Sviluppo di Tecniche per lo Studio di Agenti Patogeni: Un'Introduzione - Prof. Pesaro, Sbobinature di Malattie Infettive

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Corso di Microbiologia e Malattie

Infettive

a.a 2022/

Prof. Pesaro

MICROBIOLOGIA: branca della biologia che studia gli esseri viventi le cui dimensioni sono dell’ordine di grandezza dei micrometri

10^-6.

SVILUPPO DELLA MICROSCOPIA

● 1590 → Fratelli Janssen assemblarono il primo microscopio composto, montando due lenti all’estremità di un cilindro ● 1665 → Hooke con l’ausilio del primo microscopio da lui costruito descrisse la struttura di sottili fette di sughero ● 1632-1723 → Antoni van Leeuwenhoek, ottico e naturalista statunitense. Animalcules : la prima osservazione e descrizione di microrganismi, termine che viene usato per rappresentare batteri e protozoi. Mise a punto ambienti diversi e delle condizioni sperimentali necessarie che gli permise di descrivere con molta precisione i diversi comportamenti di protozoi e batteri osservati, di distinguerli, di classificarli, di misurarne le dimensioni e la densità media, arricchendo i dati già disponibili.

SCOPERTA DEI MICRORGANISMI: teorie contrastanti al riguardo dell’origine dei microrganismi portarono a risultati

sperimentali che influenzarono enormemente le metodologie della microbiologia. ➢ Teoria della generazione spontanea vs Biogenesi: ○ 384-322 a.C. → Aristotele per primo ipotizzò la teoria della generazione spontanea o abiogenesi che è caratterizzata da: ● i microrganismi viventi si generano spontaneamente da materiale inanimato o in decomposizione ● la vita viene creata da una forza vitale Un esempio: si pensava che le rane presenti nel Nilo si generassero spontaneamente dal fango, quando invece e erano rimaste in letargo fino a quando l’ambiente non era favorevole (fine della stagione secca). ○ 1626-1678 → Francesco Redi, sviluppò la teoria della BIOGENESI: la generazione di organismi viventi prende origine da forme di vita pre-esistenti. Egli confutò nel 1668 la teoria della generazione spontanea partendo dall’osservazione che sulla carne in putrefazione si posano frequentemente delle mosche, egli fece l’ipotesi che le larve avessero origine dalle mosche e non dalla carne. Infatti, impedendo alle mosche di venire a contatto con la carne su di essa non compariva alcuna larva. ○ 1729-1799 → Lazzaro Spallanzani pose del brodo di pollo in due fiasche di vetro sterilizzando il tutto per ebollizione. Una delle fiasche venne lasciata aperta, mentre l’altra venne chiusa per evitare una contaminazione aerogena del brodo. Si osservò una crescita solo nella fiasca aperta, i microrganismi non originano dal brodo ma sono presenti nell’aria entrata nella fiasca. Quindi i microrganismi non si formano da materiale inanimato. ○ 1700 → Jenner, partendo dall’osservazione dell’assenza di vaiolo in soggetti che avevano superato un’affezione pustulosa benigna contratta dai bovini, pensò di utilizzare l’inoculazione sperimentale della malattia del bovino per proteggere l’uomo contro il vaiolo. CONCETTO DI MALATTIA →

- Preistorico → punizione divina, presenza del diavolo, perdita dell’anima - Greco (460-377 a-C-)→ Ippocrate, osservazione del decorso della malattia, rottura dell’equilibrio dei quattro umori (sangue, linfa, bile gialla e bile nera). **- Romano

• 116-27 a.C. →** Varrone, animale così piccolo che non riesco a vedergli gli occhi - 99-55 a.C. → presenza di semi nell’aria RUOLO DEI MICRORGANISMI NELLE MALATTIE → - 1546 → Fracastoro ipotizza un’infezione contagiosa - 1835 → Bassi dimostrò che una malattia del baco da seta era di origine fungina - 1847 → Semmelweiss scoprì la causa della sepsi puerperale ed introdusse la asepsi obbligatoria delle mani dei medici e infermieri negli ospedali di Vienna - 1857 → Pasteur propose la teoria microbica della malattia - 1867 → Lister sviluppò un sistema di antisepsi durante gli interventi chirurgici (sterilizzazione degli strumenti e uso di fenolo) - 1828-1898 → Cohn classificazione batterica, endospore batteriche - 1876 → Koch isolò per primo il. anthracis e pubblicò i postulati di Koch

La nomenclatura binomiale è una convenzione standard utilizzata in nomenclatura per conferire il nome a una specie. Come

suggerisce il termine binomiale, il nome scientifico di una specie viene coniato dalla combinazione di due nomi:

• il nome del genere a cui appartiene la specie
• un epiteto che caratterizzi e distingue quella specie dalle altre appartenenti a quel genere La nomenclatura identifica l’identità batterica in base alle caratteristiche. Genere: specie che presentano caratteristiche colturali e biochimiche comuni Specie: insieme di ceppi con simili caratteristiche fenotipiche Sottospecie: ulteriore divisione della specie in base a caratteristiche fenotipiche e genetiche di cluster di ceppi Biotipo: ceppo biotipo della specie con caratteristiche biochimiche e fisiologiche Sierogruppo/sierotipo/sierovariante: batteri della stessa specie con caratteristiche antigeniche distintive. Caratteristica legata al siero immunitario, batteri della stessa specie non producono lo stesso tipo di anticorpo, ovvero hanno caratteristiche antigeniche diverse. Ceppo o clone: progenie della subcultura di una singola colonia isolata in coltura pura, la popolazione è costituita da cellule identiche

BATTERI

COCCHI:

Cellule sferiche dai 0,5-1μm, cellule individuali o associate. →domanda esame? ● Diplococchi: derivano da una cellula coccoide che dividendosi rimane appaiata (Neisseria) ● Streptococchi: lunghe catene di cocchi. Le cellule rimangono adese dopo la divisione in un paio. ● Stafilococchi: si divide in piano diversi e quindi forma grappoli ● Tetradi: divisione in due piani perpendicolari, quindi in totale 4 :: ● Sarcina: forma cubi di 8 cellule

BACILLI:

Cellule di forma bastoncellare dai 1-10μm. Singoli, sottili, allungati, forme appaiate in catene o a palizzata ● Coccobacilli: corti e ovoidali ● Vibrioni: sono bastoncellari con curvatura a formare una virgola o una spirale incompleta ● Diplobacillo ● Streptobacillo

SPIRILLI:

Cellule allungate arrotolate, rigide o flessibili ● Spirilli (rigidi): lunghi bastoncelli arrotolati o ad elica ● Spirochete: sono di natura flessibile

FILAMENTOSI: formano lunghi filamenti

PLEOMORFI: quando hanno una forma variabile in base all’ambiente e all’attività, anche se generalmente sono bastoncellari.

Sono delle forme coniche che durano nel tempo anche anni in infezioni. Un esempio è il Mycobatterium che causa la TBC. COMPOSIZIONE CHIMICA DELLA CELLULA BATTERICA:

• Acqua: rappresenta l’80% del peso totale della cellula; all’interno di essa vi sono disciolti i costituenti organici e inorganici
• Componenti inorganici: K, Na, Mg, Ca, Fe, Zn, P, s
• Componenti organici: macromolecole o polimeri

APPENDICI BATTERICHE : FLAGELLI

Lunghi filamenti proteici composti da una proteina chiamata flagellina responsabile della motilità. Hanno un diametro che varia da 15.35nm e una lunghezza fino ai 12μm. Ogni flagello è composto da un corpo basale ( anelli nei Gram -; 2 anelli nei Gram +), un uncino e un filamento. Permettono un movimento rotatorio di 360° in senso orario e antiorario per stimoli chimici o luminosi. Movimenti monodirezionali →swimming o run Movimenti improduttivo avanti e indietro →tumble o rotolamento.

• protezione da virus
• protezione da agenti tossici (lisozima, detergenti) ES: Pseudomonas aeruginosa e E. Coli sono stati tra le specie più studiate tra i batteri Gram - che formano biofilm singoli, mentre tra i Gram + più analizzati troviamo Staphylococcus epidermidis, S. aureus e gli enterococchi

PARETE CELLULARE

Circonda la membrana citoplasmatica, ha uno spessore 10-80μm. Costituita da sostanze caratteristiche dei batteri (come il peptidoglicano), che influenza la capacità di rispondere all’agente batterico da parte dell’organismo. Presenta diverse funzioni:

• determina la forma del batterio
• protegge fisicamente la cellula
• Patogenicità batterica: innesco immunità innata interferisce con la fagocitosi, mitogeno (linfociti), proteine di superficie agiscono come - adesine - invasine ed enzimi: permettono al batterio di penetrare le cellule e invadere Struttura del peptidoglicano: ripetizione di unità strutturale formata da 2 amminozuccheri diversi per i batteri Gram+ e Gram-:
• acido N-acetil-muramico
• N-acetil-glucosamina All’acido muramico sono legati 4 Aa a formarre una catena peptidica
• Gram + : parete cellulare presenta 20 strati sovrapposti di peptidoglicano trattenuti da amminoacidi. Altamente polare, permeabile a sostanza idrofila, NO a sostanze idrofobiche. Tra gli strati si trova la matrice, sostanza mucopeptide con polisaccaridi acidi detti acidi teicoici , legati al peptidoglicano o alla membrana cellulare ( acido lipoteicoici ). Sono una componente antigenica di superficie.
• Gram - : strutturalmente e chimicamente più complessa rispetto a quella dei gram +. Presentano una membrana esterna di LPS. Oltre alla presenza di porine (che servono per il passaggio selettivo di molecole idrofiliche, recettori, fattori di patogenicità). Sottile strato di peptidoglicano. La membrana esterna avvolge la cellula legata al pep. da lipoproteine resistente e struttura bilaminare. LPS → lipopolisaccaride resistente alle difese immunitarie anche quando la parete batterica è stata debellata. È formata da tre strati: ● Lipide A: porzione lipidica (glicolipide), rappresenta l’endotossina, rapporti con la membrana esterna ● Core: corta catena di zuccheri. Due zuccheri peculiari. Divisa in due parti, outer core e inner core ● Antigene somatico O: catena polisaccaridica con proprietà antigeniche, ancoraggio a recettori cellulari, fattore di resistenza alla fagocitosi. È diverso nelle varie specie batteriche, inoltre ha la funzione di ancoraggio. Grazie a questa differenza si possono distinguere le forme batteriche che infettano un organismo in un dato momento. Ha un effetto tossico e garantisce un’azione patogena dei Gram -, provoca delle reazioni nel corpo dell’ospite, all’interno del quale si libera per lisi cellulare e stimola il sistema immunitario con il rilascio di citochine (messaggeri che comunicano una determinata condizione all’organismo e inducono una risposta da parte di altre cellule che in seguito condizionano l’organismo come ad esempio shock oppure ipotensione). LPS inoltre è termoresistente, influenza l’aspetto delle colonie. Al microscopio i gram + e - sono diversi per lo spessore del peptidoglicano che influenza il colore:

• gram + → il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso di grosse dimensioni che precipita nella parete cellulare. Il decolorante condensa per disidratazione il peptidoglicano. Il complesso viene catturato dalla parete. Appaiono viola
• gram - →il decolorante agendo come solvente lipidico, dissolve in parte la membrana esterna alla parete cellulare permettendo il rilascio del complesso cristalvioletto e iodio e quindi la decolorazione della cellula batterica. Appaiono rossi

MICOBATTERI → sono un’eccezione. parete cellulare presenta una struttura complessa (ma comunque simile a quella dei gram

+) in cui il peptidoglicano è intrecciato e legato covalentemente ad un polimero di arabinogalattano e circondato da uno strato di lipidi complessati con le cere formate da acidi grassi a lunga catena (acidi micolici) dotate di potente azione adiuvante la patogenicità. Presentano cere e acidi grassi che influiscono sulla colorazione di Gram e per questo per evidenziare questo tipo di batteri viene usato un’altro tipo di colorazione.

BATTERI PRIVI DI PARETE CELLULARE →non hanno una forma ben definita

● Alofili → batteri in grado di moltiplicarsi in ambienti ad alta concentrazione di salina ● Protoplasti e Sferoplasti → perdita della parete cellulare dopo un trattamento chimico o dopo un antibiotico. Genere Mycoplasma sono pleomorfi (non hanno forma) a causa della mancanza di parete. La membrana citoplasmatica dei micoplasmi è ricca di steroli che proteggono la cellula dalla lisi osmotica.

MEMBRANA CITOPLASMATICA O CELLULARE

Spessore da 8 nm, bilaminare simile a quella della cellula eucariotica. Composta da proteine per il 60% , lipidi e fosfolipidi al 40% e carboidrati. Organizzazione: presente un doppio strato fosfolipidico (glicerofosfato e acidi grassi). Nella maggior parte dei batteri sulla membrana sono presenti gli opanoidi che sono molecole simili agli steroli, che rendono più solida la cellula. Funzione principale della membrana plasmatica è il trasporto di molecole: trasporto attivo e passivo (diffusione semplice, diffusione facilitata). MESOSOMI : sono un’invaginazione della membrana citoplasmatica di notevoli dimensioni, di forma irregolare. I mesosomi sono abbondanti e voluminosi soprattutto nei batteri gram +.

- mesosomi settali: intervengono nella divisione cellulare e tengono legato il cromosoma batterico facilitando la separazione dei due filamenti di DNA e la produzione del setto trasverso (che appare nel processo di divisione della cellula in due cellule figlie) - mesosomi respiratori: contengono la maggior parte dei citocromi e degli enzimi respiratori - mesosomi biosintetici: contengono enzimi che intervengono nella sintesi dei componenti della parete **- mesosomi fotosintetici

• mesosomi sporali:** essenziali per la formazione dell’endospora Inoltre presentano una funzione recettoriale chiamato QUORUM SENSING. Sistema di comunicazione tra i batteri sono capaci di mettere in atto attività coordinate, una capacità che un tempo si riteneva propria soltanto degli esseri viventi superiori. Sfruttando il quorum sensing i batteri possono regolare:
• l’emissione di bioluminescenza
• la formazione di biofilm sulle superfici
• la crescita competitiva tra differenti popolazioni e la sporulazione
• la sintesi di antibiotici e di batteriocine
• l’induzione di fattori di virulenza nella piante o negli umani
• i processi di infezione degli organismi superiori
• la differenziazione di linee cellulari a partire da cellule primigenie

CORPI INCLUSI

Chiamati anche granuli o inclusioni citoplasmatiche. All’interno del citoplasma di alcune specie batteriche, in funzione delle condizioni di crescita, possono essere presenti granuli o inclusioni citoplasmatiche di diversa composizione generalmente costituiti di materiale da riserva.

• Granuli di lipidi (polimeri dell’acido beta-idrossibutirrico)
• Granuli di polisaccaridi (glicogeno e amido)
• Granuli di zolfo (solfobatteri)
• Granuli di ferro (ferrobatteri)
• Granuli di polisolfato

➢ Fase II →la membrana citoplasmatica si ripiega inglobando parte del materiale nucleare e forma un setto divisorio ➢ Fase III → la membrana continua a crescere in modo da inglobare in una seconda membrana la spora immatura ➢ Fase IV → si forma la corteccia che si sviluppa nell’interspazio tra le due membrane, si ha accumulo del calcio e dell’acido dipicolinico ➢ Fase V → intorno alla corteccia si sviluppano vari strati proteici (tunica sporale) ➢ Fase VI → si ha infine la spora matura rifrangente e resistente al calore ➢ Fase VII → enzimi litici che disintegrano lo sporangio e liberano la spora nell’ambiente

GERMINAZIONE

Il passaggio della spora a cellula vegetativa avviene in tre stadi: ● Fase di attivazione: le spore per dar vita ad una nuova cellula (germinazione), può avvenire naturalmente, ma generalmente devono subire un trattamento termico (65-80 °C) per alcuni minuti, che determina la cessazione dello stato di quiescenza della spora. ● Fase germinazione: inizia con il rigonfiamento della spora, il riassorbimento o la rottura della tunica sporale; la spora diventa sensibile al calore ed agli agenti dannosi, perde la sua tipica rifrangenza, rilascia i componenti cellulari e diventa metabolicamente attiva ● Fase di esocrescita: il protoplasto fuoriesce dai resti della tunica sporale e sintetizza nuovi componenti cellulari, e si forma un nuovo batterio attivo. Inizia ad avere un metabolismo.

MECCANISMO DI VARIAZIONE BATTERICA

Mutazione genica: modificazione della sequenza nucleotidica accidentale rara e casuale (spontanee durante la duplicazione del DNA o indotte da agenti mutageni chimici, fisici e biologici). Ricombinazione: Coniugazione, Trasformazione e Trasduzione Conversione lisogenica Fusione del protoplasto PLASMIDI Sono elementi extracromosomiali mobili. Plasmide F→ plasmide della fertilità, plasmide coniugato che può essere trasferito mediante coniugazione ➢ cellule F+^ →con plasmide F, cellula donatrice o maschile ➢ cellule F-^ → senza plasmide F, cellula ricevente o femminile ➢ cellule Hfr →plasmide F integrato nel cromosoma (episoma) Portano alla produzione di:

- Pilo sessuale → struttura superficiale prodotta da cellule F+ che media lo specifico contatto tra cellule F+ e F-, ed il trasferimento del plasmide

● CONIUGAZIONE: trasferimento genico unidirezionale mediato da plasmidi che richiede un contatto fisico tra:

• batteri della stessa specie o correlati

• gram differenti, sia - che +
• batteri e cellule vegetali
• batteri e funghi Significato clinico: la coniugazione è il principale meccanismo per il trasferimento di geni per l’antibiotico-resistenza. Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori) Significato ambientale: trasferimento di resistenza a erbicidi ed idrocarburi aromatici. Resistenza batterica ai metalli pesanti, Trasferimento di geni per la fissazione dell’azoto tra Rhizobia. Plasmidi Ti da Agrobacterium possono trasferire geni alle piante (meccanismo di trasferimento genico tra domini). Significato evoluzionistico: principale meccanismo evolutivo/adattivo batterico

○ CONIUGAZIONE F+ x F- : F+^ donatore, contenente un plasmide F+ codificante per il pilo sessuale. Si ha la

formazione della coppia coniugativa e in seguito inizia il trasferimento del DNA. Retrazione del pilo sessuale e formazione di un ponte intercellulare. Una catena del plasmide F+ entra nel F-. Sintesi della catena complementare di F+ in entrambi i batteri, adesso in grado di produrre il pilo sessuale. Non si assiste a trasferimento di DNA cromosomico. ○ CONIUGAZIONE Hfr x F- : formazione Hfr ossia l’inserzione di un plasmide F+ nel nucleoide del batterio accettore. In seguito si osserva la formazione della coppia coniugata con la rottura monocatenaria del DNA a livello del plasmide F+ integrato. Retrazione del pilo sessuale e formazione del ponte cellulare. Ingresso del DNA monocatenario nel batterio accettore. A questo punto c’è un'interruzione spontanea della coniugazione che determina il fatto che solo una parte del DNA donatore verrà trasferita all’accettore. Il donatore sintetizza una coppia complementare del DNA rimanendo Hfr. L’accettore sintetizza una catena complementare del DNA trasferito. ○ CONIUGAZIONE NEI GRAM + : ( Enterococcus faecalis) le cellule accettrici producono e rilasciano feromoni che inducono la produzione di sostanza aggregante alla superficie della cellula donatrice, determinando il passaggio attraverso contatto diretto tra più cellule. Formazione di aggregati cellulari con trasferimento del plasmide coniugativo. Il passaggio di materiale genetico permette la sopravvivenza delle forme batteriche perché conferisce resistenza ai batteri, trasferimento della virulenza che indica quanto un germe è in grado di recare danno.

● TRASFORMAZIONE: È il trasferimento di informazioni genetiche per mezzo di DNA extracellulare. Morte cellulare

provoca il rilascio di DNA che penetra nella cellula ricevente competente fattore di competenza. Assorbimento, Incorporazione e Ricombinazione nel cromosoma della cellula ricevente acquisizione di nuovi caratteri da parte della cellula ricevente. È influenzata da: dimensioni del DNA, sensibilità del DNA a nucleasi, competenza della cellula.

PATOGENO ● Patogeni veri o franchi → producono sempre una malattia in ospiti sani; non richiedono alcun fattore di predisposizione; ● Patogeni opportunistici (od occasionali) → inducono malattia solo a ospiti debilitati; richiedono una immunocompromissione dell’ospite; fanno parte della flora autoctona o derivano dall’ambiente; infezioni nosocomiali. Patologia → studio della malattia e della sua eziologia Patogenesi → fattori e meccanismi coinvolti nello sviluppo della malattia Tipologia di patogeno: ➔ PATOGENI EXTRACELLULARI: causano malattie crescendo al di fuori delle cellule ospite, essi sono generalmente uccisi dai fagociti dell’ospite. La virulenza è determinata dalla capsula antifagocitaria ➔ PATOGENI INTRACELLULARI FACOLTATIVI: patogeni a riproduzione intracellulare preferenziale (listerie, brucelle e micobatteri) o occasionale (salmonelle, shigelle) ➔ PATOGENI INTRACELLULARI OBBLIGATI: patogeni a riproduzione esclusivamente intracellulare (clamidia). Parassitano la mucosa genitale e respiratoria, i monociti ed i granulociti. La virulenza è determinata da vari fattori ➔ PATOGENI TOSSIGENICI: patogeni che causano malattia principalmente attraverso la produzione di esotossine, essenziali per la virulenza del patogeno. Possono crescere anche in sede extracellulare. Tutti coltivabili in vitro. Virulenza determina da più fattori.

PROPRIETÀ PATOGENE DEI BATTERI

Patogenicità: capacità di un microrganismo di causare malattia in condizioni naturali.

1. INVASIVITÀ: è la capacità di diffondere nei tessuti adiacenti al sito d’infezione o in altri e quindi di diffondersi in un ospite.
2. TOSSIGENICITÀ: proprietà del patogeno di produrre tossine
3. INDUZIONE DI IPERSENSIBILITÀ E FATTORI IMMUNOLOGICI: producono sensibilità dell’organismo che in seguito termina con problemi dell’organismo. Queste proprietà vengono codificate a livello del genoma batterico (talvolta anche fagico). Organizzazione genica in isole di patogenicità la cui presenza/assenza determina il livello di patogenicità (batteri patogeni, scarsamente patogeni e apatogeni). Virulenza: si intende il grado o l’intensità della patogenicità di un certo microrganismo. Infezione: penetrazione e moltiplicazione dell’agente patogeno nell’ospite Infettività: capacità di colonizzare e penetrare di un patogeno stabilendo un’infezione, quantificata tramite la DI 50 che indica che il 50% della dosa è in grado di provocare un’infezione, e DL 50 che indica che il 50% dei casi provoca morte. Contagiosità: trasmissione da un ospite ad un altro. Malattia: risposta dell’ospite all’infezione con modificazione del suo stato fisiologico ed evidenti sintomi clinici. - malattia infettiva: qualunque cambiamento dello stato di salute in cui l’ospite non è capace di portare le sue funzioni a causa di un agente patogeno (virus, fungo, batterio, protozoo) o dei suoi prodotti - malattia contagiosa: trasmissibilità della malattia da un soggetto ammalato a uno sano (contatto diretto o indiretto) AGENTE INFETTANTE → ospite esposto all’agente, che deve aderire ad una parte della cute o mucosa.

• Invasione: il patogeno deve invadere e avere la capacità di passare dall’esterno all’interno delle cellule dell’ospite
• Colonizzazione →RIproduzione →Crescita: in seguito si osserva una modificazione dell’equilibrio interno dell’ospite e compare una malattia che può evolvere in base all’invasione in più distretti provocando anche in tutti i sistemi e tessuti dei danni (attraverso il circolo sanguigno).
• Tossine: alcuni batteri producono tossine, che determinano problemi a livello sistemico. Fattori di virulenza: ● fattori di colonizzazione → adesine: capsula, strato S, fimbrie ● fattori di diffusione →enzimi ● fattori antifagocitari →capsula, leucocidina, resistenza nei fagosomi ● fattori tossici → esotossine, endotossine

ADESIVITÀ BATTERICA

È la conseguenza dell’interazione specifica tra batteri patogeni e cellule dell’ospite. I batteri che sono dotati di adesine si legano a specifici recettori di natura glicoproteica o glicolipidica presenti sulla superficie. Conoscere dov’è il sito del recettore è importante per poter bloccare la malattia. Nonostante ciò non sempre il recettore sulla cellula ospite è individuato. In base alla presenza di IgA e batteri commensali, la colonizzazione batterica non sempre avviene: ➔ frenata dalle immunoglobuline che interagiscono con le forme batteriche che azionando una reazione a catena per poter bloccare il batterio ➔ si osserva una competitività tra batteri diversi ➔ processi infiammatori sull’epitelio che interagiscono a discapito dei batteri, in questo modo i batteri rimangono sulla mucosa con produzione di tossici solubili ➔ passare alla sottomucosa, agente patogeno passa nella mucosa per diffondersi

Successivamente all'adesione avviene la moltiplicazione batterica determinata da ambiente favorevole, superamento delle difese immunitarie dell’ospite.

- Aggressine: determinano l’inibizione delle difese dell’ospite e promuovono la crescita batterica - Tossine: sintomatologia morbosa e morte dell’ospite Azione patogena varia in base a come la forma batterica interagisce con l’ospite. Il batterio produce scarti del suo metabolismo che possono produrre problemi all’ospite: fermentazione con produzione di acidi, gas e prodotti tossici per i tessuti, es H 2 O 2 e NH 3.

PENETRAZIONE NEI TESSUTI DELL’OSPITE: ESOENZIMI

Coagulasi: eso-enzima prodotto da S aureus che trasforma il fibrinogeno in fibrina, causando coagulazione. La formazione di uno strato di fibrina attorno ad un accesso provocato da stafilococchi può proteggere il batterio e favorire l’adesione Collagenasi: scopo di ledere il collagene, provocando degli squarci in modo da penetrare nei tessuti. Ialuronidasi: streptococchi A, B, C, G, stafilococchi, clostridi, idrolizza l’acido ialuronico dei tessuti connettivi facilitando la diffusione del batterio nei tessuti Stafilococchi: fibrinolisina, può rompere gli ammassi di fibrina, facilitando la diffusione del batterio. Lipasi: associate all’infezione ed invasione dei tessuti cutanei e sottocutanei, essenziali per consentire la crescita e la diffusione nelle aree sebacee. Nucleasi: probabile ruolo nel fluidificare il materiale purulento e favorire la diffusione del batterio Emolisine Leucocidina Elastasi Porine Pneumolisina Desossiribonucleasi Proteasi Mucinasi SISTEMI DI PENETRAZIONE ATTIVA Salmonella (enteropatogene): invasione polarizzata della mucosa colica mediata da proteine effettrici traslocate nel citosol ospite mediante il sistema secretorio di tipo III provocando fenomeni di apoptosi e necrosi. Shigella spp: adesione a cellule M mucosali coliche stimola la polimerizzazione di actina, con formazione di pseudopodi che internalizzano i batteri; fuga di vacuolo fagocitario; proliferazione citoplasmatica e rilascio shigelle (lisi apoptotica). Ci sono due tipi di tossine: ● Endotossine: lipopolisaccaride, sono termostabili; Immunogeni, ma non neutralizzabili da anticorpi. Hanno profili d’azione poco differenziati, ma causano comunque problemi di natura generale portando effetti nefasti. Vengono però inattivate attraverso l’ingestione. ● Esotossine: prodotte non sono parte della struttura batterica, sono di natura proteica e sono termolabili nel senso che attraverso un trattamento termico e viene inattivata. Neutralizzabili dagli anticorpi, profili di azione molto differenziati, estrema potenza in quanto hanno un target specifico. In questo caso le esopeptidasi rimangono attive anche con l’ingestione. Entrambi i tipi di tossine sono immunogeni e producono una reazione degli anticorpi. Nel caso delle endopeptidasi gli anticorpi prodotti non hanno effetto di neutralizzazione come invece per le esopeptidasi. ESOTOSSINE STRUTTURA DELLE ESOTOSSINE Alcune sono monomeriche, la maggior parte sono dimeriche e costituite da subunità A e da una subunità B. Subunità A → induce l’effetto tossico che produce il danno all’organismo e poi si trasferisce all’interno dell’organismo Subunità B →permette alla subunità A di restare legata alla cellula ospite, si lega ai recettori cellulari. Le esotossine si classificano per: ● Bersaglio cellulare o tessutale ○ Citotossiche →agiscono a livello extracellulare e anche delle membrane cellulare, esfoliano e portano alla lisi tra le cellule che mantengono un legame tissutale. Hanno azione diretta sulle membrane che vengono rotte che porta alla morte delle cellule. Formano canali per penetrare e alterare la membrana. Agiscono con enzimi che inducono danni ai componenti primari della membrana. ○ Istotossiche → attaccano tessuto come muscoli, sottocute e fasce, fegato, omaso portando a gangrene e infezioni dei tessuti stessi.

➢ Tossina esfoliativa: causa la necrosi epidermica tossica, sindrome della cute scottata (dermatite esfoliativa) in neonati o pazienti immunodepressi. Si tratta di proteasi che rompono i desmosomi nello strato granuloso dell’epidermide. ➢ Enterotossine: prodotte da circa metà di tutti gli isolati, resistono a enzimi gastrici e al riscaldamento. Causa intossicazioni alimentari (crescita del batterio e produzione di tossina nei cibi, che rimangono contaminati anche dopo il riscaldamento). Stimolano citochine proinfiammatorie e causano (entro poche ore dall’ingestione) febbre, vomito (stimolano recettori della mucosa GI che generano impulsi che raggiungono il SNC) diarrea.

ANATOSSINE O TOSSOIDI

Sono tossine proteiche batteriche alle quali è stato artificialmente eliminato il potere tossico preservando le proprietà antigeniche. Sono i costituenti dei principali vaccini antibatterici (vaccino antitetanico, antidifterico e antipertosse). ENDOTOSSINE È il lipopolisaccaride (LPS) che costituisce il rivestimento esterno dei batteri Gram-. Questa parte di cellula batterica è quindi liberata solo dai batteri gram- dopo la lisi della cellula stessa. Il lipopolisaccaride ha un’azione tossica, questa parte viene viene liberata quando le cellule macrofage fagocitano i frammenti di batterio o batteri stessi all’interno del macrofago. In seguito l’azione del LPS causa l’attivazione delle citochine che poi determinano un’azione a cascata che producono una modificazione dell’omeostasi (es: febbre) dell’organismo in modo da arginare le condizione che favoriscono i batteri all’interno dell’ospite (es: interferendo sulla temperatura si ha un’azione negativa per i batteri che muoio). Nonostante ciò febbre troppo elevata può provocare morte, inoltre si può prima andare in contro allo shock per il brusco calo della pressione sanguigna o per la formazione di fenomeni di coagulazione a livello del circolo periferico che portano alla necrosi delle parti distali. Effetti negativi si instaurano in seguito al rilascio di sostanze per l’interazione di macrofagi e batteri. Le citochine se liberate in bassa quantità hanno un’azione positiva favorendo l’organismo, se al contrario vengono liberate in quantità molto elevate determinano fenomeni di shock o coagulazione intravasale diffusa. Gli effetti delle endotossine sono molteplici

• febbre
• leucopenia seguita da leucocitosi
• rilascio di citochine
• effetti metabolici (iperglicemia→ipoglicemia)
• interazione con proteine del siero
• trombocitopenia
• effetti sull’apparato endocrino
• shock circolatorio
• attivazione mitogenica specifica dei linfociti B
• attivazione e rilascio dei mediatori dell’infiammazione
• attivazione e rilascio dei mediatori del completamento
• attivazione e rilascio dei mediatori della coagulazione
• attivazione e rilascio dei mediatori della fibrinolisi
• aumentata attività dei macrofagi

OSSERVAZIONE NEI MICRORGANISMI

MICROSCOPIO OTTICO

● IN CAMPO OSCURO

La luce raggiunge il campione in esame senza entrare direttamente nell’obiettivo. La sola luce è quella deviata dal preparato che appare luminoso su fondo scuro. La risoluzione è migliore rispetto ai microscopi in campo illuminato o a contrasto di fase. È molto utile per osservare la motilità, quindi nel caso dei batteri i flagelli. Permette di osservare anche i protozoi ● A CONTRASTO DI FASE È stato sviluppato per migliorare le differenze di contrasto tra le cellule ed il mezzo circostante, così da consentire la loro visualizzazione senza ricorrere alla colorazione (la colorazione uccide le cellule e può distorcere la forma). Permette dunque l’osservazione diretta di cellule vive. È una una tecnologia presente nell’obiettivo

• una cellula batterica ha un indice di rifrazione diversa dal mezzo circostante
• ne deriva una differenza nella fase tra la cellula e il mezzo circostante
• un anello speciale presente nell’obiettivo amplifica questa sottile differenza
• si ottiene un’immagine scura su fondo chiaro con un tipico alone luminoso

● MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Utilizzo della luce UV come fonte luminosa, aumenta il limite di risoluzione dello strumento. Si osservano microrganismi fluorescenti o trattati con coloranti che emettono fluorescenza (fluoresceina, rodamina, Ab resi fluorescenti).

MICROSCOPIO ELETTRONICO

Utilizza un fascio di elettroni al posto della luce, la cui lunghezza d’onda è inversamente proporzionale alla velocità degli elettroni, questo permette di avere una risoluzione di 10.000 volte rispetto al MO e quindi avere un ingrandimento massimo di 1 milione di volte. Il campione disperde o assorbe gli elettroni e produce un’immagine micrografica a seconda dello spessore e composizione chimica. L’immagine viene in seguito proiettata su schermo fluorescente o su una lastra fotografica. ● A TRASMISSIONE (TEM) Permette di osservare l’ultrastruttura dei microrganismi compresi i virus che sono più piccoli dei batteri (con il microscopio ottico non si riescono ad osservare i virus ma solo le conseguenze che la loro penetrazione porta nella struttura delle cellule infettate). Permette un ingrandimenti di 1 milione di volte. Prevede vari passaggi per la preparazione del campione (fissazione, disidratazione, inclusione e colorazione con metalli pesanti, compreso l’oro, anche per questo motivo è una procedura molto costosa). I campioni vengono ottenuti attraverso il sezionamento in fettine che vengono successivamente analizzate al TEM ● A SCANSIONE (SEM) Il campione viene ricoperto da un metallo pesante, irradiato da fascio di elettroni a scansione. In seguito si verifica un’emissione di elettroni secondari a bassa frequenza dalla superficie. Tali elettroni vengono raccolti e messi a fuoco su uno schermo. L’ingrandimento massimo è di 300.000 volte. Le immagini risultano tridimensionali ma sono visibili solo le strutture di superficie.

PREPARAZIONE E COLORAZIONE DEL CAMPIONE

A FRESCO: osservazione diretta della forma, disposizione, dimensioni, rifrangenza, mobilità e riproduzione dei microrganismi.

Viene effettuata in mezzo liquido e avviene senza l’uso di coloranti. ➔ Preparati su vetrini porta-oggetto e copri-oggetto ➔ Preparati a goccia pendente su cella di Koch: la preparazione a goccia pendente richiede un vetrino portaoggetti spesso e con una escavazione emisferica al centro. Intorno ai bordi dell’escavazione si spalma del silicone in modo che la goccia non si espanda. La sospensione batterica viene posta al centro di un vetrino coprioggetto. Si rovescia il vetrino

COLORAZIONE ZIEHL-NIELSEN MODIFICATA →per la colorazione delle brucelle , che sono parzialmente acido-resistenti. Fucsina più diluita, decolorante acido acetico a 0,5%. Usata per la Nocardia asteroides e Chlamydia psittaci. COLORAZIONE DELLE SPORE → bacilli e clostridi formano una struttura molto resistente capace di sopravvivere per lunghi periodi in ambiente sfavorevole (endospore). Esame a fresco (formazione endocellulari rifrangenti). Colorazioni: verde malachite e fucsina fenicata, colorazione di Schaeffer-Fulton (verde malachite e safranina) richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante. COLORAZIONE DELLE CAPSULE : la capsula batterica non ha affinità per i coloranti per evidenziarla si utilizza una colorazione di sottofondo con colorante acido (nero di nigrosina) che non penetra nel batterio e si deposita attorno alle cellule o inchiostro di china, non è assorbita dalla capsula. La capsula rimane chiara (bianca) ed è osservata come alone chiaro che circonda il corpo del batterio. COLORAZIONE DEI FLAGELLI : Sali dell’acido tannico precipitano sulla membrana e sui flagelli aumentandone il diametro e con la successiva colorazione con fucsina basica diventano visibili anche al M.O. COLORAZIONE DI MACCHIAVELLO : colorazione per rickettsiae e clamidie. Stesura e fissazione del campione sul vetrino. Colorazione con fucsina basica 0,25% per 5 min. Lavaggio. Decolorazione veloce con acido citrico diluito e alcol etilico. Lavaggio con acqua, colorazione di contrasto blu di metilene 30 secondi. Lavaggio. In questo tipo di colorazione cambia il decolorante e alcune sostanze, inoltre i tempi sono molto più brevi. DIFF-QUIK : è una variabile commerciale del colorante Romanowsky. Comunemente usato nella colorazione istologica, molto rapida, non si ottengono risultati ottimi, ma nonostante ciò permette di evidenziare abbastanza chiaramente tutte le strutture.

• Preparazione dello striscio su ventrino
• immergere il vetrino 5v volte per 1-2 sec nella soluzione fissativa. Dopo ogni immersione attendere un istante per eliminare l’eccesso
• Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 sec nella soluzione rossa. Dopo ogni immersione attendere un istante per eliminare l’eccesso
• Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 sec nella soluzione blu. Dopo ogni immersione attendere un istante per eliminare l’eccesso.
• Lavaggio con acqua distillata o acqua tamponata a pH 7.
• Si lascia asciugare il vetrino all’aria.

DIVISIONE BATTERICA

Una colonia batterica risulta costituita da milioni di derivate della medesima cellula progenitrice e dotate di identiche proprietà biologiche. FASE DI LATENZA Fase di adattamento metabolico:

• sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare
• sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico Durata variabile (specie-specifica)
• in alcuni casi può essere di breve durata od assente FASE ESPONENZIALE Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva
• gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non avvengono nello stesso tempo (coltura non sincronizzata) Velocità di crescita costante nel tempo:
• aumento del numero cellulare
• aumento della massa cellulare totale Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche Chiamata anche fase logaritmica FASE STAZIONARIA Numero totale di cellulare vitali rimane costante:
• arresto della riproduzione
• tasso riproduttivo controbilanciato del tasso di mortalità Possibili cause:
• raggiungimento di una densità critica di popolazione
• accumulo di cataboliti (azione tossica)
• limitazione dei nutrienti
• limitata disponibilità di ossigeno FASE DI MORTE Morte cellulare a velocità esponenziale Morte: perdita irreversibile della capacità di riprodursi In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta a causa di un accumulo di cellule resistenti. Questa tecnica si basa sul presupposto che ogni colonia sia originata da una singola cellula vitale. Sorgono pertanto problemi per le cellule legate tra loro, ad esempio in catenelle come gli streptococchi. Per questo per unità di peso o di volume, NON si parla di cellule ma di UNITÀ FORMANTI COLONIA.