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MICROBIOLOGIA (ZARA)
Lezione 9/ La MICROBIOLOGIA è lo studio microscopico dei vari microrganismi(virus e batteri). MALATTIE TRASMISSIBILI : malattie sostenute da un agente biologico(agente eziologico),che si trasmette da un individuo(ospite) ad un altro in natura in modo diretto o indiretto. In particolare:
- DIRETTO : si trasmette direttamente senza nessun mezzo (es:contatto sessuale);
- INDIRETTO : si trasmette attraverso gli agenti infettivi (es:mani,animali e cibo); Le modalità di trasmissione possono essere:
- MODALITÀ DI TRASMISSIONE ORIZZONTALE :trasmissione tra popolazione(passa da una persona all’altra). COMUNITÀ : insieme di persone che sta al di fuori dell’ambiente sanitario(70%ospedali, strutture di riabilitazione, case di cura).
- MODALITÀ DI TRASMISSIONE VERTICALE :trasmissione dai genitori(in particolare la mamma) al figlio in diversi periodi(per lo più durante il parto). Possono essere interessate le cellule gametiche ma soprattutto può essere interessata l’infezione che può causare dei difetti nel prodotto di concepimento che può portare all’aborto. Possiamo avere degli agenti come HIV o il cytomegalovirus che interessano tutte e 3 fasi,ed altri agenti che interessano soprattutto il momento del parto (naturale). L’infezione può essere:
- prenatale : in utero;
- perinatale : durante il parto;
- postnatale soprattutto nel momento della cura e “coccole” mamma-figlio; La maggior parte delle infezioni sono su base contagiosa quindi l’agente ha la capacità di passare da un individuo all’altro. CONTAMINAZIONE : la transitoria ed autolimitata presenza del microrganismo sulla cute o sulle mucose. Il microorganismo si moltiplica/replica,ma non crea danno. Da una contaminazione si può passare ad un’infezione. INFEZIONE : interazione e replicazione/moltiplicazione di un agente biologico (microorganismo) in un ospite recettivo(uomo, animale). Gli agenti infettivi sono strutturati in una maniera tale da adattarsi all’organismo umano e poter aderire ad esso, quindi, sono in grado di passare le barriere fisiche/funzionali ed anatomo patologiche e in alcuni casi poter instaurare una MALATTIA INFETTIVA ovvero l’espressione clinica dell’infezione. La malattia(qualcosa di +grave) è l’infezione (presenza + replicazione) + danno su base organica (distruzione di cellule o mal funzionamento di esse con il conseguente mal funzionamento dell’organo). Quindi la malattia è un’espressione clinica ovvero evidenzia un danno d’organo nel quale troviamo cellule danneggiate fisicamente o funzionalmente. In qualsiasi organismo umano “alberga”,in certi distretti anatomici (nicchie ecologiche) ma soprattutto a livello cutaneo, un numero importante di microbi questo significa che siamo noi i primi dispensatori di batteri. Ogni agente infettivo ha un PERIODO DI INCUBAZIONE ovvero il periodo di tempo tra la penetrazione dell’agente patogeno (tempo zero) e l’inizio della sintomatologia clinica e varia a seconda dell’agente infettivo. I microorganismi che si trasmettono per via oro-fecale hanno una struttura tale da resistere nell’ambiente esterno. Una patologia/quadro clinico può essere lo stesso ma può essere causato da specie differenti.
ZOONOSI/INFEZIONE ZOONOTICA :Quando
l’agente infettivo passa da un animale
all’uomo (es: toxoplasmosi).
Quando si entra in contatto con dei microrganismi non è sempre scontato che si instauri una patologia e questo dipende da determinate condizioni, in particolare lo stato del sistema immunitario e se entriamo in contatto con un:
- PATOGENO STRETTO PRIMARIO : interessa un organismo umano in salute(immunocompetente) ovvero con un numero consono di cellule immunitarie;
- PATOGENO OPPORTUNISTA : si sviluppa e può far insorgere una patologia quando le difese immunitarie si abbassano;
- MICROORGANISMO CHE CAMBIA SEDE: per esempio l’Escherichia coli in quanto finché resta all’interno dell’intestino non crea danno ma se cambia sede può diventare la prima causa di batteriemia, infezione generalizzata nel sangue con conseguente sepsi. Queste categorie a rischio sono il bersaglio di patogeni non virulenti spesso appartenenti al microbiota e quindi sono più facilmente “attaccabili” dai patogeni opportunisti. Inoltre in questi soggetti possono esserci anche associazioni di più agenti: - 2 virus - 2 batteri - virus+ batterio Come già detto in precedenza la penetrazione di un microrganismo/agente infettivo non porta sempre ad un’infezione o una malattia perché il corpo umano è un ottima macchina biologica ma ci sono dei fattori di rischio che indeboliscono l’organismo e favoriscono l’instaurarsi di un’infezione. Quindi l’esposizione ai fattori di rischio può far insorgere una malattia che può evolversi in:
- Guarigione
- Fase acuta: rapida risoluzione
- Cronicizzazione: lunga durata (mesi o anni) e si suddividono in infezione cronica(es:HBV,HCV), infezione latente (es:HSV) ed infezioni lente(es:CJD)
- Decesso CONTAGIOSITÀ : capacità di un microrganismo patogeno di passare da un soggetto recettivo ad un altro; PATOGENICITA’ : capacità dei microrganismi parassiti di causare un danno all’ospite che si esprime con lo stato di malattia. Dipende dall’invasività del microrganismo ovvero la capacità di diffondersi attraverso fluidi e dalla tossicità ovvero la capacità dei batteri e di pochi funghi di produrre sostanze tossiche che distruggono le cellule. La specificità ha dei livelli di gravità sia tra diverse specie sia nelle stesse specie(in quanto non è formata da ceppi batterici uguali). In sintesi ogni specie ha un patrimonio genetico comune ma se il microrganismo si incrocia con un nuovo corredo genetico, può modificarsi acquisendo nuove capacità.(es: genere: Escherichia specie: coli) VIRULENZA : indica il diverso grado con cui di esprime la patogenicità delle diverse specie microbiche. Può essere valutata in base alla gravità delle malattie. Struttura dei microrganismi Il batterio nasce da un unico cromosoma ma può ricevere delle informazioni genetiche aggiuntive dal plasmide ovvero piccole molecole di DNA all’interno del citoplasma extra cromosomico a replicazione autonoma. Quindi questi plasmidi aggiungono dei vantaggi al batterio, ad esempio :
- la resistenza agli antibiotici ;
- assume la capacità di produrre proteine tossiche ;
- assume la capacità di produrre un enzima che gli permette di sintetizzare lo zucchero ; Virus,batteri e funghi presentano una loro superfice contraddistinta dalla presenza di molecole caratteristiche che donano un assetto/ forma antigenica. I microrganismi presentano, oltre alla struttura primaria, delle strutture accessorie che sono importanti per poter ulteriori problematiche al soggetto ( non si capisce nulla dalla registrazione) e sono:
- Capsule: è presente in tutti gli agenti che danno meningite;
- Fibre
- Flagelli Le categorie a rischio sono:
- neonati
- anziani
- adulti dopo 60 anni
- pazienti oncologici
- pazienti trapiantati
- pazienti con immunodeficienza primaria
Lezione 14/ Micobatteri I micobatteri appartengono alla famiglia delle Mycobacteriaceae e sono inclusi nell’ordine degli Actinomycetales.Del genere Mycobacterium fanno parte importanti patogeni per l’uomo e gli animali e numerosi batteri ambientali, alcuni dei quali in particolari circostanze possono causare patologie nell’ospite immunocompromesso. Mycobacterium tuberculosis .(Rappresenta la specie più importante di tutti i micobatteri). E’ l’agente eziologico della tubercolosi (TB), un’antica malattia polmonare cronica che ha accompagnato la storia dell’uomo negli ultimi millenni. La tubercolosi è un tipo di polmonite non molto diffusa perché l’agente principale della polmonite in comunità è lo streptococcus pneumonie. La scoperta di questo batterio è dovuta a Robert Koch proprio per questo viene chiamato anche bacillo di Koch; inoltre viene chiamato bacillo perché non ha una forma rotonda ma bensì allungata/ bastoncellare. EPIDEMIOLOGIA : Si stima che la TB uccida ogni giorno circa 4000 persone. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) indica in circa 1,8 milioni il numero di decessi all’anno, in 10 milioni il numero di nuovi casi e in circa 30 milioni il numero di pazienti con TB attiva. Il 95% dei casi si registra nei Paesi in via di sviluppo, in particolare Cina,India,Indonesia,Nigeria,Pakistan ed Africa, dove l’incidenza della malattia è nell’ordine dei 100- 500/100 000 abitanti a causa di serbatoi storici come il fiume Gange. Nel 2016 e 2019 ci sono stati circa 104 milioni? di persone ammalate a causa del singolo agente;poi c’è un sottogruppo di persone affette da infezione-malattia da HIV chiamata anche “accoppiata maledetta” perché spesso porta a morte. Dal 2015 al 2021 c’è stata una riduzione netta dell’incidenza della tubercolosis al contrario però non si è ridotto il tasso di mortalità. Tutti gli agenti infettivi sono classificati in 4 classi in base al RISCHIO BIOLOGICO :
- PRIMA CLASSE: troviamo micobatteri inoffensivi che si trovano nell’ambiente; si trovano in questa classe in quanto non sono un pericolo né per la persona né per la comunità. **2)SECONDA CLASSE
- TERZA CLASSE:** Gli agenti della terza classe cominciano a rappresentare un moderato pericolo della persona e un problema per la collettività.
- QUARTA CLASSE : all’interno di essa si trova il micobatterio tubercolosis insieme all’esterichia coli non commensale intraemorragico e alla tisi. La quarta classe, quindi, presenta virus che danno febbre emorragiche. I micobatteri possono andare incontro a MICORESISTENZA ;per fortuna spesso non albergano plasmidi,a differenza degli altri batteri, ma possono andare incontro a delle mutazioni a livello dell’unico cromosoma che hanno, quindi a livello del DNA, e questo può rendere non efficacie l’utilizzo di alcuni farmaci antitubercolari.
PATOLOGIA :
È una patologia infettiva contagiosa che interessa i polmoni. La via di trasmissione principale è la VIA INALATORIA quindi la persona malata tossendo e parlando può trasmettere il batterio attraverso le goccioline (Droplets). Le persone con infezione tubercolare, ma senza malattia attiva non sono contagiose. La tubercolosi umana fa parte delle cosiddette MALATTIE “GRANULOMATOSE”, in quanto la lesione elementare provocata dai bacilli di Koch (Mt) è il granuloma tubercolare , consistente in un piccolo nodulo infiammatorio cronico tendente alla confluenza con altri analoghi, costituito da un“agglomerato” microscopico di cellule immunitarie (macrofagi, linfociti T, linfociti B) ed anche fibroblasti. Il granuloma tubercolare non solo impedisce la diffusione dei micobatteri, ma fornisce un ambiente locale per la comunicazione delle cellule del sistema immunitario. PROBABILITÀ DI TRASMISSIONE TB
CATEGORIE A RISCHIO CARATTERISTICHE DEL PAZIENTE
CHE AMPLIFICANO LA TRASMISSONE
- Infettività della persona con la TB
- Ambiente di esposizione
- Durata dell’esposizione
- Virulenza del microrganismo
- Competenza immunologica dell’ospite
- Bambini ed anziani
- Persone con contatti con sogg. con TB
- Persone povere, homeless people
- Malnutrizione
- Carcerati
- Alcolisti e IVDUs (intravenous drug use)
- Patologie croniche e debilitanti
- AIDS
- Terapia con corticosteroidei o immunosoppressori o farmaci che agiscono bloccando il fattore di necrosi tumorale (TNF) Pazienti con malattia polmonare attiva (o della laringe):
- Presenza di tosse
- Presenza di BAAR nell’espettorato
- Mancato utilizzo da parte del paziente di mascherine che coprano bocca e naso, soprattutto nell’atto di tossire o starnutire...
- Cavitazioni polmonari radiologicamente dimostrate
- Durata troppo breve della terapia
- Terapia inappropriata. Il batterio penetra per aerosol, discende nella faringe, laringe e trachea e arriva a livello polmonare dove inizia a duplicarsi, come tutti i batteri, in maniera binaria. Per fortuna a livello polmonare, in particolare negli alveoli, vi sono delle cellule immunitarie importanti come i macrofagi alveolari , cellule estremamente potenti. Qui il bacillo può essere rapidamente ucciso oppure può
Fin da piccolo l’organismo entra in contatto con il micobatterio in quanto è un patogeno strettamente umano, cioè, è batterio intrinseco alla natura umana , quindi, esistono ancora oggi delle persone che lo albergano senza sviluppare la malattia attiva. È un batterio virulento che a differenza degli altri batteri ,che vedremo successivamente, non produce tossine e veleni ma produce il danno interagendo con il sistema immunitario esasperandolo. Esistono 2 FORME distinte quando parliamo di batterio tubercolosis: 1)il GIALLO : A livello mondiale più di un terzo della popolazione alberga il micobatterio tubercolosis nella forma dormiente, quindi lo ha acquisito per via respiratoria ed il sistema immunitario, in particolare i linfociti, hanno resistito e possono averlo annientato oppure possono averlo circondato, rendendolo inoffensivo in uno stato dormiente/quiescente quindi è metabolicamente inattivo però la persona è portatrice. 2)Il ROSSO : il batterio si riattiva e quindi si trasforma in malattia attiva. Quindi dipende tutto dal ruolo del sistema immunitario. Oltre a queste 2 forme troviamo:
- TUBERCOLOSI PRIMARIA : Si verifica nel 5% delle infezioni primarie di MT. Si sviluppa per :
- elevata carica infettante
- depressione immunitaria Sede : polmone (rari: intestino, laringe, cute) Complesso primario : Lesione aspecifica polmonare: alveolite essudativa che può riassorbirsi con restitutio ad integrum oppure evolvere verso la necrosi caseosa. Evoluzione del focolaio primario: ▪ RELIQUATO : trasformazione fibrosa con deposizione di Sali di calcio (maggior parte dei casi) ▪ CAVERNA PRIMARIA: colliquazione del caseum con ulcerazione edevacuazione nei bronchi o nei vasi sanguigni
- TUBERCOLOSI POST-PRIMARIA: La riattivazione può essere: ▪ endogena : per depressione del sistema immunitario (HIV, diabete, infezioni virali, tumori, alcolismo, anoressia,terapie immunosoppressive etc.) = 40-70% dei casi. ▪ esogena : nuovo contatto con soggetti malati e nuova inalazione di bacilli Mt= 30-60% dei casi DIAGNOSI : SINTOMI POLMONARI DELLA TBC SINTOMI SISTEMICI DELLA TBC •tosse produttiva prolungata (>3 settimane) •dolore toracico •emoftoe •Febbre •brividi •sudorazione notturna •assenza di appetito •perdita di peso •affaticabilità La diagnosi della TBC si effettua attraverso:
- Anamnesi ed esame obiettivo : storia di esposizione a fonti morbigene, pregressi trattamenti per TB, rischi di ordine demografico, appartenenza a gruppi a rischio, valutare i sintomi a carico di organi e apparati al di fuori del polmone. L’esame obiettivo è spesso aspecifico.
- Skin test/ Test immunologici gIFN
- Esame batterioscopico
- Coltura
- Rilevamento e Identificazione (direttamente dal campione clinico)
- Test in vitro di chemio sensibilità ai farmaci antitubercolari Gli elementi a supporto di una sospetta forma di tubercolosi sono:
- Gruppi a rischio: contatti stretti; persone provenienti da Paesi ad alta prevalenza; personale a contatto con persone appartenenti a gruppi a rischi; indigenti e senzatetto; bambini e adolescenti conviventi con persone a rischio; persone tossicodipendenti.
- Gruppi a maggior rischio: HIV+, persone infettate recentemente (< 2 anni); pazienti con patologie favorenti (diabete, insufficienza renale, steroidi, ecc.); presenza di vaste lesioni non trattate o trattate in modo inadeguato. La raccolta del materiale deve essere effettuata:
- prima dell’inizio della terapia antibiotica; è tuttavia possibile inviare campioni successivi per il follow-up del paziente in terapia;
- in modo sterile, per evitare contaminazioni;
- in quantità adeguata, per evitare falsi negativi;
- in un numero adeguato di campioni, per evitare falsi negativi;
- evitando, ove possibile, l’uso di tamponi;
- utilizzando contenitori monouso sterili, con tappo a vite;
- senza l’aggiunta di conservanti o fissativi;
- facendo attenzione a non contaminare la superficie esterna del contenitore con il materiale biologico. Il contenitore deve essere contrassegnato con un’etichetta indicante i dati anagrafici del paziente, il tipo di materiale, la sede di prelievo, la data e l’ora di raccolta; ad esso deve essere allegato, separatamente, il modulo di richiesta compilato in ogni sua parte. Campioni clinici: È ovvio che il MT. ha come modalità la via respiratoria, pertanto, il fattore d’elezione non è la saliva ma bensì qualcosa che proviene dalle **secrezioni respiratorie.
- ESPETTORATO:** deve essere raccolto di primo mattino facendo fare prima dei gargarismi , per abbassare il numero di batteri residenti nel cavo orale,poi dei colpi di tosse in modo da mandare fuori l’espettorato. Il campione non deve essere costituito da saliva o contaminato da secrezioni naso- faringee e la quantità non deve essere inferiore a 5 mL. Al fine di ottenere un campione adeguato per qualità e quantità è preferibile che il paziente sia assistito da personale qualificato durante la raccolta. Quando si ha un sospetto di Tb è bene prelevare 3 campioni al mattino per 3 giorni consecutivi per aumentare la possibilità di rilevare l’agente patogeno. I campioni vengono portati a verificare l’idoneità , indicata con il CUS CORE, indice dato dal metodo di colorazione di gram che permette di valutare il numero di neutrofili e il numero di cellule epiteliali squamose. Vengono valutati questi 2 parametri perché il batterio attira i leucociti, in particolare i neurofili; quindi, il singolo capo microscopico deve presentare + di 25 leucociti e non deve presentare cellule epiteliali squamose(Se sono presenti significa che non è effettuato bene l’espettorato). Per i pazienti che non espettorano, o con microscopia negativa in presenza di sospetto elevato, è consigliata l’induzione dell’espettorato mediante aerosol con soluzione salina. Nei bambini piccoli che non riescono ad espettorare viene inserito un sondino nasogastrico per prelevare l’aspirato gastrico. Di solito i campioni sterili non vengono decontaminati ma l’espettorato che non è sterile ,perché provenendo dal basso e risalendo si contamina, va decontaminato perché, se lui impiega tanto tempo a crescere(in coltura), gli altri batteri li porteranno via i nutrienti e lui non aumenterà mai. Quindi il campione viene decontaminato attraverso i kit commerciali che contengono le soluzioni decontaminanti (NaOH alla concentrazione finale del 2%) ovvero soluzioni molto forti che distruggono la parete complessa del micobatterio.
Solitamente la piuria si associa a infezione batterica delle vie urinarie accompagnata da batteriuria. Modalità di conservazione e trasporto I campioni dovrebbero essere processati entro poche ore dal momento del loro arrivo in laboratorio; La conservazione è tuttavia possibile a +4°C per un massimo di 2 giorni, periodo per il quale è preservata la vitalità dei micobatteri. Fanno eccezione le emocolture che vanno conservate a temperatura ambiente. Il congelamento dei campioni è da evitare poiché può diminuire la carica dei micobatteri vitali. Il trasporto al laboratorio deve essere il più rapido possibile. Campioni non idonei o pervenuti in quantità insufficiente non dovrebbero essere accettati, segnalando al clinico i motivi del rifiuto. Esame microscopico, colturale e amplificazione genica sono raccomandati anche per i campioni provenienti da sedi di sospetta TBC extra-polmonare. In tali campioni i falsi-positivi sono improbabili, mentre i falsi-negativi sono molto frequenti a causa della bassa carica presente. Esame colturale : Necessario trattamento decontaminante (lentezza di crescita BK, presenza di flora microbica), ha lo scopo di far crescere,isolare (qualcosa che era in vivo al di fuori dell’organismo umano) e permette la caratterizzazione in grandi quantità. Viene fatta perché permette di avere tanto batteriio,sottoforma di colonie, che verranno sottoposte all’antibiogramma. La Semina viene effettuata su terreni solidi specifici:
- terreno classico all’uovo: Lowenstein-Jensen
- t. agarizzato: Middlebrook 7H10 o 7H Inoculo in sistemi automatizzati ( notevole accorciamento dei tempi di crescita e maggior sensibilità) in brodocoltura:
- metodo fluorimetrico, sviluppo di batteri Con i test colturali vengono identificati:
- velocità di crescita
- aspetto delle colonie:
- rugose lisce
- fotocromogene
- scotocromogene
- non pigmentate
- crescita a varie temperature L’antibiogramma colturale (fenotipico) è raccomandato per tutti i pazienti coltura-positivi. La genotipizzazione del ceppo è raccomandata per tutti i pazienti coltura-positivi. L’antibiogramma migliore, non solo per i micobatteri a lenta crescita ma anche per altri, è quello fenotipico(quello che cresce in piastra). Si può effettuare anche un antibiogramma molecolare quindi direttamente dal campione clinico, dopo l’esame microscopico, e cercare le specie + importanti. Ci sono dei test che permettono direttamente di ricercare le sequenze conservate nucleotidiche e anche i determinanti antigenici più importanti. Inoltre viene effettuata In caso di resistenza a rifampicina o di resistenza contemporanea a isoniazide e rifampicina è richiesta la valutazione della sensibilità anche ai farmaci di seconda linea (almeno amikacina, kanamicina, levofloxacina/moxifloxacina...). TERRENI SOLIDI: permettono la crescita per scissione binaria delle colonie , in questo caso non si avranno colonie piccole ma si avranno le colonne smangiate ed irregolare.
- a base di uovo LJ
- a base di agar Middlebrok 7H10, 7H
- Selettivi
TERRENI LIQUIDI: I batteri crescono più rapidamente, lo rendono torbido ma non possiamo farci un idea delle loro colonie.
- MGIT : Campione biologico-> DIGESTIONE, DECONTAMINAZIONE E CONCENTRAZIONE->Miscela antibiotica PANTA + Supplemento di crescita OADC->incubazione TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE:
- provetta di terreno liquido per micobatteri
- miscela di antibiotici per il contenimento delle contaminazioni
- fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno.
- comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico
- rilevamento della fluorescenza:
- visivo, sotto una lampada UV
- automatizzato TERRENO REDOX:
- micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme
- i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazano dai micobatteri in crescita
- il formazano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche, permettendone il riconoscimento.
TERRENI SELETTIVI COMPONENTI
Lowenstein-Jensen Uova coagulate(servono a solidificare il terreno), Sali, glicerolo, fecola di patate Sostanza inibitrice dei batteri gram+: Verde malachite Middlebrook 7H10 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina catalasi, glicerolo Solidificato con agar quindi è trasparente e per questo può essere visualizzato attraverso il microscopio sterotassico. Middlebrook 7H11 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina,catalasi, glicerolo, idrolizzato di caseina Solidificato con agar quindi è trasparente e per questo può essere visualizzato attraverso il microscopio sterotassico
immergendo il nastrito in una soluzione denaturante,il filamento può riconoscere la sequenza complementare se riconosce la specie.(non visibile ad occhio nudo). La biotina si lega all’applicone che a sua volta si è legato per complementarietà di basi al corpo adeso come banda sulla strip, lo posso fare perché la biotina ha una forte affinità con la strepadivina. Quindi si sfrutta il sistema di riconoscimento per verificare il legame. Bisogna introdurre incubazione e lavaggio per eliminare l’ingombro, tutto quello che non si è legato, si introduce un idonea quantità di molecola di avidina la quale a sua volta è legata ad un enzima, fosfatasi?. Il tutto è ancora invisibile, per renderlo visibile bisogna colorare la banda in maniera che, se è legato l’applicano si può vedere. Strand Displacement Amplification (SDA) Amplificazione isotermica (52.5°C). Al taglio (per enzima di restrizione) del DNA segue la sintesi del filamento da parte della DNA-polimerasi, rimuovendo lungo il percorso il filamento che viene trascritto. Il filamento restante serve successivamente da stampo per nuove amplificazioni. Le fasi di taglio e di polimerizzazione/rimozione si ripetono ciclicamente producendo copie complementari a singolo filamento del DNA target L’ibridizzazione del probe specifico con il prodotto di amplificazione ne modifica la conformazione sterica consentendo l’emissione di un segnale fluorescente. FILM ARRAY PLATFORM: Si tratta di una multiplex PCR abbinata ad una lettura automatizzata i cui risultati sono fruibili in 1 ora. Si tratta di dispositivi pronti all’uso (film array pouch) che contengono nel loro interno tutti i reagenti necessari per la estrazione degli acidi nucleici, la purificazione, l’amplificazione e l’ibridizzazione (in triplicato per ogni sonda) verso diversi target. Il sistema per la sua semplicità d’uso (all’operatore è richiesta la sola reidratazione dei reagenti e l’aggiunta del campione) si configura a tutti gli effetti come un “point of care test” il cui utilizzo potrebbe essere immaginato anche in regimi d’urgenza. I Vantaggi sono:
- semplicità di esecuzione;
- elevata specificità;
- notevole sensibilità (in teoria sono necessarie poche molecole di DNA batterico per avere una positività);
- capacità di poter ricercare anche geni correlati alla resistenza agli antibiotici
- identificazione in colture polimicrobiche.
I limiti sono:
- fasi di disegno del test, è necessario selezionare un numero finito di specie/geni di resistenza che saranno i target del test e quindi specie non incluse tra i target non verranno mai identificate.
- il costo di un analisi non è trascurabile e può essere fuori dalla portata di alcuni laboratori. Spettrometro di massa: Per mette l’identificazione rapida di microrganismi, basato sulla tecnologia MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight). La spettrometria di massa MALDI-TOF MS è una tecnica biochimica analitica che consente di misurare in maniera estremamente accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinare la loro identità in base al rapporto massa/carica (m/z) Profilo MALDI: Identificazione basata su proteine ribosomiali. Si basa sull’analisi delle proteine ribosomiali contenute nel campione. Nello spettro di massa, diagramma che riporta l’abbondanza degli ioni rilevati in funzione del rapporto massa/carica, ogni picco corrisponde ad una proteina ribosomiale e ciascuno spettro è tipico di un microrganismo. CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE (High Performance Liquid Chromatography, HPLC):
- Separazione, mediante opportuni solventi, dei vari acidi micolici presenti nell’estratto depositato su una piastra di gel di silice.
- Rilevamento degli stessi dopo idonea colorazione
- Identificazione delle “macchie” in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento del solvente (fase mobile)
- Identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolici Diagnosi di infezione tubercolare latente L’infezione latente tubercolare è uno stato caratterizzato dall ‘ assenza di sintomi clinici e segni radiologici di malattia attiva, e la cui diagnosi viene fatta da un test immunologico che accerti una risposta immunitaria nei confronti di M. tuberculosis.[(positività all’intradermoreazione di Mantoux o ad un test basato sul rilascio di IFN-γ (IGRA, IFN-γ releasing assays)]. Non è possibile infatti l’identificazione diretta di M. tuberculosis. La misura positiva della risposta immunitaria può essere dovuta a:
- una positività di risposta antigene-specifica di richiamo per una presunta infezione da M. tuberculosis senza la presenza di batteri vitali.
- ad una condizione in cui i tessuti umani contengono M. tuberculosis vitale che persiste in uno stato di dormienza metabolica dalla quale si può riattivare. La prova che il batterio possa riattivare è data dai numerosi studi in cui si documenta che l’assenza di profilassi nei contatti positivi all’intradermoreazione di Mantoux esposti a casi di tubercolosi polmonare bacillifera porta a progressione rapida verso la malattia attiva.
•controllo positivo contenente fitoemoagglutinina (PHA 5 μg/ml). I linfociti presenti nell’anello vengono recuperati, lavati, contati e quindi diluiti (o concentrati) fino ad ottenere la concentrazione di 2.500/μL. Cento μL di tale sospensione vengono posti in ciascuno dei quattro pozzetti della piastra. Dopo l’aggiunta dei linfociti la piastra viene incubata a 37°C per 16-20ore, per consentire la stimolazione delle cellule T attivate eventualmente presenti. L’IFN-γ prodotto viene catturato dagli anticorpi specifici adesi al pozzetto, mentre le cellule vengono successivamente rimosse mediante lavaggio. Una nuova incubazione con un anticorpo anti-IFN-γ diretto ad un epitopo differente dal precedente e coniugato a fosfatasi alcalina permette, dopo l’aggiunta del substrato, la visualizzazione di uno spot di precipitato insolubile nel sito di reazione. Ciascuno spot rappresenta l'impronta di una singola cellula reattiva e la conta degli spot ottenuti fornisce la misura della quantità di cellule T reattive presenti. Gli spot possono essere contati al microscopio, a piccolo ingrandimento o con il lettore automatico ELISPOT. Terapia: È una patologia curabile ma essendo un batterio particolare non basta un solo farmaco per contrastarlo ma bensì serve un insieme di farmaci ( TERAPIA MULTIFARMACO o TERAPIA COMBINATA). Non si utilizzano gli antibiotici generici ma degli antibiotici appositi ovvero ANTIBIOTICI ANTITUBERCOLARI perché questo micobatterio ha una parete differente rispetto ai gram e quindi in automatico cambia anche la terapia. Anche i micobatteri possono andare in contro ad antibiotico resistenza, in particolare può esserci:
- **RESISTENZA AD UN ANTITUBERCOLARE
- RESISTENZA PIU’ ANTITUBERCOLARI** La Farmaco-resistenza è dovuta alla comparsa di mutazioni nel cromosoma batterico, in geni coinvolti nel meccanismo d’azione del farmaco. La resistenza è il risultato della selezione dei mutanti resistenti, a seguito di mono-terapie o per difetto di compliance. Per nessun farmaco esiste una mutazione associata al 100% delle resistenze Non esiste una mutazione responsabile della multi-resistenza, la quale è invece il risultato della somma di mutazioni singole Ci sono 2 tipi di resistenza:
- PRIMARIA : è già presente nel ceppo responsabile dell’infezione;
- SECONDARIA : insorge durante la terapia In maniera specifica parleremo di micobatterio tubercolosis resistente se è resistente a 2 dei fondamentali farmici antitubercolari che devono essere somministrati, in particolare all’ isoniazide e alla rifampicina. La RINFAMPCINA è un antibiotico che si complessa con la subunità beta dell’ RNA polimerasi batterica e quindi blocca la trascrizione. L’ISONIAZIDE è un profarmaco che deve essere attivato e che inibisce gli enzimi che portano alla sintesi degli acidi micolici. Impedire la formazione è fondamentale in quanto il micobatterio acquisisce forza da questi acidi. Quando parliamo di micobatteri abbiamo delle sotto definizioni perché sono dei batteri particolari atipici per struttura e per comportamento:
- quando parliamo di TUBERCOLOSI MDR è per definizione resistente a questi 2 farmaci specifici.
- TUBERCOLOSIS MDR+ RESISTENZA AD ALTRE MOLECOLE che possono essere utilizzate contro i micobatteri.(ES: fluorochiloni, inibitori della sintesi degli acidi nuclei o Aminoglicosidi,inibitori della sintesi proteica.)
Nel tempo si possono avere resistenze passive che è possono essere:
- **PAM
- TOTALY VACCINO ANTITUBERCOLARE** :Il bacillo di Calmette e Guèrin (BCG) è ancora oggi l’unico vaccino disponibile contro la TB. Il BCG è un vaccino vivo attenuato, ottenuto da Calmette e Guèrin mediante passaggi seriali (231 passaggi nell’arco di 13 anni) in terreno di patata biliata a partire da un ceppo virulento di Μ. bovis. Durante il processo di attenuazione il ceppo BCG ha perso numerosi frammenti di genoma, che prendono il nome di regioni di differenza ( RD ). Come detto in precedenza la più importante delle regioni RD è la RD. Nei Paesi in cui la TB è endemica, il vaccino BCG si somministra subito dopo la nascita per via sottocutanea e dopo un mese si verifica l’avvenuta immunizzazione mediante il test della tubercolina. Nel corso del secolo scorso è stato possibile evidenziare pregi e difetti del vaccino. Il vaccino si è dimostrato sostanzialmente sicuro e il basso costo ha reso possibile l’attuazione di procedure di immunizzazione anche nei Paesi più poveri;inoltre dimostrato efficace nel prevenire le forme, spesso fatali, di TB disseminata (miliare) e di meningite tubercolare nei bambini. Studi condotti in Paesi ad alta endemia di TB hanno tuttavia dimostrato come l’efficacia di BCG nel prevenire le forme di TB attiva nell’adulto sia piuttosto scarsa. Altri Micobatteri a crescita lenta importanti dal punto di vista clinico sono: MYCOBACTERIUM LEPRAE è l’agente eziologico della lebbra o malattia di Hansen. M. leprae è un bacillo AAR che cresce nei macrofagi, cellule neurali, nella zona plantare di topi atimici e nell’armadillo. Non è mai stato coltivato in terreno di coltura e viene considerato un patogeno intracellulare obbligato. Si ritiene che il tempo di replicazione (stimato in circa 12-14 giorni) sia responsabile del lungo tempo di incubazione e della necessità di adottare lunghi trattamenti terapeutici. Le manifestazioni cliniche dipendono dalla risposta immunitaria dell’ospite ma in genere coinvolge la pelle e i tessuti nervosi periferici. Si è solito distinguere 2 tipi di lebbra:
- LEBBRA LEPROMATOSA: è caratterizzata da una scarsa risposta immunitaria dell’ospite che non è in grado di controllare la replicazione del bacillo. In questi casi l’analisi microscopica dei tessuti evidenzia la presenza di numerosissimi batteri AAR (forma multibacillare). È questa la forma altamente contagiosa di lebbra, fortemente invalidante e che richiede prolungati trattamenti terapeutici (> 2 anni).
- LEBBRA TUBERCOLOIDE: Nel caso in cui l’ospite sviluppi una buona risposta immunitari a, si assiste alla comparsa della lebbra tubercoloide, caratterizzata dalla presenza di pochi batteri AAR nei tessuti, e da un modesto danno tissutale. La forma di lebbra tubercoloide non è contagiosa e il trattamento si conclude normalmente entro 6 mesi di terapia. MYCOBACTERIUM ULCERANS è l’agente eziologico dell’ulcera di Buruli, che dopo la tubercolosi e la lebbra è la terza principale patologia causata da micobatteri in soggetti immunocompetenti. L’infezione è prevalentemente localizzata nell’Africa occidentale, dove in alcuni Paesi raggiunge una prevalenza di 150/100 000 abitanti, sebbene siano stati descritti casi anche in altri continenti. M. ulcerans è un batterio a lenta crescita che non cresce a temperature superiori ai 33 °C, ha un tempo di replicazione di circa 10-14 giorni e si moltiplica sia a livello intracellulare che extracellulare. Il genoma di L’infezione si trasmette per via cutanea in corrispondenza di aree che presentano traumi o microtraumi. Dopo l’ingresso nei tessuti dell’ospite, M. ulcerans inizia a replicarsi prevalentemente a livello extracellulare e a produrre una tossina, il micolattone. Il micolattone è un polichetone, una tossina rilasciata dal micobatterio in grado di esercitare un’azione citotossica,un’azione immunosoppressiva e induce apoptosi. L’infezione coinvolge prevalentemente il tessuto grasso sottostante il derma e si presenta clinicamente nelle forme più gravi con estese lesioni di tipo ulcerativo. Quindi, cosa sono i micobatteri? Sono dei bacilli, che appartengono all’ordine Actinomycetales,Famiglia Mycobacteriaceae, Genere Mycobacterium. Forma: batteri stretti e lunghi. Sono :
- Stretti e lunghi;
- Tutti aerobi obbligati ;
- Non sono dotati di mobilità ;
- Incapaci di produrre spore;
Abbiamo una molecola similare al lipopolisaccaride dei gram negativi, questa molecola è chiamata LAM (Lipoarabinomannano). Questa molecola parte da una membrana citoplasmatica attraversa la parete cellulare e fuoriesce. Ha una funzione tossica,lato che assomiglia alla funzione tossica del LPS ed è capace di provocare il malfunzionamento dei macrofagi. ( INIBISCE LA FUNZIONE FAGOLISOSOMIALE ). Il LAM stimola la formazione del GRANULOMA ; il granuloma è un meccanismo di difesa che il sistema immunitario mette in atto quando percepisce, a livello polmonare e in altri tessuti, la presenza di micobatteri. Fa sì che questi vengano accerchiati dalle cellule immunitarie che riversano contro tutto quello che producono. Il danno,quindi, è dovuto al richiamo delle cellule immunitarie che riversano citochine provocando la necrosi. I micobatteri possono infettare anche le cellule immunitarie quindi sono batteri intracellulari facoltativi ; Ricordiamo che il micobatterio, in particolare il M.tubercolosis, può infettare cellule macrofagiche della linea mononucleata,può quindi influenzarle moltiplicandosi al loro interno. Queste cellule intrappolano il batterio rinchiudendolo in una vescicola/ vacuolo intracitoplasmatico che viene poi portato in prossimità degli enzimi lisosomiali delle celle immunitarie. In realtà il micobatterio è in grado, con le sue molecole di superficie soprattutto le proteine codificate dalla regione RD, di impedire il completamento della fagocitosi delle cellule immunitarie. Dal vacuolo intracitoplasmatico il batterio si duplica, fuoriesce e si riversa nel torrente circolatorio; quindi, può comportarsi come un patogeno intracellulare facoltativo. FACOLTATIVO : può infettare qualcosa ma può anche moltiplicarsi all’interno o all’esterno della cellula. I micobatteri sono dotati di replicazione autonoma, in questi caso binaria perché sono dei batteri. IMPORTANTE PER ESAME !!!! La porzione mediana ed esterna della parete è estremamente ricca di lipidi, glicolipidi complesse e fenolici composti da materiale simile alle cere. Sono non polari e possono essere parzialmente rilasciati dalla cellula micobatterica svolgendo azioni tossiche interferendo con le nostre cellule. Questa ricchezza di lipidi rende la parete molto particolare per cui il metodo della colorazione di gram non funziona. Quindi scienziati hanno inventato la colorazione adeguata ovvero la Ziehl- Neelsen che utilizza un colorante rosso ovvero la fucsina basica, il decolorante (HCl) e poi il colorante di contrasto il blu di metilene. Inoltre, si utilizzano sostanze fluorescenti (metodo del fluorocromo) che al contrario della Ziehl- Neelsen che richiede esperienza, con il metodo dei fluorocromi si ha uno sfondo scuro con un lipide che brilla quindi è facile individuare il batterio. Le sostanze utilizzate nella fluorescenza sono la rodamina e l’auramina. Tutti i micobatteri hanno questa forma bacillare e quindi vengono detti ,in situazione microscopica, BAAR:BACILLI ALCOL ACIDI RESISTENTI.
IL GRAM E LO ZIEHL-NIELLSEN (le colorazioni in
generale) RILEVANO NON IDENTIFICANO!
IMPORTANTE PER ESAME!!!
Però non confondiamo i micoplasmi con i micobatteri:
- MICOPLASMI : sono batteri particolari che mancano della classica parete cellulare perché sono incapaci di produrre il peptidoglicano;
- MICOBATTERI : hanno una parete complessa ma peculiare ma hanno una piccola quantità di peptidoglicano equivalente a quella dei gram negativi.
Abbiamo oltre 200 specie di micobatteri che sono in realtà dei microrganismi opportunisti che però hanno una virulenza differente, quindi alcuni potrebbero dare gravi problemi. Questi batteri sono divisi in 3 gruppi fondamentali dal punto di vista clinico-medico :
- COMPLESSO DEL MICOBATTERIO TUBERCOLARE :hanno un elevata omologia nucleotidica ovvero hanno abbastanza simile la sequenza dei nucleotidi però quelle piccole differenze sono significative. Comprende:
- M. tuberculosis
- M. bovis
- M. bovis BCG
- M. africanum
- M. canettii
- M. microti
- MICOBATTERI NON TUBERCOLARI O MOTT (mycobacteria other than tuberculosis): troviamo micobatteri più o meno virulenti che possono causare patologie severe in infanti, anziani o persone già affette da altre patologie. Questi non vengono acquisisti attraverso la via respiratoria ma attraverso il contatto con l’ambiente(ES:acqua contaminata). I ricercatori gli hanno suddivisi in 4 gruppi in base ALLA VELOCITA’ DI CRESCITA e ALLA VELOCITA’ DI DARE O MENO COLONIE PIGMENTATE. Le prime 3 classi sono micobatteri a crescita lenta, l’ultima invece è a crescita rapida. Per convenzione si dice che quelli a crescita lente esigono più di una settimana al contrario invece quelli rapidi meno di una settimana. I) FOTOCROMOGENI :produzione di un pigmento carotenoide giallo quando le colonie vitali vengono esposte alla luce intensa. (ES:M.kansasii,M.simiae,M. marinum) II) SCOTOCROMOGENI: Produzione di colonie intensamente colorate in giallo sia alla luce che al buio. In alcune specie la produzione di pigmento può essere incrementata con l’esposizione alla luce. (ES:M.scrofulaceum,M.gordonae, M.xenopi) III) NONFOTOCROMOGENI : sebbene alcune specie di questo gruppo possano produrre piccole quantità di pigmento giallo pallido, l'esposizione delle colonie alla luce, lo intensifica la produzione di colore (M.intracellulare-avium,M.malmoense,M.terrae) IV) RAPIDA CRESCITA : sono in grado di crescere molto più rapidamente degli altri tre gruppi., spesso dando colonie mature in 3/ 5 giorni. Alcuni rapida crescita producono un pigmento giallo carico; Tuttavia, le due specie più riportate, che sono responsabili di infezioni umane, non sono pigmentate. Queste specie hanno una predisposizione di infettare i medical device. (M.fortuitum,M.chelonei) 3) MICOBATTERIO DELLA LEBBRA Lezione27/ STAPHYLOCOCCUS Il genere staphylococcus appartiene alla famiglia staphilococcacie e comprende i batteri importantissimi per la patologia umana, la specie più importante è lo staphylococcus aureus che può essere acquisito per via esogena ma può anche verificarsi la virulentazione dello staphylococcus aureus appartenente al microbiota. Appratendo al microbiota è presente nelle vie aeree,cavo orale,naso,intestino soprattuto a livello del retto. Caratteristiche :
- Si tratta di bacilli rotondi quindi cocchi gram positivi ;
- CATALASI POSITIVI :La catalasi è un enzima, appartenente alla classe delle ossidoreduttasi, coinvolto nella detossificazione della cellula da specie reattive dell'ossigeno. Catalizza la seguente reazione : 2 H2O2 ⇄ O2 + 2 H2O.
