Il DNA: struttura, sequenziamento e applicazioni, Sintesi del corso di Biologia, microbiologia e tecnologie di controllo ambientale

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BIOTECNOLOGIE

BIOLOGIA MOLECOLARE

INGEGNERIA GENETICA

Cantone Mariagabriella

Dal DNA alla decifrazione del genoma umano

Il DNA, acido deossiribonucleico, è dal punto di vista chimico un polimero, cioè un insieme di “mattoncini” detti monomeri, i deossiribonucleotidi, composti da tre soli ingredienti: uno zucchero detto deossiribosio, una sequenza di atomi detta gruppo fosfato, e una base azotata.

Le basi azotate che possono essere usate sono quattro:

A: adenina

C: citosina

T: timida

G: guaina

Il DNA ha la celebre forma di una doppia elica: i due filamenti sono associati tra loro e ogni base forma un legame con una base sul filamento opposto.

I legami non sono aleatori.

Le basi puriniche, cioè adenina e guanina, non si legano tra loro ma formano legami detti ad idrogeno con le basi pirimidiche, cioè citosina e timina. Precisamente la guanina lega solo la citosina e l’adenina solo la timina

I filamenti sono divisi e letti in triplette di nucleotidi; ad ogni tripletta corrisponde una determinata informazione per la sintesi delle proteine, che eseguono tutte le funzioni fondamentali delle cellule.

Questa particolare struttura permette al DNA di replicarsi (cioè duplicarsi) con relativa semplicità: le due eliche si separano gradualmente e su ciascuna può crescere un’altra elica, con la formazione, infine, di due doppie eliche uguali. La molecola di DNA nelle cellule eucariote in divisione si arrotola in modo estremamente complesso, anche con l’aiuto di proteine accessorie tra le quali gli istoni, per dare strutture bastoncellari dette cromosomi.

Il DNA controlla l’RNA, attraverso il quale presiede alla sintesi di tutte le proteine necessarie alla vita delle cellule e degli organismi.

Benché ogni essere umano sia portatore del medesimo corredo genetico, il DNA di ogni singola persona presenta mutazioni, e se queste differenze si verificano in un tratto di DNA particolarmente importante, vi può essere un’alterazione della normale attività biologica: è questo l’evento variamente designato come deficienza, difetto o malattia genetica.

Il DNA è stato l’affascinante obiettivo di uno storico piano internazionale di ricerca, il Progetto Genoma Umano. Suo scopo: mappare il genoma umano, ovvero stabilire la posizione dei geni nei 46 cromosomi che caratterizzano la specie umana. Studio che implica il sequenziamento del DNA, cioè la determinazione dell’esatto ordine dei 3 miliardi di coppie di basi azotate, dell’intera successione delle “lettere” che compongono il DNA. Ciò non significa capirne immediatamente il significato, ma è una tappa indispensabile per poterlo fare. Finalità strategica del Progetto è dunque la comprensione della funzione dei geni e delle malattie che possono derivare dalle loro alterazioni.

L’idea di mappare l’intero genoma umano fu lanciata negli anni Ottanta dal premio Nobel James Watson, scopritore, assieme a Francis Crick, della struttura a doppia elica del DNA. L’immane sforzo venne ufficialmente varato nel 1990, quando il Dipartimento dell’energia statunitense e i National Institutes of Health stabilirono un programma di ricerche che avrebbe dovuto portare, in 15 anni, alla decifrazione completa del DNA dell’uomo. A capo del Progetto Genoma fu nominato Francis Collins, scienziato di fama. Ma la marcia verso la conoscenza del DNA conobbe un’inaspettata accelerazione con la comparsa sulla scena scientifica della Celera Genomics, azienda

sequenze geniche sconosciute e non associabili ad alcuna funzione. Tale funzione può spesso essere ricavata da ricerche successive, comparando, per esempio, la struttura del gene scoperto a quella di altri geni. Il sequenziamento può quindi condurre all’aumento delle conoscenze sulle funzioni delle cellule.

Nella genomica comparata si confrontano le sequenze genomiche di organismi diversi per individuare i geni presenti in un organismo e assenti in un altro, al fine di mettere in relazione questi risultati con la rispettiva fisiologia. La genomica comparata fornisce anche un solido sostegno alla teoria dell'evoluzione.

In questi anni, lo studio della genomica si è rivelato di grande importanza per le sue applicazioni in campo medico-sanitario, ma anche, per esempio, alimentare o ecologico. Un caso particolarmente affascinante è quello della produzione di un organismo artificiale, dotato di un genoma costruito interamente in laboratorio.

L’ingegneria genetica (dal DNA ricombinante agli OGM)

La scoperta dei meccanismi che regolano la sintesi proteica ha consentito, dagli anni ’70, lo sviluppo di una tecnologia in grado di far produrre da un organismo microscopico (riproducibile in gran quantità e a un costo relativamente limitato) una proteina di un altro organismo, impossibile da ottenere in altro modo o, comunque, ottenibile (per estrazione o per sintesi industriale) in quantità limitate o solo a costi molto elevati.

Questa tecnologia, detta tecnologia del DNA ricombinante o ingegneria genetica, impiega il DNA ricombinante, ossia una molecola di DNA ibrida, ottenuta inserendo il gene della proteina desiderata in una molecola di DNA- vettore che si introduce e si replica nelle cellule dell’organismo da cui si vuol far produrre la proteina (cellule ospiti).

In pratica, da una cellula di un organismo “donatore” si estrae il gene richiesto (o, meglio, frammenti del DNA tra i quali è compreso anche quello richiesto), lo si lega a un vettore (una molecola particolare di DNA capace di penetrare in una cellula ospite) formando così un DNA ibrido, detto DNA ricombinante, che si inserisce in una cellula “ospite”, appartenente a un altro organismo. La cellula ospite, ricevuto il DNA ricombinante, acquisisce la capacità di produrre la proteina codificata da quel gene, cioè si trasforma, diventa una cellula ricombinante.

La trasformazione comporta per la cellula l’acquisizione di una nuova proprietà: la capacità di produrre quella proteina. Essendo stabilmente integrato nel DNA della cellula ospite, il gene si riproduce insieme alla cellula, per cui le cellule figlie manterranno tutte la capacità di produrre la nuova proteina. Stimolando la riproduzione delle cellule ospiti (clonazione), in poco tempo si otterrà una popolazione di milioni di cellule, tutte in grado di produrre la proteina desiderata. Le cellule che vengono utilizzate come “ospiti” del DNA ricombinante devono essere:

1. in grado di ospitare il DNA ricombinante (che va costruito utilizzando un vettore adeguato alla cellula in cui deve inserirsi);

2. facili da coltivare (si devono riprodurre rapidamente);

3. innocue (sia per il personale di laboratorio che le manipola che per il destinatario della proteina prodotta: non possono essere usate cellule di microbi patogeni, che potrebbero infettare i laboratoristi o contaminare la sostanza proteica da produrre con sostanze tossiche prodotte dal batterio stesso).

Le cellule ospiti più frequentemente utilizzate sono batteri e microrganismi unicellulari eucarioti ma possono essere impiegate cellule provenienti da piante o animali. Ognuna di queste cellule può

ricevere nuovo DNA mediante un idoneo vettore, specifico per ogni tipo di cellula. I vettori possono essere: batteriofagi (virus che infettano i batteri) per i batteri; plasmidi (piccole molecole di DNA circolare) per i batteri e altri organismi unicellulari; virus vegetali e virus animali rispettivamente per cellule di piante e di animali.

La tecnologia del DNA ricombinante, chiamata anche ingegneria genetica, ha avuto inizio a partire dal 1972, quando sono stati scoperti gli enzimi di restrizione (endonucleasi), che derivano da alcuni microrganismi, ai quali devono anche il nome, ossia la sigla che li caratterizza: ad esempio, l’endonucleasi BAM deriva dal Bacillus aminoliquefaciens. I batteri utilizzano questi enzimi per tagliare ed eliminare frammenti di DNA estranei, derivanti dai batteriofagi; rappresentano cioè un tentativo di difesa contro la riproduzione dei virus che li distruggerebbero. L’ingegneria genetica sfrutta questi enzimi che agiscono come “bisturi” chimici per sezionare il DNA, che, viene poi incollato grazie alla DNA-ligasi, scoperta già nel 1967. Nel 1972 si è ottenuto il primo DNA ricombinante e l’anno successivo si è riusciti a inserirlo in un batterio. Dal 1977 le tecniche del DNA ricombinante sono state applicate anche ai geni dei mammiferi.

PCR (Polymerase chain reaction)

La PCR è un metodo di biologia molecolare, utile per amplificare (i.e. creare copie multiple di) DNA, inventato da Kary Mullis alla fine degli anni ’80. Lo scopo della PCR è di produrre un enorme numero di copie di una sequenza di DNA, sia essa un gene o parte di questo.

Nella pratica corrente i principali componenti della PCR sono: DNA stampo, che contiene il frammento da amplificare; Due primers (Forward e Reverse), che determinano l’inizio e la fine della regione da amplificare; DNA Polimerasi, che copia la regione da amplificare (si usano le DNA polimerasi di batteri termofili, che sono stabili ad elevate temperature; es. Taq Polimerasi); Nucleotidi, per la sintesi di nuovo DNA; Buffer, che fornisce l’ambiente chimico ideale per la DNA Polimerasi.

Il processo della PCR consta di tre steps principali che vengono ripetuti dalle 30 alle 40 volte, attraverso l’utilizzo di un termociclatore.

1). Denaturazione a 94oC (Melting): Durante la denaturazione, i due filamenti di DNA si separano e tutte le reazioni enzimatiche si arrestano (es. l’estensione del filamento del ciclo precedente);

2). Annealing a 50 – 60 oC: La temperatura di questo stadio dipende dai primers usati. Durante l’annealing vengono utilizzati due primers (Forward e Reverse), che si legano ai loro siti specifici. Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei primers ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da templato (filamento stampo). I primers che si appaiano esattamente con il filamento stampo formano i legami più stabili ed, in questo piccolo tratto di doppia elica, si lega la polimerasi, che così inizia a copiare il filamento stampo;

3). Estensione a 70 – 75 oC (Elongation): La temperatura di elongation dipende dalla DNA Polimerasi. Durante l’estensione, la Polimerasi estende i primers aggiungendo le basi (complementari al templato) all’estremità 3’. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio filamento.

La PCR può essere utilizzata in un’ampia varietà di analisi tra cui:

• (^) Genetic fingerprinting (usata in medicina legale);
• Test di paternità;
• Studi di evoluzione e filogenesi;
• Identificazione di malattie ereditarie;
• Identificazione di malattie virali;
• Clonaggio di un gene;
• Analisi di DNA antico;
• Genotipizzazione di specifiche mutazioni e polimorfismi.

Approfondimento: Clonaggio del DNA

La capacità di costruire molecole di DNA ricombinante e di mantenerle nelle cellule viene detta clonaggio del DNA. Il processo coinvolge un vettore, che fornisce l'informazione per propagare il DNA clonato nella cellula, ed un inserto di DNA, che viene inserito nel vettore e contiene il DNA di interesse. Per costruire molecole di DNA ricombinante sono fondamentali gli enzimi di restrizione, che tagliano il DNA in siti specifici, ed altri enzimi che consentono di unire gli uni agli altri i frammenti di DNA tagliati. Però, una volta che il DNA è tagliato in frammenti dagli enzimi di restrizione deve essere inserito in un vettore per la propagazione. Cioè, il frammento di DNA deve essere inserito in una seconda molecola di DNA (il vettore) per essere replicato in un organismo ospite. I vettori per DNA hanno tre caratteristiche:

1. contengono un'origine di replicazione che permette loro di replicarsi indipendentemente dal cromosoma dell'ospite;

2. contengono un marcatore di selezione che permette alla cellula che contiene in vettore di essere facilmente identificate; e

3. possiedono singoli siti di taglio per enzimi di restrizione.

Ciò consente di inserire i frammenti di DNA in posizioni definite all'interno di un vettore altrimenti intatto. I vettori più comuni, che soddisfano le prime due caratteristiche, sono piccole molecole di DNA circolare (circa 3 kb) dette plasmidi. Infatti, queste molecole, associate al cromosoma batterico hanno un'origine di replicazione e possiedono geni marcatori, come ad esempio quelli per la resistenza a particolari antibiotici. Inoltre, in alcuni casi, questi plasmidi possiedono siti unici di restrizione. Però, dopo la loro scoperta, i plasmidi sono stati semplificati e modificati in modo che un tipico vettore plasmidico ora possieda più di 20 siti unici di restrizione in una regione relativamente piccola. Ciò consente di utilizzare una varietà maggiore di enzimi di restrizione per tagliare il DNA bersaglio. Anche i virus e i fagi sono stati modificati in modo da poter essere usati come vettori di clonaggio. A questo punto, e con queste informazioni, supponiamo che un vettore plasmidico contenga un singolo sito di riconoscimento per EcoRI. Il plasmide digerito con l'enzima di restrizione sarà linearizzato. Dato che EcoRI genera estremità che protrudono al 5' e che sono complementari tra loro, le estremità sono in grado di riassociarsi e di dare origine ad una forma circolare del plasmide con due tagli. A questo punto il DNA bersaglio, che vogliamo clonare, viene digerito con lo stesso enzima di restrizione per far sì che abbia le estremità complementari al taglio del plasmide. In seguito, il trattamento del plasmide stesso con l'enzima DNA ligasi, in presenza di ATP, chiude i tagli, rigenerando un plasmide covalentemente chiuso, in cui però troviamo

incorporato l'inserto di DNA da noi preso in considerazione. Per procedere con quest'ultimo passaggio, abbiamo bisogno di un eccesso di DNA dell'inserto rispetto al DNA plasmidico, per far sì che la maggior parte dei vettori incorpori l'inserto e venga richiusa. Bisogna ricordare, inoltre, che alcuni vettori non solo permettono l'isolamento e la purificazione di specifici DNA, ma sono anche in grado di dirigere l'espressione di geni all'interno del DNA inserito. Tali plasmidi vengono detti vettori d'espressione e possiedono promotori trascrizionali immediatamente adiacenti al sito di inserzione. In questo modo possiamo vedere l'espressione del tratto di DNA da noi inserito oppure ottenere grandi quantità della proteina prodotta dalla sequenza genica presa in considerazione.

OGM

Un OGM, che può essere un virus, un batterio, un fungo, una pianta o un animale, viene definito, con terminologia ufficiale, come un: "organismo il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale" (Art. 2, Direttiva 2001/18/CE del 12/03/01)

In una pianta che si vuole modificare vengono inseriti uno o più geni, prelevati da altri organismi, anche molto lontani dal punto di vista della parentela genetica, in modo da introdurre nuove caratteristiche morfologiche o funzionali, cioè nuovi caratteri, che è impossibile ottenere tramite i metodi tradizionali, dato che questi organismi non possono incrociarsi tra loro e generarne altri.

Per ottenere un O.G.M., chiamato anche organismo transgenico si usano le biotecnologie, cioè l’insieme delle tecnologie che permettono di usare esseri viventi per scopi produttivi. Ci sono due tipi di biotecnologie:

•AVANZATE (Ingegneria Genetica):Tecnologie che permettono lo studio e le operazioni sugli organismi, per la trasformazione in O.G.M.

•TRADIZIONALI: Tecnologie antichissime, basate sulla fermentazione, altre su incroci tra organismi di razza diversa.

OGM: CLASSIFICAZIONE Kaare Nielsen, con riferimento al gene codificante, cioè portatore del carattere di interesse, ha proposto di adottare una nomenclatura precisa per differenziare i vari organismi “ingegnerizzati”, ponendo cinque livelli lungo i quali la distanza genetica tra la pianta ricevente il gene e il “donatore” (virus, batterio, fungo, vegetale, animale) aumenta progressivamente.

Quindi si può parlare di OGM:

1. intragenici (il DNA proviene dalla stessa specie)

2. familigenici (il DNA proviene da specie affini, interfeconde)

3. lineagenici (il DNA proviene da specie della stessa linea filogenetica)

4. transgenici (il DNA proviene da specie filogeneticamente lontane)

5. xenogenici (il DNA esogeno è costituito da geni artificiali).

Solo i primi due gruppi di organismi sono ottenibili anche con gli incroci tradizionali, perché non si infrangono le barriere naturali, che separano tra loro le specie e i generi diversi.

MAPPATURA DEI CROMOSOMI

Strategie di mappatura

Markers

Affinche' un marker possa essere usato per costruire mappe genetiche, esso deve essere polimorfico.

Qualsiasi caratteristica fisica o molecolare ereditata nella progenie e che differisce tra gli individui di una popolazione e che abbia una frequenza superiore all'1%, e' un potenziale marker genetico.

I markers possono essere o regioni di DNA esprimibili o segmenti di DNA anonimi dei quali non si conosce niente, tranne che sono polimorfici. I numerosi alleli per molecole MHC di classe I e II, gli antigeni del gruppo sanguigno ABO (un individuo puo' essere di gruppo sanguigno A, B, AB, o 0), la presenza di varianti enzimatiche (es. forma A e B di G-6Pi-DH, distinguibili su gel di poliacrilamide per diverso peso molecolare e mobilita' elettroforetica), sono esempi di polimorfismo per sequenze di DNA codificante, il cui pattern ereditario puo' essere facilmente seguito. Altri markers invece sono in grado di definire un polimorfismo neutrale, ossia variazioni all'interno di DNA non associate a effetti fenotipici tra gli individui di una popolazione, poiche' spesso le mutazioni cadono all'interno di introni o sono mutazioni silenti. Esempi di quest'ultima categoria di markers sono i VNTR basati sugli RFLPs. I VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) sono sequenze nucleotidiche note ripetute in tandem un numero variabile di volte, precedute e seguite da sequenze di DNA a singola copia. Digerendo il DNA genomico di diversi individui con enzimi di restrizione che tagliano all'interno delle sequenze uniche che fiancheggiano un locus VNTR, si evidenzieranno dopo corsa elettroforetica del prodotto di digestione, frammenti di lunghezza diversi a seconda del numero di ripetizioni. Polimorfismi di lunghezza degli enzimi di restrizione, che sono alla base degli RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms), possono essere dovuti anche alla presenza/assenza nel genoma di un individuo di siti di taglio per enzimi di restrizione. Mutazioni puntiformi all'interno della sequenza riconosciuta da un enzima di restrizione hanno spesso come unico effetto la mancata digestione del DNA da parte di quell'enzima (evidenziabile dalla diversa dimensione dei frammenti dopo corsa elettroforetica). In ogni caso queste variazioni tra gli individui possono essere usate come marcatori per costruire mappe genetiche di linkage.

Nel 1993/94 il Genethon, usando come markers dei microsatelliti, ossia sequenze da 1 a 4 pb ripetute in tandem un numero variabile di volte e intersperse nel genoma, ha costruito una nuova mappa genetica. Sono stati mappati 2066 dinucleotidi (AC)n, ottenendo 1266 intervalli per una distanza di 3690 cM. La distanza media tra i markers e' di 2.9cM, ma il 56% e' ad una distanza di 1cM. Queste mappe possono essere usate per mappare in particolare geni responsabili di malattie monogeniche. Recenti mappe consensus di alcuni cromosomi hanno una distanza tra i markers di circa 7-10cM.

Inizialmente i markers sono stati isolati in maniera casuale da libraries genomiche e successivamente mappati su un dato cromosoma. Oggi nuove tecniche permettono di isolare markers DNA cromosoma-specifici partendo da libraries cromosoma specifiche. Queste possono essere realizzate mediante l'uso di uno strumento, chiamato FACS (Fluorence Actived Cell Sorter), che permette di separare i vari cromosomi di una sospensione, colorata con fluorocromi, in base alla intensita' di fluorescenza che a sua volta e' direttamente proporzionale alla grandezza del cromosoma. Il cromosoma isolato e' digerito con enzimi di restrizione e i frammenti sono clonati in specifici vettori. Sempre per ottenere markers per una regione subcromosomica specifica (ad es. una banda cromosomica) si puo' usare la tecnica della microdissezione. Un micromanipolatore dotato di aghi molto sottili e' usato per tagliare una particolare banda da un preparato metafasico colorato con tecniche di colorazione differenziale e osservato al microscopio. La regione di

interesse e' cosi' isolata e clonata mediante PCR. Il DNA cosi' ottenuto puo' essere usato come sonda per l'ibridazione e per identificare grandi inserti di DNA presenti nelle libraries genomiche.

Mappe fisiche

Differenti tipi di mappa fisica, che descrivono l'ordine e la distanza tra due marcatori misurata in numero di nucleotidi (bp), variano nel loro grado di risoluzione, ossia nella precisione della localizzazione di una sonda. I metodi usati nella mappatura fisica si possono dividere in due categorie:

• metodi a bassa risoluzione;
• metodi ad alta risoluzione.

Mappa fisica a bassa risoluzione

I sistemi di mappatura piu' usati utilizzano gli ibridi cellulari e la tecnica della ibridazione in situ.

Mappatura mediante ibridi cellulari

Cellule somatiche ibride interspecifiche derivano dalla fusione di cellule provenienti da specie differenti.

Gli ibridi piu' usati per la mappatura derivano dalla fusione di cellule umane e di roditore, comunemente topo o hamster, indotta da sostanze chimiche, come il polietilenglicole, in grado di creare dei pori a livello della membrana plasmatica.

Le cellule ibride che inizialmente tendono a perdere in maniera casuale e progressiva cromosomi umani, in seguito si stabilizzano fino a contenere il set cromosomico del roditore e il cromosoma umano che assicura un vantaggio selettivo all'ibrido, insieme a cromosomi ritenuti casualmente.

Dopo aver selezionato le cellule ibride e averle caratterizzate dal punto di vista cariotipico, si allestisce un pannello di ibridi, dato dall'insieme delle cellule ibride il cui contenuto cromosomico umano nel complesso corrisponde all'intero set cromosomico dell'uomo. Tale pannello e' usato per studi di mappatura.

Gli ibridi cellulari sono stati utilizzati inizialmente per mappare geni di cui si conosceva il prodotto (proteine enzimatiche o strutturali). Sugli estratti proteici delle cellule ibride si esegue una corsa elettroforetica su gel. Il gel si usa in seguito o per far avvenire una reazione enzimatica catalizzata dall'enzima il cui gene si vuole mappare, in presenza di un cromogeno, o per far avvenire (in caso di proteine non enzimatiche) una reazione di precipitazione usando anticorpi contro la proteina stessa. Se la cellula ibrida non ha ritenuto il cromosoma su cui mappa il gene codificante, non si avra' reazione colorimetrica o di precipitazione.

Un limite di questa applicazione e' dato dal fatto che, essendo il topo o l'hamster e l'uomo due specie affini, potrebbero esserci problemi nel discriminare tra la reazione, colorimetrica o di precipitazione, dovuta a proteine umane e quella relativa a proteine murine.

Oggi, grazie all'avvento delle tecniche di DNA ricombinante, e' possibile mappare qualsiasi segmento clonato indipendentemente dalla sua espressione. Digerendo il DNA estratto dai cloni ibridi con enzimi di restrizione, eseguendo un blotting e ibridando con la sonda a disposizione, e' possibile localizzarla su un dato cromosoma, calcolando l'indice di concordanza, ossia il rapporto percentuale tra gli ibridi positivi per la sonda in esame e gli ibridi totali. Usando un enzima in grado di discriminare tra la banda di ibridazione umana e murina, si puo' riconoscere l'eventuale segnale di ibridazione proveniente dalle cellule di roditore.

Per la mappatura fisica su larga scala e' necessario organizzare contigui che coprano estese regioni cromosomiche. Tale obiettivo risulta tanto piu' facilmente realizzabile quanto piu' grandi saranno i frammenti clonati.

Lo sviluppo dei cromosomi artificiali di lievito (YACs) come vettori di clonaggio, mediante i quali e' possibile isolare frammenti di DNA dell'ordine di grandezza di 1 Mb, ha dato un notevole contributo alla soluzione di questo problema.

Per identificare YACs di una data regione cromosomica in modo da costruire un contiguo, si possono usare delle sequenze nucleotidiche note, lunghe da 200 a 500 pb, distribuite su tutta una regione genomica o su tutto il genoma dette STS (Sequence Tagged Site). E' stata costruita una mappa mostrando l'ordine e la distanza degli STS. La mappa con gli STS puo' essere rappresentata elettronicamente e conservata in una banca dati facilmente accessibile. Un STS identifica in maniera univoca un qualsiasi tratto di DNA e pertanto un laboratorio che voglia clonare uno specifico frammento genomico, dovra' semplicemente consultare un computer per conoscere le due sequenze STS che delimitano questo frammento. Usando due primers corrispondenti alle due sequenze STS, si potra' amplificare mediante PCR il frammento e successivamente clonarlo. Poiche' nella reazione di amplificazione l'enzima usato non riesce ad amplificare frammenti superiori a 1000 pb, i primers scelti, corrispondenti alle due sequenze STS che delimitano il frammento da clonare, non devono distare piu' di 1000 pb.

Poiche' ogni elemento mappato (cloni, contiguo, sequenza) e' definito da un unico STS, la mappe con gli STS sono molto utili per identificare e combinare dati di mappatura ottenuti da differenti strategie. Per identificare tra le sequenze di DNA umano quelle corrispondenti a geni sono usati particolari STS, chiamati ESTs (Expressed Sequence Tags), ottenuti scrinando libraries di cDNA, che riconoscono sequenze trascritte. Infatti una applicazione degli ESTs include la localizzazione di geni lungo i cromosomi e l'identificazione di regioni codificanti nel genoma umano.

Relazione tra mappa genetica e mappa fisica

La distanza della mappa genetica per le 3000Mb del genoma umano e' di circa 3000cM e pertanto 1cM corrisponde approssimativamente a una distanza di mappa fisica di 0.8Mb.

In realta' il rapporto delle distanze di mappa genetica e fisica sui segmenti cromosomici spesso deviano da questo valore medio a causa della localizzazione non casuale dei chiasmi. I segmenti cromosomici contenenti gli "hot spots" di ricombinazione mostrano una piu' alta frequenza di ricombinazione e per tanto markers localizzati in questa zona sembrano piu' distanti del reale. In generale c'e' una frequenza di crossing-over piu' alta in corrispondenza delle regioni subtelomeriche rispetto a quelle centromeriche.

YACs

Gli YACs (cromosomi artificiali di lievito) sono vettori di clonaggio molto utili per la costruzione di mappe fisiche ad alta risoluzione. Gli YACs permettono infatti di clonare larghe regioni di DNA (da 100Kb a piu' di 1500Kb), risultando uno strumento utilissimo per ottenere contigui di una data regione cromosomica. Piu' che di vettori veri e propri gli YACs sono dei cromosomi artificiali inseriti in una cellula ospite di lievito. Per potersi replicare un cromosoma ha bisogno di strutture fondamentali:

una o piu' origini di replicazione per permettere la duplicazione del DNA che contiene e strutture terminali, dette telomeri, che assicurano la completa replicazione del DNA fino all'estremita' di un cromosoma lineare. Cromosomi privi di telomeri si accorciano leggermente ma costantemente ad

ogni ciclo di replicazione cellulare e tendono a rompersi alle estremita' per saldarsi ad altri cromosomi.

Analizzando questi requisiti si e' pensato di poter costruire un cromosoma condensato, ossia una molecola lineare contenente una origine di replicazione, un centromero (necessario per la corretta segregazione dei cromosomi) e due telomeri agli estremi. Tale minicromosoma si puo' replicare e restare come molecola lineare all'interno del nucleo di una cellula eucariotica. Gli YACs sono inseriti in cellule di lievito poiche' contengono le sequenze ARS (sequenze che si replicano autonomamente) di lievito. Tali cromosomi possono ospitare al loro interno frammenti di DNA grandi fino a 1Mb. Per le grandi dimensioni degli inserti clonati, un numero ridotto di cloni sara' necessario per coprire l'intero genoma.

Nel sistema di mappatura, gli YACs ottenuti estraendo il DNA dalle cellule di lievito che li contengono non sono usati, a differenza di altri vettori come plasmidi e cosmidi, come sonde tal quali, poiche' l'alto rapporto tra DNA di lievito e frammento di DNA clonato renderebbe necessario l'utilizzo di una elevata quantita' di DNA per aumentare l'efficienza del sistema di mappatura.

Per superare questo limite gli YACs sono usati come sonde per esperimenti di FISH dopo essere stati amplificati con primer Alu, sequenze di 300pb distribuite una volta circa ogni 5Kb nel genoma umano, le quali permettono l'amplificazione specifica di sequenze inter-Alu umane dal DNA di lievito. L'amplificazione aumenta l'efficienza del segnale in esperimenti di FISH rispetto all'utilizzo della stessa sonda non amplificata. L'efficienza della generazione di sonde mediante Alu-PCR dipende dal numero delle sequenze Alu adeguatamente spaziate che fiancheggiano le sequenze sito specifiche in ciascuno YACs. Cloni YACs derivati da parti del genoma con un contenuto particolarmente basso in sequenze Alu daranno un segnale meno efficiente rispetto a cloni derivati da sequenze genomiche ricche di Alu.

Allo stesso scopo si puo' utilizzare una tecnica di separazione elettroforetica di lunghi frammenti di DNA, detta PFGE (pulse field gel electrophoresis), che permette di separare i cromosomi artificiali di lievito da quelli naturali. Nella PFGE larghi frammenti di DNA ricavati dalla digestione di regioni genomiche possono essere separati su gel d'agarosio attraversato da un campo elettrico discontinuo. Il principio su cui si basa questa tecnica e' quello di far ruotare le molecole di DNA all'interno del gel in modo che anche molecole molto lunghe possano passare tra le maglie della matrice semisolida e migrare piu' o meno velocemente secondo la loro lunghezza. Si possono cosi' separare frammenti di DNA lunghi da 50Kb a qualche Mb.

Gli YACs sono molto usati in citogenetica come sonde specifiche di determinate regioni cromosomiche. Sono anche usati per isolare e caratterizzare regioni coinvolte in malattie genetiche o per caratterizzare punti di rottura sui cromosomi associate ad es. a trasformazioni neoplastiche. Per questo scopo e' necessario conoscere la posizione fisica degli YACs e verificare che non siano chimerici.

Gli YACs chimerici sono YACs che contengono frammenti di DNA che ibridizzano su differenti regioni del genoma. Questo puo' essere dovuto o alla presenza di due frammenti diversi all'interno dello stesso clone o alla presenza di elementi ripetuti all'interno del genoma stesso. Per superare questi problemi si sta cercando di utilizzare tecniche sempre piu' raffinate come quella che permette di separare su gel di agarosio frammenti di DNA molto piccoli da grandi inserti in maniera da ridurre la possibilita' di clonare insieme nello stesso YAC questi due tipi di frammenti. Inoltre si sta cercando di creare una banca dati, completa anche di immagini, relativa a YACs dimostratisi non chimerici e omogeneamente distribuiti lungo il genoma. Per ottenere YACs di una data regione cromosomica, al fine di costruire un contiguo, si possono utilizzare dati sulla distribuzione degli STS lungo il genoma. Utilizzando sempre gli STS si possono ordinare gli YACs del contiguo. Due

terapeutici. Questo ha gettato le basi per la creazione di Genentech e l'aumento della moderna industria della biotecnologia.

BIOTECNOLOGIE

Le biotecnologie sono tutte quelle tecnologie che usano organismi viventi, o parti di essi allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili all'uomo, di migliorare piante ed animali o sviluppare microrganismi utili per usi specifici.

Molte persone pensano che le biotecnologie sono nate solo negli ultimi tempi, ma in realtà esistono da migliaia di anni...

Infatti le biotecnologie si possono dividere in due tipi: Tradizionali e Innovative

BIOTECNOLOGIE TRADIZIONALI

•Le biotecnologie tradizionali sono tecnologie produttive utilizzate da millenni, quali l'agricoltura, la zootecnica e lo sfruttamento delle attività fermentative dei microrganismi.

BIOTECNOLOGIE INNOVATIVE

•Lo sviluppo delle biotecnologie innovative è molto veloce... Infatti, in solo 1-2 secoli si è arrivati ad un livello di conoscenza molto elevato rispetto a quello che è stato ottenuto in precedenza, in più di 7000 anni.

La scoperta dei microrganismi: nascita delle biotecnologie innovative

•Pasteur tra il 1857 e il 1876 comprende la produzione della birra e i microrganismi che la permettono. Per questo viene considerato il padre della biotecnologia. Inoltre, individua i batteri responsabili della fermentazione del latte e del burro, i microbi responsabili delle alterazioni della birra e del vino. Pasteurcrea un vaccinoper la rabbia, selezionando dei mutanti del virusdella rabbia che hanno perso la virulenza rispetto all'uomo. Questa èuna tecnica che anticipa la biotecnologia moderna basata sull'ingegneria genetica. Nel 1878 vengono scoperti i componenti delle cellule di lievito e vengono chiamati "enzimi".

Divisione e sostenibilità biotecnologie

a livello mondiale si tende a suddividere le biotecnologie in quattro categorie, anche se moltissime sono le intersezioni e le sovrapposizioni.

Biotecnologie VERDI

Biotecnologie Agroalimentari di applicazione al segmento agri-food, ovverosia agricolo ed alimentare.

In agricoltura ed orticoltura, in l’allevamento, le nuove tecniche di sequenziamento genomico e di smart breeding , le piante transgeniche e cisgeniche, gli alimenti geneticamente modificati, rappresentano la chiave di volta con cui scienza ed innovazione possono affrontare le sfide di sicurezza alimentare e di sostenibilità ambientale.

Biotecnologie ROSSE

Biotecnologie Medico-Farmaceutiche, le applicazioni rivolte alla salute, (Healthcare) non solo nel campo farmaceutico, ma anche di ausilio alla professione medico-sanitaria.

Dalla diagnostica alla terapia genica, dalla medicina rigenerativa (staminali, ingegneria tissutale e biomateriali) al molecular farming per la creazione di biofarmaceutici in pianta, per ricomprendere anche le scienze veterinarie, le applicazioni delle biotecnologie rosse sono volte al miglioramento della qualità della vita ed alla riduzione della sofferenza.

Biotecnologie BIANCHE

Biotecnologie Industriali, utilizzate per il processo e la realizzazione di prodotti chimici, materiali ed energia.

Vengono sfruttati enzimi e microrganismi per realizzare prodotti utili in svariati settori economici: dal chimico al farmaceutico, dalla carta al tessile, dal food all’energia (bioenergia), passando per i polimeri.

I microorganismi sono utilizzati come bioreattori.

Biotecnologie GRIGIE

Biotecnologie Ambientali, in particolare le tecnologie di rimozione degli inquinanti, dagli effluenti industriali alle acque di scarico, dai suoli contaminati all’acqua per uso alimentare, le tecniche impiegate sono il biorisanamento, la biodegradazione e la biofiltrazione.

In ambito diagnostico si adoperano i biosensori per il rilevamento ed il monitoraggio dei contaminanti e di sonde molecolari per il monitoraggio dei microorganismi.

In particolare nelle tecnologie di bioremediation (biorisanamento) si sfruttano le capacità di degradazione dei contaminanti e di accelerazione della detossificazione naturale ambientale da parte di alcuni microorganismi.

Con tecniche di controllo biogeochimico viene effettuata la biostimolazione degli inquinanti e delle matrici ambientali da risanare.

Alla luce di questo breve sguardo di insieme, si può senz’altro sostenere che, nel loro insieme, le biotecnologie sono strategiche per lo sviluppo sostenibile e stanno alla base della bioeconomia.

Conclusa la carrellata tassonomica, va rilevato che -ormai da decenni- nella vita quotidiana si sente parlare -spesso in maniera errata- di microorganismi geneticamente modificati, meglio noti come MOGM.

Si tratta di organismi di cui è stato alterato il materiale genetico per ottenere dei risultati che altrimenti non sarebbero possibili naturalmente.

Gli MOGM non si trovano però solo nell’ambito agroalimentare, ma sono utilizzati anche nei processi industriali, oltre ad avere grande uso in medicina e nella somministrazione farmacologica.

Nell’industria alimentare vengono usati sia per rafforzare le coltivazioni (per esempio aumentando la resistenza a pesticidi) sia per modificare la qualità degli alimenti.

Come per le nanotecnologie, la biologia sintetica impiega sia l’approccio ingegneristico top-down (partendo da organismi già esistenti per ottenere i moduli operativi desiderati), sia bottom-up.

E’ quest’ultimo l’approccio che esalta l’idea di modularità dei sistemi viventi: si creano nuove proprietà biologiche, assemblando i moduli biologici caratterizzati da specifiche proprietà (come con il Lego).

Tali moduli sono disponibili per l’ “ordinazione” da un “catalogo delle parti comuni”, come avviene ad esempio sul Registro Delle Parti Comuni del Massachussets Institute Of Technology.

La creazione di forme di vita sintetica comporta una serie di rischi etici, giuridici ed ambientali, a fronte dei quali è in corso un intenso dibattito tra eticisti, giuristi e scienziati.

Per una ampia trattazione degli aspetti etici si rimanda al rapporto Ethics of Synthetic Biology, Opinion N° 25, (Brussels 17.11.2009) elaborato dallo European Group on Ethics in Science And New Technologies.

Nel Dicembre 2010 la Commissione presidenziale americana per lo studio dei temi bioetici ha pubblicato un rapporto dedicato alla biologia sintetica e le tecnologie emergenti.

Prima di proseguire però, una premessa sul diverso approccio USA-EUROPA alla

regolamentazione della scienza da parte del diritto.

In ragione della natura “Science Based” dell’ordinamento giuridico americano, in cui la scienza è assunta come valore neutrale e prevalente, basato sul diritto giurisprudenziale e sul precedente vincolante, l’attenzione è focalizzata sempre sul singolo caso in concreto: non aderisce a valutazioni preventive astratte del danno e del rischio, preferendo punire severamente ex post.

Diversamente, gli ordinamenti europei di Civil Law (policy oriented) sono centrati sulla norma giuridica e quindi sulla regolazione astratta e generale. Non avendo a disposizione rimedi processuali efficaci come quelli statunitensi, serve una sorta di “consenso preventivo” sulla regolazione della scienza da parte del diritto.

Della scienza in Europa vengono riconosciuti i limiti insuperabili e –specie nelle applicazioni pratiche- l’ultima parola spetta al diritto, o meglio dire alla politica; è così che in virtù del principio di precauzione le lacune della scienza sono colmate con misure di tutela precauzionale a favore dei cittadini.

Tornando al rapporto della Commissione americana sulla biologia sintetica, in ossequio alla tradizione di politica del diritto USA, lo stesso è caratterizzato dal consueto approccio cauto, orientato alla preservazione della libertà di svolgimento della ricerca scientifica e alla esclusione della creazione di regole ad hoc in materia.

In conclusione di questo sguardo di insieme sulle biotecnologie, pare opportuno sottolineare che il rapporto tra la scienza ed il diritto è complesso, cangiante e suscettibile di trasformazioni rapidissime, ma necessariamente transdisciplinare.

Se da un lato la scienza deve essere regolata, dall’altro il diritto deve ascoltare correttamente la scienza, senza imbrigliare irragionevolmente la ricerca: servono una scienza disposta ad essere saggiamente disciplinata ed una politica sapientemente informata.

La rivoluzione biotecnologica in particolare pone questioni sempre nuove con le quali il giurista e l’economista devono confrontarsi: dalla definizione di embrione e la sua brevettabilità alla proprietà

di tessuti, campioni biologici e informazioni genetiche, dall’accesso e limiti delle tecniche di diagnosi genetica al potenziamento cognitivo, dalle manipolazioni genetiche delle specie vegetali agli impatti sulla salute umana e quella dell’ambiente, le questioni giuridiche sono molte e complesse.

biocombustibili

I biocombustibili sono carburanti derivati da fonti rinnovabili come le piante e gli animali

I biocombustibili emettono CO2 carbon neutral durante la combustione

Diversi tipi di biocombustibili sono attualmente in fase di sviluppo

I combustibili solidi, liquidi o gassosi prodotti a partire dalla biomassa sono chiamati biocombustibili. Sono rinnovabili e rappresentano una buona alternativa ai combustibili fossili. La maggior parte dei biocombustibili attualmente disponibili sul mercato deriva da fonti vegetali. Sono spesso utilizzati come carburanti per trasporto.

Alcune piante vengono coltivate specificatamente per la produzione di biocombustibile. Negli USA, il panico verga, la soia e il mais sono le principali fonti di biocombustibile. In Brasile viene utilizzata la canna da zucchero, mentre in Europa si sfruttano la barbabietola da zucchero e il grano. Altri prodotti agricoli che vengono trasformati in biocombustibile sono la manioca e il sorgo in Cina, il miscanto e l’olio di palma nel Sud Est asiatico e la jatropha in India.

Alcuni esempi di biocombustibili sono il biodiesel, i bioalcool (bioetanolo, biometanolo, biobutanolo), il biogas, il syngas e i biocombustibili solidi come il legno, il carbone e la segatura. Il Brasile, gli USA, la Francia, la Svezia e la Germania sono alcuni dei paesi che hanno incoraggiato fortemente lo sviluppo dei biocombustibili.

Tipi di biocombustibili

I biocombustibili sono classificati in tre gruppi – prima generazione, seconda generazione e terza generazione.

I biocombustibili di prima generazione sono prodotti, con l’uso di tecnologie convenzionali, a partire da zuccheri, amidi, olio vegetale o grassi animali. Poiché queste materie prime sono anche risorse alimentari, il dibattito “cibo o combustibile” rappresenta il problema principale collegato ai biocombustibili di prima generazione.

La produzione di biocombustibili di prima generazione è limitata perché potrebbe avere un effetto negativo sulla disponibilità di cibo e sulla biodiversità. Per fare fronte alla crescente domanda di biocombustibili, sono stati sviluppati i biocombustibili di seconda generazione. Sono prodotti a partire da colture non edibili o da porzioni di piante edibili che non possono essere utilizzate come cibo e sono quindi scartate, come gli steli, i gusci, i trucioli di legno e le bucce.

Secondo gli esperti, i biocombustibili di seconda generazione permettono di ridurre maggiormente le emissioni di gas serra rispetto a quelli di prima generazione. La produzione dei biocombustibili di seconda generazione, tuttavia, è più complessa, poiché è necessario estrarre le materie prime utilizzabili dalla biomassa legnosa o fibrosa.

I biocombustibili di terza generazione sono prodotti a partire dalle alghe. La produzione di “oilgae”, o combustibile derivato da alghe, prevede la fermentazione dei carboidrati presenti nelle alghe.

I biocombustibili di seconda e terza generazione vengono chiamati anche biocombustibili avanzati. Un esempio di combustibile avanzato ancora in fase di sviluppo è il diesel rinnovabile derivato da