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Chimica e propedeutica Biochimica - modulo 2
Amminoacidi
Amminoacidi
Gli amminoacidi sono le unità monomeriche delle proteine. Tutti gli aminoacidi presentano un gruppo amminico -NH2 e un gruppo carbossilico -COOH , entrambi legati a un carbonio centrale detto carbonio α. Si parla infatti di α-amminoacidi anche se, in forma molto più rara, esistono in natura altri tipi di amminoacidi. Il carbonio centrale dell’amminoacido, oltre a legare un gruppo amminico -NH2 e un gruppo carbossilico -COOH, interagisce con un atomo di idrogeno H e con una catena laterale (o residuo) R, porzione caratterizzante per ogni amminoacido, poichè ognuno ne presenta una diversa. Le prorietà della catena laterale di un amminoacido ne determinano le caratteristiche chimico-fisiche. Normalmente, la forma neutra dell’amminoacido non esiste in natura, perchè a pH fisiologico l’amminoacido si trova nella sua forma che presenta una carica positiva sul gruppo amminico e una carica negativa sul gruppo carbossilico. COOH è un acido relativamente forte che si deprotona (perde l’atomo di H in forma H+), a dare la base coniugata COO-. Mentre NH2 è una base abbastanza forte che si protona (acquista un atomo di H in forma H+) formando l’acido coniugato, NH3+. Il caso appena analizzato è quello della forma zwitterionica (dal tedesco zwitter , che significa “entrambi”), cioè la forma in cui entrambi gli ioni (negativo e positivo) sono presenti sulla stessa configurazione. I venti amminoacidi si dividono in:
- non essenziali -> sono 11 e vengono sintetizzati dalle nostre cellule
- essenziali -> sono 9, non possono essere sintetizzati e devono essere assunti con la dieta Tutti e venti gli amminoacidi sono solubili in acqua e la loro solubilità varia in base alle caratteristiche delle diverse catene laterali. Allo stesso tempo sono poco solubili nei solvente organici dal momento che presentano le cariche (COO-, NH3+). Gli amminoacidi possono essere separati da una miscela in base alle loro proprietà acido/base per mezzo dell’ elettroforesi. Questo metodo si basa sulla mobilità degli ioni nel campo elettrico. Le molecole cariche positivamente (cationi) migrano verso l’elettrodo carico negativamente (catodo). Mentre le moleocle cariche negativamente (anioni) migrano verso l’elettrodo carico
positivamente (anodo). Inoltre ioni con massa minore si muovono più velocemente di ioni con massa maggiore. Es. La goccia contiene solo due amminoacidi, glicina e cisteina. Imponiamo come pH della soluzione 5.5 (relativamente acido). Sappiamo dalle curve di titolazione che la glicina ha un punto isoelettrico = 6 quindi in questo pH (inferiore al punto isoelettrico) è carica positivamente. Mentre la cisteina ha pI = 5 e quindi in questo pH (maggiore del punto isoelettrico) la cisteina è carica negativamente. Perciò la cisteina va verso l’elettrodo positivo mentre la glicina verso l’elettrodo negativo. Domanda esame -> se invece il pH = 7 Glicina (PI=6) è carica negativamente Cisteina (PI=5) è carica negativamente Perciò migrano verso l’elettrodo di destra. La glicina si muove più velocemente perchè ha una massa minore della cisteina. Domanda esame -> comportamento di un amminoacido in soluzione acquosa
Reazioni degli amminoacidi
Gli amminoacidi sono reattivi. I gruppi funzionali NH2 e COOH possono reagire. Allo stesso tempo le catene laterali degli amminoacidi non polari possono contenere gruppi funzionali inerti. Mentre le catene laterali di altri amminoacidi possono contenere gruppi funzionali reattivi.
- Acetilazione Le proteine dei cromosomi possono essere regolate tramite l’acetilazione della lisina. - Idrossilazione dei residui di prolina La prolina può essere idrossilata. La malattia dello scorbuto è causata da una carenza di idrossilazione della prolina in una specifica proteina. - Ossidazione di residui di cisteina Importante per la formazione dei ponti di solfuro, che servono a stabilizzare la struttura di una proteina.
Questa reazione da sinistra a destra è un’ossidazione mnetre da destra a sinistra è una riduzione. L’ambiente intracellulare (citosolico) è fortemente riducente ed è essenzialmente per mantenere la funzionalità delle proteine. Perciò se vedo una proteina che presenta anche solo un ponte disolfuro capisco che questa proteina vive nell’ambiente extracellulare ossidante. Mentre tutte quelle che vivono nell’ambiente intracellulare non possono fare ponti disolfuro. Alcuni amminoacidi o loro derivati sono potenti agenti biologici, che agiscono come neurotrasmettitore e come ormoni:
- Dal Glutammato -> GABA
- (^) Dall’Istidina -> istamina
- (^) Dal Triptofano -> serotonina
- (^) Dalla Tirosina -> Adrenalina (o epinefrina) Chimica e propedeutica Biochimica - modulo 2
Il legame peptidico e la struttura delle
proteine
Legame peptidico
Le proteine sono sequenze lineari dei 20 L-alfa-amminoacidi. Il legame peptidico è un legame forte che unisce un amminoacido al seguente in modo ordinato e sempre e solo lineare. Il legame peptidico è una reazione di condensazione tra il gruppo amminico di un amminoacido e il gruppo carbossilico dell’amminoacido adiacente con l’allontanamento di una molecola d’acqua. Questa reazione porta alla formazione di un dipeptide (due amminoacidi). Quello che rimane dell’amminoacido dopo la reazione non è più un amminoacido ma è detto residuo amminoacidico.
legame doppio e di conseguenza non può ruotare liberamente. Se fosse singolo non sarebbe planare ma potrebbe ruotare. Perciò nella maggior parte del tempo è doppio e non può ruotare, se per una frazione di secondo si trasforma in singolo può ruotare al massimo di 180°.
- (^) Conformazione Cis e Trans -> Nella conformazione Trans (la più comune) due carbonio alfa consecutivi dispongono la catene laterali su emispazi opposti. Mentre nella conformazione Cis le due catene laterali sono sullo stesso emispazio. La conformaizone trans è la più comune perchè riduce le interazioni steriche. La Cis può avvenire in alcuni casi, come ad esempio nel caso i due residui siano delle glicine, dal momento che sono molto piccoli. Anche nel caso in cui il residuo seguente è una prolina è favorita la conformazione Cis. Un altro modo di rappresentare la catena polipeptidica è questo: La catena principale è una sequenza monotona di N, C-alfa, C (carbonilico). I residui sono tutti in conformazione Trans. L’unica possibilità di rotazione avviene attorno ai singoli legami C-alfa—C carbonilico (angolo di rotazione Psi) e C-alfa —N (angolo di rotazione Phi). La rotazione attorno a questi legami da luogo al folding delle proteine. Ogni C-alfa ha associati due angoli: Phi e Psi
Ogni due C-alfa consecutivi è presente un piano che non è mai coplanare al piano che si forma nei C-alfa seguenti. Questi due piani sono collegati da un C-alfa, ma ogni C-alfa ha una coppia di angoli di rotazione collegati, perciò i due piani possono ruotare. Questo è il principio di folding delle proteine, in cui si passa da una catena lineare ad una proteina arrotolata. Il grafico di Ramachandram rappresenta le coppie di angoli di rotazione (Phi e Psi) che effettivamente si possono trovare in natura.
Peptidi
Sono molecole di peso fino a 5000 Dalton costituiti da una catena lunga fino ad alcune decine di amminoacidi uniti da legami peptidici. I peptidi possono essere:
- Ormoni Come insulina e glucagone che agiscono in ambiente extracellulare. - Veleni Il mastoparan è una tossina peptidica che si trova nel veleno delle vespe. - Neurotrasmettitori Come le endorfine. - Antibiotici Come la gramicidina. È uno dei rarissimi casi in cui sono presenti i D-amminoacidi. - Sviluppo di patologie Si formano dei peptidi che tendono ad aggregare e causare l’Alzheimer
trovano. La reattività dei gruppi è importante per la funzione che deve svolgere una certa proteina (es. Enzimi). Inoltre le proteine possono formare complessi proteici , associandosi con altre proteine, per svolgere una funzione. Infine le proteine, nonostante abbiano una struttura stabile, sono caratterizzate da una flessibilità strutturale che è fondamentale per la funzione da svolgere. Quando una proteina ha un folding corretto (stabile e flessibile) prende il nome di struttura nativa. Al contrario se viene srotolata si dice che la proteina è denaturata. La sequenza primaria guida il folding della proteina. Quando la proteina è denaturata è instabile mentre nella sua struttura nativa ha un minimo di energia libera. La struttura delle proteine può essere: -primaria -secondaria -terziaria -quaternaria
Struttura primaria
Sequenza ordinata e lineare di residui amminoacidici. Si legge dell’ammino terminale (a sinistra) al carbossi-terminale (a destra). Questa struttura è detta anche sequenza proteica/polipeptidica. Le proteine solitamente iniziano sempre con una metionina.
Struttura secondaria
La struttura secondaria rappresenta il modo in cui parti di una proteina si ripiegano per formare elementi di struttura secondaria. Questa struttura è definita dalla coppia di angoli Psi e Phi. Nel grafico di Ramachandran le zone più scure corrispondono alle coppie di angoli Phi e Psi caratteristiche delle strutture secondarie più frequenti nelle proteine:
- alfa-elica -> A
- foglietto-beta -> B La strutture secondarie sono disposizioni regolari della catena principale, le catene laterali si dispongono a seguire. Inoltre sono stabilizzate da legami a ponte idrogeno fra il gruppo amminico e il gruppo carbonilico della catena principale.
La regolarità della conformazione di una struttura secondaria dipende quindi dalla regolarità della struttura atomica della catena principale e dai valori degli angoli Phi e Psi di ogni amminoacido, che si ripetono quasi costantemente all’interno di ogni elemento di struttura secondaria. Tre tipi fondamentali di strutture secondarie:
- Alfa-elica
- Foglietto beta
- Reverse turn -> non vengono ripetuti Le proteine possono avere forme molto diverse tra loro. Ad esempio gli enzimi sono proteine globulari e hanno una struttura compatta che può essere racchiusa all’interno di una sfera. Circa il 70-80% degli amminoacidi delle proteine globulari assume la conformazione regolare di uno dei 3 tipi di struttura secondaria. Il restante 20-30% è costituito da strutture non regolari che prendono il nome di random coil (porzione lunga) o loop (porzione breve) che sono spesso prive di legami idrogeno tra i residui amminoacidici che le compongono. Queste strutture servono a collegare tra loro strutture secondarie diverse, fanno da giunzione.
Alfa-elica
È stata scoperta da Linus Pauling. In questa struttura la catena principale si avvolge su se stessa in senso orario, mentre le catene laterali non contribuiscono alla struttura. La alfa-eliche sono strutture ripetitive caratterizzate dai seguenti parametri:
- passo (p) -> altezza di una spira = 5.4 A
- distanza (d) -> distanza tra 2 residui amminoacidici successivi = 1.5 A
- numero (n) -> numero di residui per spira = 3.6 residui Le coppie di angoli di torsione tipici di un Alfa-elica sono: -Phi = -60° -Psi = -50° I ponti idrogeno servono per stabilizzare la struttura dell’alfa-elica. Questi ponti si instaurano tra il gruppo CO di C-alfa x e il gruppo NH del C-alfa x+4 e sono ripetuti. Inoltre dal momento che la maggior parte dei polipeptidi sono costituiti da L-amminoacidi l’elica può solo essere destrogira. Esistono solo pochissime eliche levogire, molto corte (es. Glicina). Mentre catene laterali non contribuiscono alla formazione dell’alfa-elica e sono rivolte verso l’ esterno e verso l’ N terminale dell’elica perchè in questo modo si minimizzano gli ingombri sterici. Infine al centro dell’elica sono presenti gli atomi della catena principale
Questo andamento rappresentato è parallelo però è motlo più comune L’andamento antiparallelo in cui le catene vanno in direzioni opposte. La struttura antiparallela è più stabile di quella parallela. La struttura foglietto beta, rispetto all’alfa-elica, è molto meno compatta perchè le coppie di angoli danno al foglietto un andamento pieghettato. Se gli angoli Phi e Psi fossero piatti il foglietto sarebbe stirato. Alcuni foglietti beta sono così estesi da formare delle strutture di protezione o supporto molto resistenti, dette barilotti beta (beta-barrel). Hanno una struttura chiusa a cilindro. Es. La GFP (green fluorescent protein) è un barilotto beta. E formata da 11 filamenti beta messi sia in modo parallelo che antiparallelo a formare una struttura chiusa forma di cilindro.
Reverse turn
Servono a far cambiare la direzione di una catena polipeptidica di circa 180°. Si trovano in mezzo a strutture a alfa-elica o foglietti-beta. Ne esistono di diversi tipi:
- beta-turn -> costituita da 4 residui. Presenta sempre una prolina e una glicina e due amminoacidi
- gamma turn -> costituita da 3 residui. Presenta sempre una prolina e due amminoacidi Anche i reverse turn, come le altre due strutture secondarie, sono possibili grazie alla presenza di un ponte idrogeno tra il C=O di un C-alfa e l’N-H di un altro C-alfa.
Elementi di struttura secondaria possono combinarsi per formare strutture supersecondarie (o motivi):
- Motivo alfa Consiste in 2 alfa-eliche antiparallele collegata da un loop, detto alfa-hairpin - Beta-hairpin Consiste in due filamenti beta antiparalleli collegati da un loop. - Motivo beta-alfa-beta Consiste di due foglietti beta paralleli adiacenti, connessi da un’alfa elica che collega l’estremità C-terminale dal primo filamento beta con l’estremità N- terminale del secondo filamento beta. - Coiled-coil Motivo in cui due o più alfa-eliche sono avvolte insieme (eliche superavvolte) come i fili che compongono una corda. Un esempio è la alfa-cheratina (capelli). Anche la miosina ha un coiled-coil che finisce con una parte globulare che permette alla miosina di camminare sui filamenti di actina. - Tripla elica Consiste di tre eliche avvolte insieme. Un esempio è il collagene.
Al contrario la denaturazione di una proteina, ovvero il passaggio dalla forma nativa alla forma denaturata , avviene con una transizione rapida. Per la denaturazione si può utilizzare la temperatura o l’urea. La proteina ha una certa resistenza però oltre una certa soglia di temperatura o urea la transizione è rapida e la proteina si denatura. La struttura terziaria è stabile e dipende, oltre che da eventuali ponti disolfuro, da interazioni non covalenti:
- Legami idrogeno
- Legami ionici
- Legami idrofobici
- (^) Interazioni di Van Der Waals Le proteine globulari solubili, in ambiente acquoso, si ripiegano in strutture compatte con una parte centrale idrofobica e una superficie idrofilica (es. Mioglobina). La funzione di una proteina dipende dalla sua struttura terziaria. La mutazione nel gene che codifica una proteina può causare l’alterazione della struttura terziaria. La proteina mutata può perdere la sua funzione perchè non può raggiungere la destinazione appropriata (ambiente intracellulare o extracellulare). Le proteine mutate possono formare aggregati insolubili , dove le proteine si trovano in uno stato non funzionale. Ciò accade quando le parti idrofobiche che si trovano all’interno vengono messe sulla superficie, portando così alla formazione di strutture beta che rendono la proteina insolubile. Gli aggregati insolubili in cui prevalgono le strutture beta sono detti amiloidi. Al contrario se una proteine abbonda di alfa-eliche è solubile.
Struttura quaternaria
È riferita alla struttura di proteine composte da più catene polipeptidiche. Le subunità di una proteina con struttura quaternaria sono legate tra loro per mezzo di legami non covalenti o ponti di solfuro (ambiente extracellulare). Le strutture quaternarie sono dette:
- Omodimero -> 2 polipeptidi identici
- Eterodimero -> 2 polipeptidi diversi
- (^) Eterotrimero -> 3 polipeptidi diversi
- (^) Omotetramero -> 4 polipeptidi identici Es. L’immunoglobina è un eterotetramero perchè è costituita da 4 subunità polipeptidiche: 2 catene pesanti e 2 leggere tenute insieme da ponti disolfuro. Perciò è una proteina extracellulare. Anche l’ emoglobina è un eterotetramero perchè è costituita da quattro subunità: 2 catene alfa identiche e 2 catene beta identiche tenute insieme da interazioni non covalenti.
Classificazione delle proteine
La classificazione può essere fatta sulla base di diverse caratteristiche:
- Localizzazione
- ambiente cellulare -> in cui a sua volta può fare parte del citoplasma o essere nel nucleo.
- **ambiente extracellulare
- Composizione** Possono dividersi in:
- proteine semplici -> formate solo da amminoacidi
- proteine coniugate -> contengono, oltre agli amminoacidi, anche gruppi chimici diversi (es. Glicoproteine, emoproteine, lipoproteine, etc…). Se la parte non proteica è essenziale per la funzione della proteina, prende il nome di gruppo prostetico. Es. La mioglobina è un esempio di proteina coniugata ad un gruppo prostetico EME.
Emoglobina
L’ emoglobina è una proteina intracellulare situata nel citosol dei globuli rossi. L’emoglobina trasporta l’ossigeno, la CO2 e i protoni (H+) in tutto il corpo. È formata da 4 catene polipeptidiche e ha una struttura quaternaria che gli conferisce delle particolari caratteristiche. L’emoglobina è una proteina allosterica , infatti il legame dell’ossigeno è regolato da tre molecole: protoni, CO2 e fosfato inorganico. L’emoglobina è il trasportatore di ossigeno presente negli eritrociti. Ha una struttura a tetramero con 4 subunità molto simili tra loro. Una molecola di emoglobina corrisponde a 4 siti di legame con l’ossigeno. Esistono diverse forme di emoglobina nell’adulto e nel feto. L’emoglobina A, ovvero al principale nell’adulto è formata da:
- 2 catene alfa identiche -> alfa1 e alfa
- 2 catene beta identiche -> beta1 e beta La struttura primaria di queste catene, ovvero la loro sequenza amminoacidica, è molto diversa mentre la loro conformazione che è quella terziaria è simile tra catena alfa, catene beta e mioglobina. Le quattro catene sono organizzate in una struttura quaternaria precisa. Queste subunità sono ricche di alfa-eliche. Nella zona in cui è presente l’eme l’HIS 7 costringe l’ossigeno a legarsi al ferro in modo obliquo. Le 4 catene sono tenute insieme da legami deboli che mantengono la struttura stabile. Ciò vuol dire che sulla superficie della subunità esistono delle zone che tendono a cercare altre subunità, ogni alfa prende contato con le due beta e ogni beta prende contatto con le due alfa. Le catene dell’emoglobina hanno delle affinità tra loro. Differenze rispetto alla mioglobina :
- Cooperatività Il legame dell’ossigeno all’emoglobina favorisce il legame di altro ossigeno. Significa che se una subunità lega un primo ossigeno poi la seconda subunità sarà più favorita a legarne un altro e cosi via per la terza e la quarta. La saturazione indica quante molecole di emoglobina sono legate all’ossigeno. L’equazione della curva della mioglobina è:
Mentre l’equazione che descrive la curva dell’emoglobina è: n corrisponde al grado cooperatività del legame.
- pH L’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno dipende dal pH. Piccole variazioni di pH verso l’acidità abbassano l’affinità dell’ossigeno per l’emoglobina. - Trasporto Oltre all’ossigeno trasporta anche CO2 e protoni (H+). La CO2 che il corpo espelle deriva dall’ossidazione delle molecole degli alimenti che ingeriamo. - L’afffinità dell’emoglobina per l’ossigeno dipende anche da composti con gruppi fosforici La presenza all’interno degli eritrociti di gruppi fosforici risulta in un affinità più bassa dell’ossigeno per l’emoglobina rispetto alla mioglobina. Il bi-fosfo-glicerato si posiziona all’interno della nicchia centrale dell’emoglobina e abbassa l’affinità dell’emoglobina per O2. Inoltre l’ossigenazione provoca una rotazione di 15° nella struttura quaternaria dell’emoglobina:
- stato T -> forma deossigenata, bassa affinità per O
- stato R -> forma ossigenata, alta affinità per O Perciò l’emoglobina è allosterica perché il legame dell’ossigeno su una delle sue quattro subunità provoca un cambiamento di conformazione che modifica l’affinità delle altre subunità per l’O₂. In particolare, l’emoglobina può passare dallo stato T (teso, bassa affinità, tipico della forma deossigenata) allo stato R (rilassato, alta affinità, tipico della forma ossigenata). Quando si lega il primo O₂, la transizione verso lo stato R rende più facile il legame dei successivi, producendo cooperatività positiva e una curva di saturazione sigmoide. Inoltre, molecole come H⁺, CO₂ e 2,3-BPG agiscono da effettori allosterici stabilizzando lo stato T e favorendo il rilascio di ossigeno nei tessuti.
