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LEZIONE 7 PROBE MITOCONDRIALI E SENSORI METABOLICI
I mitocondri sono organelli cellulari essenziali per la sopravvivenza degli organismi cellulari eucariotici. Sono infatti: 1) i principali produttori di ATP, 2) i regolatori dell'omeostasi ionica e dello stato ossidativo cellulare e 3) sono produttori di radicali liberi (ROS). I mitocondri sono, inoltre, direttamente coinvolti nel trasporto di metaboliti e proteine, nel metabolismo dei lipidi e degli aminoacidi. Questi organelli sono coinvolti nel mantenimento della vitalità, ma svolgono anche un ruolo centrale nella regolazione della morte cellulare programmata, l’apoptosi. Esiste un legame evidente tra disfunzione mitocondriale e un gran numero di malattie. La maggior parte dei sistemi dipendenti dall'energia, come i muscoli scheletrici e cardiaci, il sistema nervoso e i sistemi renale ed endocrino, sono frequentemente affetti da patologie connesse con un malfunzionamento mitocondriale. In questo contesto, la valutazione della struttura, del numero e della funzionalità dei mitocondri è cruciale. La morfologia dei mitocondri varia a seconda del tipo e dell'attività cellulare. Nella maggior parte delle linee cellulari, i mitocondri sono organizzati in una rete dinamica con una struttura multi-ramificata. Durante la divisione delle cellule, l'organello può passare dalla morfologia ramificata a quella frammentata. Mitocondri con struttura ramificata Mitocondri con struttura frammentata
Mitotrackers- Traccianti mitocondriali Alcuni dei coloranti specifici dei mitocondri sono considerati coloranti "tracer” perché sono solo in grado di colorare i mitocondri indipendentemente dal loro stato di attività. Essendo i mitocondri organelli membranosi alcuni tracers specifici per i mitocondri sfruttano la presenza nei mitocondri di uno specifico lipide: la cardiolipina. È costituito da due fosfolipidi tenuti insieme da una molecola di glicerolo. Ne risulta un lipide complesso con 4 code e tre teste. Il Nonil Arancio di Acridine (NAO) ed il DiOC6 sono probe con una grande affinità per la cardiolipina. È probabilmente la loro lunga catena idrocarburica ad attribuire a questi due coloranti la loro affinità per I mitocondri. Acridinium, 3,6-bis(dimethylamino)- 10 - nonyl-, bromide
Mitosensor Questa serie di coloranti fluorescenti si accumulerà nei mitocondri in funzione del potenziale di membrane di questi organelli. Si accumuleranno preferenzialmente in mitocondri di cellule sane, perché è in queste che i mitocondri saranno più attivi. Le pompe protoniche della catena di trasporto degli elettroni agiscono nel contesto della respirazione ossidativa, creando un potenziale di membrana mitocondriale o forza proton-motrice. I protoni vengono pompati dalla matrice allo spazio intermembrana, creando un incremento sostanziale del pH e un gradiente elettrico in corrispondenza della membrana interna mitocondriale. I protoni rientrano in seguito nella matrice tramite l'ATPasi, guidando la sintesi dell'ATP. Il gradiente protonico è di circa - 180 mV ed è dovuto ad un potenziale di membrana (m) di - 150 mV e una variazione di pH di + 0,5 U. La distribuzione del colorante mitocondriale è governata dall'equazione di Nernst: 𝑉 =
ln
Dove V è il potenziale di membrana, R è la costante dei gas ideali, T è la temperatura assoluta, F è la costante di Faraday e Ci ed Co sono le concentrazioni di colorante interno ed esterno alla cellula. Considerando il potenziale nel mezzo extracellulare pari a 0 mV e che il potenziale di membrana della membrana cellulare plasmatica è di - 60 mV, tale differenza comporterà un accumulo di dieci volte della sonda cationica nel citosol. Considerando che il potenziale mitocondriale è di - 180 mV questo causerà un accumulo di 10.000 volte del probe in questi organelli.
La tetrametilrodamina metilestere perclorato è uno di quei coloranti che si accumulerà nei mitocondri in funziona del potenziale di membrana.
Rilevazione di specie reattive dell'ossigeno Le specie reattive dell’Ossigeno sono metaboliti cellulari fisiologici per la cellula. Sono generati continuamente e sono essenziali per la vita. I ROS svolgono ruoli cruciali nell'attivazione genica, nella crescita cellulare e nelle reazioni metabolica e sono componenti principali della difesa contro batteri e virus. Tuttavia, quando i ROS vengono prodotti in eccesso o quando il pool di antiossidanti cellulari viene esaurito, queste specie reattive causano stress ossidativo, causando danni cellulari che possono essere irreversibili. Essendo i principali produttori di radicali liberi nella maggior parte delle cellule, i mitocondri svolgono un ruolo chiave in diverse patologie che coinvolgono lo stress ossidativo (p. Es., Diabete, invecchiamento, apoptosi, cancro e malattie neurodegenerative). Il principale sito di produzione dei ROS è la catena di trasporto degli elettroni. In seguito ad invecchiamento cellulare o a danni ad uno dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, questi ultimi non fluiscono in maniera ottimale verso il complesso IV. Si accumuleranno invece nel Complesso I a nel complesso III. L’Ossigeno molecolare verrà dunque ridotto in corrispondenza di questi due siti anomali e si ridurrà solo parzialmente, generando i ROS. Questo è il motivo per cui tra le sostanze più nocive per il nostro corpo troviamo gli inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni come il Rotenone, l’antimycine A. La Figura mostra le diverse specie di radicali. Hanno emivita breve in quanto vengono catturati e disattivati dai diversi sistemi antiossidanti presenti all’interno della cellula. In assenza di questi sistemi di protezione i radicali interagiscono chimicamente con lipidi, proteine ed acidi nucleici.
Le sonde fluorescenti redox dipendenti sono eccellenti indicatori di ROS. Sono razionalmente molto simili ai sensor mitocondriali ma sono privi della porzione cationica che li fa indirizzare al mitocondrio. Le sonde fluorescenti Dichloro-di-idrofluoresceina H2 (DCFH-DA) diventa fluorescente solo a seguito di ossidazione da parte di ROS. Presenta due funzioni acetato alle estremità che hanno la funzione di aumentarne la lipofilicità. Nel citoplasma la funzione acetato viene de-acetilata dalla esterasi cellulari ad ossidrile, una forma impermeabile alle membrane e che quindi viene intrappolata. In presenza di ROS la molecola viene ossidata e diventa fluorescente. DCFH-DA colora due tipi strutture cellulari, il citoplasma ed i perossisomi (gli organelli responsabili della riduzione dei perossidi e dei radicali in acqua).
Una ditta ti chiede ti testare i seguenti farmaci stimolatore mitocondriali. Dovrebbero aumentare la attività della catena di trasporto degli elettroni. Esegui un esperimento in cui tratti cellule epatiche con diverse dosi dei diversi farmaci. Marchi le cellule con un Mitosensor che emette a 650 nm. Nella tabella trovi le intensità di Fluorescenza che registri. Calcola a quali dosi i farmaci funzionano meglio. Sapendo che all’esterno della cellule il potenziale è 0 mV, di quanti mV è cambiato il potenziale di membrana alla dose di farmaco attiva? Dose log[M] Composto A Composto B Composto C Composto D Composto E
- 11,00 37,02 37,00 56,44 215,45 37, - 10,00 37,20 37,00 55,45 1018,50 37, - 9,00 38,96 37,02 10,50 1821,55 37, - 8,00 56,44 37,20 182,55 1980,56 37, - 7,00 215,45 38,96 100,56 1998,04 37, - 6,00 1018,50 56,44 198,04 1999,80 38, - 5,00 1821,55 215,45 199,80 1999,98 56, - 4,00 1980,56 1018,50 199,98 2000,00 215, - 3,00 1998,04 1821,55 200,00 2000,00 1018,
