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LUCE:
Teoria corpuscolare - > formulata da Newton nel XVII sec; la luce veniva vista come composta da piccole particelle di materia (corpuscoli) emesse in tutte le direzioni con propagazione in linea retta. Teoria ondulatoria - > venne formulata da Huygens nel 1678; la luce veniva vista come un'onda che si propagava, analogamente alle onde del mare o a quelle acustiche, in un mezzo, chiamato etere. Fisica quantistica - > teoria che descrive il comportamento della materia, della radiazione e le loro interazioni viste sia come fenomeni ondulatori sia come fenomeni particellari (dualismo onda- particella). DIFFRAZIONE: La diffrazione è un fenomeno fisico associato alla propagazione delle onde, ed è tipica di ogni genere di onda. Gli effetti della diffrazione sono rilevanti quando un'onda incontra un ostacolo o una fenditura le cui dimensioni sono comparabili o minori rispetto alla propria lunghezza: in questo caso l’onda diffonderà anche nella zona dell’ombra geometrica dell’ostacolo e su uno schermo posto al di là dell’ostacolo si osserveranno particolari figure di diffrazione. CARATTERISTICHE DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE: Monocromatica = stessa frequenza o lunghezza d’onda; Policromatica = diverse frequenze o lunghezze d’onda Polarizzata = le o.e. vibrano sullo stesso piano; Non polarizzata = le o.e. vibrano su piani diversi (360°) Coerente = le o.e. vibrano in concordanza di fase; Incoerente = le o.e. vibrano in discordanza di fase Collimato = raggi paralleli con fronte d’onda planare; Divergente = raggi non paralleli POLARIZZAZIONE: Filtro polarizzatore: composto da materiale con struttura ordinata che blocca o smorza l’oscillazione del campo elettrico della luce non parallela all’asse di polarizzazione. Due filtri polarizzatori sovrapposti e orientati a 90° tra loro determinano il totale oscuramento. La luce può essere polarizzata anche in conseguenza di un fenomeno della riflessione (esempio pratico: il riflesso della luce solare sul cofano delle automobili viene attenuato dagli occhiali polaroid). RIFRAZIONE: Rifrazione: fenomeno ottico per cui un fascio di luce subisce una deviazione passando da un mezzo con un indice di rifrazione ad un mezzo con diverso indice di rifrazione. L’indice di rifrazione rappresenta il fattore numerico per cui la velocità di propagazione di una radiazione elettromagnetica viene rallentata, rispetto alla sua velocità nel vuoto, quando questa attraversa un materiale. L’indice di rifrazione varia con la frequenza della radiazione. La dipendenza della rifrazione dalla λ viene sfruttata per realizzare la dispersione della luce (cioè la separazione delle componenti monocromatiche della luce bianca) tramite un prisma le radiazioni
vengono a via a via più deviate passando dal rosso (minore frequenza) al violetto (maggiore frequenza) Il prisma è quindi un buon dispositivo monocromatore. ANGOLO LIMITE: L'angolo critico (noto anche come angolo limite) è quell'angolo di incidenza oltre il quale si ottiene una riflessione interna totale. Se l’angolo α del raggio incidente è superiore all’angolo limite il raggio non viene rifratto e si ha solo il raggio riflesso. DIFFUSIONE OTTICA: La diffusione ottica è uno dei fenomeni di interazione radiazione-materia. Si riferisce alla dispersione della luce da parte di oggetti più o meno microscopici come le particelle colloidali in liquidi o i solidi polverizzati o il pulviscolo o le molecole dell'atmosfera. La diffusione può presentarsi anche insieme alla riflessione, se le scabrosità della superficie non sono trascurabili rispetto alla λ della luce incidente, in questo caso si parla di riflessione diffusa. In base alle dimensioni delle particelle incontrate si possono avere differenti tipi di diffusione, p.es.: Diffusione di Rayleigh : se le particelle hanno dimensioni molto più piccole (< 1/10) della λ della luce incidente la diffusione e isotropa (avviene con uguale intensità in tutte le direzioni). L'intensità della luce diffusa e proporzionale alla quarta potenza della frequenza della radiazione le frequenze maggiori sono diffuse con maggiore efficienza, e questo il motivo per cui il cielo appare azzurro. Diffusione di Mie : se le particelle hanno dimensioni > 1/10 della λ della luce incidente la diffusione dipende di meno dalla lunghezza d'onda. Le goccioline d'acqua diffondono tutte le lunghezze d'onda della luce visibile con intensità circa uguale e le nuvole e la nebbia quindi appaiono bianche o grigie. Diffusione (o effetto) di Tyndall : quando un raggio di luce attraversa un liquido puro o una soluzione vera il suo percorso non è visibile lateralmente perché le particelle in soluzione sono troppo piccole per diffondere la luce. Nei sistemi colloidali invece le dimensioni delle particelle sono in grado di diffonderla per cui il suo percorso è visibile lateralmente (questa è la ragione per cui, per esempio, il latte si mostra torbido e biancastro). INGRANDIMENTO E MICROSCOPIO OTTICO La visione distinta di un oggetto richiede la formazione di una immagine nitida sulla retina (delicato strato di fibre nervose) dell’occhio umano, successivamente trasferita attraverso il nervo ottico al cervello. Il cristallino ha le proprietà di una lente convergente in grado di modificare la sua forma e quindi la sua distanza focale (intervallo di spazio in cui è’ possibile la messa a fuoco). L’elasticità del cristallino consente all’occhio normale di “riarrangiarsi” per una visione distinta a tutte le distanze comprese tra un minimo di 250 mm (punto prossimo) e l’infinito (punto remoto). LENTI: Una lente sferica è un corpo trasparente delimitato da due superfici sferiche, che produce immagini ingrandite o rimpicciolite degli oggetti. Le lenti convergenti sono più spesse al centro che ai bordi. Fanno convergere in un punto (fuoco) un fascio di raggi paralleli all’asse ottico. Le lenti divergenti sono più spesse ai bordi che al centro. Fanno divergere da un punto (fuoco) un fascio di raggi paralleli all’asse ottico. L’ asse ottico è la retta che congiunge i centri delle due superfici sferiche che delimitano la lente. Il centro O è il punto dell’asse ottico che divide a metà lo spessore della lente. La distanza focale f è la distanza tra il fuoco F e il centro O. Nella trattazione delle lenti si fa riferimento a lenti sferiche il cui spessore è così piccolo da risultare trascurabile rispetto a grandezze quali il raggio di curvatura e la distanza focale. Le lenti con tali caratteristiche sono dette lenti sottili.
la luce è poi raccolta dall’obiettivo l’obiettivo insieme alle lenti posti nel tubo, focalizzano l’immagine del campione a livello del diaframma dell’oculare l’immagine è poi vista dall’osservatore come se essa è posizionata a 250 mm dall’occhio L’immagine non deve essere solamente ingrandita ma deve essere anche chiara. PROFONDITÀ DI CAMPO: distanza sull’asse verticale tra il piano più vicino e quello più lontano di un oggetto che appaiono simultanea a fuoco nell’immagine osservata. Profondità di campo = λ/NA2 + (n/M x NA) e dove: λ = lunghezza d’onda NA = apertura numerica n = indice di rifrazione M = ingrandimento laterale e = capacità di risoluzione del detector RISOLUZIONE E APERTURA NUMERICA: quando la luce dai vari punti del campione passa attraverso l’obiettivo, questi punti sono visti nell’immagine come piccoli dischi e non punti. Questo è causato dalla diffrazione e diffusione della luce. Tali dischi sul piano dell’immagine, consistono di piccoli cerchi concentrici luminosi e bui. Più piccoli sono questi dischi, meno si sovrappongono e maggiore saranno i dettagli dell’immagine. La capacità di distinguere chiaramente i dettagli più minuti del campione è conosciuta con il nome di potere di risoluzione. Il potere risolvente del microscopio è misurato dalla minima distanza che separa due punti o due linee vicine ma ancora distinguibili. Se si riduce l’apertura del diaframma di apertura del condensatore, il contrasto aumenta ma diminuisce il potere risolvente. Comunemente si trova un compromesso fra i due estremi. La capacità di un obiettivo di comprendere i vari raggi della luce provenienti da ciascuna parte illuminata del campione, è direttamente relativa all’apertura angolare dell’obiettivo apertura numerica = n * sin μ dove: n= indice di rifrazione del materiale presente nello spazio tra il campione e la lente frontale μ= grado di apertura angolare dell’obiettivo L’apertura numerica del microscopio è data da quella dell’obiettivo più quella del condensatore. I dettagli dell’immagine possono essere rilevati anche con obiettivi di bassa apertura numerica. Infatti, gli obiettivi a bassa apertura numerica hanno una maggiore profondità di campo e quindi una maggiore distanza tra l’obiettivo e il campione rispetto agli obiettivi di alta apertura numerica. ABERRAZIONE CROMATICA: luce di lunghezza d’onda diversa è focalizzata su piani diversi. Il risultato è una immagine in cui i componenti cromatici diversi hanno un piano focale leggermente sfasato fra loro. CORREZIONE ABERRAZIONE CROMATICA: i principali colori sono proiettati in un unico punto di focalizzazione. ABERRAZIONE SFERICA: i raggi luminosi provenienti da punti diversi della superficie della lente sono focalizzati su piani diversi. Il risultato è un’immagine distorta.
CORREZIONE ABERRAZIONE SFERICA: i raggi di luce che passano in posizioni diverse attraverso la lente sono proiettati in un punto di focalizzazione. ABERRAZIONE CURVATURA DI CAMPO: l’immagine di un oggetto piano si forma su una superficie curva (Superficie di Petzval). Il risultato è una immagine non perfettamente a fuoco nelle sue parti. Rappresentazione schematica di un microscopio ottico composto monoculare del tipo più semplice: la messa a fuoco si attua spostando il tubo ottico. A – oculare B – obiettivo C – preparato D – condensatore E – tavolino portaoggetti F – specchio COMPONENTI OTTICI DI UN MICROSCOPIO: OBIETTIVO: l’obiettivo è il più importante componente ottico del microscopio ed è costituito da una serie di lenti: la sua funzione di base è acquisire la luce che passa attraverso il campione e proiettare un’immagine invertita del campione nel corpo del microscopio. Dovrebbe avere la capacità di ricostruire i vari punti del campione in corrispondenti punti dell’immagine chiamati “anti punti” (disco circolare di diametro definito). Deve essere costruito in modo tale che possa focalizzare ad una distanza più vicina possibile al campione e quindi proiettare un’immagine ingrandita nel microscopio. Dovrebbe avere la parte frontale della lente ritraibile in modo da proteggerla nel caso in cui l’obiettivo richiede di focalizzare molto vicino al campione. Tipi di obiettivi:
Acromatico meno costoso sono corretti cromaticamente per la luce blu e rossa sono corretti per le aberrazioni sferiche per il colore verde migliori risultati sono ottenuti con luce che passa attraverso un filtro verde e con immagini in bianco e nero
Fluorite più costoso dell’acromatico sono corretti cromaticamente per la luce blu, rossa ed anche verde sono corretti per le aberrazioni sferiche per il blu ed il rosso sono utili per la fotomicrografia a colori
INGRANDIMENTO:
rapporto tra le dimensioni dell’oggetto reale e quelle dell’immagine ottenuta: MA = Ma X Mb dove: Ma = ingrandimento obiettivo Mb = ingrandimento oculare Ma = d/f Con d = lunghezza ottica del tubo F= lunghezza focale DIGITAL IMAGING: Charge-coupled devices (CCDs) è un circuito integrato in base di silicone consistente in una matrice densa di fotodiodi in grado di convertire l’energia luminosa (fotoni) in cariche elettriche. Gli elettroni generati vengono immagazzinati in una buca di potenziale e successivamente trasferiti ad un amplificatore. Three-pass sequential color CCD imaging systems employ a rotating color wheel to capture three successive exposures in order to obtain the desired RGB (red, green, and blue) color characteristics of a digital image. The major advantage of this technique is the ability to fully utilize the entire pixel array of a CCD imaging chip, by using one pass for each color. TIPI di ILLUMINAZIONE: Illuminazione critica: l’immagine della sorgente luminosa (filamento) è focalizzata sul piano dell’oggetto. Fornisce una illuminazione molto intensa ma disomogenea. Illuminazione Kohler: l’immagine della sorgente è ingrandita mediante una lente (collettore) posta tra la sorgente e il condensatore e focalizzata sul diaframma d’apertura del condensatore così da produrre un fascio di luce parallelo e sfocato sul piano dell’oggetto. Fornisce una illuminazione meno intensa ma più omogenea. SISTEMA DI ILLUMINAZIONE KOHLER: inizialmente, la sorgente di luce era costituita dalla luce solare mentre successivamente sono state adottate delle lampade elettriche di vario tipo. Queste sorgenti luce erano focalizzate direttamente sul campione mediante un condensatore. Il problema principale era la scarsa uniformità di illuminazione determinata da: limitata dimensione della sorgente di luce (poca luce) l’immagine della luce era inopportunamente sovrapposta sull’immagine del campione. Nei primi anni del 1900, August Kohler progettò un sistema di illuminazione (Illuminazione Koehler) che superò tali problemi: Metodo: una lente (collector lens) è posta di fronte alla sorgente di illuminazione e proietta un’immagine allargata della luce verso il diaframma di apertura del condensatore. Poiché la luce è focalizzata di fronte al piano focale del condensatore, la luce emergente attraversa il campione per raggi paralleli e poiché la luce non è focalizzata sul piano del campione, essa si presenta estesa e non sgranata. La regolazione del diaframma di apertura del condensatore controlla l’angolo del cono di luce che raggiunge il campione. Un secondo diaframma (diaframma di campo) invece controlla il diametro (e non l’angolo) della luce che attraversa il campione. Manipolando questi due diaframmi si raggiunge il miglior compromesso tra risoluzione e contrasto
Procedura per settare l’illuminazione di Koehler: accendere la lampada del microscopio, aprire totalmente entrambi i diaframmi (diaframma di apertura e diaframma di campo) ruotare il portaobiettivi per portare l’obiettivo 10X sulla il percorso della luce. porre il campione sulla piastra e focalizzare mediante le viti chiudere totalmente il diaframma di campo. Quindi, salire il condensatore e focalizzare l’immagine del diaframma di campo (forma poligono) su quella del campione. Se l’immagine del diaframma di campo non è centrata, usa le manopole del condensatore per centrarla. Poi aprire il diaframma di campo fino alla sua scomparsa dalla vista tirare fuori un oculare e guardare dentro il tubo. Nel guardare, aprire e chiudere il diaframma di apertura del condensatore ed aggiustare la sua apertura che sia aperta di 2/3 o ¾ (miglior compromesso tra risoluzione e contrasto). Quindi riporre l’oculare osservare i suddetti steps ogniqualvolta si cambia l’obiettivo Procedura per focalizzare il microscopio: accendere la lampada e settare l’intensità di luce per un’osservazione confortevole guardando attraverso l’oculare, afferrare i due tubi con le mani ed avvicinarli o allontanarli fino a che si osserva un solo cerchio di visione porre un vetrino con il campione sulla piastra ed aumentare o diminuire l’altezza della piastra utilizzando la vite macrometrica. Portare a fuoco e quindi utilizzare la vite micrometrica per una perfetta messa a fuoco se si desidera utilizzare un altro obiettivo, la nuova messa a fuoco sarà eseguita solamente con la vite micrometrica. I DIVERSI TIPI DI MICROSCOPIO: MICROSCOPIO OTTICO Il microscopio ottico è il più semplice. Per mezzo di lenti ingrandisce l'immagine del campione, illuminato con luce nell'intervallo spettrale del visibile. Può essere semplice (un solo sistema di lenti o addirittura una sola lente) o composto (almeno due sistemi, oculare ed obiettivo), e l'illuminazione può raggiungere il campione da dietro, attraversandolo (luce trasmessa), o esserne riflessa (luce riflessa). Il microscopio ottico permette di avere immagini di soggetti dimensionalmente collocati all'incirca tra il millimetro ed il micrometro, anche di esseri viventi. I primi esempi di ingrandimento ottico datano migliaia di anni e risalgono alle civiltà mesopotamiche. Nel 1648 Antoni van Leeuwenhoek osservò e descrisse numerosi microorganismi, utilizzando un microscopio semplice, inizialmente dotato di pochi ingrandimenti e poi perfezionato fino a raggiungerne alcune centinaia (275 accertati, 500 ipotizzati). Nel 1665 Robert Hooke, utilizzando una forma molto rudimentale di microscopio ottico composto, con un limitato potere di ingrandimento ed osservando il sughero vide e descrisse per la prima volta la struttura cellulare propria di tutti i viventi. MICROSCOPIO SEMPLICE A LUCE TRASMESSA: come nei primi esemplari di van Leeuwenhoek si tratta di una semplice lente o sistema di lenti (un doppietto frequentemente) con una serie di supporti per il campione ed un sistema elementare di spostamento dell'ottica per la messa a fuoco. MICROSCOPIO SEMPLICE A LUCE RIFLESSA: come il precedente, l'illuminazione in questo caso è frontale o laterale, il caso tipico è la lente contafili in uso in filatelia e nel controllo dei filati dell'industria tessile.
dovuto alla porzione di luce che attraversa il campione, andandosi a ricombinare con la luce non rifratta renderà visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo. In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua, tuttavia vediamo che le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule mantenute in vita in apposite colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. La tecnica in questione fu messa a punto dal fisico olandese Frederik Zernike (Frits Zernike) negli anni '50 e gli valse il Premio Nobel per la fisica nel 1953. MICROSCOPIO A CONTRASTO INFERENZIALE: analogamente al contrasto di fase è utilizzato per osservare strutture trasparenti non altrimenti visibili in campo chiaro. Combina effetti di interferenza e di polarizzazione e fornisce immagini più contrastate e con un effetto di tipo tridimensionale. Questo metodo di contrasto è conosciuto anche con il nome di "DIC" (differential interference contrast). Una delle due tecnologie più utilizzate è la Nomarski, dal nome dell'inventore della configurazione ottica che si ritrova in diffusi microscopi odierni a contrasto interferenziale. MICROSCOPIO AD INTERFERENZA: si attua con due treni di onde completamente separate e tramite due diversi percorsi ottici: uno attraversa il preparato che lo sfasa, indi si incontra con il secondo non sfasato, dando luogo a fenomeni di interferenza. Queste forniscono notizie utili, anche quantitative, sui componenti presenti nel campione. MICROSCOPIO POLARIZZATORE: il microscopio polarizzatore sfrutta un fascio di luce polarizzata di dato orientamento che attraversa il corpo del preparato, posto su un tavolino rotante, per venire poi analizzato da un secondo filtro polarizzatore, anch'esso orientabile e in genere posto sul piano posteriore dell'obiettivo. Questo tipo di microscopio è molto utilizzato in petrografia, cioè nello studio delle rocce e dei minerali che le compongono. La microscopia in luce polarizzata utilizza onde ciascuna delle quali oscilla in un piano, detto piano di vibrazione o piano di polarizzazione che è perpendicolare alla direzione di propagazione dell’onda stessa. In un raggio di luce normale le onde oscillano in tutti i possibili piani. Definiamo polarizzato un raggio di luce formato da onde i cui piani di vibrazione sono tutti orientati in un’unica direzione, sono cioè paralleli fra loro. ULTRAMICROSCOPIO: l'ultramicroscopio ed il microscopio in campo oscuro, sono microscopi ottici con un condensatore paraboloide, con pareti a specchio, o comunque munito di uno schermo anulare che ferma i raggi che illuminerebbero direttamente il preparato. Vengono raccolti dall'obiettivo solo i raggi che vengono opportunamente deviati (rifratti) oppure diffratti. La diffrazione (deviazione dei fotoni a onde decrescenti rispetto alla traiettoria principale) viene operata da particelle del preparato che abbiano dimensioni submicroscopiche comprese fra 0,1 micrometro e 1 nanometro, particelle che, pur sotto la soglia di risoluzione del microscopio, appariranno come punti luminosi su sfondo buio, senza dettagli morfologici (effetto Tyndall).
MICROSCOPIO CONFOCALE:
il microscopio confocale si basa su una tecnologia ottica volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato. Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante (Nipkow disk), Programmable Array Microscopes (PAM), e laser. Quest'ultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di confocal laser scanning microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo. La sua sorgente luminosa è costituita uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza d'eccitazione. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare in diversi colori diverse molecole presenti nel preparato, permettendone di apprezzarne la tridimensionalità (esempio actina in rosso tubulina del citoscheletro in verde e DNA del nucleo in blu). MICROSCOPIO A 2 FOTONI: due fotoni di bassa energia assorbiti in contemporanea da una molecola provocano il passaggio allo stato eccitato, analogamente all’assorbimento di un solo fotone di energia doppia. Esempio: l’assorbimento simultaneo di due fotoni nel rosso equivale all’assorbimento di un fotone nel blu. Nel microscopio a fluorescenza convenzionale (epifluorescenza o confocale) si ha un'eccitazione ad 1 fotone: un fotone colpisce il fluoroforo, questo passa direttamente allo stato eccitato e quindi torna allo stato fondamentale emettendo fluorescenza. Nell'eccitazione a 2 fotoni si colpisce il fluoroforo con luce di lunghezza d'onda maggiore (energia più bassa) che non ha energia sufficiente a farlo arrivare allo stato eccitato, ma lo fa andare in uno stato "virtuale" fra i due livelli. Se in un tempo molto breve (10-12 sec) un altro fotone di bassa energia colpisce il fluoroforo che si trova nello stato «virtuale», questo passa allo stato eccitato (le energie dei due fotoni si sommano). L'utilizzo di speciali laser che emettono impulsi di luce di breve durata riesce a far sì che il laser ecciti le molecole di fluoroforo solo in un punto e solo nel piano di fuoco. Questo perché, anche se le molecole di piani fuori fuoco possono essere colpite da un primo fotone, la probabilità che vengano colpite da un secondo fotone è praticamente nulla, in quanto la densità di fotoni al di fuori del piano focale è troppo bassa perché ciò accada. In questo modo si ottiene la fluorescenza solo dalle molecole che si trovano sul piano focale. Confronto microscopia confocale (MC) / microscopia a due fotoni (M2F): MC opera sulla configurazione dello strumento per eliminare tutti i fotoni di fluorescenza che non provengono dallo stesso piano focale. M2F eccita (e quindi ottiene fotoni di fluorescenza) solo le molecole che si trovano sul piano focale. MICROSCOPIA A FORZA ATOMICA: Il microscopio a forza atomica (AFM) è un microscopio a scansione di sonda realizzato per la prima volta nel 1986 e attualmente in commercio. Consiste di una micro-leva (cantilever) alla cui estremità è montata una punta acuminata (generalmente di silicio) che viene posizionata in stretta prossimità della superficie del campione da analizzare. Un sistema motorizzato provvede a muovere il campione. Le forze di Van der Walls che agiscono tra la punta e il campione provocano una deflessione della micro-leva. L’entità della deflessione viene valutata attraverso un sistema di rilevazione laser o con sistemi piezoelettrici e riproduce a risoluzione elevatissima (dell’ordine della decina di A°) la superficie in esame. La AFM fornisce indicazioni solo sulle caratteristiche del campione. La limitazione della tecnica consiste nel fatto che può analizzare solo superfici con area molto piccola (0.1mmX0.1mm).
