'enzima fosfogluco isomerasi (PGI) nella maggior parte delle specie studiate è codificato

in due loci distinti nel genoma (PGI-1e PGI-2, quindi due isoenzimi).

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I primi marcatori molecolari: i marcatori biochimici L'analisi quali-quantitativa dei composti proteici ha costituito un primo strumento ai fini degli studi genetici a livello molecolare. L’analisi di proteine strutturali è stato un primo approccio; benchè diverse classi proteiche possano essere valutate in diversi organi vegetali, l'elettroforesi delle proteine del seme è stato il metodo più usato. Nei cereali si è applicata l’analisi della frazione alcool-solubile delle proteine del seme (prolamine). L'elettroforesi su gel di poliacrilamide viene in genere preferita all'amido, in quanto solo la maggiore risoluzione consentita da questa tecnica permette la 'lettura' del complesso modello di bande prodotte sul gel. L’elettroferogramma di un gel di proteine è il risultato dell'espressione di diversi geni, per cui, dipendendo direttamente dalla costituzione genetica, può essere considerato come marcatore del genotipo che lo presenta. La complessità dei fenotipi proteici (20-50 bande presenti) ha costituito un limite per l'applicazione di quest'analisi come marcatore puro, in quanto non è possibile seguire con esattezza le frequenze o la segregazione dei molti geni codificanti per questi composti. D'altra parte, questa stessa complessità, fornisce un valido strumento ai fini della caratterizzazione e dell'identificazione varietale (fingerprinting): l'elettroferogramma delle proteine può essere infatti considerato come l'impronta digitale di una cultivar ed utilizzato per la discriminazione tra popolazioni geneticamente simili. Marcatori biochimici: Isoenzimi: insieme delle differenti forme molecolari di proteine enzimatiche codificate da geni ubicati in loci diversi, ma che catalizzano la stessa reazione metabolica; si tratta di forme alternative di un enzima, dette isoforme. Alloenzimi: varianti di proteine enzimatiche che catalizzano la medesima reazione metabolica, ma che sono tuttavia codificate da forme alleliche di uno stesso gene, potendosi pertanto riferire ad un singolo locus. Isoenzimi e alloenzimi Un’altra classe di marcatori biochimici sviluppata e utilizzata per analisi genetiche è quella degli alloenzimi, varianti di proteine rilevate attraverso la migrazione differenziale su gel di amido sottoposto ad un campo elettrico. A partire dalla fine degli anni sessanta questa classe di marcatori è stata ampiamente utilizzata per numerosi lavori riguardanti soprattutto la genetica delle popolazioni. Tuttavia i metodi basati direttamente sulle variazioni a livello del DNA, disponibili a partire dalla metà degli anni ottanta, hanno ormai sostituito la tecnica degli alloenzimi. In ogni organismo, il numero delle forme enzimatiche con una determinata azione catalitica è generalmente basso; il polimorfismo presente in queste proteine può essere facilmente evidenziato tramite elettroforesi, qualora le diverse molecole enzimatiche presentino diverse proprietà cinetiche. Il polimorfismo isoenzimatico può essere dovuto principalmente a due fattori: l'espressione di geni diversi in diversi loci del genoma (famiglie multigeniche) o l'espressione di alleli diversi all'interno dello stesso locus. Quest'ultimo tipo di polimorfismo risulta il più utile ai fini delle analisi genetiche, perciò il termine 'isoenzimi', inteso in senso stretto, indica appunto la presenza di polimorfismo enzimatico intralocus; per tale accezione il termine 'alloenzimi' sarebbe senz'altro più rigoroso. Ad esempio l'enzima fosfogluco isomerasi (PGI) nella maggior parte delle specie studiate è codificato in due loci distinti nel genoma (PGI-1e PGI-2, quindi due isoenzimi).

Al locus PGI-2, in molte specie, sono presenti diverse forme alleliche (alloenzimi), che segregano in maniera mendeliana e che possono essere utilizzate come caratteri marcatori. Metodologia per l’analisi di polimorfismi enzimatici nelle piante:

estrazione enzimatica, in genere condotta a partire da foglie giovani oppure da germogli in attiva crescita, mediante omogeneizzazione dei campioni con un tampone appropriato;
separazione elettroforetica, impiegando solitamente gel di amido (SGE) o di poliacrilammide (PAGE);
divisione orizzontale del gel e rilevazione istochimica mediante un colorante specifico per ciascun sistema enzimatico. Qualsiasi tessuto in accrescimento può essere sottoposto ad analisi isoenzimatica: i campioni vengono omogeneizzati meccanicamente insieme ad alcune gocce di una soluzione tampone, per ottenere la rottura delle pareti ed il rilascio del succo cellulare. Gli estratti vengono poi assorbiti su linguette di carta da filtro di piccole dimensioni (1x0,4 cm) e collocati sul gel (generalmente d'amido) precedentemente preparato. Il gel viene quindi sottoposto ad un campo elettrico. Di regola gli estratti sono caricati al polo negativo (catodo), in quanto essendo gli enzimi molecole con carica negativa essi migrano verso il polo positivo (anodo). Il rilevamento della posizione relativa delle molecole sul gel viene effettuato attraverso procedure di colorazione istochimica, specifiche per ogni enzima o complesso enzimatico. Dopo la colorazione, sul gel appaiono poche bande colorate; tale fenotipo isoenzimatico (zimogramma) può essere generalmente interpretato in termini di genotipo, ossia in termini di geni e di loro alleli. Per la colorazione di un gel al fine di evidenziare una forma isoenzimatica, come detto, si sfrutta una reazione biochimica basata sull’attività dell’enzima stesso e sulla precipitazione di un composto colorato che possa essere visualizzato sul gel. Nel caso della colorazione per la PGI, il protocollo di colorazione prevede l’incubazione con una soluzione che contiene un tampone (Tris-HCl pH 8), acqua, il substrato della PGI (fruttosio 6 fosfato), un substrato per una reazione secondaria (NADP), l’enzima che la catalizza (glucosio 6 fosfato deidrogenasi), il substrato di un sale ossidato (nitro blue tetrazolo, NBT) che riducendosi precipita dando finalmente un composto colorato.

Analogamente, se l’enzima è tetramerico, cioè formato da quattro catene polipeptidiche codificate dallo stesso locus, in presenza di due allleli polimorfici si possono formare i fenotipi isoenzimatoci mostrati a destra nella slide successiva. I due omozigoti producono un unico tipo di tetramero formato da 4 polipeptidi uguali (omotetrameri). Un eterozigote invece produce 5 tipi di tetrameri: 2 omotetrameri e 3 eterotetrameri, corrispondenti alla combinazione casuale dei due polipeptidi prodotti. La mobilità elettroforetica degli eterotetrameri è intermedia rispetto a quella dei due omotetrameri. Si vedano nella slide seguente esempi di segregazione in sistemi enzimatici tetramerici.

Tale sistema di analisi molecolare presenta un certo numero di vantaggi rispetto alle procedure utilizzate negli studi genetici tradizionali:

Per numerose specie si sono messe a punto le procedure per il rilevamento di numerosi sistemi enzimatici (50-100) e diversi loci sono risultati altamente polimorfici nelle popolazioni saggiate;
gli isoenzimi forniscono un metodo di analisi rapido ed economico (relativo ai tempi in cui venivano usati!): fino a 30 genotipi possono essere osservati in ogni gel ed in pochi giorni di lavoro si possono analizzare parecchi gel;
gli alloenzimi presentano in genere penetranza completa ed eredità mendeliana, sono espressi in maniera codominante (come visto) e sono privi di effetti pleiotropici ed epistatici;
non sono solitamente alterati dalle condizioni ambientali;
molti isoenzimi sono espressi ad uno stadio fenologico assai precoce, nei semi o nei germinelli, cosicché l'analisi può essere effettuata in maniera anticipata e rapida. Per tutte queste ragioni, quindi, l'elettroforesi isoenzimatica è diventata in passato ed ancora è in alcuni casi una tecnica di analisi molto utile nel campo della sistematica, degli studi evolutivi, della genetica delle popolazioni e del miglioramento genetico delle piante. In quest'ultimo settore gli isoenzimi sono stati utilizzati come marcatori molecolari per studiare la posizione, il numero e la natura dei geni codificanti per caratteri quantitativi, per l'analisi dei sistemi di unione, per la caratterizzazione e l'identificazione varietale o per stimare il grado di omozigosi raggiunto nel processo di produzione di linee inbred. I loci isoenzimatici sono stati i primi marcatori molecolari in senso lato ad essere integrati nelle mappe genetiche sino ad allora costruite solo con marcatori morfologici. Tali loci sono rimasti poi integrati nelle prime mappe molecolari (a sinistra), dove però i marcatori mappati sono cominciati a diventare sempre più densi. Uno dei problemi relativi ai marcatori isoenzimatici è che il fenotipo che vediamo, pur avendo una base genetica come insito nella definizione stessa di marcatore, è in realtà la forma enzimatica, cioè il prodotto della traduzione dell’informazione genetica. Come tale la loro rilevabilità dipende da come i geni relativi vengono espressi in diversi organi e stadi di sviluppo della pianta. La slide rappresenta due sistemi isoenzimatici complessi, cioè per i quali si evidenziano prodotti genici dovuti a più loci.

In breve ad una semplicità del metodo si contrappone il fatto che gli isoenzimi rilevabili sono pochi come numero e quelli «leggibili» in termini di alleli allo stesso locus (alloenzimi) ancora meno. Essendo il prodotto dell’espressione genica, possiamo dire che gli isoenzimi hanno una scarsa stabilità, cioè la loro espressione può variare con l’età e l’organo analizzato, ma anche con le condizioni ambientali in cui sono state allevate le piante prima dell’estrazione. Per un esempio di analisi genetica utilizzando gli isoenzimi, si consideri la necessità di verificare se una popolazione di Lolium perenne (una specie erbacea da foraggio e da tappeto erboso) risulta in equilibrio Hardy-Weinberg. Si ricorda che secondo la legge di Hardy-Weinberg una popolazione è in equilibrio se le frequenze geniche sono costanti (popolazione numerosa, assenza di mutazione preferenziale, migrazione, selezione e unione casuali); in tal caso le frequenze genotipiche sono in relazione con le frequenze geniche (alleliche) secondo lo sviluppo del quadrato di un binomio [siano p e q le frequenze alleliche, le frequenze genotipiche in caso di equilibrio saranno p2, q2, 2pq]. Cioè se in una popolazione l’allele a ha frequenza 0,40 e l’allele A ha frequenza 0,60 se la popolazione è in equilibrio le frequenze genotipiche hanno frequenza teorica pari a 0,16 per aa, 0, per AA e 0,48 per Aa. Nell’esempio sono stati rilevati appunto 2 alleli. L’esercizio si risolve confrontando con il test statistico del chi-quadrato (χ2) le frequenze osservate con quelle attese in caso di equilibrio. Si possono quindi calcolare le frequenze alleliche e quelle genotipiche osservate per l’esempio in questione. Le frequenze alleliche relative sono 0,7 e 0,3 per «A» e «a» rispettivamente. Utilizzando le frequenze alleliche si possono calcolare le frequenze genotipiche attese nell’ipotesi di equilibrio.

Ad es. il genotipo AA è atteso con una frequenza relativa pari a [(0,7)2]=0,49 e con frequenza assoluta nella popolazione di 40 individui pari a 0,49 * 40 = 19, Analogamente, seguendo le formule, si calcolano le frequenze assolute attese per i genotipi aa (3,6) e Aa (16,8) Il test statistico idoneo a saggiare la conformità di una distribuzione osservata rispetto a una distribuzione attesa è il test del chi-quadrato. L’indice statistico nel nostro caso è dato dalla sommatoria dei valori [(oss-att)2/att] per tutti e sei i confronti. Il primo valore è [(20-19,6)2/19,6] = 0,008. Svolgendo tutti i calcoli e la sommatoria, il valore del chi-quadrato risulta pari a 0,09, un valore inferiore ai valori soglia di significatività per il livello del 0,05 per (3-1)=2 gradi di libertà. Quindi l’ipotesi nulla non può essere rigettata, la distribuzione osservata non è diversa da quella attesa e la popolazione deve considerarsi in equilibrio H-W. Esempio di applicazione degli isoenzimi: isoenzimi negli incroci tra piante. Un esempio è un collegamento straordinariamente stretto tra un locus della fosfatasi acida (Aps-I) e il gene per la resistenza alle neoplasie radicali matodes (Mi) nel pomodoro. Il gene Mi è stato scoperto in un parente di pomodori selvatici, Lyco-persicon peruvianum, ed era associato a una variante acida definita banda di fosfatasi. Ibridi tra L. Perùvianum e pomodoro coltivato, L. esculentum, hanno entrambe le bande dei genitori e un intermedio,cioè la banda “ibrida” in posizione centrale. Tutti e tre i possibili genotipi possono essere rilevati da semplici preparazioni di fusti, radici, o foglie di piante di qualsiasi stadio. Ad oggi, non è stata trovata quasi nessuna eccezione per l'associazione tra la banda della fosfatasi acida lenta e Mi. Così possiamo identificare le piante resistenti in una fase molto precedente, e distinguere piante resistenti da piante suscettibili più affidabilmente perché il test contro il parassita è spesso afflitto da problemi tecnici e per distinguere tra omozigoti ( M i / M i ) e piante eterozigoti (Mi/ +).

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