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Microbiologia Generale
LA CELLULA PROCARIOTICA
Tutti gli organismi sono costituiti da cellule , strutture di cui riconosciamo due tipi: la cellula procariotica e la cellula eucariotica. Quali sono le caratteristiche distintive dei procarioti rispetto agli eucarioti? Il nucleo è negli eucarioti e non nei procarioti. Mentre nella cellula eucariotica i cromosomi sono presenti nel nucleo, delimitato da una membrana nucleare, nella cellula procariotica la membrana nucleare è assente e il materiale ereditario si trova a stretto contatto con il citoplasma, formando una struttura chiamata nucleoide. Gli eucarioti presentano un DNA lineare , mentre i procarioti presentano un DNA circolare. Gli eucarioti possono essere sia pluricellulari che unicellulari, mentre per quanto riguarda i procarioti sono pluricellulari. Le cellule eucariotiche presentano organelli cellulari delimitati da membrane, quali: (mitocondri, reticolo endoplasmatico, complesso di Golgi, lisosomi e, nei vegetali, plasmidi). Nei procarioti sono, invece, assenti. Differenza nel genoma La parete Le dimensioni delle cellule eucariotiche sono maggiori rispetto alle cellule procariotiche. Le funzioni svolte nella cellula eucariotica da mitocondri e cloroplasti, come respirazione e fotosintesi, nella cellula procariotica sono localizzate a livello della membrana plasmatica. In questa immagine possiamo vedere due cellule procariote durante la divisione cellulare. Quindi, le cellule si stanno dividendo. La divisione delle cellule procariotiche avviene per scissione binaria , presente nei batteri ed è presente in un solo lievito, Schizosaccharomyces pombe , il quale si divide ma, dal punto di vista morfologico, si comporta come se fosse un batterio. La scissione binaria divide in maniera equazionale, le due cellule hanno la stessa dimensione. In realtà, i funghi e i lieviti nello specifico, nel momento in cui si riproducono, la cellula che sta avendo origine è sempre un pochino più piccola di quella madre. Durante questo processo il DNA viene replicato e ciascuna cellula figlia ne riceve una copia.
E’ un lievito, troviamo: in blu quello il nucleo e a seguire tutti i vari organelli, dei vacuoli e altri compartimenti. In questa immagine, vediamo in modo schematico tutto quello che contraddistingue una cellula batterica e una fungina. Nell’immagine in alto vediamo il batterio, dove è presente: Il nucleoide , si chiama così perché ha il DNA concentrato nello stesso punto; I ribosomi , comune tra lieviti o funghi. Nei ribosomi avviene la sintesi proteica, sono i macchinari che mandano avanti la cellula; Il citoplasma , il quale contiene nei lieviti o funghi degli organelli. Negli eucarioti e nei batteri non lo troviamo. La membrana plasmatica e la parete cellulare nei batteri. La membrana plasmatica e a volte qualche aggiunta alla membrana plasmatica nei lieviti. La divisione cellulare è una delle più grandi differenze che troviamo tra un batterio e un lievito. È il processo di accrescimento di una popolazione. Per quanto riguarda i procarioti, in questo caso abbiamo una coltura di Escherichia Coli. C’è un allungamento e poi una divisione, quindi abbiamo una cellula che si accresce momentaneamente per poi dare origine ad una strozzatura che fa avvenire la citodieresi, quindi dalla divisione di una cellula ne derivano due delle stesse dimensioni.
Operoni policistronici per bacteria e archea, assenza negli eucarioti. Questo rientra a livello di differenze a livello di genoma. RNA polimerasi. La mureina nella parete cellulare quindi è presente nei batteri e assente negli archea e negli eucarioti
DIFFERENZE MORFOLOGICHE
Una differenza importante riguarda le morfologie. I batteri sono invisibili a occhio nudo e hanno dimensioni lineari nell’ordine del micrometro. Essendo per la maggior parte unicellulari, i batteri presentano molteplici forme: sferoidali , bastoncellari , a virgola , a spirale , filamentose e altre ancora. Le forme più comuni si dividono in due categorie: Forme sferiche, che prendono anche il nome di cocchi. Forme allungate, che prendono il nome di bacilli. A ciascuna di queste due morfologie, corrispondono degli aggregati cellulari differenti. Possiamo avere: I cocchi , i quali hanno una forma sferica, quando si dividono possono rimanere attaccati in vari modi, formando così: o I diplococchi , i quali sono una catena di due cellule; o Gli streptococchi , rappresentano una collana di cellule; o Le tetradi , si formano quando i cocchi si dividono su due piani e restano uniti in gruppi da quattro; o Le sarcine , quando i cocchi si dividono su tre piani, sono costituiti da otto cellule; o Gli stafilococchi , formano grappoli d’uva irregolari. Ciò è dato da un metodo di divisione cellulare in cui non abbiamo una divisione cellulare, ma le cellule continuano a riprodursi in grappoli. Per quanto riguarda i bacilli possiamo avere: o I coccobacilli , è la morfologia; o I diplobacilli , quando i bacilli sono appaiati tra loro;
o Gli streptobacilli , sono catenelle di bacilli; o I vibrioni , i quali sono batteri che hanno la forma di una virgola; o Gli spirilli , i quali sono batteri a forma di spirale; o Gli spirochete , formati da cellule più sottili e flessibili. Altri batteri hanno forme molto più complesse, ad esempio: I batteri filamentosi , come gli streptomiceti , i quali formano delle ife formate da lunghe catene di cellule, le quali poi danno origine a un micelio simile (insieme di ife) a quello dei funghi; I batteri peduncolati , detti anche prostecati , i quali presentano un peduncolo che consente loro di aderire al substrato o aumentare la superficie di scambio con l’ambiente. La morfologia batterica è data dalla parete mureinica formata dal peptidoglicano , la quale circonda il batterio ed è formata da proteine, le quali hanno ruolo simile a quello della tubulina e dell’actina che troviamo nelle cellule eucariote. Esistono forme più complesse come i batteri filamentosi , ad esempio gli Attinomiceti , i quali crescono formando degli allungamenti che prendono il nome di IFE. Le morfologie dei batteri sono supportate da proteine specifiche presenti nel citoscheletro delle cellule eucariotiche, le quali controllano la forma e le dimensioni. Sono tre proteine principali: FtsZ ( fts: filamentous temperature-sensitive ). È una proteina simile alla tubulina che durante il processo di divisione cellulare si localizza in posizione mediana e forma un anello che coordina la sintesi della nuova parete che separerà le due nuove cellule sia nei cocchi che nei bastoncelli. Quindi, i cocchi presentano solo FtsZ. Mentre, per quanto riguarda i bacilli, la FtsZ, proteina essenziale per la divisione cellulare, durante la divisione si aggrega formando un anello, il quale ha il compito di “strozzare” le due cellule nel punto in cui avviene la divisione. MreB , simile all’ actina , forma una struttura a spirale a livello della membrala, la quale produce un aumento del diametro cellulare fino a provocare un arrotondamento delle cellule. Crescentina , o CreS , è presente solo nei vibrioni , è una proteina che presenta una struttura simile ai filamenti intermedi degli eucarioti, responsabile della curvatura della cellula.
MEMBRANE E PARETI DELLE CELLULE PROCARIOTICHE
Le cellule procariote sono dotate di complesse strutture di rivestimento che consentono loro di adattarsi a specifici ambienti. Come tutte le cellule, anche la cellula procariotica è delimitata da una membrana plasmatica , o citoplasma. La membrana, a sua volta, è protetta da una parete, la quale assume strutture diverse in Archea , batteri Gram positivi o batteri Gram negativi. Molti procarioti, in aggiunta, oltre la parete presentano strati di rivestimento, quali: strato S , capsula o glicocalice ; oppure presentano delle appendici, quali: pili e flagelli. Le diverse caratteristiche della parete permettono di distinguere i Bacteria in due categorie: Didermi , chiamati anche Gram negativi. Nella parete dei Gram negativi troviamo una membrana plasmatica , la quale presenta un doppio foglietto di lipidi e glicolipidi e delle proteina associate alla membrana esterna , quest’ultima ha il compito di dare resistenza alla cellula e controllare il passaggio e la diffusione di molti composti che migrano dall’esterno verso l’interno della cellula. Nello spazio delimitato dalle membrane, detto periplasma , troviamo un sottile strato di peptidoglicano , polimero formato da amminozuccheri e amminoacidi. Monodermi , detti anche Gram positivi. I Gram positivi sono privi di membrana esterna e la loro parete è formata da: o Uno spesso strato di peptidoglicano ; o Acidi teicuronici , i quali sono uniti, tramite legame covalente, con il gruppo 6- ossidrile dell’acido muramico del peptidoglicano; o Acidi teicoici , sono un gruppo di acidi che ricoprono la superficie della parete cellulare dei Gram positivi; o Proteine
La colorazione di Hans Christian Gram , permette di distinguere i batteri, Gram positivi e Gram negativi, in base alla risposta della colorazione. La colorazione di Gram avviene per fasi, con l’utilizzo di diverse colorazioni e decolorazioni.
- Abbiamo la fissazione delle cellule al calore, quindi avremo uno striscio di sospensione batterica su di un vetrino. A questo punto, la fissiamo al calore, lo passiamo sul becco bunsen (su una fiamma) e immergiamo il vetrino nella colorazione con cristalvioletto ( clururo di esametil- pararosanilina ).
- Il cristalvioletto farà diventare le cellule blu.
- Al cristalvioletto si va ad aggiungere ioduro , attraverso il quale le cellule diventeranno viola.
- In seguito, abbiamo una decolorazione con alcol o acetone. Quali sono le conseguenze della decolorazione? La decolorazione, elimina il cristalvioletto nei Gram - , poiché va a rimuove la membrana esterna, ma resta colorata con i Gram +. A questo punto abbiamo una colorazione dei Gram + e un’assenza di colorazione nei Gram -.
- A questo punto, si fa una colorazione di contrasto finale con safranina e il batterio che era già viola, quindi il batterio Gram +, resta viola (colore dato da ioduro); mentre, il batterio Gram - , il quale non presentava alcuna colorazione si colora con safranina.
- Vedremo i Gram – rossi e i Gram + viola. Questo è il motivo per la quale le due tipologie di raggruppamenti si distinguono con questo tipo di colorazione, che non è data da un solo colorante, ma da un insieme di passaggi di colorazione e decolorazione con coloranti diversi.
Perché si dispongono in questo modo? Perché è la conformazione termodinamica più stabile. Quindi c’è una conformazione della membrana plasmatica, struttura termodinamicamente più stabile delle molecole lipidiche. La regione idrofoba è composta da acidi grassi , i quali rappresentano le code idrofobe dei fosfolipidi. Gli acidi grassi nei fosfolipidi sono in maggioranza saturi. Il rapporto acidi grassi insaturi/saturi contribuisce al controllo della fluidità della membrana. Avremo, inoltre, anche una regione idrofila composta da glicerolo , un gruppo fosfato e delle eventuali aggiunte che possono essere ad esempio: etanolamina , serina o da altri composti che vanno a funzionalizzare il fosfolipide e andranno a dare caratteristiche peculiari. La membrana plasmatica di Bacteria ed Eukarya è formata, come già detto, da fosfolipidi in cui la testa polare è rappresentata da una molecola di D-glicerolo 3-fosfato e la coda da due molecole di acidi grassi esterificati al C1 e C2 dello scheletro del D-glicerolo. Al fosfato esterificato in C3 , possono essere legati gruppi funzionali, etanolamina e serina, le quali danno origine a fosfolipidi diversi.
DIFFERENZE TRA PROCARIOTI, EUCARIOTI E ARCHEA
I lipidi delle membrane degli Archea presentano delle caratteristiche che li distinguono da Bacteria ed Euckarya. Questa differenza risiede principalmente in due aspetti principali: La chiralità del glicerolo , abbiamo un L-glicerolo negli archea e un D-glicerolo nei procarioti ed eucarioti. Cosa vuol dire L-glicerolo e D-glicerolo? Vuol dire che le code di acidi grassi sono legate in carboni differenti tra due tipologie di fosfolipide, abbiamo: o Le code legate al C2 per quanto riguarda gli archea; o Le code di acido grasso sono legate al C1 e al C2 nei procarioti e negli eucarioti; o Il gruppo fosfato legato al C1 negli archea e legato al C3 negli eucarioti e nei procarioti. Tipo di legame tra glicerolo e catena alifatica. Negli Archea il fosfato è esterificato con il glicerolo in C1, producendo L-glicerolo. Le catene laterali alifatiche non contengono acidi grassi esterificati al glicerolo ma catene isoprenoidi , dove il gruppo alcolico (-OH) è condensato all’L-glicerolo in C2 e C3 tramite legame etere. Quindi, abbiamo un legame etere negli archea (L-glicerolo) e un legame estere nei procarioti e negli eucarioti. I lipidi degli archea possono essere dieteri di glicerolo o tetraeteri di glicerolo. I dieteri di glicerolo sono formati da due catene alifatiche ( fitanili ), a 20 atomi di C legate ad una molecole di glicerolo. I tetraedi, invece, sono formati da due catene alifatiche ( bifitanili ) a 40 atomi di C, le quali sono legate a due molecole di glicerolo.
Nelle membrane citoplasmatiche eucariote si ritrovano gli steroli. Gli steroli sono dei lipidi caratterizzati da un nucleo a quattro anelli aromatici. Sono delle molecole planari molto rigide che, a differenza degli acidi grassi, vanno a conferire una stabilità alla membrana e una diminuzione della membrana (non deve essere fluida altrimenti la membrana non riesce a svolgere la sua funzione). Gli steroli, inoltre, sono presenti solo ed esclusivamente negli eucarioti microbici. Nelle nostre cellule, lo stesso ruolo viene svolto dal colesterolo. Il colesterolo si trova nella membrana, gli steroli si trovano nei funghi. Nella maggior parte dei Bacteria , invece, sono presenti gli opanoidi , i quali sono molto simili agli steroli. Gli opanoidi differiscono dagli steroli per la struttura, ma allo stesso tempo svolgono una funzione simile, cioè quella di conferire rigidità alla membrana.
MEMBRANA PLASMATICA: FUNZIONI
La membrana cellulare dei procarioti non è utile solo per delimitare la cellula e assicurare scambi con l’ambiente circostante, ma è importante anche per l’attività metabolica. FUNZIONI DELLA MEMBRANA PLASMATICA A livello strutturale contiene il citoplasma. La membrana plasmatica è una barriera selettiva permeabile tra il citoplasma e l’ambiente circostante. Questa caratteristica è dovuta alla composizione lipidica e proteica della membrana. Il doppio strato fosfolipidico permette la diffusione di acqua, gas e di piccole molecole idrosolubili. I sistemi di trasporto controllati da proteine sono due: trasporto attivo e passivo , nello specifico trasporto attivo che è caratterizzato dalla presenza di proteine. Uno dei ruoli delle proteine di membrana è il trasporto di molecole che non sono permeabili, che non riescono ad attraversare la membrana plasmatica. Cosa riesce a passare all’interno della cellula senza ricorrere a trasporti specifici? Sono molecole idrofobiche, quindi ossigeno, anidride carbonica, le quali riescono ad attraversare la membrana senza problemi. Troviamo una totale impermeabilità agli ioni, composti polari e grosse molecole. È un ruolo molto importante per il passaggio limitato solo a chi abita nella cellula. Molto importante è il ruolo della membrana nella produzione di energia. Il ruolo di barriera selettiva è fondamentale non solo per impedire il passaggio di molecole, ma anche per la produzione di energia, perché impedendo il passaggio casuale di, ad esempio protoni, fa sì che questi si accumulano all’esterno della membrana e che entrano in punti specifici, ad esempio l’ATP sintasi. A livello di questa struttura, nei procarioti, avviene la fotosintesi e la respirazione. Questi processi vengono generati da un gradiente ionico
Sono noti alcuni composti antimicrobici, solitamente molecole anfipatiche di natura peptidica , lipopeptidica o polienica , le quali agiscono in maniera selettiva sulle membrane di batteri o funghi. Abbiamo: I lipopeptidi , i quali si troveranno a livello della membrana, ne esistono di due tipi: o Le polimixine , le quali costituiscono una famiglia di antibiotici lipopeptidici a sintesi non ribosomiale, prodotte da alcuni ceppi del batterio Gram positivo, Paenibacillus polymyxa. Le polimixine sono di diversi tipi, ma presentano un azione molto simile (simili per quanto riguarda l’azione tra batteri Gram – e Gram+, ma saranno differenti). Ci sono polimixine che agiscono con i lipoposaccaridi della membrana esterna nei Gram negativi; mentre, ci sono polimixine che agiscono con i fosfolipidi della membrana citoplasmatica per quanto riguarda i Gram positivi. In questo modo, le polimixine, distruggono la membrana alterando la cellula e causando la morte della cellula stessa. Perché succede questo? Poiché formano dei pori sulla membrana e ciò che era presente all’interno esce fuori, quindi la cellula si svuota e muore. Le due tipologie di polimixine: Polimixina E Polimixina B Sono differenti ma hanno la stessa tipologia di azione, quella di disgregare la membrana, creare dei pori, i quali sono i punti in cui avviene sia la distruzione della membrana che la fuoriuscita del materiale cellulare, portando così alla morte della cellula. o Un altro lipopeptide è la daptomicina. La daptomicina ha un azione abbastanza simile alla polimixina. La daptomicina è prodotta da Streptomuces roseosporus e agisce sulla membrana plasmatica batterica. La daptomicina, in presenza di ioni calcio, si lega alla membrana dove inserisce la sua coda lipofila. Dopo aver alterato la conformazione della membra, forma dei pori causando la depolarizzazione e la perdita, in seguito, di ioni potassio. L’effetto finale è lo stesso, cioè la cellula si svuota dei suoi componenti e muore
Un’ altra classe di antimicrobici sono i polieni , i quali sono un equivalenza dei funghi. Questi complessi formano complessi con gli steroli di membrana, soprattutto con l’ergosterolo , e sono attive solo per quanto riguarda le cellule eucariotiche. Vengono usate solo per il trattamento di infezioni fungine. Un rappresentanza dei polieni è data dall’ anfotericina B , è un composto che si aggancia agli steroli di membrana degli eucarioti. L’anfotericina B è una molecola tossica poiché si aggancia alle cellule dell’ospite, crea dei pori sulla membrana. Infine, abbiamo i peptidi , i quali pur agendo contro i batteri, sono attivi anche verso i virus, funghi e protozoi. I peptidi sui batteri e funghi vengono sintetizzati da altri microrganismi come azione di difesa, quindi vengono prodotti per la sintesi proteica ribosomiale, possono subire o meno delle modifiche post-traduzionali, ma in quel caso abbiamo una sintesi ribosomiale. Nel caso di altre tipologie di peptidi possiamo avere anche una sintesi proteica. Possono agire in due modalità differenti, che sono: o L’uccisione diretta del microrganismo o Modulazione del sistema immunitario Quindi, l’azione non è specifica sul singolo microrganismo, ma può essere anche di modulazione del sistema immunitario nei confronti dei microrganismi. Abbiamo appunto un accentuazione di risposta del sistema immunitario. ATTENZIONE : utilizzo di peptidici, in campo microbiologico, per l’uccisione diretta del microrganismo. Come può avvenire? Avviene attraverso un interazione elettrostatica tra il peptide e la superficie cellulare. Quindi, i peptidi formano un interazione con l’involucro del batterio e lo vanno a disgregare. Successivamente forma dei pori dai quali fuoriesce il contenuto della cellula. Possiamo, inoltre, anche avere un ingresso del peptide all’interno della cellula che va a modulare, inibire, le funzioni cellulari. L’azione più frequente, per quanto riguarda questo tipo di molecole, è formazione di pori e successiva fuoriuscita di materiale cellulare. Un peptide importante sono le batteriocine. Le batteriocine costituiscono un grande gruppo eterogeneo di polipeptidi con azione antimicrobica prodotti sia da batteri Gram positivi che Gram negativi tramite la sintesi ribosomale. Le batteriocine agiscono legandosi a recettori, posti sulla membra, formando dei pori, i quali hanno lo scopo di danneggiare la membrana plasmatica, oppure essere traslocate nel citoplasma dove possono compromettere le funzioni della cellula. Un gruppo di batteriocine, lantibiotici , possono interferire con la sintesi del peptidoglicano.
