RIASSUNTI BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA DIAGNOSTICA, Sbobinature di Biologia Molecolare

Scarica RIASSUNTI BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA DIAGNOSTICA e più Sbobinature in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA DISGNOSTICA PROGRAMMA: Transgenesi: esperimento in vitro e in vivo; aggiunta di un gene al genoma, costruzione gene transgenico, inserimento nella cellula e selezione cellulare; inibizione gene con ricombinazione omologa e non omologa; analisi molecolare dopo la ricombinazione; topi knockout condizionali e modello del fago. Trascrizione: fattori di trascrizione e domini; enhancher, geni omeotici, recettori nucleari, PCR e RT-PCR e geni reporter. Epigenetica: struttura nucleosoma, istoni, rimodellamento cromatina; immunoprecipitazione e EMSA. RNA: miRNA, siRNA, long non-codingRNA. Splicing alternativo: processo dello splicing alternativo, modello di CD44 e BCR con tumore alla mammella. Tumori: oncogeni e oncosoppressori; tumore al colon. Diagnosi prenatale: amniocentesi, villi coriali e prelievo di sangue materno. Fibrosi cistica e distrofia di Duchenne. MEN: neoplasie endocrine multiple. TRANSGENESI La transgenesi e lo studio delle funzioni dei geni all'interno di animali viventi. Un modello di studio più semplice è quello delle cellule adattate a crescere un ambiente artificiale come le piastre di coltura, su queste piastre le cellule vengono fatte aderire e vengono fatte crescere: per farle crescere c'è bisogno di un ambiente sterile altrimenti si possono avere contaminazioni batteriche e di parassiti vari. Si deve avere un terreno di coltura nel quale vi sono i fattori di crescita e nutrienti che possono variare in base al tipo di cellula che stiamo utilizzando. Solitamente si utilizza un liquido generico che è il siero bovino che è una miscela con tutti i nutrienti e i fattori di crescita, questo siero viene aggiunto in base al tipo di cellula con percentuali diverse. Per permettere la crescita cellulare si ricopre la plastica della piastra con un collagene che permette quindi l'adesione delle cellule, altre cellule invece come le cellule del sangue non crescono in adesione ma crescono in sospensione nel mezzo di cultura. In questo modo si può quindi studiare ad esempio l'azione di un ormone +, di un fattore di crescita, o di un farmaco e vedere quindi la cellula come risponde a tale sostanza. Questi studi vengono definiti in vitro ma, quello che succede in vitro è esattamente quello che succede anche nella cellula in vivo? Non sempre in quanto le cellule di molti tessuti hanno una polarità quindi hanno una parte apicale e poi delle parti baso-laterali, le cellule si vanno a disporre quindi una di fianco all'altra e a formare delle giunzioni in queste cellule ci sarà quindi una direzionalità del funzionamento delle molecole infatti in alcuni casi i nutrienti possono arrivare dal lato apicale oppure dal lato baso laterale, questo ci dice che c'è quindi un organizzazione della cellula che non possiamo ottenere mettendo le cellule in coltura , vi sono quindi una serie di modelli in cui le cellule vengono forzati su dei substrati per cercare di andare a ricreare le stesse situazioni ma ci sono comunque dei limiti perché la risposta in questo caso potrebbe essere diversa da quella fisiologica, o ancora le interazioni cellulari che si vengono a creare in vivo non possono essere ricreate e quindi non possono essere studiate. Si stanno quindi utilizzando dei modelli intermedi come, ad esempio quelli degli organi iperfusi che vengono utilizzati soprattutto per il metabolismo dei farmaci, ad esempio in un animale in cui si vuole studiare la quantificazione di un farmaco a livello del fegato, si considera la vena che porta il farmaco al fegato cioè la vena porta e poi la vena epatica che fa fluire il sangue dal fegato. Il farmaco viene quindi iniettato all'interno della vena porta, si lascia per un determinato tempo e poi si va ad aspirare il sangue dalla vena epatica e si va quindi a considerare la concentrazione di farmaco che rimane, sei diminuita effettivamente sta a significare che quel farmaco viene quindi assorbito a livello epatico. Un altro metodo è quello di considerare degli organi ed effettuare una serie di piccoli pezzettini in modo tale da generare dei cubi di tessuto che sono stati poi adattati su una piastra , su questo tessuto sono state fatti poi una serie di esperimenti in questo modo andavamo quindi ad avere tutte quelle determinate cellule che vanno a costituire quel determinato tessuto e quindi tutte le risposte che derivano dai vari esperimenti, Questo è un metodo che fa uso degli organoidi, con questo sistema si possono anche utilizzare dei substrati di tipo organico come i polimeri sul quale vengono fatte attecchire le cellule in modo tale che si vadano a formare delle strutture tridimensionali, in questo modo si vanno a stabilire anche i contatti tra le cellule che si stabiliscono all'interno di un tessuto, questi polimeri vengono ad esempio utilizzati anche per la medicina rigenerativa infatti, ad esempio nel caso di un osso rotto si vanno a utilizzare dei problemi di speciali in maniera tale che quando questi polimeri vengono ricoperti dagli osteoclasti, vanno a mimare l'osso che può essere quindi sostituito a quello malato. Una delle prime cose che si va a studiare sugli animali interi, sono i farmaci Costruzione gene transgenico i geni degli eucarioti sono organizzati in esoni ed introni, la superficie del DNA che è occupata da un gene è molto grande la grandezza dipende dalle dimensioni della proteina che quel gene andrà codificare, Le cellule embrionali in stadi molto precoci sono totipotenti e forniscono al DNA estraneo un modo per inserirsi nella linea germinale. Femmina donatrice Il DNA può essere trasferito: A. Incellule non selezionate di embrioni molto precoci Solitamente questo tipo di trasferimento si effettua utilizzando vettori retrovirali e può essere effettuato sugli embrioni prima dell'impianto o in fasi precoci post impianto. Il trasferimento genico che si ottiene non coinvolge tutti | tipi cellulari dando luogo ad animali mosaico. Mena ci possono essere Questo metodo è stato utilizzato per studiare il . destino di linee cellulari nel corso dello sviluppo, geni che sono mediante geni indicatori. composti anche da un numero di basi maggiore di un milione. Per introdurre un frammento di DNA così grande all'interno di un vettore bisogna utilizzare i vettori di clonaggio che sono dei frammenti di DNA che possono accomodare frammenti di DNA esogeno e consentono quindi la propagazione di questi frammenti di DNA, questi vettori possono ad esempio essere plasmidi o fagi. Ognuno di questi vettori ha una propria capacità, quindi possono accomodare frammenti di DNA di una certa dimensione. Si vanno ad utilizzare questi vettori e quando si introduce questo costrutto nelle cellule eucariotiche possono insorgere delle modifiche come delle delezioni, quindi il DNA viene frammentato perché troppo grande e in questo modo frammenti più piccoli sono più gestibili. Ci si può però trovare in una condizione in cui ci sono una serie di frammenti che possono perdere una delle due estremità, come 5’ e 3, per evitare questa cosa si è pensato quindi di andare ad utilizzare il CONA che è il DNA complementare all’mRNA, questo perché l’mRNA non contiene gli introni, quindi risulta essere molto più piccolo del DNA che corrisponde al gene. Il cDNA che viene prodotto deve essere completo, cioè di lunghezza intera deve infatti cominciare dal cap e finire con la coda poliA, questo perché si devono avere tutte le informazioni sia per la parte codificante ma anche per le regioni all'estremità che possono essere delle sequenze che possono avere un ruolo di regolazione. Bisogna poi inserire il cDNA All'interno di un vettore che sono tutti capaci di crescere all'interno di un batterio. Per poter crescere però devono avere una serie di caratteristiche, devono infatti contenere l'origine di replicazione altrimenti il DNA non si replica, e poi deve avere un gene per la resistenza ad un antibiotico, inoltre sappiamo che il cDNA porta solo le sequenze ma per avere la trascrizione di un gene dobbiamo avere anche un promotore che viene inserito al 5’ del cDNA, i promotori possono essere di vario tipo infatti possiamo avere promotori semplici, complessi, con la TATA box, senza la TATA box, promotori ubiquitari o promotori cellule specifici, La scelta del promotore bisogna essere seguita in base alle esigenze sperimentali infatti se si vuole inserire una proteina che deve essere espressa in tutte le cellule B. Inlinee cellulari derivanti da cellule staminali embrionali (ES) dell’organismo, allora bisogna utilizzare un promotore ubiquitario se invece si vuole trascrivere solo all'interno di un determinato tipo di cellula o di tessuto allora se dovrò utilizzare un promotore tessuto specifico. Il promotore scelto deve essere fuso con il CONA in modo tale da mantenere una cornice di lettura capace di produrre l' esatta proteina. AAUAAA “A (segnale di AUG stop i; poliadenilazione) promotore |5' UTR cDNA insulina 3' UTR neoR AGOUTI 500 bp Inoltre, per la costruzione del vettore transgene abbiamo bisogno del gene della resistenza alla neomicina, che in un terreno ricco di neomicina fa sì che la cellula sopravvive; accanto al gene della resistenza alla neomicina si va poi ad inserire un altro gene , è un gene che codifica per un carattere fenotipico morfologico, il gene è più semplice da utilizzare e il gene agouti che codifica per un particolare tipo di pelo, infatti il Topolino classico di laboratorio ha un pelo liscio di colore bianco o grigio, questi peli auguti sono invece ispidi e neri. Se si introduce questo genere all'interno del Topolino questo andrà conferire il pelo scuro al manto del topo. Quindi già visivamente possiamo vedere se il topo esprime il transgene se va ad avere quindi il manto aguti. Inserimento del materiale genetico esogeno all'interno della cellula questo processo prende il nome di trasfezione e abbiamo quattro tecniche diverse: Cellule che crescono in una piastra di coltura i ì enne Aggiungere DNA e CaCI, tere Lasciare che il precipitato si formi lentamente ( _ ì Transiezione CARATTERISTICHE DEL METODO * Bassa efficienza di trasfezione (-20%) * | DNA trasfettato spesso si integra nel genoma (trasfezione stabile) * Applicabile solo a cellule che crescono in monostrato I granuli di calcio fosfato associati al DNA entrano nella cellula per endocitosi e vengono poi trasportati al nucleo 1. calcio fosfato Ca2PO4: si forma questa molecola che tende a precipitare, se la formazione di questa molecola la si fa avvenire a contatto con le cellule andremo ad avere che le cariche negative della molecola vanno ad interagire con le cariche positive dei fosfolipidi di membrana e si vanno quindi a formare delle interazioni abbastanza forti. Quando si forma questa molecola essa è in grado di formare delle reti tridimensionali, un vero e proprio reticolo nel quale si dispone il DNA. Questi reticoli attraverso le cariche del fosfato prendono contatto con la membrana e la membrana va quindi incontro alla formazione di una serie di pori attraverso i quali le molecole di calcio fosfato entrano all'interno della cellula trascinando con sé il DNA esogeno. I liposomi sono vescicole fosfolipidiche di 2. Lipidi origine sintetica. | lipidi possono essere ‘nnici; | af. neutri o carichi positivamente cationici: _il Ma Il DNA entra nelle cellule in seguito alla lipide piu += Tg. fusione delle vescicole con la membrana utilizzato è Cyv” plasmatica delle cellule da trasfettare la ” È È CARATTERISTICHE DELLA LIPOFEZIONE La Se Trasfezione sia stabile che transiente Ad Sa Elevata efficienza di trasfezione ter I Metodo “delicato” utile quando si lavora con SN GIS frammenti di DNA di grandi dimensioni Dy è dyg Speranze di utilizzare tale metodologia per J la terapia genica. Sono in atto tentativi di sviluppare liposomi cellulo-specifici Fusione dei liposomi con la membrana cellulare ed inserimento dol DNA all'interno della cellula lipofectamina, che forma delle vescicole dove all'interno si va a depositare il DNA esogeno. Questi lipidi interagiscono con le cariche della membrana facendo quindi entrare il DNA all'interno della cellula, la densità di carica è molto più alta e la quantità di DNA che riescono ad inglobare è maggiore, dunque l'efficienza di questa tecnica risulta essere più alta._ . Liposomi: sono strutture a doppio strato lipidico , quindi simile alle membrane per questo vanno a generare delle vescicole ricoperte appunto da questo doppio strato lipidico, all'interno delle quali si va a depositare il DNA. vengono quindi messe a contatto le due membrane che vanno a fondersi e si ha in questo modo il rilascio all'interno della cellula del DNA esogeno. Elettroporazione Elettroporazione: si introduce il DNA all'interno della cellula sottoponendola a uno shock elettrico, le cellule sono disposte in una cuvetta, ai due lati Efficienze di trasfezione alta con molti tipi cellulari Facile da eseguire se si ha a disposizione l’apparecchiatura idonea * Trasfezione stabile L'’intesità e la durata dell'impuls vanno stabiliti empiricamente i della cuvetta sono base al tipo cellulare da trasfettare disposti due poli elettrici attraverso i cuvette . . quali si fa passare la corrente elettrica che Va provocare una rottura del potenziale di membrana e fa quindi entrare il DNA. Ò Con le prime tre tecniche il DNA entra all'interno della cellula in grande quantità e va a formare degli ammassi che prendono il nome di concatenameri, cioè dei polimeri concatenati uno dopo l'altro. L' elettroporazione invece consente di introdurre all'interno della cellula corrisponde al gene che noi abbiamo aggiunto, non è espressa: questo potrebbe essere perché magari il DNA si è inserito all'interno di quelle regioni che non si esprimono cioè le regioni di eterocromatina, dove la cromatina è molto compatta e quindi non avviene la trascrizione , questo può accadere perché l'integrazione del DNA esogeno all'interno della cellula ospite avviene in modo casuale. Oppure può accadere che il gene aguti può essere espresso perché ha un promotore a parte. Infine, si può confermare il tutto andando ad effettuare una RT-PCR che va ad amplificare il cDNA ea verificare la presenza del gene agouti, e del gene della neomicina. Se anche questa tecnica ha dato un esito positivo vuol dire che effettivamente il DNA sia integrato ma la proteina non si produce magari a causa di un errore nella sintesi proteica. USO DEGLI ANIMALI TRANSGENICI: si può ad esempio prendere un topo con una patologia e inserire all'interno del suo genoma un gene umano sano e vedere se l'espressione di quel gene può recuperare andando quindi ad eliminare la patologia. Si possono invece modificare gli animali per poter generare dei modelli murini di patologie umane ovvero animali che portano le stesse mutazioni riscontrati negli umani, in questo modo si può sia studiare la patologia che un eventuale terapia. gli animali transgenici inoltre possono essere utilizzati per produrre i farmaci , ad esempio nel caso di topi in grado di produrre insulina umano, questo perché quando l'insulina e non funziona nell’uomo si va a generare la patologia del diabete, in modo particolare con il diabete di tipo 2 abbiamo una resistenza periferica all'insulina, l'insulina viene prodotta normalmente ma non funziona perché non riesce ad entrare nelle cellule per essere metabolizzata, in un primo momento essa quindi viene prodotta continuamente ma questa iperproduzione dopo un determinato intervallo di tempo porta all' esaurimento delle cellule beta del pancreas che di seguito porterà alla carenza di insulina. Fino a 30 anni fa l'unica insulina che poteva essere somministrata era quella di origine suina, ma si verificavano una serie di problemi perché nonostante i due tipi di insulina fossero comunque simili, si generava una resistenza in quanto l'insulina di origine suina veniva riconosciuta come no-self, e quindi si generavano una serie di anticorpi contro di essa con formazione di una reazione. Quando il gene dell'insulina fu isolato, fu preso il cDNA e venne inserito all'interno di diverse cellule sotto un promotore forte e veniva così prodotta insulina umana che tutt'oggi utilizzata. INATTIVAZIONE DEL GENE Un gene è formato da una serie di esoni ed introni, se vengono eliminati degli esoni tale gene non funzionerà più e quindi non si avrà più la produzione della proteina per cui normalmente codifica, il gene però non viene eliminato ma viene inattivato nel suo locus cromosomico. Per stabilire la regione del gene che deve essere inattivata dipende dalla funzione della proteina, se consideriamo i fattori di trascrizione questi presentano un dominio che lega il DNA e un dominio che interagisce con le altre proteine, quindi si potrebbe intervenire su entrambi i domini inattivandoli. Nel caso della proteina di membrana si potrebbe intervenire nel modificare l'esposizione della stessa proteina evitando quindi l'interazione tra recettore o ligando. O ancora nel caso degli enzimi si possono andare a bloccare i siti attivi. Ad esempio, se un determinato gene è formato da sei esoni e voglio andare ad inattivare l‘esone 3 e l’esone 4 cosa si può fare? In laboratorio andiamo a generare una copia del gene in cui alcune regioni sono conservate e altre vengono modificate, nel nostro caso le regioni corrispondenti all’esone 3 e 4, formando l’incoming vector. Questo processo prende il nome di ricombinazione e può essere distinta in ricombinazione omologa e ricombinazione non omologa, quella non omologa è anche definita illegittima perché viene effettuata tra due sequenze diverse. La ricombinazione omologa risulta essere molto rara, per un evento di ricombinazione omologa bisogna ricorrere al processo della selezione, infatti si vanno a sostituire nel nostro caso all’esone 3 e 4 il gene della resistenza alla neomicina e il transgene aguti. Il vettore che si costruisce deve avere le regioni al 5’ e 3’ in quanto la ricombinazione omologa è favorita dalla lunghezza delle regioni di omologia, infatti più sono lunghe queste regioni e più facilmente si verifica l'evento, queste regioni non devono mai scendere al di sotto delle 1000 basi. Queste sequenze di omologia sono posizionate al 5’ e 3’ perché non si sa in che direzione avviene l'evento di ricombinazione quindi la sequenza di omologia è presente ad entrambe le estremità. Queste regioni di omologia sono anche chiamate box di omologia e devono andare a fiancheggiare la porzione che si vuole sostituire, il nostro gene sarà quindi formato da: 2kb I [neoR - transgene - Agoutif l 3 kb ESO1-ES02-BOX DI OMOLOGIA AL 5’- GENE NEOMICINA- TRANSGENE AGUTI- BOX DI OMOLOGIA AL 3’- ESO5-ESO6 Per poter inserire il vettore genico all'interno delle cellule staminali embrionali si va ad utilizzare la tecnica dell'elettroporazione in quanto questa è l'unica che fa entrare una sola copia di DNA, perché se entrerà più DNA si avrà l'inserimento del materiale ovunque quindi c'è la possibilità che la ricombinazione sia non omologa mentre, facendo entrare poco DNA si posizionerà specificamente nel suo locus favorendo la ricombinazione omologa. Una volta che il gene viene integrato e mostra la resistenza alla neomicina si deve stabilire se la ricombinazione è avvenuta nella posizione giusta, Questo lo si può fare andando ad aggiungere un altro marker di selezione che è TK cioè la timidino-kinasi che codifica per la chinasi della timidina che trasforma la timidina in TMD. IK 1 2 x ixP_5 16 RTKF Questo enzima risulta particolarmente abbondante nel virus herpes, si manifesta con la comparsa di vescicole e viene quindi utilizzato un farmaco che è l'aciclovir, una pomata da mettere sulla vescicola appena viene abbozzata quindi viene somministrata nella fase iniziale in cui il virus deve cominciare replicarsi per infettare, mentre se il virus è già replicato non avrà la sua efficacia. Quindi alla sequenza dell'incoming vector si va da giungere alle due estremità il gene che codifica per TK dell'herpes. essendo questo un virus dell'herpes non fa parte del genoma umano, quindi se si realizza un evento di ricombinazione omologa questo genere viene escluso perché appunto la sequenza virale non ha omologia, se invece la ricombinazione che si verifica e non omologa si inserisce anche il gene TK. Questo viene visto in quanto prendo le cellule e le metto sul fondo dell’agar e inserisco poi il farmaco aciclovir, le cellule che hanno assimilato anche il gene TK in presenza di questo farmaco vengono uccise e quindi è avvenuta la ricombinazione non omologa, mentre se la cellula non muore sta a significare che è avvenuta la ricombinazione omologa. Una volta effettuato ciò, le cellule vengono fatte crescere e poi vengono isolate dalle altre , a questo punto bisogna fare un analisi molecolare per vedere se effettivamente l' evento di ricombinazione è avvenuto e ciò si può fare sia tramite la southern blot, per andare a verificare l'organizzazione del genere oppure tramite la PCR: ho un frammento di DNA che conosco e indicavo i due filamenti, vado a sintetizzare una coppia di primer in maniera da essere complementari a due filamenti, o un primer lo chiamo forward e un altro lo chiamo reverse, ci servirà poi la polimerasi che consentirà di effettuare la sintesi. Andando a prendere in considerazione, ad esempio il cromosoma 10 e la regione che va fiancheggiare il gene dove vado a posizionare un primer che mi va a delimitare il frammento di DNA in questione, l'altro primer lo metto sul gene della neomicina. Questo frammento si può amplificare soltanto nel caso in cui è avvenuta la ricombinazione omologa in quanto soltanto in quel caso il gene della neomicina viene a trovarsi sullo stesso segmento di quel frammento di DNA dove è presente il primer, se fosse invece avvenuta una ricombinazione non omologa la neomicina non avrebbe mai trovato la stessa sequenza. Per quanto riguarda il southern blot si prende il DNA della cellula e si digerisce con gli enzimi di restrizione si vanno così ad ottenere una serie di frammenti di varie dimensioni che vengono poi separati sul gel di agarosio, vengono denaturati e si rendono a singolo filamento, dal gel si trasferiscono su una cellulosa e si fa l' ibridazione con una sonda di DNA. a questo punto vengono fuori delle bande di varie dimensioni ma a noi interessa sapere quali sono le bande di corrispondenza del gene, per questo si va utilizzare una sonda che permette di ottenere l'ibridazione degli acidi nucleici, si vanno quindi ad appaiare i frammenti di DNA complementari. Si va a utilizzare il CONA che si marca con isotopi radioattivi per fare in modo che la banda dove venuto l'appaiamento si va ad evidenziare. Si possono ad esempio formare tre bande, la banda uno corrisponde al tratto 5’, la banda due alla regione centrale e la banda tre alla regione 3’. si va poi a prendere il DNA delle cellule non trasfettate, si va a digerire con l'enzima e si va a fare l'ibridazione con il nostro gene e anche in questo caso si vanno ad ottenere le tre bande questo è il DNA di riferimento che si va a comparare con quello della cellula Topo normale Topo transgenico ricombinante. Qualora è avvenuta la ricombinazione questa è ii Oz avvenuta su un solo allele, quindi avremo che la 3-4 3-4 prima e la terza banda sono sempre uguali, mentre i la seconda è un po’ diversa perché appunto 5-7 5-7 = andremo ad avere un allele normale e un allele mutato questo fa sì che la banda diventa più debole. Quindi l'intensità della banda che corrisponde alle parti conservate del genere saranno della stessa intensità della cellula con il DNA di riferimento, mentre invece l'intensità della banda dove è avvenuta la ricombinazione omologa sarà una banda di intensità inferiore. Questo ci permette di andare ad affermare che l'evento è stato effettuato e in maniera corretta. Adesso le cellule si possono impiantare nella blastocisti, la blastocisti è però formata da due tipi di cellule quelle della blastocisti ricevente, e quelle che sono state impiantate punto si avrà quindi una blastocisti chimerica perché vanno ad avere due tipi di cellule con patrimonio genetici diversi. KNOCKOUT CONDIZIONALE dr «n «a i | = sor bu Promotore « « ppi transar « @ ZZZ fu ine bersagli Jersaolo A La mancanza di un determinato gene può andare a determinare l'alterazione dello sviluppo che coinvolge vari apparati, ma non sappiamo di preciso qual è il primo apparato ad essere alterato e che può poi portare modifiche a carico degli altri quindi non andremo ad avere delle informazioni specifiche all'interno di un determinato organo o tessuto, questo però non è permesso con le tecniche viste in precedenza in quanto con quelle tecniche il gene veniva inattivato in tutte le cellule. Per eseguire un'attivazione mirata si è partiti da organismi più semplici come i batteri e fagi, utilizzando la ricombinazione conservativa si perde materiale che colpisce un sito specifico. Nei batteri e nei faggi la ricombinazione colpisce delle sequenze molto piccole di una lunghezza tra i 50 e 100 nucleotidi, questo va a generare dei riarrangiamenti di DNA ma essendo delle regioni molto piccole non c'è bisogno di avere una omologia particolarmente estesa. Questa ricombinazione si verifica perché A Cre-loxP system O Cre recombinase (38 kDa) loxP site loxP- loxP loxP sequence (34 bp) s' -ATAACTTCGTATANNNTANNNTATACGAAGTTAT- 3 2. Inactivated Gene Y vengono riconosciuti i dei siti specifici tramite la presenza di un enzima che prende il nome di ricombinarsi che catalizzano lo scambio tra due filamenti con un taglio e poi la riunione dei due monconi. Il fago che viene utilizzato è un batteriofago lisogenico con la funzione lambda in grado di provocare sia la Lisi delle cellule sia ad integrarsi all'interno del genoma. Questo essendo un batteriofago colpisce batteri e codifica per la proteina CRE che è una ricombinasi che è capace di tagliare e cucire due sequenze, in particolare è in grado di riconoscere una sequenza precisa formata da 34 coppie di basi che prende il nome di LoxP. Il fago lambda contiene una struttura di pedicelli e presenta un corpo e una testa nella quale è contenuto il materiale genetico. Il fago attraverso la struttura periferica attacca la parete cellulare e determina la formazione di una serie di pori attraverso i quali il DNA vieni iniettato all'interno della cellula batterica formando l'infezione fagica. Una volta che il DNA è entrato all'interno della cellula avremo che la ricombinasi facilita la circolarizzazione del DNA fagico, che fino a questo momento è stato lineare e che contiene un sito P ad entrambe le estremità dove è contenuta la sequenza LoxP. Si va poi ad ottenere una struttura circolare con LoxP1 da un lato e LoxP2 dall’altro. Questa circolarizzazione permette la replicazione del DNA e poi le conseguenti trascrizioni e traduzioni. La replicazione richiede l'origine ORI sulla quale la polimerasi della cellula inizia a sintetizzare determinando lo spostamento progressivo del filamento e generando quindi la sintesi del filamento complementare. Si va poi ad avere la lisogenia, cioè il genoma fagico viene introdotto all'interno del genoma della cellula, infatti il filamento ottenuto viene staccato e le varie molecole prodotte vengono liberate sottoforma di tanti multimeri che verranno tagliati per ottenere le singole unità di genoma fagico. La ricombinazione vera e propria inizia quando la proteina CRE Lega un sito di riconoscimento LoxP formato da circa 34 coppie di basi, queste 34 coppie di basi vanno ad avere una regione centrale di circa 8 nucleotidi i quali in base a come sono disposti permettono di fare avvenire l'appaiamento in una direzione piuttosto che in un'altra. Questi eventi sono definiti dall'attività della specifica ricambinasi, infatti se viene utilizzato una ricombinarsi diversa questa non andrà a riconoscere e allegare LoxP, questo è il principio che si può mettere alla base del meccanismo nel quale inattiviamo un determinato gene all'interno di un determinato tessuto infatti per fare ciò bisogna avere un sito che viene riconosciuto da una specifica ricombinarsi che funziona solo in quel determinato tessuto in modo tale che quell’evento non si verifica anche negli altri tessuti diversi. . cei Si è pensato quindi di Cre-lox Tissue-Specific Knockout, cont. fire un animale in cui viene espressa la proteina CRE tessuto n + EI5- specifica e un altro se Xx nie TERM - animale nel quale invece viene circoscritta la zona hemizygous cre homozygous “floxed” mouse che si vuole eliminare heterozygous “floxed” gene del nostro gene, andando ad inserire delle bandierine di segnale rappresentate da LoxP a monte e a valle, questi due animali vengono fatti incrociare e solo in quella cellula in cui si esprime la proteina CRE, avviene la ricombinazione. Per quanto riguarda il topo transgenico che esprime la proteina CRE questo sarà formato da: sequenza promotrice + gene CRE + la regione 3’UTR con la coda poliA + gene di resistenza alla neomicina + il transgene aguti + il gene della resistenza all' ampicillina + il sito di inizio per la replicazione (ORI). Il gene CRE essendo un gene fagico, non è interrotto dagli introni ma è lineare con il proprio RNA, quindi dopo il promotore viene subito messo il gene CRE, inoltre gli RNA dei batteri non hanno una regione 3’ con una coda poliA, quindi hanno bisogno di questa resistenza che gli permette di essere riconosciuto e di poter quindi aggiungere la coda di poliA, poi bisogna scegliere la giusta sequenza promotrice, infatti se si vuole fare esprimere questa proteina ad esempio nel fegato bisogna mettere un promotore specifico per il fegato e che quindi possa funzionare esclusivamente nelle cellule epatiche. Oltre al topo CRE bisogna generare anche un topo che sia LoxP: se il gene che si vuole inattivare è formato da 6 esoni, se la porzione da eliminare è ad esempio rappresentata dagli esoni 3 e 4, si vanno ad inserire le LoxP tra l’esone 2 e 3 e tra l’esone 4 e 5 in modo tale da circoscrivere la zona da eliminare. Se si incrociano queste due animali si genererà un unico animale che avrà il nostro gene di interesse che contiene una copia modificata e una normale e che produrrà la proteina CRE solo nel fegato, dove riconoscerà le sequenze LoxP e effettuerà l’escissione. Nei geni che non esprimono CRE la loro funzione è normale, perché mancando la proteina CRE i siti LoxP è come se non ci fossero. TRASCRIZIONE INTEGRAZIONE LIBRO IL MECCANISMO DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI Negli eucarioti vi sono: - 3 diverse Rna polimerasi (pol. I, pol. II, pol. III) che permettono la trascrizione a partire da promotori diversi; ognuna di esse trascrive per uno specifico RNA (pol. I 3 rRNA, pol. II > mRNA, pol. III > trascrive i tRNA) - A differenza dei procarioti, la polimerasi non viene associata al fattore o il riconoscimento del promotore. Ci sono invece numerosi fattori di trascrizione, fra questi ve ne sono varie classi: ®* fattori generali di trascrizione (GTF) sono quelli che riconoscono il promotore basale, che si localizzano al livello del promotore e che poi richiamano l’RNApol (quindi si può dire che mimano l’azione del fattore o dei procarioti); * il complesso mediatore che è costituito da varie sub-unità ed è molto grande come complesso; ® altri fattori che legano il DNA. N.B.: qualunque fattore che interviene nel richiamo dell’attivazione del promotore, in realtà non è mai un fattore che interagisce o solo con la proteina o solo con il DNA, ma stabilisce sempre moltissimi rapporti soprattutto proteina-proteina. ma inizia in punti differenti (quindi la sua eliminazione dà origine a trascritti multipli con differenti punti d’ inizio). Questo è un elemento ben conservato del promotore dei geni eucariotici (dal lievito agli eucarioti superiori): dopo la sequenza T-A-T-A la quinta base può essere una A o una T, e la sesta è una A (in realtà si può anche estendere un’altra base a monte e un’altra base a valle). Mentre la prima T è presente solo nel 7% dei casi (infatti può essere anche un’altra base), le altre basi sono estremamente conservate. INIZIATORE: determina il preciso punto d’inizio del trascritto. Ha una sequenza consenso che non si è ben mantenuta, cioè è degenerata, però è sempre ricca in pirimidine: Py-Py-A-nn-T/A-Py-Py +1 Ì Punto d’inizio della trascrizione DPE: (promotore a valle) è un componente comune dei promotori della RNApol II che non contengono una TATABox; questo elemento è presente solo nei promotori che mancano di TATABox. Alcuni promotori sono TATABox less, per cui il promotore basale contiene solo Inr e DPE N.B.: quello che abbiamo descritto è il promotore basale, ma aggiunti gli altri elementi di cui parleremo più avanti., ogni promotore degli eucarioti diventa unico. I FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE(TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIF) Hanno le stesse funzioni del fattore o dei procarioti, quindi: * aiutano la RNApol a legare il promotore * permettono di denaturare localmente il DNA * una volta legata l’RNApol la aiutano a evadere, cioè lasciare il promotore per iniziare la fase di allungamento. Assemblaggio dei GTF: formazione del COMPLESSO DI PREINIZIO L’ RNApol II forma un complesso di pre-inizio con i fattori generali della trascrizione sul promotore: 1. TFyDsi lega al promotore a livello delle sequenze TATA; TFD ha una massa totale di 800kD (fattore molto grande che si estende per tutto il promotore) ed è costituito da: TBP (TATA Binding Protein, cioè proteina che lega TATA) che è la sub-unità che riconosce la TATABox, e da 11 TAF (di cui alcuni sono capaci di legare DPE e Inr). Queste TAF aiutano la TBP a riconoscere ed a legare la TATABox ed alcune hanno la capacità di legare esse stesse il DNA (in particolare sono la TAF150 e la TAF850). TBP si lega al DNA in modo molto particolare e determina in esso una distorsione a livello delle sequenza TATA. Questo fa sì che gli altri elementi che si vadano a legare al promotore, vengano legati con una maggiore forza. TFiD posiziona il complesso con l’RNApol sul DNA 2. Dopo che si lega TBP entrano altri 2 fattori di trascrizione generali: prima TFyA (che serve ad aumentare l’affinità di legame di TF,D al promotore, quando ancora 1’ RNApol non è stata reclutata) e poi TFiB che, riconoscendo la regione del promotore core, si lega all’elemento più a monte (BRE) e ai fattori TFyD-TFyA che sono già posizionati. Successivamente viene reclutata l’RNApol, la quale entra già associata ad un altro fattore, TFyF, il quale si lega reversibilmente alla RNApolII, la indirizza verso il promotore e stabilizza il complesso DNA- TBP- TF1B, prima che TFyE e TF1H vengano legati. 3. Infine entrano altri 2 fattori che sono TFyE e TFyH, i quali, diversamente dagli altri, si vanno a posizionare davanti la RNApol. TFyE recluta e stimola l’attività elicasica di TFiH; TF1H svolge 3 funzioni: attività elicasica e ATPasica (che servono per denaturare il DNA) e attività chinasica (che serve per la fosforilazione della coda CTD dell’RNAPol). Grazie all’attività elicasica di TFnH, che richiede l’idrolisi di ATP, viene denaturato il DNA a livello del promotore. N.B.: TFiH lo si trova anche nei processi di riparazione dei mismatch dove svolge attività elicasica e ATPasica 4. Cosìsiè venuto a formare il complesso di pre-inizio. Nel momento in cui si forma la bolla di denaturazione, anche qui, come nei procarioti, si hanno dei tentativi di sintesi del trascritto, cioè anche qui si hanno degli inizi abortivi; poi quando poi riesce ad arrivare al promotore, è allora che si determina la sintesi continua. Tra la fase di pre-inizio e quella di allungamento la coda CTD della RNApol viene fosforilata. Ciò è un avvenimento estremamente importante poiché guiderà sia la fase di allungamento che quella di maturazione degli RNA; in funzione della sua vicinanza con il canale di uscita dell’ RNA, su questa coda verranno assemblate tutte le proteine necessarie per la maturazione degli RNA. Nella successiva fase di allungamento l’RNApol si libera di tutti i fattori generali di trascrizione (poiché essi avevano solo la funzione di posizionarla a livello del promotore e stimolare l’inizio della trascrizione). Molti di questi fattori generali di trascrizione sono bersaglio di attivatori, cioè altri fattori che si legano più a monte del promotore core, i quali hanno la capacità di collegare varie porzioni del promotore core con le regioni regolatrici (cioè porzioni del promotore che si trovano ancora più a monte). TBP (Tata Binding Protein) - In molti, ma non in tutti, i geni per gli mRNA lega il DNA nel solco minore sulla sequenza TATA (a circa — 25 bps); - a livello della TATA Box TBP determina un’incurva il DNA di circa 80°; - la TBP è un fattore di posizionamento utilizzato, nel complesso d’inizio, che si ritrova nei promotori per tutte e 3 le polimerasi: * TPB o TFD per la RNApol I * nel caso dei promotori dell’ RNApol I vi è un fattore SL1 che contiene TBP I « « “« . RNApol III l’equivalente è la TEyjB (fattore che contiene TBP) Quindi tutti e 3 i promotori sono riconosciuti da un fattore che contiene la TBP o un equivalente (quindi che ha la stessa funzione). Il legame così caratteristico di TBP è dovuto a 2 motivi: non solo si inserisce nel solco minore della sequenza TATA, ma inoltre, stranamente, non lo fa con un’a-elica, ma con una regione a foglietto B. Nell’inserirsi allarga talmente tanto la sequenza, che appiattisce la regione di DNA in cui si inserisce di circa 80°, sebbene non distacchi i filamenti, cioè le basi continuano ad essere appaiate. Per lo più interazioni fra TBP e DNA a questo livello avvengono fra le basi della sequenza TATABox e le catene laterali di 2 fenil-alanine che si trovano nella porzione C-terminale della proteina. TBP riconosce nella TATABox la possibilità di subire una distorsione specifica Il complesso ternario TF,B-TBP-promotore TFyB riconosce questo complesso grazie anche alla deformazione data dalla TBP. TFyB è un fattore abbastanza grande, tanto è vero che interagisce con il solco minore a valle della TATABox, e con il solco maggiore a livello dell’ elemento BRE (cioè prima della TATABOx). Altra caratteristica di TF1B che si rifà agli inizi abortivi della trascrizione: l’ N-terminale di TF1B s'inserisce nel canale d’uscita dell’RNApol II, andandolo ad ostruire (azione equivalente a quella svolta da 03.2 nei batteri). Ciò spiega perché anche negli eucarioti si determinano questi tentativi di inizio della trascrizione, in cui appunto anche in questo caso, l’RNApol trascrive brevi tratti e li rilascia, fino a che riesce a liberare il canale dell'RNA determinando l’evasione del promotore e quindi inizia così la fase di allungamento. Evasione del promotore: richiede la fosforilazione della RNApol L’ evasione del promotore, a differenza dei batteri, necessita non solo della liberazione del canale d’uscita degli RNA, ma richiede la fosforilazione della coda C-terminale della RNApol: il domino C-terminale (CTD) delle subunità maggiori della RNApol forma una coda (circa 8004) caratterizzata da numerose ripetizioni di una sequenza di 7 aa.(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser- Pro-Ser), le cui Ser nel complesso di allungamento sono fosforilate da chinasi specifiche, principalmente da TFH, che oltretutto è posizionato vicino a queste Ser. N.B.: il numero delle ripetizioni cambiano a seconda della specie ( ad es. nell'uomo vi sono 52 ripetizioni di questo eptapeptide) Ricapitolando, per posizionare la RNApol non c’è bisogno che la coda sia fosforilata, quindi si forma il complesso di pre-inizio; per passare alla fase di allungamento è necessaria l’attività chinasica di TF1H sulla coda. SEQUENZE REGOLATRICI A monte del promotore basale, anche distanti decine di kb, si localizzano altre sequenze necessarie per un’ efficiente trascrizione, le sequenze regolatrici: -sequenze attivatrici a monte (UAS) -elementi del promotore prossimale (cosiddette poiché fra tutte sono quelle che sono più vicine al promotore core (es. sequenze CAAT) -Enhancer (attivatori, cioè sequenze in grado di amplificare l’attività di trascrizione); si possono trovare a grandissima distanza dal promotore basale, inoltre un enhancer può funzionare anche su geni diversi -Silencer (inibitori, cioè silenziano l’espressione di un determinato gene) -Isolatori (insulator) -Elementi di confine (boundary elements) Tutte queste sequenze regolatrici sono riconosciute da proteine regolatrici (che possono essere attivatori o repressori). * Elementi del promotore prossimale Sono così detti perché sono posizionati più vicini al promotore core; essi sono molto comuni, cioè si trovano nella maggior parte dei geni. Ad essi si legano proteine attivatrici o fattori di trascrizione; esempi sono rappresentati dalla CAAT Box che lega la CAAT binding proteins, così come la GC Box (GGGCGGG) è un altro elemento del promotore prossimale estremamente comune, che viene legato del fattore di trascrizione SP1. Gli elementi del promotore prossimale possono essere variamente ripetuti (cioè vi possono essere più ripetizioni ad es. di CAAT Box, di GC Box...). * Gli ENHANCER: sequenze addizionali di DNA che regolano la trascrizione e la amplificano antiparallelo al filamento stampo del DNA. Una volta finito il processo di allungamento, bisogna terminare questo meccanismo e questo può avvenire perché sul filamento stampo del DNA ci sono particolari sequenze di basi che vanno a stabilire la terminazione. La regione di riferimento è la regione promotrice dove il sito +1 rappresenta il sito di inizio della trascrizione chiamato anche TSS, che rappresenta il punto dove il DNA diventa stampo per la sintesi di una nuova molecola di RNA. Viene definito promotore prossimale il punto in cui si assembla il macchinario della trascrizione, queste regioni vengono definiti elementi di regolazioni in cis perché sono adiacenti al gene che deve essere trascritto. L'elemento principale della trascrizione si localizza intorno a -25 ed è la TATA box che consente l'inizio dell'assemblaggio dell’apparato generale della trascrizione. Nel nucleo delle cellule eucariotiche vi sono almeno tre diversi tipi di RNA polimerasi, ognuna delle quali riconosce sul DNA promotori diversi per sequenza e posizione e va sintetizzare specifici tipi di RNA. Quella che noi prendiamo in considerazione è la rana Punto inizio polimerasi II in quanto va trascrivere per l'RNA sani 1 tt Messaggero che andrà poi a codificare per le proteine. 60 40 -20-10 1020304050 Negli eucarioti la sequenza TATA è l'unica che viene riconosciuta in maniera specifica dal fattore TFIID na attraverso il suo componente TBP, infatti il fattore ; TEP silega alla scanalatura IFIID risulta costituito dalla proteina TBP e da altre DE dé orge lia {NA proteine TAF, la proteina TBP riconosce e Lega la i TATA box. TBP e una piccola proteina formata da una regione globulare che lega il DNA nel solco minore, al © re contrario degli altri fattori che solitamente legano il ) DNA nel solco maggiore perché è più ampio e garantisce SE _ una maggiore superficie di interazione. Ma proprio © #SZSZAZSZ l'interazione con il solco minore fa sì che il DNA subisce TE un ripiegamento di circa 80 ° che fa allargare il solco minore fino ad assumere una conformazione quasi piatta che va ad aumentare l'interazione del DNA con le altre proteine. Una volta che TBP lega il DNA richiama le b altre proteine TAF il cui numero può variare dalle 8 fino Polimerasi alle 12, l'assemblaggio di tutti questi fattori sulla TATA box fa sì che vengano richiamate tutte le altre proteine dell'apparato di trascrizione. TATA box non serve soltanto per il legame con TBP ma anche perché si è visto che in alcuni esperimenti è stata spostata da -25 a -30 in modo da allontanarla dal sito di inizio della trascrizione, ma effettivamente questo provocava uno spostamento anche del sito di inizio di circa 5 posizioni, questo ci fa capire che questa sequenza è una sorta di spaziatore di lunghezza fissa e infatti viene anche definito elemento di posizionamento perché fa in modo che posiziona tutto l'apparato trascrizionale per far cominciare la trascrizione in un punto ben preciso. Vi sono anche promotori privi di TATA box, che vengono definiti TATA-less dove il sito di inizio può variare, questi promotori non hanno nessun tipo di regolazione e sono definiti housekeeping, questi si trovano nei geni come l'actina che deve essere sempre trascritta e quindi i livelli di trascrizione devono essere costanti e non risentono di nessuna modifica, questo è un modo in cui la cellula si assicura di non variare l'espressione di alcuni geni fondamentali. Dopo aver legato il fattore TFIID si lega il fattore TFIIA, quest'ultimo si va a posizionare a Monte rispetto TFIID, ha un ruolo di rimozione di un controllo negativo dell’apparato, infatti TFIIA è il segnale che si sta assemblando il complesso in un promotore che deve essere trascritto, quindi è un segnale di via libera per le fasi successive. In particolare, TFIIA riconosce uno dei fattori TAF e lo rimuove perché questo fattore è un elemento negativo che prova un blocco, una volta eliminato dell'evento negativo si invia un segnale a TFIIB che va invece a posizionarsi a valle, questo grazie al ripiegamento che ha subito il DNA va a prendere contatto con TFIIA. TFIIB stabilisce la velocità con cui avviene l'assemblaggio e la velocità della regolazione della trascrizione. In seguito, viene reclutato il fattore TFIIF che porta con sé la polimerasi II che è molto più grande rispetto ai singoli fattori e infatti con il suo legame va a coprire la maggior parte del filamento di DNA. A questo punto viene reclutato il fattore TFIIE e si crea così il complesso di preinizio che risulta essere un complesso ancora instabile, infatti ha bisogno degli ultimi due fattori: viene così reclutato TFIIH che è l'unico fattore che va da avere un'attività enzimatica, infatti è una chinasi che va a fosforilare una sequenza specifica formata da 7 aminoacidi che si trovano nel dominio carbossiterminale della subunità maggiore della polimerasi II. In particolare, di questi 7 amminoacidi andiamo a trovare due serine in posizione 2 e 5 che sono facilmente fosforilate, in particolare viene fosforilata la serina in posizione 5. nell'uomo questo elemento è ripetuto circa 60 volte e per ogni elemento abbiamo l'aggiunta di un gruppo fosforico quindi si vanno a consumare 60 molecole di ATP, e se non avviene la fosforilazione non può avere inizio la trascrizione. A questo punto viene richiamato l'ultimo fattore TFIIJ che è un elicasi, svolge il DNA e lo denatura a partire dalla TATA box, in quanto questa è formata da Timine e adenine, che sappiamo essere legate da soli due legami idrogeno, quindi richiedono un minor consumo di energia per essere spezzati. Con l'inizio della trascrizione non tutti i fattori restano uniti alla polimerasi ma si va da avere la liberazione del promotore seguita poi dall' allungamento, viene fatto una sintesi iniziare di una ventina di nucleotidi , questa prende il nome di sintesi abortiva che viene effettuata per testare tutto il macchinario della trascrizione ed essere sicuri che funziona nel modo corretto per evitare gli errori , questo processo viene effettuato in quanto la trascrizione è un processo in cui si ha un elevato consumo di energia, quindi si cerca di evitare sintesi errate. Una volta superata la fase abortiva, si ha la liberazione del promotore e con il rilascio di alcuni fattori e l'inizio della fase di allungamento con il richiamo di altri fattori questa volta però appunto di allungamento. Uno dei fattori di allungamento più importanti e P-TEFb che causa la perdita della fosforilazione sulla serina in posizione 5 e trasferisce la fosforilazione sull’altra serina, in posizione 7 e questa modifica richiama altri fattori di allungamento che si caricano sulla polimerasi. Nel momento in cui si libera il promotore molti fattori vanno via, la polimerasi carica su di sé altre proteine come le proteine dell’incappucciamento, in quanto sappiamo che l'RNA Messaggero una volta sintetizzato subisce il processo di capping perché questa sequenza è facilmente attaccabile dalle esonucleasi quindi bisogna proteggere le estremità; la polimerasi carica poi altri fattori per lo splicing e in ultimo le proteine che fanno parte dell’apparato di poliadenilazione. Ci sono delle piccole regioni di DNA composte dai 6 agli 8 nucleotidi che sono elementi di risposta , vengono riconosciuti da specifici fattori questi vengono definiti elementi in cis che vengono quindi riconosciuti dai fattori in trans, e sono delle proteine sequenza specifiche che riconoscono solo particolari tipi di sequenze come la sequenza CAAT box, queste sequenze servono ad aumentare l'efficienza della trascrizione infatti in base a questo si possono differenziare promotore forti e promotori deboli, se si considera solo il promotore questo avranno efficienza di trascrizione uguale a 10 ma con l'aggiunta di queste sequenze l'efficienza posso salire a 100. Le proteine che legano il DNA sono fattori di trascrizione e possono essere rappresentati da diversi tipi di domini: ® Dominia dita di zinco: sono delle strutture a forma di dito che si stabilizzano per la presenza di un atomo di zinco, il quale si lega a quattro aminoacidi, ® © questi possono essere Si Ò og ne” 905 ne quattro cisteine oppure 2 cisteine e 2 istidine. La 00° Hi 00000. %000 009 00 struttura è formata da un aminoacido che sia cisteina o istidina, altri due o tre amminoacidi di differenza , poi si ripete un amminoacido di cisteina o istidina , poi abbiamo la struttura del dito costituito a sua volta da circa 13 amminoacidi, un altro residuo di cisteina o istidina , due o tre amminoacidi di differenza e infine l'ultimo residuo di cisteina o istidina abbiamo poi l'atomo di zinco posizionato al centro della struttura e fa legami di interazione con le cisteine e le istidine. quando sono presenti più di due dita di zinco l'atomo di zinco interagisce allora con due istidine e due cisteine, la presenza di più di due dita di zinco consente di aumentare l'affinità di legame al DNA, quando sono presente solo due dita di zinco allora si realizzerà una struttura diversa con quattro cisteine. gli amminoacidi che costituiscono la vera e propria strutturare il dito, quindi la parte più esterna, sono amminoacidi carichi positivamente e che quindi possono andare ad interagire con le cariche negative del DNA, l'estremità all' N-terminale assume una struttura a foglietto beta, mentre la regione all’C-terminale assume una struttura ad Alfa elica , questa conformazione fa in modo che il dito di zinco si introduce nel solco principale del DNA ® Dominio omeotico: è formato da una Il braccio struttura elica-giro-elica in particolar Le eliche 1 82 SARTORIA ra modo vi sono tre eliche e due giri, le tre sono sopra il DNA eliche della struttura si dispongono secondaria . , ° 7 diversamente l'una rispetto all'altra e vengono definite a, b e c; l'elica B si inserisce nel solco maggiore del DNA mentre le altre due eliche L'elica 3 entra nella scanalatura principale servono per dirigere l'elica b e posizionarla correttamente nel solco. . cerniera è infatti un motivo di interazione proteina-proteina, ogni 7 amminoacidi si va ad inserire un residuo di leucina, questa regolarità nel posizionamento stesso, queste sono quelle sequenze che vengono riconosciute e legate dai fattori di trascrizione come AP3, AP2, AP1, OTTAMERO. A questo punto la domanda che sorge spontanea è perché i promotori garantiscono un’efficacia della trascrizione minore nonostante fattori di trascrizione che si legano sono gli stessi che legano gli enhancers? La risposta in realtà è molto semplice, il promotore di SV40 è costituito da circa 150 basi che contengono tre siti di legame, l'enhancers invece è costituito da 72 basi e contiene quattro siti di legame. Ogni fattore quando si lega copre un certo pezzo della molecola che è lungo circa 20 nucleotidi, se ogni proteina copre 20 nucleotidi allora sta a significare che quattro proteine ne coprano 80 e che quindi il frammento degli enhancers è completamente coperto. Mentre invece se consideriamo i 150 nucleotidi del promotore, i tre siti di legame vanno a coprire soltanto 60 nucleotidi quindi meno della metà dell’intera lunghezza del promotore. Questo fa sì che l'enhancers lega gli stessi fattori ma presenta una quantità di carica maggiore e quindi ha una maggiore capacità di interazione con le proteine. Affinché però enhancers possono funzionare è necessario che il DNA si pieghi in modo tale che i fattori legati all’enhancer possono interagire con i fattori legati al promotore. L'interazione che si deve formare tra i fattori legati all enhancers e i fattori legati al promotore può essere diretta quindi con la formazione di un ponte proteico tra enhancers e promotore, ma può essere anche indiretta in quanto può capitare che l' enhancers non riesce ad interagire con il promotore, in questo caso interviene un co attivatore che si posiziona tra l' enhance e il promotore mediando l'interazione tra i fattori. Ogni elemento responsivo sul DNA è un modulo, ogni modulo presenta una sequenza riconosciuta da un fattore di trascrizione che è a sua volta presenta una sequenza rivolta verso l'esterno che interagisce con le proteine vicine che possono essere localizzate sia sul promotore prossimale che su quello distale. Il promotore distale variabile è formato infatti da elementi modulari che si possono mettere in ordine diverso, questi elementi legano i fattori e l'insieme delle interazioni che si vanno a stabilire tra il DNA e i fattori di trascrizione, tra i fattori di trascrizione e i fattori dell'apparato basale del promotore prossimale, va a determinare l'espressione di un gene. Una caratteristica della struttura modulare del promotore e quello della tessuto specificità infatti esistono dei meccanismi che fanno in modo che l'espressione di alcuni geni avvenga solo in specifici tessuti. Se ad esempio consideriamo l'albumina, il gene dell'albumina ha un promotore di un determinato tipo e uno dei fattori che si vanno a legare a questo promotore è un fattore tessuto specifico che si può legare al promotore dell'albumina perché prodotto solo nel fegato. Quindi nel fegato è presente questo fattore tessuto specifico che si può legare al promotore e può essere quindi prodotta l'albumina. Questo meccanismo però vale soltanto per alcuni geni ma non per la maggior parte dei geni, ad esempio il gene che codifica per a1 antitripsina è espresso solo nel fegato, questa è una proteina di fase acuta nella risposta infiammatoria, ma si è visto che sul promotore di questo gene c'è una particolare proteina HNFI1 e si pensava quindi che questa proteina si legasse al promotore in maniera tessuto specifica e facesse in modo che al antitrispsina si esprimesse solo nel fegato ma in realtà è stato visto che HNFI1 si esprime anche in altre cellule è stato quindi proposto un modello che si basa sulla struttura modulare dei promotori e quindi a seconda di come questi moduli si dispongono, i fattori che riconoscono questi elementi si legano e formano un complesso che fa la differenza e cioè che può determinare se il gene si esprime in maniera tessuto specifica. La base molecolare di questo meccanismo è data dalle interazioni tra le cariche esposte sul lato esterno del DNA dai fattori di trascrizione portate quindi dal dominio di trans attivazione, dove la diversa tipologia di questo dominio e le diverse interazioni vanno a determinare l'espressione differenziale dei geni. Inoltre, molti fattori di trascrizione quando legano il DNA si portano dietro delle proteine che sono dei coattivatori cioè proteine che partecipano agli eventi di trascrizione e interagiscono con i fattori di trascrizione mediante interazione proteina- proteina, questo assicura una maggiore efficienza della trascrizione. Ad esempio, le immunoglobuline vengono prodotte solo nelle cellule del sistema immunitario, anche se le cellule hanno tutte lo stesso genoma, ma una piccola quota si esprime in una cellula rispetto che in un’altra. Se nel promotore o sull’enhancer si sono messi una serie di fattori con ordine A-B-C, questo è un ordine specifico solo per quel gene, infatti in un altro gene possiamo trovare gli stessi fattori ma con un ordine diverso come C- A-B: se A e C sono positivi e B è negativo con l’ordine A-B-C ci sarà una determinata interazione ma se mettiamo C al centro, essendo A e C positivi si crea una repulsione questo porta ad cambiare la densità di carica e quindi l' interazione proteina-proteina e questo può far si che si vanno a generare delle interazioni più o meno forti che si trasmettono all’apparato basale e all’enhancer. Infine, nel caso delle immunoglobuline, in un tratto che precede la regione costante c’è una sequenza che è stata riconosciuta come enhancers questa non funziona fino a quando non viene posto in vicinanza degli altri quindi fino a quando non avviene la ricombinazione. Solo dopo l'arrangiamento l'enhancers può funzionare, questo meccanismo è però somatico avviene solo linfociti e quindi soltanto nei linfociti andremo ad avere la produzione di immunoglobuline. Viene definito mediatore un insieme di proteine che contengono i fattori dell'apparato basale ma anche altri fattori che sono posizionati sulla regione del promotore. Collegate al mediatore di sono anche i co attivatori che non hanno un dominio di legame al DNA ma possono interagire con le altre proteine facendo quindi da ponte tra le proteine legate a un tratto di DNA e proteine legate a un altro tratto di DNA. Ci sono vari modi in cui può avvenire una regolazione di espressione genica, possiamo avere un caso in cui il gene spento perché non si ha la proteina che lo va a trascrivere quindi manca il fattore di trascrizione che deve essere sintetizzato ex novo e solo dopo che viene sintetizzato può legarsi al promotore, questa è una situazione che prende il nome di on-off, in quanto per molti geni per poter ottenere la trascrizione si deve attivare tutto l'apparato (caso delle proteine omeotiche). Altre modalità prevedono che il fattore c’è già nella cellula ma non funziona quindi non è attivo perché non è fosforilato oppure ancora potrebbe essere già fosforilato ma con la fosforilazione risulta essere inattivo. O ancora potrebbe esserci una proteina che è già presente ma che non funziona perché non vi è uno specifico ligando, quindi solo quando arriva questa molecola con cui interagisce questo fattore diventa attivo come fattori di trascrizione. Ho ancora la proteina può essere presente ma magari può essere legata ad un inibitore che ne impedisce il funzionamento e quindi solo quando sotto determinati stimoli inibitore viene rimosso la proteina può funzionare come fattori di trascrizione (caso dei recettori nucleari). PROTEINE E GENI OMEOTICI (GENI HOX) Le proteine omeotiche contengono circa 60 aminoacidi e costituiscono il dominio omeotico, uno di quei domini che Lega il DNA formato da tre Alfa eliche e da due giri , dove le prime due eliche sono di posizionamento e prendono contatto con il solco minore, mentre la terza elica si va ad infilare nel solco maggiore questo dominio risulta essere molto conservato, infatti lo troviamo nella proteina UNc86 importante nello sviluppo di Caenorhabditis, nella proteina HIF alfa 2 che permette il passaggio del lievito da stato aploide a diploide, MOX2.4 nel topo è importante nel corso dello sviluppo embrionale. DROSOPHILA: abbiamo la cellula uovo che deve essere fecondata e come in tutti gli altri organismi la cellula uovo prima di essere fecondata contiene nel suo citoplasma soltanto RNA Messaggero che non viene tradotto ed è quindi di origine materna, solo dopo che è avvenuta la fecondazione arriva un segnale per cui questi messaggeri vengono prodotti e per cui si producono queste proteine che vengono appunto chiamate proteine omeotiche che fanno in modo che la cellula uovo che si è fecondata inizia a dividersi per la formazione dello zigote. Queste proteine si espongono all'interno di questa cellula in maniera da generare un gradiente e questo gradiente definisce quello che sarà il polo caudale e il polo apicale. Quindi lo zigote inizia a dividersi e comincia a formare l'embrione, l'embrione a un certo punto viene diviso e segmentato in 7 frammenti che sono divisi da un altro segmento che prende il nome di para segmenti, queste regioni sono determinati dalla presenza dell’espressione di alcuni geni che prendono il nome di geni di segmentazione e che vanno quindi a determinare le specifiche regioni dell'organismo quindi la parte cefalica, il torace, l' addome e poi la coda. Ognuno di queste regioni viene codificata e viene quindi determinata dal fatto che si esprimono alcuni di questi geni generando quindi delle cascate, si parla di cascate di attivazione trascrizionale perché abbiamo questi messaggeri che vengono tradotti e andiamo ad avere quindi una prima proteina omeotica che va ad attivare il gene per un'altra proteina omeotica. Queste regioni andranno poi a differenziarsi ulteriormente e andranno a produrre ad esempio nel caso del torace tutto quello che serve per lo sviluppo produttivo del torace stesso come ad esempio le ali anteriori che prendono il nome di bilancieri, nella zona addominale invece andremo ad avere le zampe posteriori e le ali posteriori. Per differenziare tutte queste regioni del corpo intervengono varie classi di geni, i geni materni quindi appunto i geni della madre che si esprimono nella cellula uovo ma il prodotto finale non si esprime fino a quando l'uovo non viene fecondato. Abbiamo poi i geni della polarità che permettono la formazione e la distinzione dell’asse cranio caudale e dell'asse antro posteriore. Vi sono i geni della segmentazione che sono coinvolti quando si iniziano a formare questi segmenti del corpo. I geni omeotici definiscono l'identità dei segmenti durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, una mutazione di un gene omeotico influenza l'espressione degli altri geni causando quindi la conversione di una parte del corpo in un'altra. Drosophila si compone di due complessi, il complesso antennapedia che rappresenta la regione anteriore e costituisce le prime zampe, se si prende il gene dell'antennapedia e si sposta più avanti si osservato che la zampa anteriore si è formata dove c'è regolarmente l'antenna e quindi nella regione posteriore. Poi abbiamo il complesso Bithorax che è costituito da tre segmenti della regione toracica, il segmento UBX che comprende il terzo segmento toracico ed è fondamentale per stabilire il numero di zampe e di ali che il L'aumento della concentrazione Perdita di vertebré toraciche ME i Ò di 0. acido retinoico può però portare ESTA durante lo sviluppo NIats1V.A\ I embrionale a un errore nell’embriogenesi, ad esempio si può osservare l’esofalcimia cioè formazione di mano con sei dita, oppure si può invertire l'ulna con il radio. Questo ci fa capire che è importante il gradiente e la concentrazione di acido retinoico, in particolare se l'acido retinoico viene somministrato dall'esterno alcuni geni HOX sono espressi in cellule che normalmente non li esprimono, infatti i ratti esposti ad acido retinoico durante lo sviluppo embrionale presentano molte formazioni craniofacciali, assenza di cartilagine, mancanza delle vertebre. L'acido retinoico è una sostanza che è presente in numerose creme antirughe, i geni bersaglio della pelle di tali prodotti assicurano elasticità ed idratazione quando invece non c'è acido retinoico si hanno con il tempo la comparsa di rughe e scarsa elasticità della pelle. Le donne in fase di gravidanza devono interrompere il trattamento con tali creme in quanto l'acido retinoico contenuta al loro interno viene trasferito tramite la placenta della madre al feto e si possono avere delle conseguenze gravi come appunto deformazioni delle ossa, spina bifida e labbro leporino. Nei Mammiferi un gene omeotico molto importante e il gene CDX2 che appartiene alla famiglia dei geni omeotici, contiene il dominio di legame elica giro elica e la struttura del DNA favorendo la trascrizione. Nell'uomo questo gene mappato sul cromosoma 13 e la proteina che ne deriva hanno un ruolo essenziale nell’embriogenesi e nell’organogenesi intestinali, le sue funzioni sono di indirizzare lo sviluppo e il precoce differenziamento dell' epitelio intestinale attivando la trascrizione di geni intestino specifico. Topi con doppia mutazione per questo gene mostrano una mortalità precoce, nei topi eterozigoti invece si osservano anomalie di sviluppo a carico dell’apparato scheletrico a carico del grosso intestino, questi fenomeni suggeriscono quindi che la proteina è necessario per mantenere la differenziazione nel cellulare dell'epitelio del colon. Queste proteine hanno tutte la stessa struttura e hanno la capacità di legare il DNA, ma la determinazione della specificità del legame dipende da altre proteine che si chiamano co fattori che possono modificare la specificità di legame col DNA e facilitare quindi l'azione del fattore di crescita. Nell'uomo le mutazioni riguardanti geni omeotici possono portare a varie patologie come la sindrome di Waardenburg che è una malattia molto rara che porta a difetti del viso e dello scheletro e alla pigmentazione dell’iride. Altra patologia può essere l'aniridia che è una malattia congenita data dal difetto del gene omeotico pax6 che caratterizzata dalla perdita dell’iride. O ancora sinpolidattilia che coinvolge il gene hoxd13 che porta ad una malformazione congenita delle dita dei piedi. Per quanto riguarda invece la famiglia dei geni omeotici TBX si possono avere patologie come la sindrome di George in cui andremo ad avere alterazioni facciali, depressione, disturbi psichiatrici e problemi di apprendimento. La sindrome mammaria ulnare che determina ipoplasia del seno ipogonadismo e obesità. E la sindrome di Holt-Oram che determina malformazione degli arti. 6 lombari RECETTORI NUCLEARI Esistono due tipi di recettori nucleari, il primo gruppo sono i recettori di classe I che comprendono recettori che legano i corticosteroidi, gli ormoni glucocorticoidi come il cortisolo, i recettori per i mineralcorticoidi come l' aldosterone, i recettori per gli ormoni steroidei come estrogeno e testosterone. Questi vengono definiti recettori perché sono appunto capaci di legare queste molecole che sono di natura idrofobica e quindi possono attraversare la membrana ed entrare nella cellula indipendentemente dalla presenza di possibili recettori di membrana. Il recettore in condizione basale è complessato con una proteina che appartiene alla famiglia delle proteine dello shock termico HSTF che in condizioni basali hanno un'attività da caperonine, hanno quindi bisogno di altre proteine per stabilizzarsi o per diventare attive. Il legame con le caperonine impedisce al recettore di andare nel nucleo in quanto lo lega in corrispondenza del segnale di localizzazione nucleare NLS che viene quindi mascherato. Questo segnale è costituito da una serie di amminoacidi basici, solitamente lisine, e fa da navetta tra nucleo citoplasma, se questo segnale viene bloccato la proteina rimane stabilmente nel citoplasma. Possiamo fare una serie di esempi: come nel caso degli steroidi in cui andremo ad avere una proteina che è inattiva ma che è già sintetizzata ma è legata comunque con qualche molecola che non ne permette il funzionamento, quando arriva lo steroide questo Lega la proteina che può così immigrare nel nucleo e andare a funzionare come fattore di trascrizione. O ancora nel caso del colesterolo andremo ad avere una proteina legata alla membrana ma che è inattiva, quando la concentrazione di colesterolo all'interno della cellula raggiunge un certo livello si attiva una peptidasi per cui questa proteina viene tagliata, viene liberato il frammento extra membranario il quale funziona come fattore di trascrizione e va a regolare le espressioni dei geni che servono. Un altro modello è quello del fattore NFkB formato da un dimero P65/P50 questa è una proteina che rimane bloccata nel citoplasma in quanto si va a legare ad un’altra proteina inibitrice IKB, quando però nella cellula arrivano determinati stimoli, attraverso le chinasi IKK che vanno a fosforilare IKB e la vanno a degradare, il complesso quindi si libera e va nel nucleo per attivare i geni NFkB. Infine, possiamo avere proteine dello sviluppo come la proteina MIU T che è importante per lo sviluppo dei miociti e quindi per la formazione dei muscoli. Questa proteina appartiene alla famiglia dei fattori di trascrizione HLA che contengono due eliche ma in questo caso fra le due eliche non c'è un semplice ripiegamento ma un loop di proteine HLH, queste proteine devono legare il DNA sottoforma di eterodimero e nel caso in cui vanno a legare un inibitore ovviamente l'eterodimero non funziona mentre ci sono altre proteine come ad esempio E6, E47 che consentono a MIU T di legarsi ed attivare la trascrizione dei geni del muscolo. In tutti questi casi il meccanismo rimane lo stesso: quando arrivo un ligando il legame tra recettore e ligando va a cambiare la conformazione del recettore, quindi l'interazione tra il recettore e il suo legando e la proteina che prima lo costringeva a rimanere nel citoplasma perde di affinità, così recettore è libero e ha a disposizione la possibilità di esporre in superficie il segnale di localizzazione nucleare così può migrare nel nucleo ed entra nel DNA per poter esercitare i suoi effetti. Per quanto riguarda gli estrogeni invece il meccanismo è diverso, infatti c'è una quota di questo recettore che è collegato alla membrana attraverso altre proteine o molecole di acidi grassi in maniera che questo recettore rimane fermo sotto la membrana, in questo caso poi la presenza e il legame con il ligando comporta il trasferimento verso il nucleo. Questo, quindi spiega la presenza di questi recettori nel citoplasma anche se poi la loro attività biologica si va ad esplicare nel nucleo. Per quanto riguarda invece i recettori di classe II sono ad esempio i recettori della vitamina D3, i recettori degli ormoni tiroidei, i recettori dell'acido retinoico, gli altri recettori che legano gli attivatori dei perossisomi (PPAR). Questi recettori sono già presenti nel nucleo ma possono fare da navetta tra il nucleo e il citoplasma, infatti questi possono andare a prendere il ligando nel citoplasma e poi portarlo legato all'interno del nucleo. Inoltre, questi possono trovarsi direttamente nel citoplasma privi del ligando, una volta che vengono legati si vanno a trasferire nel nucleo. Il retinolo quando arriva sulla superficie delle cellule ISRBP.-ROH> bersaglio può trovare un recettore che prende il nome di recettore del retinolo RBP che è la proteina che lo va ROH a legare, mentre invece RBP4 e la proteina che “W CRBP=CFBPROH trasporta il retinolo del sangue essendo comunque una j molecola idrofobica. In alcuni tessuti funziona come PIQODONONDINE DNA tale mentre in altri deve essere convertito in acido retinoico. Come già sappiamo il ritinolo, la forma che noi assumiamo, non è altro che la vitamina A che si introduce attraverso la forma vegetale sotto forma di carotenoidi, quando questi arrivano all’intestino vengono poi divisi e si vanno a liberare i singoli carotenoidi che vengono assorbiti dalle cellule intestinali, degradati e modificati fino a generare il retinolo. Ma la vitamina può essere assunta anche attraverso la forma animale, sotto forma di esteri del retinolo quindi legati ad acidi grassi questi si vanno ad accumulare negli epatociti tramite i chilomicroni, nel fegato gli esteri vengono degradati si vanno a generare i nuovi esteri del retinolo che viene mandato in circolo ovviamente legato alla proteina. Il retinolo ha vari effetti biologici che si esercitano su alcuni tessuti come, ad esempio sulle cellule della gametogenesi maschile in quanto si è visto che l'assenza di retinolo provoca una sterilità in quanto viene bloccato il passaggio da spermatogoni a spermatociti e poi spermatozoi, una volta che il passaggio viene bloccato queste molecole vanno incontro ad apoptosi mentre se si ripristina una determinata concentrazione di retinolo la spermatogenesi riprende. Un altro effetto del retinolo è sulla funzionalità di alcuni epiteli come quello delle vie aeree, si è vista infatti che la carenza di vitamina A soprattutto nei bambini fa sì che si possono sviluppare gravi forme di polmoniti. Un altro effetto importante e l’emeralopia, quando cala il sole si ha un cambio della luce e questo comporta nel nostro occhio uno swich dai bastoncelli ai coni, infatti effettivamente i bastoncelli servono per la visione durante il giorno e i Coni per quella notturna, quando manca la vitamina A la sostituzione dei bastoncelli con i Coni avviene in maniera ritardata perché non si forma una quantità sufficiente di retinaldeide, infatti i bastoncelli hanno sulla superficie una proteina detta rodopsina che è formata dall’opsina che è una proteina di membrana e da un coenzima che è la retinaldeide, quando arriva un determinato quanto di luce questa molecola subisce una modificazione l' aldeide passa da una forma cis a una forma trans, si traduce il segnale attraverso una proteina G di tipo inibitorio e questo stimola lo scambio di calcio che fa partire un impulso nervoso che dal bastoncello arriva fino alla corteccia visiva. Se non si ha un’abbastanza concentrazione di vitamina A tutto questo circuito funziona di meno. Questi recettori nel nucleo vanno poi a legare specifiche sequenze di DNA che prendono il nome di elementi responsivi, questi recettori non legano il DNA sottoforma di HE HA BIN PRUMUTORE Sito d'inizio | m_ Nel caso del nostro esperimento noi abbiamo inserito un elemento responsivo degli estrogeni, le sequenze del primo e del secondo dito di zinco sono importanti per il legame infatti andremo ad avere la presenza di amminoacidi diversi : se c'è una glicina e una serina quello sarà specifico per il recettore dei glucocorticoidi, se invece c'è un acido glutammico e una glicina è specifico per il recettore degli estrogeni. Quindi se prendiamo il recettore per gli estrogeni e ci mettiamo i nucleotidi per la glicina e la serina al posto dei nucleotidi per l'acido glutammico e la glicina avremo sempre il promotore con l'elemento responsivo agli estrogeni ma il recettore che produciamo non viene riconosciuto perché non va più a riconoscere gli amminoacidi e quindi non trascrive la sequenza, quindi se prendo quel mutante e lo metto su un genere reporter per gli estrogeni il mutante non funziona, l'attività luciferasi va a zero e non si avrà la produzione della luce. Questo esperimento ci dimostra che la specificità di legame dipende anche dagli amminoacidi che sono presenti sul recettore. Vi sono poi altri recettori come gli attivatori dei perossisomi che sono definiti molecole xenobiotiche in quanto entrano all’interno del nostro organismo e possono essere agenti contaminanti, pesticidi o prodotti di degradazione delle altre molecole. I perossisomi sono degli organelli che si trovano nelle cellule epatiche che somigliano ai mitocondri in quanto al loro interno vanno gli acidi grassi a catena molto lunga che non possono essere degradate dal mitocondrio a causa della loro dimensione, vengono quindi prima frammentate nei perossisomi e poi vanno nei mitocondri dove vengono degradate. Questi recettori vanno ad avere una tasca più grande che ha la capacità quindi di poter far inserire anche altri ligandi con struttura e dimensione diversa, vengono quindi definiti recettori polifunzionali che riescono ad attivare la trascrizione da stimoli diversi. Infine, abbiamo i recettori definiti orfani in quanto non si conoscono i ligandi, due di questi prendono il nome di LXR che legano specifiche molecole di fegato e sono intermedi della bile e poi FXR che lega prodotti che fanno parte del metabolismo del colesterolo. PCR E REAL TIME PCR Se si vuole investigare la presenza della proteina che viene espressa nei tessuti si possono utilizzare gli anticorpi che vanno a riconoscere quella determinata proteina e fare in modo che questi anticorpi possono reagire con delle sostanze che si colorano a seguito del contatto. Queste sostanze possono essere cromogeni, quindi sostanze possibili da vedere soltanto attraverso il microscopio, oppure attraverso un emissione di luce come ad esempio i fluorofori che hanno delle caratteristiche principali, sono capaci di assimilare i fotoni e permettono quindi l'eccitazione della molecola, e quindi il passaggio di un elettrone da un livello agli orbitali successivi. Si può adottare lo stesso criterio per andare ad individuare anche gli RNA. Per quanto riguarda la PCR gli elementi principali per poter effettuare questa tecnica sono il DNA stampo, la DNA polimerasi, i primer, filamenti forward e reverse e i nucleotidi. in un primo momento si va ad applicare una temperatura molto elevata in modo tale che i doppi filamenti si staccano e permettono al complesso di raggiungere le regioni da amplificare riconoscibile attraverso i primer, si abbassa la temperatura e vengono incorporati i nucleotidi che permettono quindi la processività, che viene però agevolata attraverso una soluzione salina in cui si aggiunge il cloruro di magnesio che risulta essere un cofattore essenziale per la taq polimerasi che è un enzima di origine batterica che riesce a resistere anche alle elevate temperature. La PCR si verifica in tre fasi diverse, la prima è la fase della denaturazione in cui appunto il doppio filamento viene denaturato; la seconda è la fase dell’anneling in cui abbiamo il legame della polimerasi e alla fine abbiamo l'allineamento cioè la fase in cui l'enzima a partire dai primer copia le sequenze fiancheggianti. Questo processo viene effettuato tramite una serie di cicli solitamente i cicli sono circa 40 durante i quali si va a sviluppare una quantità molto elevata di materiale genomico in quanto in ogni fase noi andremo ad avere il raddoppio del numero dei frammenti. I primer che andiamo ad utilizzare sono degli inneschi, sono infatti costituiti da nucleotidi solitamente non sono più lunghi di 25 basi, e hanno una specificità cioè hanno la capacità di individuare una determinata sequenza in quanto essendo essostesso una sequenza può allinearsi e può complementare con un'altra sequenza che può anche non essere esattamente identica, infatti possono essere amplificate anche le sequenze aspecifiche. Per capire qual è la coppia di premier da adottare vi è uno specifico criterio che è quello della temperatura che deve essere identica tra i due primer, si va infatti ad associare ad ogni citosina e ad ogni guanina una temperatura di 4 ° mentre per le adenine e le timine una temperatura di 2 °. Esistono però dei software come ad esempio primer blast, dove noi possiamo andare a copiare la sequenza del gene all'interno di questo software e questo ci va a dare come output delle opzioni , solitamente ci fa scegliere tra 10 coppie di primer quelle che solitamente deve essere selezionate sono quelle che vanno ad avere una temperatura simile tra di loro e in particolar modo i primer tra di loro non devono interagire perché quando i primer si appaiano tra di loro la regione target non viene amplificata e quindi si impedisce la normale reazione. Questa tecnica viene effettuata in determinate macchine di amplificazione in cui abbiamo dei termo blocchi, cioè delle piastre metalliche che vanno ad aumentare o a diminuire la temperatura permettendo quindi di condurre la reazione. Questa tecnica viene applicata per poter clonare frammenti di geni, geni interi, per fare l'analisi di mutagenesi quindi magari per poter investigare su un determinato gene che è responsabile di una patologia a seguito di una mutazione, si può effettuare anche il test di paternità e in particolare in questo caso si vanno ad analizzare le STR (short tandem repeat), che sono piccole sequenze ripetute in tandem localizzate nel genoma e possono esser ereditate, quindi analisi di paternità si va ad analizzare queste sequenze del soggetto e le sequenze dell' eventuale padre. Infine, questa tecnica ci può dare un'indicazione se un gene e più o meno espresso tra i due riferimenti, ad esempio tra un tessuto normale e un tessuto trasformato. Nella Real Time PCR possiamo seguire l'amplificazione in tempo reale per questo motivo si va ad avere una sensibilità maggiore nel determinare la quantità di un determinato gene, la reazione viene seguita tramite un grafico dove sull’asse delle ascisse si ha il numero dei cicli effettuati e sull’asse delle ordinate abbiamo la differenza di fluorescenza che viene registrata dalla macchina. Nei primi cicli non si registra nessun incremento di fluorescenza, man mano che la reazione procede andremo ad avere una fase esponenziale che va poi a diventare una fase lineare fino ad arrivare ad un plateau oltre il quale la reazione non può andare, il primo punto di flesso che va a indicare il punto preciso in cui avviene la reazione di amplificazione. In questa tecnica la componente aggiuntiva rispetto alla precedente sono i fluorocromi, sostanze che emettono la luce questo ci permette di investigare contemporaneamente più geni se ogni gene è marcato con un fluorocromi diverso. Vi sono modi diversi per poter rilevare la presenza di un amplificato , nel caso classico si va utilizzare una sostanza che prende il nome di server green che assomiglia all’etidio bromuro che viene utilizzato per colorare il DNA, in questo caso però andremo ad avere l’emissioni di fluorescenza infatti la macchina va ad eccitare le molecole si registra questa luce e il server green ha la capacità di Intercalarsi tra i doppi filamenti, uno svantaggio è che ha la possibilità di andare a vedere soltanto ciò che è a doppio filamento mentre il DNA complementare non lo vede , quindi non individua qual è il frammento da analizzare e quale no. Ci sono però altri metodi come ad esempio una sequenza costituita da una sonda di DNA alle cui estremità ci sono due elementi definiti reporter e quencher, rispettivamente il primo è una sostanza che emette fluorescenza e il secondo è una sostanza che spegne la fluorescenza, durante la reazione di amplificazione la tac polimerasi stacca il quencher e lo allontana dal reporter. in modo tale che si ha la fluorescenza per dare il segnale. L' allontanamento di questi due elementi fa registrare una luce improvvisa che avviene solo a seguito dell'amplificazione, il vantaggio è che in questo caso la sonda è molto specifica e quindi è costruita in modo da individuare il gene in questione. Una situazione simile è il caso invece delle molecole a nylon che sono delle anse alle cui estremità esiste il reporter e il quenche: nel momento in cui si apre la sequenza target i due elementi si allontanano e andremo quindi ad avere la fluorescenza. un altro metodo è quello dell’escorpion che è un approccio opposto ai precedenti, si hanno due sequenze in cui andremo sempre ad avere il reporter e il quencher ma in questo caso quando le due sequenze si allontanano la fluorescenza viene spinta, e quindi avremo che la rimozione della fluorescenza viene strettamente correlata alla quantità di espressione del gene. La quantizzazione può essere assoluta o relativa, in quella assoluta si va a considerare il movimento di uno standard e poi si va a costruire una retta a cui faremo riferimento per quantizzare il gene che stiamo studiando, in quella relativa invece si va a considerare il CT che se basso vuol dire che il gene è fortemente espresso. Le macchine della Real Time hanno bisogno che il ciclo di amplificazione intervenga a partire dall’ottavo ciclo in poi, c’è quindi bisogno di una latenza prima in cui la macchina non deve registrare assolutamente nulla perché questi cicli iniziali servono alla macchina a tarare il rumore di di fondo del segnale di fluorescenza. In questo caso possiamo avere diversi tipi di applicazioni, possiamo infatti effettuare una quantificazione virale e vedere se c'è una sequenza specifica di RNA all'interno delle cellule dell'ospite, si può effettuare la valutazione dell'espressione genica, valutare l'efficacia di una determinata sostanza, si possono misurare i danni al DNA in funzione delle sequenze mutate e si può effettuare il controllo e la valutazione della presenza di OGM. Possiamo andare ad effettuare indagini della curva di dissociazione in cui si stabilisce una temperatura di 72 ° in cui avviene la denaturazione e si vanno poi ad osservare i grafici se andremo ad avere una popolazione omogenea nei frammenti amplificati andremo ad avere una gaussiana che si troverà tutto nello stesso punto, se vi sono invece curve diverse vuol dire che andremo ad avere frammenti diversi e questo è molto importante per capire se c'è stata la contaminazione di altri frammenti. GENE REPORTER In molte circostanze è necessario che i nucleosomi possano essere spostati o che la loro forza di legame possa diminuire, in modo da rendere accessibili determinate regioni del DNA infatti molte proteine possono riconoscere e legare il DNA quando questo è “nudo”, privato quindi degli istoni. Vi sono dunque i complessi di rimodellamento istonico che facilitano i cambiamenti nella posizione del nucleosoma che hanno la capacità di provocare lo scivolamento dei nucleosomi e sono una piccola parte di questi complessi possono anche trasferire o rimodellare i nucleosomi stessi. Il posizionamento del nucleosoma permette al sito di legame per proteine regolative sul DNA di rimanere accessibile, solitamente si va ad istaurare una competizione tra i nucleosomi e queste proteine. Ma può anche accadere l’inverso, cioè se due di queste proteine sono legate a siti che distano un numero di paia di basi inferiore a quello necessario per formare un nucleosoma, il DNA fra queste due proteine rimane libero senza nucleosomi. Un secondo metodo di sequenziamento è determinato da particolari sequenze che risultano affini per il complesso istomerico, come le regioni ricche di A e T che ha una tendenza a curvarsi verso il solco minore, quindi gli istoni vengono esposti verso il solco minore e si ha una maggiore tendenza a formare il nucleosoma, a differenza delle zone ricche di G e C. Come già detto, le cose istoniche sono soggette a modifiche, nel particolare le lisine sono soggette a acetilazione e metilazione, mentre le serine a fosforilazione. I nucleosomi acetilati sono associati a zone trascrizionalmente attive, mentre i nucleosomi deacetilati sono associati a zone dove la trascrizione è repressa. Alla metilazione, invece, in funzione dell’amminoacido che viene metilato, possiamo trovare zone in cui la trascrizione è attiva o repressa. Acetilazione e fosforilazione fanno si che le cose istoniche vanno a perdere le loro cariche positive, e ciò riduce l’affinità di queste code con il DNA carico negativamente e questo va a modulare la formazione della struttura della cromatina a fibra di 30 nm. Le modifiche delle code istoniche hanno anche un effetto sulla funzione del nucleosoma permettendo la formazione di siti di legame per le proteine regolative. Possiamo trovare due diversi domini: il bromodominio che è presente in quelle proteine che interagiscono con le code istoniche acetilate, mentre le proteine che contengono il cromodominio interagiscono con le code metilate. L’acetilazione è effettuata dall’enzima acetil-transferasi che catalizza l'aggiunta di gruppi acetilici sulle lisine delle code istoniche, mentre l’enzima deacetilasi rimuove queste modifiche. Le metil-trasferasi aggiungono gruppi metilici agli istoni che possono essere eliminati tramite le demetilasi. Modifiche differenti esercitano un effetto differente sulla funzione del nucleosoma, e ciò può ripercuotersi sulla struttura e sul funzionamento della cromatina. Modificazione epigenetica Modificazione ereditabile che non altera la sequenza del DNA ma l’espressione dei geni. Nelle cellule di mammifero le modificazioni epigenetiche di maggior frequenza sono, a livello della cromatina, l’acetilazione e la deacetilazione degli istoni e, a livello del DNA, la “n metilazione della citosina. LiAh, L’acetilazione degli istoni rende più descetitazione - DNA d.cone acetilazione efficiente il legame con i fattori di trascrizione. L’istone H4 viene acetilato prima di assemblarsi nel nucleosoma; la ° } È È gruppo deacetilazione di H4 invece si verifica in na, de 7 coincidenza del legame di H1 al ) x o } nucleosoma e il conseguente attivazione dell'espressione geni compattamento della cromatina di ordine superiore. La cromatina trascrizionalmente attiva presenta sempre un alto livello di acetilazione degli istoni rispetto a quella inattiva, e l’istone H4 è acetilato in quelle regioni cromosomiche (bande R) che si pensa contengano la maggior parte dei geni housekeeping, deputati alle funzioni ordinarie comuni a tutte le cellule e la cui espressione rimane costante nel tempo. La metilazione costituisce il più importante processo di modificazione del DNA nei Vertebrati e nelle piante; è invece modesta o non rilevabile nel lievito, in Drosophila melanogaster e nei Nematodi. Nel genoma dei Mammiferi dal 2 al 7 % delle citosine risulta metilato. La maggior parte delle citosine metilate si trova sotto forma di doppiette di coppie di basi con la struttura: 5'mCpG 3'3' GpCm5' nella quale mC indica la metilcitosina, la p fra C e G indica il legame fosfodiesterico fra nucleotidi adiacenti e 5' e 3' sono le estremità del doppio filamento di DNA antiparallelo. Isole CpG, ossia tratti di genoma di 1+2 chilobasi di lunghezza, nei quali le sequenze CpG sono dieci volte più frequenti, si trovano soprattutto all'estremità 5' dei geni, in prossimità dei siti di inizio della trascrizione. Nei geni housekeeping le isole CpG non sono mai metilate. Nei geni tessuto- specifici la metilazione varia invece con l’attività del gene: le isole CpG che si trovano davanti ai geni attivi sono ipometilate, mentre quelle situate davanti ai geni silenti sono ipermetilate. SBOBINE La cromatina nella cellula è sotto forma di fibre da 30 nm dove gli istoni H3 e H4 formano un tetramero che si dispone a ferro di cavallo nella struttura del nucleosoma mentre gli istoni H2A e H2B formano un dimero che si va a posizionare all'interno. In questo modo si forma la struttura centrale attorno a cui si va da avvolgere il DNA. Un nucleosoma è composto da 8 istoni che formano il cosiddetto ottamero istonico dato da H2A, H2B, H3, H4 che vengono ripetute per due volte, tutti gli istoni vanno ad avere lo stesso motivo funzionale detto Iston fold caratterizzato da tre Alfa eliche che sono la parte centrale della proteina , mentre le estremità sono più libere e flessibili non hanno una struttura ben definita e vengono chiamate code. Gli istoni sono delle proteine basiche per cui sono cariche positivamente e possono quindi legare il DNA carico negativamente, il DNA che collega i due nucleosomi prende il nome di DNA linker e l’istone H1 mantiene la stabilità del complesso. sei nucleosomi formano un giro e formano la struttura a 30 nm, in questa struttura le code degli istoni H1 vengono in contatto tra loro e avendo una regione flessibile vanno ad avvicinare i nucleosomi che si ripiegano a formare la struttura a solenoide che può essere classica o a zig zag. Prima di questo abbiamo però una struttura a 11 nm definita collana di perle , i singoli nucleotidi riescono poi ad avvicinarsi grazie all' intervento dell’istone H1 che va incontro a un processo di modificazione, si Lega alla regione linker del nucleosoma e promuove un cambiamento della geometria del nucleosoma stesso associato a una struttura più compatta, le code che escono da un nucleosoma e quello che escono da un altro prendono contatto con il DNA del nucleosoma adiacente compattando così la struttura della fibra 30 nm. L’epigenetica va a raggruppare gli eventi che si verificano a carico della cromatina ma che non comportano modifiche nella sequenza del DNA, si possono quindi definire cambiamenti dell'espressione genica ma che non alterano il codice genetico. Sappiamo che la cromatina si distingue in eucromatina che è meno condensata e rappresenta le zone trascritte, e l’eterocromatina che è la componente più densa dove non sembra ci sia attività trascrizionale. Le regioni che possono essere modificate sono le code degli istoni che non entrano a far parte del nucleosoma ma che sporgono all'esterno, le modifiche delle code istoniche vanno ad influenzare lo stato di condensazione della cromatina. Queste code ad esempio possono subire acilazione, quindi viene aggiunto un gruppo acetilico che va a reagire con il gruppo amminico delle lisine delle catene laterali e la carica positiva viene neutralizzata. La struttura non è più stabilizzata da questi legami elettrostatici e diventa più lassa, cioè i singoli i nucleosomi non sono più tenuti insieme in maniera compatta. L' allentamento della struttura della cromatina facilita l'accesso sul DNA ai fattori di trascrizione. Le modifiche sugli istoni possono essere di vario tipo: abbiamo l'acetilazione in cui andremo ad avere un allentamento della cromatina e questo sta a significare un aumento della trascrizione, al contrario la de acetilazione porta ad un compattamento della cromatina e repressione della trascrizione. Un'altra possibile modifica e la metilazione che si accompagna a repressione della trascrizione. Ad esempio, la metilazione della lisina 9 dell’istone H3 porta compattazione della cromatina e quindi a blocco della trascrizione, così come la metilazione della lisina 27. Mentre nel caso della lisina 4 dell’istone H3 questa funziona nella maniera opposta, infatti se viene metilata rappresenta un segnale di attivazione della trascrizione. Questi sono eventi coordinati, vanno infatti a seguire una determinata regola e cioè se sia ha un segnale positivo di attivazione trascrizionali gli istoni subiscono una serie di modifiche che devono andare tutte nella stessa direzione, questi eventi coordinati rispondono a quello che viene chiamato il codice istonico che va a determinare un aumento o la repressione della trascrizione. Queste modifiche vengono effettuate da alcuni enzimi come, ad esempio l'acetiltrasferasi cioè gli enzimi che trasferiscono il gruppo acetile e quindi generalmente svolgono l'attivazione della trascrizione. Tra le più importanti ricordiamo p300/CBP che è un attivatore trascrizionale che a sua volta va a fosforilare la proteina CREB che Lega direttamente il DNA nelle regioni responsive all’AMP ciclico. questa proteina forma un dimero fosforilato, e solo in questo modo può attivare la trascrizione. Inoltre, CBP è legata ad un’attività acetilasi, quindi quando va a fosforilare la proteina questo è direttamente coinvolta come co attivatore, va sul gene che deve essere trascritto ed induce queste modifiche sul listone. Alla proteina CBP/p 300 è associata la proteina pCAF sono proteine che subiscono la fosforilazione da parte di CBP. Ci sono poi anche le proteine NuA3, NuA4, SAGA. Per pCAF e p300 i bersagli sono H3 e HA, mentre per le proteine NuA sono H2a e H2b. L'altra famiglia di enzimi da considerare e quella delle deacetilasi, che vanno a bloccare l'acetilazione come ad esempio, le più abbondanti sono le proteine NuRD, non tutte le deacetilasi sono ubiquitarie e infatti alcune sembrano avere delle specificità di azione. Inoltre facciamo sempre riferimento al dominio infatti il bromo dominio è associato all'attività acetilasi, mentre il cromo dominio a quella di deacetilasi. Poi ci sono le mettilasi HMT, tra le più note possiamo trovare SET1 sulla lisina 4, SET2 sulla lisina 36, SET9 sulla lisina 20, SUB39 sulla lisina 9. stimoli maggiori provengono da ormoni e fattori di crescita oltre che da sostanze nutrienti; le modificazioni che avvengono nel genoma rispondono a delle modificazioni che avvengono nella cellula. I pluricellulari vivono in un ambiente esterno che subisce modificazioni molto più di frequente, rispetto all'ambiente extracellulare di organismi unicellulari in cui le modificazioni sono molto più controllate: gli organismi unicellulari rispondono per lo più a variazioni di sostanze nutrienti nell’ambiente esterno. I fattori esterni possono produrre modificazioni transienti dell’attività del genoma e portano a rimodellare continuamente il trascrittoma e il proteoma in funzione delle modificazioni dell’ambiente. A queste si associano delle modificazioni permanenti o semipermanenti dell’attività del genoma che comportano alterazioni del proteoma non immediatamente reversibili (il più delle volte vengono mantenute) e sono alla base del differenziamento, cioè quello che porta alla specializzazione di determinati tipi cellulari. Quindi la costituzione di numerosi tipi di cellule specializzate necessita nel corso dello sviluppo di un organismo di un coordinamento delle attività del genoma nelle diverse cellule basato sia su modificazioni transienti che permanenti o semipermanenti. Modificazioni transienti: Sono provocate da sostanze extracellulari che trasmettono il segnale e queste possono agire: ® Direttamente: la determinata sostanza è capace di passare direttamente attraverso la membrana cellulare e può: - Se è una proteina, agire da fattore di trascrizione, infatti può attivare o reprimere l'assemblaggio del complesso d’inizio; oppure può interagire con gli enhancer o silencer di splicing (es.: la lattoferrina, che è un attivatore) - Se il fattore è di altra natura (non proteica) può influenzare direttamente l’attività di un fattore di trascrizione (agisce modulandone l’azione) - Se il fattore è di altra natura può influenzare indirettamente (attraverso uno o più intermedi) l’attività di un fattore di trascrizione (es.: repressione da catabolita nei batteri) ® Indirettamente: la sostanza che non riesce a passare la membrana si lega ad un recettore di membrana specifico che trasmette il segnale dentro la cellula, in maniera diretta o indiretta. (es.: ormoni steroidei) Modificazioni permanenti o semipermanenti Devono essere mantenute per lunghi periodi anche quando viene a mancare lo stimolo induttivo originario. La sua regolazione prevede meccanismi ulteriori e più estesi rispetto alla modulazione di attivatori e repressori della trascrizione ed esattamente tali modificazioni sono: ® Dovute a riarrangiamenti del genoma — conversione del mating type del lievito; il meccanismo che porta alla diversità delle immunoglobuline. ® Dovute a modifica della struttura della cromatina —> posizionamento dei nucleosomi; silenziamento di certi tratti del genoma: (dove ci sono tratti di eterocromatina estremamente condensata, queste impediscono l’assemblaggio del complesso d’inizio della trascrizione) Le modificazioni di questo tipo, una volta ottenute, possono essere mantenute grazie a circuiti autoregolativi. Di questo fenomeno esistono molti esempi, fra i quali MyoD che è un fattore di trascrizione delle cellule muscolari e non solo caratterizza il differenziamento della cellula muscolare ma ne determina il suo caratteristico ciclo cellulare (manca della fase G). Si parla di meccanismo autoregolativo perché è lo stesso MyoD che stimola la propria sintesi e mantiene questo stato di differenziamento della cellula. Anche nel caso degli eucarioti, ci sono vari livelli di regolazione dell’espressione genica, ma anche in questo caso, come nei procarioti, il livello principale di regolazione riguarda l’inizio della trascrizione, cioè la maggior parte dei sistemi genici sono regolati a questo livello. Gli altri livelli di regolazione vengono attuati, non proprio come meccanismo di regolazione, ma soprattutto hanno un significato di meccanismo di modulazione fine dell’espressione: - Regolazione a livello dell’inizio della trascrizione - Regolazione a livello della maturazione degli mRNA - Regolazione a livello della stabilità degli mRNA - Regolazione a livello della traduzione degli mRNA - Regolazione a livello della stabilità delle proteina Il controllo dell’inizio della trascrizione può avvenire mediante 2 eventi: 1 Mediante un cambiamento strutturale a livello del promotore (scaturito da una serie ordinata i eventi) che lo rende accessibile ai fattori di trascrizione (attivazione genica). Questo però è un meccanismo piuttosto raro. 2. Attivazione e reclutamento dell'apparato basale della trascrizione (fattori generali e RNApol) che si lega al promotore e viene attivato da altri fattori di trascrizione con funzione regolatrice. Questo è il meccanismo più utilizzato. Differenze e caratteristiche comuni con i batteri dei meccanismi di regolazione dell’inizio della trascrizione: Caratteristica comune: - la trascrizione è regolata da attivatori e repressori Differenze: - La trascrizione è un meccanismo più complesso - Organizzazione del genoma in nucleosomi (in base al loro posizionamento possono reprimere o stimolare l’inizio della trascrizione) - Complessità nell’attivazione delle unità trascrizionali, che dipende non solo dal meccanismo di trascrizione ma anche dal fatto che gli elementi che costituiscono il promotore sono dislocati in varie regioni, quindi non solo troviamo gli elementi del promotore basale, ma anche gli elementi a monte (GCbox, CAATbox e ottamero, elemento di 8bp). Questo implica che questi elementi reclutino a loro volta molti altri fattori di trascrizione. - Maggior numero di proteine che regolano l’espressione di uno stesso gene - Maggior numero di siti regolativi posti, a volte, anche a grande distanza dal punto d’inizio: sequenza regolativa molto ampia negli organismi multicellulari. Tra le sequenze regolative troviamo non solo gli elementi a monte, ma anche gli enhancer e i silencer. Enhancer (NON è un elemento del promotore) Gli enhancers sono quelle sequenze che funzionano da “amplificatori del segnale d’attivazione genica”; legando, in un determinato momento e nelle cellule appropriate, specifici regolatori possono amplificare l’espressione di quel gene o addirittura attivarla. Gli enhancers non per forza devono essere posizionati a monte ma possono trovarsi anche a valle (possono funzionare in entrambe le direzioni). Elementi analoghi agli enhancer, chiamati sequenze attivatrici a monte (UAS, upstream activator sequences), si trovano nel lievito e possono funzionare in entrambi gli orientamenti a distanza variabile a monte del promotore, ma non quando sono posti a valle. Le UAS hanno un ruolo regolatore: in parecchi casi la UAS è legata dalle proteine regolatrici che attivano i geni a valle. Silencer Sono delle sequenze che svolgono un'azione opposta a quella degli MT enhancers, quindi bloccano l’attivazione enbancer promotore dei promotori da parte degli enhancers. FA Insulator _ Sono delle sequenze di isolatori, cioè ‘anbancer isoletore promotore o bloccano il passaggio di qualunque effetto passagg, q q pri attivante o inattivante: se per es. un insulator è posto fra un enhancer ed il promotore di un gene, inibisce l'attivazione del gene da parte a" dell’enhancer (situazione b). L’insulator + dia i seen non inibisce l’attivazione di quello stesso gene da parte di un altro enhancer se piazzato a valle del promotore, nè inibisce l’attivazione di un diverso gene che è sotto l’influenza del primo enhancer (situazioni c e d). Gli insulators possono agire anche nei confronti dei silencers e in ogni caso possono agire in entrambe le direzioni. Se per es un gene presenta alle due estremità due isolatori non risentirà di alcuna attività attivatrice o silenziatrice di eventuali enhancers o silencers. enbancer Isolatore promotore enhancer A. livello degli eucarioti abbiamo delle sequenze regolative molto più complesse rispetto a quelle batteriche. Nei batteri infatti troviamo un promotore con una sequenza regolativa subito a monte; nel Lievito, che è il più semplice fra tutti gli eucarioti, troviamo numerose sequenze regolative; negli eucarioti superiori (per es. nell'uomo) si trova un aumento notevole di sequenze non solo a monte ma anche a valle: anche trascrizione, ma l’attivazione dipende dal particolare dominio che lega il DNA? Dal gene VII: “L’attivatore GAL4 ha un dominio che lega il DNA che riconosce una UAS e un dominio attivatore che stimola l’inizio a partire dal promotore bersaglio. Il repressore batterico LexA ha un dominio N-terminale che lega il DNA che riconosce un operatore specifico. Quando LexA si lega a questo operatore, reprime il promotore adiacente. In un esperimento di “scambio”, il dominio che lega il DNA di LexA può essere sostituito al dominio che lega il DNA di GALA. Il gene ibrido può quindi essere introdotto nel lievito insieme ad un gene bersaglio che contiene la UAS o un operatore LexA. Una proteina GAL4 autentica può attivare un gene bersaglio soltanto se ha una UAS. Il repressore LexA è naturalmente privo della capacità di attivare entrambi i bersagli. L’ibrido LexA-GALA non è più capace di attivare un gene con una UAS, ma può adesso attivare un gene che ha un operatore LexA! Questo risultato si adatta all’ipotesi modulare degli attivatori della trascrizione. Il dominio che lega il DNA serve a portare la proteina nella giusta posizione e il modo e il punto preciso di legame sono irrilevanti, ma, una volta portato sul posto, il dominio attivatore può svolgere il suo ruolo. Secondo questo modello, non importa se il dominio che attiva la trascrizione è portato nelle vicinanze del promotore dal riconoscimento di una UAS tramite il dominio che lega il DNA di GALA o dal riconoscimento di un operatore LexA tramite il modulo di specificità di LexA. La capacità dei due tipi di moduli di funzionare in proteine ibride indica che i domini della proteina si ripiegano in modo indipendente in una struttura attiva che non è influenzata dal resto della proteina. La dimostrazione genetica di tutto ciò risiede nel fatto che mutanti nel controllo positivo (pc) legano normalmente il DNA, ma sono difettivi nell’attivazione. Si è visto che eliminando il dominio di attivazione l’attivatore anche se ha il dominio di legame non riesce ad accendere il gene specifico. I domini di legame e di attivazione di Gal4 furono individuati mediante due esperimenti complementari. In un primo esperimento, l’espressione di un frammento N- terminale del gene GALA (codificante un terzo della proteina) produceva un polipeptide che legava normalmente il DNA ma non attivava la trascrizione. Questo polipeptide conteneva il dominio di legame al DNA, ma mancava della regione di attivazione ed era, quindi, formalmente comparabile ai mutanti pc degli attivatori batterici. In un secondo esperimento, venne prodotto un gene ibrido codificante per i tre quarti della regione C-terminale di Gal4 fusa al dominio di legame al DNA del repressore batterico LexA. La proteina di fusione fu espressa in lievito assieme ad un plasmide reporter che portava il sito di legame per LexA posto a monte del promotore di GAL1 (la figura indica il gene lacZ perché si riferisce al saggio del doppio ibrido). In questo caso la proteina di fusione era in grado di attivare la trascrizione del reporter. Questo esperimento dimostra che l’attivazione non è mediata solamente dalla presenza del sito di legame al DNA. GLI ATTIVATORI INTERAGISCONO CON L’APPARATO BASALE - Direttamente: un attivatore può funzionare direttamente quando consiste di un dominio che lega il DNA unito a un dominio che attiva la trascrizione. L’attivatore interagisce tramite la formazione di contatti proteina-proteina con i fattori generali della trascrizione, come TFIID, ma può anche interagire con TFIIB o TFIIA. Il fattore di trascrizione basale TFIID è il bersaglio L'attivatore contatta TAF di TF,D S TE,B Attivatore più comune degli attivatori, che possono prendere contatto con una delle sue varie subunità TAF; ciò spiega perché TBP da sola può supportare un livello basale di trascrizione, ma TAF sono necessari per i livelli più alti stimolati dagli attivatori. Inoltre, TAF diversi di TFIID possono interagire con attivatori diversi. Alcuni attivatori interagiscono con singoli TAF, mentre altri interagiscono con più TAF. - Indirettamente: l’attivatore non ha esso stesso un dominio per l’attivazione trascrizionale, ma lega un’altra proteina (un coattivatore) che possiede il dominio che attiva la trascrizione. I coattivatori costituiscono dunque un mezzo di connessione fra gli attivatori e l’apparato basale. Essi funzionano mediante interazioni proteina:proteina, formando ponti fra gli attivatori e l’apparato basale della trascrizione. Il coattivatore non ha un dominio di legame al DNA, ha un dominio di interazione proteina:proteina attraverso il Attivatore . quale riconosce l’attivatore. Inoltre, presenta (a Sortiatore un dominio di attivazione. TED Benché i componenti proteici siano organizzati in modo diverso, il meccanismo è lo stesso. Un attivatore che prende direttamente contatto con l’apparato basale possiede un dominio di attivazione unito covalentemente al dominio per il legame col DNA. Quando invece un attivatore funziona tramite un coattivatore, le connessioni consistono in legami non covalenti fra subunità proteiche. Le stesse interazioni sono responsabili dell’attivazione, indipendentemente dal fatto che i diversi domini siano presenti nella stessa subunità proteica o in più subunità. IN CHE MODO UN ATTIVATORE STIMOLA LA TRASCRIZIONE? Si distinguono due tipi generali di modelli: e Nel modello del reclutamento, l’unico effetto di un attivatore sarebbe quello di stimolare il legame della RNA polimerasi sul promotore. ® Secondo un modello alternativo, l’attivatore induce un qualche cambiamento nel complesso di Si legano gli attivatori e i fattori basali trascrizione, per esempio nella conformazione dell’enzima, tale da accrescerne l’efficienza. a Attivatori e coattivatori stabiliscono contatti non L arl covalenti con un elemento del mediatore oppure con sitegata RNA polimerasi oloenzima un fattore basale (TFIIB, TFIID o TFIIA). Sommando AT tutti i componenti necessari per una trascrizione efficiente — fattori basali, RNA polimerasi, attivatori e sai coattivatori — si ottiene un apparato molto grande. E” i e possibile che questo apparato si assembli in passaggi * successivi sul promotore. Alcuni attivatori, coattivatori e fattori basali possono farlo, ed in tal caso possono essere raggiunti da un complesso molto grande che consiste’ di RNAP preassemblata con ulteriori attivatori e coattivatori. Sono state trovate diverse forme di RNA polimerasi in cui l'enzima è associato a vari fattori di trascrizione. Il “complesso oloenzima” più prominente nel lievito consiste della RNA polimerasi associata al mediatore. Riguardo il mediatore, avevamo detto che la sua composizione è variabile non solo da cellula a cellula ma anche da momento a momento della vita della cellula stessa. Molto studiati sono stati i mediatori del lievito, perché il numero di geni è estremamente più basso, dunque è stato più facile caratterizzarli. Sempre nel lievito, il complesso dell’oloenzima è per lo più costituito da un mediatore che generalmente contiene 20 subunità oltre ad alcuni fattori basali della trascrizione. Riassumendo, il complesso dell’oloenzima contiene: l’RNAP - il mediatore - fattori basali della trascrizione In accordo con un'ipotesi corrente, la maggior parte del complesso trascrizionale arriva sul gene sotto forma di oloenzima, che contiene il mediatore, la RNA polimerasi ed alcuni dei fattori generali della trascrizione. Soltanto pochi altri complessi arrivano separatamente: fra questi TFIID e TFIIE. Questi ultimi componenti possono essere reclutati da attivatori o legarsi cooperativamente all’oloenzima. Si ricordi che, nel momento in cui si dice che l’attivatore regola il complesso trascrizionale, ovviamente si sottintende il complesso dell’oloenzima. L’attivatore può contattare direttamente il mediatore o reclutare direttamente la RNA polimerasi, oppure, mediante l’interazione con TFIID (con l’apparato basale), può posizionare l’intero complesso. Si presume che l’interazione con TAF contribuisca al legame di TFIID con la TATA box, o che faciliti il legame di altri attivatori sulla superficie del complesso TFIID-TATA box. In entrambi i casi, l’interazione stabilizza il complesso basale, accelerando il processo dell’inizio della trascrizione e incrementando così l'utilizzo del promotore. Quando l’attivatore (o gli attivatori) interagisce col complesso oloenzima, il mediatore cambia conformazione, attivando o reprimendo la polimerasi. Il più delle volte la attiva. ELEMENTI DI RISPOSTA RICONOSCIUTI DAGLI ATTIVATORI Sono sequenze situate sul DNA che contengono brevi tratti consenso. Nei promotori, gli elementi non sono disposti a distanze fisse dal punto d’inizio, ma di solito si trovano a meno di 200 basi da esso. Altri elementi di risposta si trovano nell’enhancer ed essere quindi molto più distanti dal sito di inizio della trascrizione. Ciascun elemento di risposta è riconosciuto da un attivatore specifico (attraverso il suo dominio di legame al DNA). L’attacco di un attivatore all’elemento di risposta è necessario per permettere alla RNAP di iniziare la trascrizione. Gruppi di geni controllati dallo stesso attivatore presentano lo stesso elemento di risposta. Alcuni elementi di risposta molto importanti: - HSE (heat shock response element) elemento di risposta allo shock termico. E’ riconosciuto dall’attivatore HSTF. Negli eucarioti, i geni dello shock da calore possiedono anch’essi la sequenza comune HSE, ma posta in varie posizioni rispetto al punto di inizio e riconosciuta da HSTF. L’attivazione di questo fattore fornisce perciò un mezzo per iniziare la trascrizione di un gruppo specifico di circa 20 geni che contengono nel promotore la sequenza bersaglio appropriata. - GRE (glucocorticoid response element) elemento di risposta ai glucocorticoidi adiacenti e separate da un breve tratto privo di struttura definita. Si noti che i domini HTH degli eucarioti possono funzionare da monomeri, omeodimeri e da eterodimeri. MOTIVO ZINC FINGER de Esempi: TFmA, Sp1, GALA, una forma particolare dei recettori steroidei. g ° Descrizione: è un motivo abbastanza rappresentato. Due tipi di proteine che Ò legano il DNA hanno strutture di questo tipo: le proteine £ De classiche a “dita di zinco” ed i recettori degli steroidi. Il ta ast motivo prende il nome da un’ansa di circa 23 aa che 0 o sporge a partire da un sito che lega uno ione Zn° 20° OA Quest’ansa è formata in particolare da residui di His e Cys, che trattengono lo ione zinco in una struttura tetraedrica. La Spa consenso di un I dito è : X,= numero di aa variabili | La sequenza ci dà un’idea dell'abbondanza di Cys e His. Nel caso delle 7) proteine classiche, questa sequenza presenta due Cys e due His. Proteine e) che hanno questo tipo di dominio vengono indicate proteine a dita di zinco Cysz-His.. Un esempio di questo è rappresentato da TFIIIA che si lega con ben 8 dita di zinco al gene per l’rRNA 5S. In generale si distinguono 3 classi di motivo a dita di zinco: 1. Tipologia C2H-, come nel caso di TFIIIA. Questa classe rappresenta, in generale, proteine contenenti almeno 3 dita di zinco che si legano al DNA come monomeri. 2. Tipologia C2C2-, come nel caso dei recettori degli steroidi. Questa classe presenta dita di zinco che nella sequenza consenso hanno sostituito le His con le Cys (non ci sono più His, bensì 4 Cys disposte a due a due). Le proteine contengono due dita consecutive e si possono legare al DNA come omodimeri o eterodimeri. vo C n > Zi An CH) gf c é cs 3. Tipologia Cs, come nel caso di GALA. In questo caso 6 aa legano lo Zn'* piuttosto che 4 e sono tutte e 6 Cys e formano con lo Zn una struttura di forma globulare. Le proteine contenenti questa tipologia si associano come omodimeri. Solitamente nelle proteine che legano il DNA è presente più di un gruppo di eo do e” o dita di Zn, disposti uno dopo l’altro. La È p 6 p ° È regione che collega le dita è di solito 9 O Q O O di 7-8 aa. Il tratto che contiene le dita © o 0 o O i gtoinni . Po Po sì Lo va da 9 ripetizioni che occupano quasi Ozn'*6 oz ‘© © Zn'*0 tutta la proteina a un piccolo dominio pd “00 sed” lacco Ret boo che consiste di 2 dita. In figura è © Forma Forma Forma mostrata una proteina con 3 dita di Zn: ogni motivo è stato diviso in due colori per indicare la porzione N- terminale e la porzione C-terminale. In basso è riportata poi la struttura terziaria di ogni motivo. La parte N- terminale di ogni dimero costituisce un foglietto- mentre la porzione C- terminale forma un’ -elica (per semplicità, il foglietto- e la posizione dello ione zinco non sono mostrati nella parte inferiore della figura). In questo caso avremo tre -eliche che si posizionano all’interno di un giro del DNA, nel solco maggiore, e stabiliscono ognuna due contatti sequenza-specifiche (indicati dalle frecce). E’ importante andare a vedere, nella struttura primaria delle, quali sono gli aa differenti, perché sono le differenze che stabiliscono le interazioni specifiche col DNA (ma sono anche coinvolte nel legame a RNA) HOOC. COOH MOTIVO LEUCINE ZIPPER Descrizione: Steven McKnight ha suggerito che Lu le proteine che legano il DNA contengono - LL eliche con una sequenza pseudoripetitiva di sette residui (a-b-c-d-e-f-g)n in cui i residui a e d sono idrofobici. Le -eliche destrogire si avvolgono l’una sull’altra, con 3,5 residui per giro e quindi lo schema si ripete integralmente ogni 7 residui. / Questo tipo di ripetizione a sette residui è capace — NH; NH, di formare avvolgimenti avvolti in cui le catene laterali dei residui di Leu oppure altri aa (Come Val o Met) si intercalano tra loro, formando un’organizzazione che ricorda la disposizione dei denti di una cerniera. Quindi, le cerniere di leucina consistono in un tratto di aa con un residuo di Leu ogni 7 posizioni Queste cerniere di leucina producono la dimerizzazione di alcune proteine che legano il DNA, ma non sono di per sé motivi che legano il DNA. Due monomeri si dispongono l’uno accanto all’altro in modo tale che due Leu di due -eliche siano vicine tra loro e possano permettere la formazione del dimero. In molte proteine contenenti cerniere di leucina, una regione che lega il DNA ricca di residui basici si viene a trovare in una posizione immediatamente j vicino alla parte N-terminale della cerniera di Sé sulle facce leucina. Entrambi i monomeri di un motivo leucine S ee aliche zipper presentano una regione basica che insieme permettono l’associazione al DNA Per esempio, nella proteina GCN4 i 56 residui C-terminali formano un’ -elica estesa. Gli ultimi 25 residui 12 'egione . . . . . basica lega il DNA di due di queste eliche si associano tra loro formando una cerniera di leucina. Le porzioni N- PN terminali di queste due eliche tendono ad 1 allontanarsi leggermente per legare due facce opposte del DNA, che si viene a trovare tra le due lame di una forbice. Le due cerniere di Leu formano una struttura a Y ed il motivo viene detto bZIP. Il motivo bZIP spiega perché gli elementi di risposta hanno ripetizioni invertite senza tratti interposti, cioè sono costituite da due emisiti che sono ripetizioni invertite senza sequenza spaziatrice perché le due regioni basiche sono consecutive. I residui basici in questa regione della GCN4 formano molti contatti con le basi e con gli atomi di ossigeno dei HOOC COOH Elica clica Ansa Ansa Elica ] ica } gruppi fosforici della sequenza bersaglio di DNA, la cui P: conformazione non viene distorta. Le proteine che wr * * sr . . . + contengono questo dominio si legano o in forma di NH Sa omodimero o in forma di eterodimero. Motivo Helix-Loop-Helix (HLH) Esempi: E12, E47, MyoD. Descrizione: Struttura e caratteristiche molto simili al motivo leucine zipper (cambia il dominio di dimerizzazione). Le proteine helix-loop- helix (elica-ansa-elica) sono regolatori eucariotici e contengono 2 - eliche di legame al DNA. Si dividono in due gruppi: basiche (bHLH) e non basiche (HLH) a seconda se hanno residui basici per il legame al DNA adiacenti al motivo HLH. Le proteine bHLH presentano quindi, oltre alle due -eliche, una regione basica di circa 15 aa fra i quali 6-7 sono specifici per il legame al DNA. Da questo si deduce che le proteine bHLH sono capaci di legare il DNA, quelle che invece non hanno la sequenza basica non sono in grado. Queste proteine sono presenti sia come omodimeri o eterodimeri; se consideriamo un eterodimero costituito da un monomero basico e uno non basico (ad es. Ac-S/cmce) non sarà capace di legarsi al DNA, quindi per farlo deve essere costituito da due monomeri entrambi basici (ad es. MyoD/E12). La dimerizzazione dipende dall’anfipaticità delle 2 eliche che interagiscono fra di loro (situazione simile alla cerniera di leucine). Il motivo HLH, sebbene spesso possa essere confuso con HTH, in realtà è profondamente differente dal punto di vista strutturale. Consideriamo due proteine HLH: MyoD e Id Nota: alcuni ligandi hanno recettori multipli! Ciò che cambierà in recettori riconosciuti dallo stesso ligando non è solo la regione C-terminale ma anche la regione di legame al DNA. IL DOMINIO CHE LEGA IL DNA DI UN RECETTORE DEGLI STEROIDI E’ UN MOTIVO “ZINC FINGER” Il dominio è costituito due dita di zinco del tipo Cys2/Cys2. Legano il DNA sottoforma di omodimeri oppure sottoforma di eterodimeri. In quest’ultimo caso, l’effetto è l'aumento del numero di possibilità di pattern di legame. Ogni dito controlla una proprietà 4 Polito ; x . . x x x importante del recettore. Gli aa sul x 3 . . ene EX lato destro del primo dito tati Cs È c’ È Xe: ‘ci ISFFRIRRX 9 IOOMOXAXGM 9dOK determinano la specificità di È Ù sequenza del sito bersaglio nel 2 x DNA (sono quelli che discriminano n c l’elemento di risposta), mentre gli % aa in basso nella regione di sinistra Sme Lada , del secondo dito (aa in blu) sono quelli che E discriminano la spaziatura, cioè controllano = la distanza fra i siti bersaglio riconosciuti Specific amino acids control binding and spacing da ciascuna subunità del dimero. Ogni sequenza sul DNA riconosciuta da questi oo 0° motivi è formata da due emisiti (i quali H n ° dA possono essere palindromi o ripetizioni © ® © © dirette) che possono essere o meno sparati % o d © da un certo numero di bp (sequenza 3, Pe e93f0 spaziatrice). Il recettore riconosce non solo o/e o ne la sequenza bersaglio attraverso quegli aa i Vo O Cojo sul lato destro del primo dito, ma per 0° 00000 000 discriminare gli elementi di risposta @DNA binding | Spacing ® riconosce anche la spaziatura fra i due ovirtdaliext www.©Fgito.com mezzi siti, tramite gli aa nella regione di sinistra del secondo dito. Le due dita formano -eliche che si ripiegano insieme per formare un grande dominio globulare. Le facce aromatiche delle -eliche formano un centro idrofobico, insieme a un foglietto che connette le due eliche. Un lato dell’elica N-terminale (si sta riferendo al primo dito) prende contatti nella scanalatura principale del DNA, mentre l’altro permette la dimerizzazione, tramite un loop (Dimerization loop) (cioè lei voleva dire che la regione C- terminale del dominio, ovvero nel secondo dito, c’è la regione di dimerizzazione). Un dito di Zn contatta il DNA mentre l'altro permette la dimerizzazione del recettore. UNO SCAMBIO IDENTIFICA DUE © Stessa sequenza in @ AMMINOACIDI CRITICI entrambi i recettori gr I recettori per i glucocorticoidi e per gli CECO estrogeni hanno una sequenza sovrapponibile —@ TOI Ctoze bp ASASGA quasi del tutto, l’unica differenza riguarda © appena due aa alla base del primo dito di zinco @ ( ì che discriminano gli elementi di risposta. In o © Glucocorticoid (GR) PS Mineralocorticoid (MR) Androgen (AR) Progesterone (PR) cvitualtexi wm:ergito.com più, distanza ed orientamento fra i due mezzi siti determinano il tipo di recettore conosciuto. Una prova diretta che il primo dito lega il DNA è stata ottenuta in un esperimento di “scambio della specificità”, in cui il dito del recettore degli estrogeni è stato deleto e sostituito dalla sequenza del recettore dei glucocorticoidi. La nuova sequenza riconosceva la sequenza GRE (il bersaglio usuale del recettore dei glucocorticoidi) invece di ERE (il bersaglio usuale del recettore di estrogeno), dimostrando che questa regione stabilisce la specificità con cui è riconosciuto il DNA. Nell’ambito dei recettori steroidei si distinguono due gruppi di recettori, in base fondamentalmente alle caratteristiche di riconoscimento: Elementi di risposta formati da due mezzi separati da 0 a 4 bp (sequenza spaziatrice). I recettori appartenenti a questo gruppo sono i recettori dei glicocorticoidi (GR), dei mineralcorticoidi (MR), degli androgeni (AR) e del progesterone (PR). Il recettore degli estrogeni (ER) funziona nello stesso Heterodimer binds direct repeats modo, ma la sequenza del suo mezzo TGACCT 0.5 pp TGACCT sito è TCACCT Questi recettori DOleca selcce riconoscono gli elementi di risposta sotto ( forma di omodimero. Quindi, su ogni { ‘ elemento di risposta (RE) palindromo si lega un omodimero testa-a-testa. E 3 È z Sei Elementi di risposta formati da due 4bp - T3R 5 bp - RAR vintualtext www ergito.com e riconosciuti da eterodimeri di cui un membro è RXR (recettore dell’acido 9-cis-retinoico); appartengono a questo gruppo anche i recettori della vitamina D3 (VDR), i recettori degli ormoni tiroidei ed i recettori dell’acido retinoico (RAR). La sequenza spaziatrice può essere da 0 a 5 bp. COME I RECETTORI DEGLI STEROIDI ATTIVANO LA TRASCRIZIONE Repression prevails in absence of ligand Corepressor Csvgt » VASVAN DININININISTN Steroid receptor PECE FR NERIZONI Coactivators Basal apparatus TR. ZI CBP/p300, Vai, Cr VAI ANTA A RNA polymerase PCAF Ligand virmaltert. vw Orgito com In generale questi recettori agiscono come attivatori indiretti dell’apparato basale. Hanno bisogno del coattivatore CBP/p300 che agisce a livello dei nucleosomi e lì acetila gli istoni. Fanno eccezione i recettori degli ormoni tiroidei e dell’acido retinoico (che possono agire anche sotto forma di eterodimeri) perché possono comportarsi sia da attivatori sia da repressori. In assenza di ligando, il recettore degli steroidi TR e RAR si legano ai loro elementi di risposta ed interagiscono con un complesso corepressore chiamato SRMT, il quale è il vero artefice della repressione. Nel momento in cui arriva e si lega il ligando, cioè il segnale, si scatena un cambiamento conformazionale cha causa l'allontanamento di SRMT e ciò consente al coattivatore (CBP/p300) di legarsi; ciò provoca l’attivazione della trascrizione da parte dell’apparato basale. Ci sono poi altre due modalità: una riguarda i recettori dei glucocorticoidi, l’altra i recettori degli estrogeni. Caso dei recettori dei glucocorticoidi: Il recettore da solo non è in grado di legare l'elemento di risposta (GRE). Nel momento in cui il ligando si lega al recettore (il recettore presenta 3 domini: dominio di legame al DNA, dominio di attivazione, dominio di legame del ligando), quest’ultimo viene attivato e può andare a legare il recettore. In assenza di ligando, il recettore viene mantenuto inattivo perché è legato a due subunità della proteina Hsp90. Il ligando ha maggiore affinità per il recettore di quanta ne abbia Hsp90, per cui, quando è presente (il ligando) si lega al recettore spiazzando Hsp90. Ciò comporta l’attivazione del recettore che entra nel nucleo dove svolge la sua funzione di attivatore. Questo sistema agisce su moltissimi geni, ma non su tutti ha un’attività di attivatore. Su alcuni geni l'elemento di risposta è leggermente diverso da quello canonico. «= Nei geni in cui è presente l’elemento di risposta classico, il recettore adotta una conformazione standard che gli permette di legare il coattivatore CBP, un istone acetilasi, che aiuta il recettore nella sua azione di attivazione genica. «= Nei geni in cui è presente l’elemento di risposta leggermente variato, il recettore assume una conformazione diversa da quella standard. Questo tipo di conformazione gli consente di reclutare un istone deacetilasi per cui l’effetto finale sarà la repressione di questi geni. Nota: Tutto viene “guidato” dalla sequenza degli elementi di risposta. VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE Negli eucarioti la maggior parte dei segnali vengono trasmessi ai geni attraverso una cascata di eventi che rappresentano appunto la trasduzione del segnale. Il ligando che dà l’avvio alle reazioni, in genere si lega alla superficie di uno specifico recettore cellulare di superficie. Ne risulta una serie di modificazioni di determinati fattori di trascrizione. Queste modificazioni sono per lo più fosforilazioni e defosforilazioni. Nei procarioti le vie di trasduzione sono molto brevi, limitate a pochi regolatori. Negli eucarioti, invece, queste vie di trasduzione determinano l’attivazione di molti regolatori prima di determinare l’effetto sulla trascrizione del gene bersaglio. Si determina in questo modo il cosidetto effetto a cascata. Solitamente, si tratta di una cascata di fosforilazioni compiuta da una serie di chinasi che via via si attivano e fosforilano siti specifici che determinano l’attivazione successiva di altre chinasi. Grazie al legame del ligando al recettore di membrana si determina una serie di reazioni che porta, nel citosol, all'attivazione di una proteina, la quale solo dopo essere stata attivata entra nel nucleo e va a regolare la trascrizione di vari geni. LA VIA DI JAK-STAT: Sulla membrana citoplasmatica i recettori del ligando (tirosina chinasi recettoriale) in questione (citochine, ovvero fattori di crescita. Si noti che la stessa via può essere avviata dal ligando interferone IFN , il quale, ovviamente, si legherà ad un recettore specifico diverso dal recettore riconosciuto dalle citochine) sono presenti sottoforma di due monomeri e sono inattivi. I due monomeri legano la chinasi JAK, anch’essa inattiva. Nel momento in cui il recettore dimerizza, cioè quando si lega la citochina, la chinasi JAK si attiva e svolge la sua azione chinasica su di sé ò nia o 08 ale 0 | aloe _ n /8 Ù —dbe__—_; lo DNA viene srotolato dal nucleosoma e ciò scopre anche il sito di legame per la seconda proteina. IL GENE HO E’ CONTROLLATO DA DUE REGOLATORI, UNO RECLUTA MODIFICATORI DEI NUCLEOSOMI, L’ALTRO RECLUTA UN MEDIATORE. Un altro importante esempio dell’integrazione del segnale è quello del gene HO, che codifica per l’endonucleasi HO coinvolta nel cambio del gruppo di compatibilità di lievito. Il gene HO ovviamente non deve essere sempre espresso. L’espressione del gene HO dipende dalla presenza di due attivatori, che se presenti entrambi accendono il gene. Inoltre c’è da considerare che il gene HO è attivo soltanto nella cellula madre, perché nel momento in cui si forma una cellula figlia, questa non ha il gene HO attivo; quindi a questa regolazione di HO si associa anche un meccanismo che impedisce l'attivazione di questo gene nella cellula figlia. I due attivatori che funzionano nella cellula madre sono: ED corpisso cirmodo lamento delle croma! SWI15 (attivo solo nella cellula e: i madre) che presenta dei siti di si A legame in una regione molto a f monte rispetto al gene HO (a circa 1 spento kb dal promotore), di conseguenza MIE + quando si lega non può andare ad __000 attivare da solo il gene (si ricordi che nel lievito gli attivatori non riescono a lavorare a lunga a ade so - distanza), quindi recluta un sito SBF complesso di rimodellamento della cromatina (che nel lievito è SW YSNF) ; questo complesso, come la maggior parte dei complessi di rimodellamento, va ad attivare un’istone acetilasi che modifica la regione che contiene i siti di legame per il secondo attivatore: SBF (attivo solo in una fase del ciclo. Si lega ad un sito posto più vicino al promotore). Solo dopo l’attivazione dell’istone acetilasi (quindi grazie all’azione di SW15) può legarsi SBF che recluta il complesso trascrizionale interagendo col mediatore. LEGAME COOPERATIVO DEGLI ATTIVATORI SUL GENE DELL’INTERFERONE UMANO 5 mesi Un altro esempio di integrazione del ii segnale è dato dal legame cooperativo degli attivatori sul gene INF- umano rr f- 3 () 1000 (interferone). Questo gene viene attivato soltanto in seguito ad un’infezione virale perché questa provoca la sintesi di tre attivatorii NFKB, IRF e complesso Jun/ATF, che non sono attivatori specifici, cioè vanno ad attivare anche altri geni (ad es. regolano anche l’espressione del gene per la catena leggera dell’Igk). Questi attivatori si legano cooperativamente a monte del promotore su siti specifici posti vicini l’uno dopo l’altro nell’enhancer (posto circa 1 kb a monte del promotore), costituendo l’enhanceosoma. L’interazione tra gli attivatori viene anche stimolata dalla presenza di alcuni dimeri di una proteina architettonica: HMG-1 che piegando il DNA a formare un’ansa, facilita il legame fra gli attivatori. HMG-1 è costitutivamente attivo nella cellula. Quindi questo tipo di integrazione del segnale si basa sul legame cooperativo degli attivatori (tutti e tre gli attivatori ed HMG-1 devono essere presenti. Una volta assemblato, l’enhanceosoma contatta il complesso trascrizionale ed il gene viene attivato), mentre quella che abbiamo analizzato in precedenza si basava sulla contemporanea espressione di più attivatori che non interagivano direttamente l’uno con l’altro. IL CONTROLLO COMBINATORIO DELL’ATTIVITA’” GENICA E’ FONDAMENTALE PER LA COMPLESSITA’ E DIVERSITA’ DEGLI EUCARIOTI © Negli eucarioti il controllo combinatorio d 2 è ampiamente utilizzato ed è ottenuto TTT è grazie al fatto che uno stesso attivatore 9 press ur “io può agire su più geni. Nel caso dei procarioti avevamo parlato di controllo combinatorio relativamente all’azione che svolge CAP sul controllo di più geni legati al metabolismo di zuccheri alternativi in assenza di glucosio. Sul gene lac, CAP lavora con il repressore Lac mentre sul gene gal con il repressore Gal. Nel caso degli eucarioti il meccanismo è un po’ più complesso perché sono moltissimi gli attivatori che possono contribuire. In un esempio che possiamo vedere in figura, il gene A viene attivato da più stimoli (è controllato da 4 segnal: 1, 2, 3 e 4), ogni stimolo corrisponde all’azione di un attivatore e di conseguenza ci si aspetta che nel gene ci siano 4 siti diversi ognuno per il legame di ciascun attivatore (attivatori 1, 2, 3 e 4). Il gene B invece risponde a 3 stimoli piuttosto che a 4 (3, 5 e 6) e anche in questo caso si ha una situazione simile, inoltre l’attivatore 3 è un attivatore comune per entrambi i geni. Questo esempio spiega il fatto che quando gli attivatori interagiscono sinergicamente con un pool di attivatori diversi hanno un effetto che è diverso perché vanno ad attivare uno specifico gene. Quindi attivatori differenti (o più molecole dello stesso attivatore) interagiscono sinergicamente fra loro ed hanno un effetto finale che può variare da gene a gene. Questo permette di spiegare il perché regolatori differenti possono lavorare in differenti combinazioni avendo come bersaglio geni diversi. sito 3 sito 5 sito 6 DOMINI DI ATTIVAZIONE (AD) Per quanto riguarda i regolatori abbiamo ben studiato come sono strutturati i domini di legame al DNA, adesso consideriamo invece i domini di attivazione. Relativamente ai domini di attivazione non ci sono delle regole generali sulle quali basarsi o delle strutture ben identificate: i loro bersagli sono estremamente numerosi e sono ancora mal definiti, mentre per i domini di legame la struttura degli elementi di risposta è perfettamente conosciuta (sequenze a livello del DNA). Per es. bersagli dei domini di attivazione possono essere fattori generali di trascrizione, enzimi che modificano gli istoni (acetilasi e deacetilasi), complessi di rimodellamento dei nucleosomi,etc. etc. Non c’è una struttura ben precisa dei domini di attivazione, è noto soltanto che spesso quando si determina l’interazione col bersaglio assumono una conformazione ad elica; quindi, la conformazione che avevano prima dell’interazione è estremamente varia e non ben definita, ma spesso, nel momento in cui interagiscono vanno a costituire una conformazione ad elica (anche se non sempre è così). La possibilità di classificare questi domini di attivazione dal punto di vista strutturale è abbastanza difficile, ma in generale possiamo distinguerli in base al loro contenuto amminoacidico: ® Regioni con caratteristiche “acide” (come per es. quelle del dominio di attivazione Gal4): queste regioni acide, che ovviamente hanno una preponderanza di amminoacidi acidi, si è visto che il più delle volte funzionano da attivatori forti. I domini con aa acidi alcune volte vanno a costituire un’elica anfipatica (aa acidi su un lato), ma altre volte non sono formano nessuna struttura secondaria o terziaria. Alcuni esempi di proteine con AD acidico sono: - Gal4 (un particolare Zn finger: Znz — Cyse) - AP1 (bZIP) - VP16 (no DBD) E’interessante notare che non c’è alcuna corrispondenza tra un dominio che lega il DNA e il dominio acidico, cioè se una proteina ha un determinato dominio di attivazione, per esempio HTH, allora tutte quelle che hanno HTH avranno lo stesso dominio di attivazione: c’è invece una situazione estremamente eterogenea. ® Ricchi in Glutammina (Q-rich) Alcuni esempi di proteine con Q-rich AD: - Sp1 (Zn finger) - Antp (cooperativo) - Oct (ottamero) a Anche in questo caso possiamo notare che non meccanismo: c’è alcuna corrispondenza con il dominio di ey oi petzione legame , FE promotore ® Ricchi in Prolina (P-rich) sito di legamé Studi sulla struttura degli AD Come abbiamo già sottolineato in precedenza, non esistono strutture fisse nei domini di attivazione. Attraverso studi di cristallografia pain a raggi X ed NMR non sono state individuate delle conformazioni specifiche da associare a questi domini. Si ipotizza che i domini di attivazione restino non strutturati fino all’interazione col bersaglio, quando la maggior parte di questi va a costituire un'elica. In genere, i geni eucariotici sono per lo più sotto controllo positivo, mentre quelli procariotici sono per lo più sotto controllo negativo. Per controllo positivo si intende il fatto che molti geni sono spenti e vengono accesi da un induttore. Anche negli eucarioti però sussistere un controllo mediante repressori. I repressori eucariotici non per l'attivatore Pa venue! gal protein binding J site 1 A TS ln protein binding!” | site 2 A protein 2 nudleosome assembly ' ' positioned nucleosome Nel nucleosoma le sequenze del DNA hanno un’accessibilità differente a seconda del punto in cui sono posizionate rispetto al nucleosoma: più centrali si trovano rispetto al DNA nucleosomico tanto meno saranno accessibili, tanto più si trovano nella porzione terminale del DNA nucleosomico tanto più risulteranno accessibili. L’accessibilità delle sequenze del DNA può cambiare mediante i tre meccanismi di rimodellamento della cromatina (Scivolamento-Trasferimento-Rimodellamento vero e proprio). Inoltre l’organizzazione dei nucleosomi sul DNA può essere determinata da vari fattori, quali la presenza di «proteine di posizionamento”, cioè quei fattori che escludono, in base al loro posizionamento l’assemblaggio del nucleosoma perché il tratto di DNA che viene reso disponibile è minore al tratto necessario per formare il nucleosoma (vedi lez. precedenti). Le proteine di posizionamento inoltre possono posizionare il nucleosoma in un preciso tratto di DNA. ETIE d_ LL To Ha HISTONE Ha Key ® Acetylation (O) Methylation @ Proestonizion Figura 10.1 Human Molscular Genetica, Sie. (© Garland Scienoe 2004) Le code N-terminali degli istoni sono suscettibili alle modificazioni in quanto sporgono all’esterno del nucleosoma; grazie all’intervento di enzimi specifici le code N-terminali possono quindi andare incontro a fosforilazione su residui amminoacidici specifici, acetilazione o metilazione. L’acetilazione N-terminale degli istoni ha un significato dal punto a di vista della regolazione genica, cioè tratti di DNA genomico a livello dei quali le code N- terminali degli istoni sono altamente acetilate equivalgono a cromatina più aperta, quindi più accessibile ai fattori di trascrizione, di conseguenza a regioni di genoma che probabilmente contengono dei geni che devono essere espressi. La deacetilazione, al contrario, è tipica di quelle regioni di genoma nelle quali la cromatina risulta ea rie ar essere più compatta } (eterocromatina) ed equivale a Negrar insonne quelle regioni che devono essere silenti, cioè non espresse in quel determinato momento. Gli enzimi HAT agiscono come co-attivatori di geni nella cromatina, mentre gli enzimi HDAC come co-repressori, quindi hanno azioni antagoniste. Tra i residui amminoacidici più significativi tra quelli che spesso subiscono modificazione, nello specifico acetilazione e deacetilazione, vi sono le lisine in posizioni specifiche (ricordare che una modificazione in un determinato residuo può avere un significato diverso se si presenta in una posizione diversa, quindi la stessa modificazione può determinare effetti diversi a seconda del residuo amminoacidico che va a modificare sulla stessa coda). Le modificazioni covalenti che avvengono sulle code istoniche sono coinvolte nella regolazione genica anche perché, i loro residui amminoacidici modificati, vengono riconosciuti da proteine specifiche che contengono dei bromodomini e cromodomini, in particolare: - Bromodominio: le proteine che lo presentano hanno un dominio di legame ad una Lys- acetilata - Cromodominio: le proteine che lo presentano hanno un dominio di legame ad una Lys- metilata \Ld Riassumendo: Le code N-terminale degli istoni vengono modificate dall’acetilasi (o metilasi o deacetilasi), dopodiché a loro volta queste code permettono il reclutamento di ulteriori proteine di regolazione (con bromo e cromodominio che riconoscono particolari residui amminoacidici modificati sulle code) che a loro volta richiamano i complessi di rimodellamento che agiscono in loco (vabbè insomma.. ci sono complessi di rimodellamento, come SWI/SNEF, che possiedono già bromodomini e/o cromodomini). Nel nucleo le HAT e le HDAT non lavorano isolatamente ma {a) Repressor-directed histone deacetylation fr E da Re 7% Desceriaion entrano a far parte di grossi È tl sf no 3 IRIMORCRA complessi multiproteici (es fd ADA o TFTC per le HAT oppure Sin3 o NuRD per le HDAC). All’interno di questi Histono octorner complessi costituiscono delle subunità. Per esempio un ) ATO attivatore, che contiene’ un terminal tas dominio di legame al DNA e un dominio di attivazione, interagisce con un complesso che i SO, contiene due fattori che agiscono come deacetilasi (o come ativator eri $ acetilasi), si tratta in questo caso quindi di un contatto diretto. In altri casi invece ci può essere il complesso contattato dall’attivatore che con una sua subunità contatta anche un altro complesso di cui fanno parte le acetilasi o le deacetilasi ® (contatto indiretto). Anche alcuni co-attivatori funzionano da acetilasi, quindi possiamo immaginare una situazione in cui il dominio di attivazione dell’attivatore contatta il co-attivatore ed esso stesso funziona da acetilasi. Ovviamente tutti questi complessi di rimodellamento vengono enhancers dei geni attivi, cioè espressi. Sono tratti di DNA che vengono prodotti in seguito all’attacco dei fattori di trascrizione che spostano gli ottameri di istoni, cioè queste regioni non sono sempre e costantemente sensibili alla DNasi o sempre prive di nucleosomi, ma la loro comparsa dipende dallo stato di attivazione di quel determinato gene: quindi nel momento in cui quel gene deve essere attivo i fattori di trascrizione si associano a queste regioni regolative che sono chiaramente prive di nucleosomi, cioè si determina la formazione di questi siti ipersensibili nel momento in cui si deve attivare quel gene e di conseguenza le regioni regolatrici (promotore ed enhancer) devono essere rese disponibili per l'attacco del complesso trascrizionale. Inoltre il concetto di “sito ipersensibile” si associa a quello di “dominio funzionale”: all’interno del nucleo, le anse di DNA si trovano attaccate alla matrice nucleare (regioni MAR o SAR); queste anse vengono indicate come “domini strutturali”. Un sito di attacco alla matrice (MAR, matrix attachment region) può essere responsabile dell’attacco della cromatina alla periferia del nucleo ed è probabile che sia responsabile della creazione di un dominio fisico di DNA che prende la forma di un’ansa che si estende dai siti di attacco. Questo meccanismo assomiglia a un modello dell’azione degli isolatori e in effetti alcuni elementi MAR si comportano da isolatori e quindi non c’è una semplice relazione di causa-effetto. Non sarebbe sorprendente se l’isolatore e gli elementi MAR fossero associati per mantenere una relazione fra effetti regolatori e struttura fisica. I domini funzionali invece corrispondono a quelle regioni ipersensibili alla DNasi. La sensibilità alla DNasi I definisce un dominio cromosomico, una regione di alterazione della struttura che comprende almeno un’unità di trascrizione attiva e talvolta si estende al di là di essa. (Si noti che l’uso del termine “dominio” non implica alcuna necessaria connessione con i domini identificati dalle anse di cromatina nei cromosomi). Questo concetto è anche abbastanza ovvio perché il dominio funzionale è una regione del genoma che contiene uno o più geni che devono essere espressi; dal punto di vista strutturale un dominio funzionale equivale a cromatina rilassata: sottoforma di fibra di 30 nm o addirittura sottoforma di filo di perle (11 nm). Quindi una regione sensibile alla DNasi che contiene un gene espresso costituisce un dominio funzionale. Il dominio funzionale è fiancheggiato da regioni che sono insensibili alla DNasi perché lo isolano dal resto del genoma. I siti ipersensibili precedono i promotori attivi. Possiamo notare dagli esempi in figura che i siti ipersensibili non sono presenti TENESSE Too sempre con la stessa struttura: in un | Cleavage sites Cleavage sites Stertpoint > caso (minicromosoma di SV40) in un Vwywy promotore a circa 300 bp a monte del 3 È aa sito d’inizio troviamo due siti ipersensibili |‘ casi alla -300 -50 SV40 late region DNasi I e una regione “protetta”, che presumibilmente riflette l’associazione del DNA con proteine V v v Vv non istoniche: tre siti di taglio per la DNasi, |_ 1341 «70 ___ Bgiobingene | Ja regione “protetta” e poi altri siti di EJ PICEICII taglio; nell’esempio più in basso in figura invece abbiamo nel promotore della -globina, a circa 270 bp a monte del punto di inizio, 4 siti di taglio. Da questo si intuisce che un sito ipersensibile quindi non è sensibile alla nucleasi in modo uniforme, ma in maniera eterogenea, cioè cambia da promotore a promotore. La cosiddetta “regione protetta” è così chiamata perché grazie al legame con altre proteine si impedisce l’azione della DNasi in quel tratto: questo significa che la struttura del sito ipersensibile è il risultato del legame di proteine regolative specifiche, cioè il sito ipersensibile non è costituito solo dalle regioni di taglio per la DNasi, ma anche da regioni protette da proteine regolative; queste proteine possono essere esse stesse proteine di rimodellamento oppure proteine che richiameranno il complesso di rimodellamento. Nell'esempio in figura, un fattore sequenza-specifico si lega al DNA (è il fattore che per primo riconosce un elemento regolatore); dopodiché il complesso di rimodellamento viene richiamato, si lega in loco e spiazza l’ottamero di istoni. Quindi quelle stesse proteine che si trovano legate alle regioni protette fanno parte o degli attivatori o di proteine che in ogni caso modulano il richiamo del complesso di rimodellamento. Il sito ipersensibile è il risultato del legame di proteine regolatrici specifiche che escludono i nucleosomi. Il meccanismo dello spostamento degli ottameri di istoni dipende dai complessi per il rimodellamento della cromatina, che utilizzano ATP come fonte di energia per effettuare il cambiamento strutturale. Questi complessi possono essere reclutati da una varietà di fattori per agire su siti specifici della cromatina. = ISOLATORI Si tratta di sequenze che delimitano un dominio funzionale del DNA (si trovano alle estremità) impedendo che su di esso si esercitino effetti dovuti a sequenze regolatrici circostanti (ma non correlate) che possono avere effetto di attivazione o silenziamento. Notare che all’interno di un dominio funzionale possono esserci uno o più geni. Gli isolatori (o insulator) sono sequenze di 1-2 kb. Gli isolatori possiedono almeno una delle seguenti proprietà chiave: - Quando un isolatore è posto fra un enhancer e un promotore, impedisce all’enhancer di attivare il promotore. L’effetto di blocco può spiegare perché l’azione di un enhnancer è limitata a un particolare promotore. - Quando un isolatore è posto fra un gene attivo e l’eterocromatina, fornisce una barriera che protegge il gene dall’effetto inattivante che si diffonde dall’eterocromatina. #4 Alcuni isolatori possiedono entrambe queste fin ss proprietà, ma altri ne hanno una soltanto; erano FERREE oppure la funzione di blocco e quella di barriera possono essere separate. Sebbene ( see entrambe le azioni siano probabilmente a I mediate da cambiamenti della struttura della cromatina, potrebbero coinvolgere 060 effetti diversi. In ogni caso l’isolatore enoncer Moletore | promotore enhanoer definisce comunque un limite per gli effetti Pl 1 a lunga distanza. Du co Qual è lo scopo di un isolatore? Una funzione principale potrebbe essere quella di contrastare un’attività indiscriminata degli enhancer sui promotori. La maggior promatore — enhancer isolatore z 4 0 promotore Sd TU IZ 14 lo 18 ZU Z£ 24 Z0 25KD <_sza6l —s7a7 — |s748 è parte degli enhancer funziona con scs ASP7O NSp7O scs “ qualunque promotore che si trovi nelle = = vicinanze e un isolatore potrebbe limitare un enhancer bloccando il passaggio dei suoi 350 bp 200 bp effetti oltre un certo punto, così da limitarne l’effetto su un promotore I ssi Hell resistant resistant sensitive sensitive sensitive sensitive wergito.com specifico. In modo simile, quando un gene è posto vicino l’eterocromatina, un isolatore può impedire che sia inattivato inavvertitamente dalla diffusione dell’eterocromatina. Gli isolatori sono perciò elementi che aumentano la precisione della regolazione dei geni. Gli isolatori sono stati scoperti durante l’analisi di una regione del genoma di D.melanogaster di 18 kb che costituisce la banda 87A7. All’interno di questa regione ci sono due geni hsp70 con orientamento opposto. Alle estremità della banda si trovano strutture specializzate della cromatina, chiamate scs SETE a e scs’, ognuna delle quali consiste di una regione ll O altamente resistente alla degradazione da parte (A della DNasi I, fiancheggiata su entrambi i lati da siti ipersensibili, spaziati di circa 100 bp. Lo An active insulator is a barrier to heterochromatin schema di taglio a livello di questi siti è alterato quando i geni sono accesi dallo shock termico. VANANANZ N18 (AN Qualunque sequenza che si trovi al di fuori dei due Propagation Insulator Promoter isolatori non può agire sui geni hsp70. Due isolatori ia nin i possono proteggere la regione che si trova in mezzo a essi da tutti gli effetti esterni. Sebbene svolgano la stessa funzione, i due isolatori hanno un’estensione diversa (scs 350 bp; scs’ 200 bp) e non hanno sequenze perfettamente identiche, quindi in generale per gli isolatori non ci sono dei moduli strutturali ben precisi, ma sicuramente contengono delle sequenze in grado di richiamare proteine specifiche e quindi in grado di legarsi al DNA bloccando l’effetto esterno di enhancers o silencers. Le due unità specializzate della cromatina non sembrano avere ruoli positivi o negativi nel controllo dell’espressione genica, ma impediscono semplicemente agli effetti di passare da una regione alla successiva. Se regioni adiacenti hanno effetti repressivi, gli elementi scs potrebbero essere necessari per bloccare la diffusione di questi effetti e perciò potrebbero essere essenziali per l’espressione genica. In questo caso, la delezione di questi elementi potrebbe eliminare l’espressione dei geni adiacenti. Un altro fenomeno molto importante dovuto al posizionamento di un isolatore è il blocco dell’avanzamento dell’eterocromatina, cioè l’isolatore funziona da barriera “contro” la propagazione dell’eterocromatina che è associata al silenziamento genico. A differenza dello spegnimento di un singolo gene la propagazione dell’eterocromatina è un meccanismo estremamente veloce e può portare a silenziare anche tratti estremamente grandi di genoma in tempi brevissimi. (per es.: l’inattivazione del cromosoma X). La presenza di un isolatore, bloccando la propagazione dell’eterocromatina, può mantenere acceso anche un singolo gene. Expression is con led by several types of elements| Insulator MAR LCR Enhancer e = X* On R_ A ‘ovirtualtext www.ergito.com Transcription units I domini funzionali corrispondono a regioni di eucromatina. A livello di questi domini troviamo sempre degli elementi ben precisi : due isolatori alle estremità, al centro l’unità di trascrizione, a monte ci sono i MAR o SAR ed un altro elemento sempre presente è 1’ LCR. - H3 metilato a °Lys lega la proteine HP1 tramite il cromodominio. Il cromodominio ha una sorta di regione di appaiamento specifica con il dominio dell’istone che contiene la lisina metilata. (RONN NET SOR Le HP1 hanno la capacità di autoaggregarsi velocemente SUV39HI ed in breve tempo; in questo modo riescono a propagare RIS RARI I TO l’inattivazione nelle regioni vicine finché non si incontra un isolatore. In altre parole, l’attacco di HP1 all’istone A complex polymerizes along histone tails H3/H4 N-terminal tails RAP1 binds to DNA metilato H3 rappresenta l’innesco del silenziamento perché RIMASTA NINE rated ce Active chromatin Inactive chromatin ergito.com 4P1 binds to me ulteriori molecole di Hpl si DI aggregano sulla catena di SIR3/SIR4 bind to H3/H4 INDIIIPIIIDI SIR3/SIR4 polymerize IMI SIR3/SIR4 attach to matrix ratti @TAILO com IPi crssgono Rapl DÒ E’ la proteina che interviene nel S*csesegtes __silenziamento della cromatina nel lievito. Questa proteina si lega alle ripetizioni Ci3A presenti in corrispondenza dei telomeri e si lega anche agli elementi silencer cis-agenti necessari per la repressione di HML e HMR. Rapl svolge il ruolo cruciale d’individuare nel DNA le sequenze al cui livello si forma l’eterocromatina; quando Rapl si lega alle ripetizioni presenti a livello dei telomeri, recluta il complesso delle SIR, costituito da SIR2,3,4. SIR2 funziona da deacetilasi nei confronti delle code N-terminali degli istoni H3/H4 senza specificità di aa. Le altra due SIR legano in maniera specifica le code appena deacetilate da SIR2. SIR3 e SIR4 (legate alle code deacetilate) richiamano a questo punto altri complessi SIR3/SIR4 ed il meccanismo si propaga velocemente. SIR3/SIR4 polimerizzano lungo la cromatina e possono connettere i telomeri alla matrice nucleare. Si ignora che cosa limiti la propagazione del complesso. La regione C-terminale di SIR3 presenta una somiglianza con le lamìne nucleari (proteine costituenti la matrice nucleare) e potrebbe essere responsabile dell’ancoraggio dell’eterocromatina alla periferia del nucleo. O 9 Ri talomero1-5 kh 4 dIPIIIIIIO0I =" Repl — proteina Sir 2 dd O è Jess Sir3.4 Y y L da Anche la METILAZIONE del DNA ha negli eucarioti un significato di regolazione dell’espressione genica ed è sfruttata anche nel fenomeno dell’imprinting (che consiste in una differenza di comportamento fra gli alleli ereditati da ciascun genitore), a differenza dei procarioti nei quali la metilazione è associata all’identificazione del particolare ceppo batterico ed anche alla distinzione del DNA replicato da quello non replicato. Negli eucarioti esistono due tipi di metilazione: - Metilazione di mantenimento. Fa sì che le cellule figlie abbiano lo stesso grado di metilazione della cellula madre. - Metilazione de novo. Serve ad aggiungere dei gruppi metile in nuove posizioni specifiche con un significato diverso rispetto al significato precedente, perché è cambiato il profilo di metilazione del DNA. Normalmente i siti di metilazione sono la palindrome CpG (citosina-fosfato-guanina; che si ha ove la citosina è direttamente seguita da una guanina nella sequenza del DNA). La maggior parte dei gruppi metilici si trova in “doppietti” CpG e in effetti la maggioranza delle sequenze CG è metilata. Di solito sono metilati i residui di C (a livello della posizione 5 della C) su entrambi i filamenti di questa breve sequenza palindroma, dando la struttura 5° "CpG 3° 3° GpC" 5’ Al contrario della metilazione, la sottometilazione è TE associata a geni attivi. In certe regioni la densità dei DN doppietti CpG raggiunge invece il valore previsto ed è infatti 10 volte più alta rispettoal resto del genoma. I Denon metnyiase MI doppietti CpG in queste regioni non sono metilate. > Ma Queste isole ricche di CpG (isole CpG) sono Ba” sequenze il cui contenuto di C e G è estremamente N ampio (contenuto medio di GC del 60% in confronto Perpetuation y alla media del 40% della massa del DNA) e prendono movies ; la forma di tratti di DNA lunghi in genere 1-2 kb. ic Alcune isole sono presenti in elementi ripetuti Alu SET fi e potrebbero essere semplicemente la conseguenza Demis , = del loro alto contenuto di GC, ma il sequenziamento E del genoma umano ha confermato che, a parte queste, i esistono circa 30.000 isole (tante quanti sono i geni). ana = Queste sequenze possono essere metilate o non metilate e contengono poco H1 (il che probabilmente significa che la struttura è meno compatta), gli altri istoni sono estesamente acetilati (una caratteristica che tende ad essere associata all'espressione genica) e ci sono siti ipersensibili (come atteso per i promotori attivi). Questi dettagli hanno fatto capire che queste sequenze costituiscono regioni di controllo che fanno parte dei domini funzionali, ovvero regioni geneticamente attive. In parecchi casi, le isole CpG iniziano appena a monte di un promotore e si estendono a valle nella regione trascritta prima di svanire gradualmente. Grazie all’alto contenuto di CpG queste regioni possono essere metilate/non metilate. Anche se il genoma umano viene tipicamente descritto come composto da quattro basi azotate, una di esse, la citosina, può essere presente in forma metilata. Questa lieve modificazione può avere effetti drastici sul comportamento e sulle funzioni della regione genomica circostante. La mutilazione della citosina può verificarsi solo quando il residuo di citosina è localizzato immediatamente in 5’ rispetto ad un residuo di guanina (dinucleotide CpG). Anche se i dinucleotidi CpG sono molto poco rappresentati nel genoma, esistono delle brevi regioni genomiche (500-2000 coppie di nucleotidi), dette isole CpG, in cui la frequenza di dinucleotidi CpG eguaglia o supera il numero matematicamente prevedibile in caso di distribuzione nucleotidica casuale. Circa la metà dei geni del genoma umano recano un'isola CpG nel loro promotore (1). In gran parte dei geni dei tessuti normali la trascrizione non è regolata dalla mutilazione dell’isola CpG localizzata nel promotore. In alcuni casi, tuttavia, le isole CpG sono metilate: i geni sul cromosoma X inattivo ed i geni imprinted vengono metilati durante il processo di inattivazione, le isole CpG metilate sono associate con la cromatina in conformazione altamente condensata, e l’inattivazione dei geni tramite metilazione delle isole CpG può contribuire alla carcinogenesi. Come nel caso delle mutazioni e delle delezioni, la metilazione somatica de novo delle isole CpG può determinare l’inattivazione di geni oncosoppressori e fornire così alla cellula un vantaggio di crescita selettivo. L’ipermetilazione di un’isola CpG è stabile, e persisterà nel tumore man mano che questo si sviluppa. Anche se l’esatto meccanismo che determina l’ipermetilazione aberrante è ancora sconosciuto, sono state caratterizzate tre metiltransferasi che giocano un ruolo nell’instaurazione e nel mantenimento dei quadri di metilazione (2). L’analisi del quadro di metilazione di una cellula potrebbe fornire informazioni cruciali sulla cellula stessa, incluso il tessuto di origine, la sua funzione ed il suo stato di malattia. L'interesse della comunità scientifica su questo argomento è in rapida crescita, e i ricercatori stanno scoprendo le enormi potenzialità delle informazioni codificate nei quadri di metilazione. Le malattie come il cancro lasciano il loro segno sul genoma, ed i test futuri di diagnostica molecolare utilizzeranno queste tracce di mutilazione per rilevare la presenza del cancro e ricavare informazioni sulla progressione della malattia. Per ciascun tipo di metilazione si usano enzimi differenti, di conseguenza distinguiamo 3 classi di metilasi: - metilasi de novo, che riconosce il DNA in virtù di una sequenza di DNA specifica e agisce soltanto su DNA non metilato aggiungendo un gruppo metilico ad un filamento. - metilasi di perpetuazione (o di mantenimento), reclutata subito dopo la replicazione per andare a ripristinare il profilo di metilazione dei genitori. - demetilasi, enzimi che rimuovono i gruppi metilici. La denominazione più formale per questi enzimi è metiltrasferasi. Nel momento in cui vengono metilate le regioni regolatrici di un gene, come il promotore o l’enhancer, vengono richiamate nelle relative posizioni delle proteine che legano in maniera specifica il DNA metilato, riconoscono la 5"C e richiamano il complesso di rimodellamento ed i vari istoni deacetilasi che determinano lo spegnimento del gene. Normalmente per reprimere l’espressione di un gene è sufficiente attuare i meccanismi per la repressione. Tuttavia, mentre nel caso della repressione il gene è spento per un tempo limitato, nel caso del silenziamento si ottiene lo spegnimento del gene (o di più geni) per un tempo maggiore. L’inverso della repressione richiede poco tempo per consentire l’accensione del gene; l’inverso del silenziamento ha bisogno di segnali ben più significativi. saturazione, si definisce un enzima ad azione aspecifica perché questa degrada ogni singolo legame fosfodiesterico. Se però vado a legare il mio frammento di DNA con una proteina e vado poi ad effettuare la digestione, tutti i legami fosfodiestereci a Monte e a valle della proteina verranno digeriti mentre quelli sotto la proteina non verranno digeriti in quanto la proteina impedisce l'azione dell'enzima. Se andiamo ad effettuare una reazione il DNA che noi stiamo utilizzando è definito freddo, non è riconoscibile quindi per capire la sequenza protetta dalla proteina bisogna inserire un marcatore cioè una bandierina , quindi prendo il frammento di DNA e lo vado a marcare con l'isotopo radioattivo cioè vado ad introdurre un atomo di un elemento che emette radiazione, se seguiamo le radiazioni emesse dell'atomo possiamo seguire il destino della molecola nella quale l'atomo è stato introdotto. In un acido nucleico possiamo inserire un gruppo fosfato marcato, infatti noi sappiamo che la molecola degli acidi nucleici hanno una polarità dove all'estremità 5’ troviamo il gruppo fosfato che così però non permette di seguire la molecola quindi si va ad effettuare una digestione con una fosfatasi per eliminare questo fosfato terminale a questo punto quindi l'estremità 5’ diventa un substrato da rifosforilare quindi possiamo aggiungere un nuovo gruppo fosfato. Andiamo quindi a aggiungere una chinasi che trasferisce un gruppo fosfato andando ad utilizzare l’ATP come sorgente per trasferire il gruppo fosfato, questa molecola di ATP utilizzata in realtà è molto particolare in quanto il fosfato gamma contiene un atomo di fosforo 32 che è l'isotopo che vado emettere radiazioni. A questo punto si va a denaturare il frammento di DNA perché l'analisi va effettuata sui singoli filamenti, e dopo si va ad effettuare la digestione con l'enzima. Se l'enzima viene digerito nella sua totalità, otteniamo i singoli nucleotidi che in realtà non possono essere poi legati alla proteina, In quanto siamo in una situazione di saturazione, abbiamo saturato tutti i siti sul DNA e l'enzima ha digerito tutti i possibili siti e quindi in queste condizioni non abbiamo alcun risultato. Per questo si va ad effettuare una digestione parziale in cui vado quindi ad inserire una quantità minore di enzima per un tempo minore, quindi l'enzima non avrà il tempo sufficiente o comunque non ci sarà una quantità sufficiente di enzima per poter tagliare tutti i siti, questo ci permette di ottenere una popolazione di molecole di tutte le dimensioni perché l'enzima ha tagliato in siti diversi. Si va da effettuare prima un esperimento pilota in cui al frammento di DNA aggiungo una determinata unità di enzima e lo faccio andare per tempi diversi, a 5 minuti, a 10 minuti e così via. Ogni 5 minuti vado ad interrompere la reazione e il prodotto della mia digestione lo vado ad osservare sul gel di agarosio in questo modo va ad osservare che mano a mano che il DNA viene frammentato ottengo una progressiva diminuzione delle bande che nel tempo si spostano verso il basso fino a quando va da avere frammenti piccolissimi ottenuti dalla digestione completa, questo mi serve per ottenere un profilo che va a rappresentare tutti i possibili frammenti ottenuti. Vado a considerare il campione uno in cui vado ad inserire il DNA marcato più il mio enzima e faccio andare la reazione per un minuto, dovrei avere in questo modo una di gestione totale del DNA e questo sarà quindi il mio controllo. Nel secondo campione invece vado ad utilizzare il DNA marcato più la proteina faccio incubare per 15 minuti poi aggiungo l'enzima e faccio andare la reazione per un altro minuto. Il DNA digerito solo quell’enzima va a darmi le bande viste con l'esperimento pilota, quando aggiungo la proteina invece l'enzima non può digerire i siti coperti dalla proteina e quindi vedo una serie di bande a Monte e a valle, mentre al centro rimane un pezzo di DNA che non si vede, questo tratto prende il nome di finestra di protezione in quanto il DNA viene protetto dalla digestione dell'enzima perché legato appunto alla proteina. Vi sono due tipi di questa tecnica: NchiP che tratta la cromatina nativa non introduce degli agenti che aumentano la forza di legame tra il DNA e la cromatina, quindi io prendo il DNA uguale a come lo trovo all'interno della cellula e lo vado ad immunoprecipitare, questa modalità viene utilizzata solitamente per quelle proteine che sono strettamente associate come ad esempio gli istoni. Xchip introduco dall'esterno un agente che rende ancora più forte questi legami, nella maggior parte dei casi si va ad utilizzare proprio questo modalità in quanto già normalmente è abbastanza difficile comunque poter vedere l'interazione in quanto il legame tra DNA e proteine è abbastanza blando. Protocollo ChiP: si va ad effettuare il Centnitugazione | cross. link della cellula con la formaldeide in vivo , Supematant: DINA and proteine not antiched . di 10 the beacs si utilizza la formaldeide perché ir Pellet: DNA and proteing attached to he besds | ron questa crea un ponte Estrazione del DNA dalla cellula a Ri linking mediant : : idi So | tatamento conpwasi mo {tra gli amminoacidi \ (1) petemeni A rendendo questo sa legame più forte , inoltre viene Trattamento fisico-chimico per attenere frammenti di cromatina utilizzata perché è ®- @ solubile in acqua , @ % s & @ penetra le membrane Pai ® e quindi non S da Lintae pre interferisce col | Aggiunta di anticorpi e di proteina A| t—=" 4 sistema cellulare e ss = perché il legame ATE della formaldeide e reversibile in quanto noi in un primo momento vogliamo aumentare il legame tra il DNA e le proteine ma poi in un secondo momento le dobbiamo andare a separare quindi il legame deve essere eliminato. È importante non andare ad eccedere con la concentrazione della formaldeide, infatti solitamente si utilizza una concentrazione all' 1% e non eccedere nemmeno con il tempo perché se il trattamento con la formaldeide dura troppo a lungo e probabile che questa vada a mascherare l'attività degli epitopi e che quindi l’anticorpo non riconosce la proteina. A questo punto si va ad effettuare la Lisi cellulare e precipitazione dell'intero estratto cellulare con la frammentazione della cromatina in quanto il DNA va estratto dall’interno della cellula, quindi bisogna effettuare la Lisi cioè la rottura. Ma con questa tecnica non si può agire sul DNA a singolo filamento quindi devo andarlo a Sonicare, cioè frammentarlo e per avere una giusta frammentazione abbiamo fatto più prove, perché quando vado a sonicare posso scegliere il numero di cicli, il sonicatore è una macchina all'interno della quale c'è un'asticella di ferro, in esso mettiamo il DNA che attraverso delle onde viene frammentato e quindi sonicato, posso quindi scegliere il numero di onde da mettere. Il DNA sonicato appare con una banda che non è ben definita in quanto stiamo avendo a che fare con dei frammenti, se invece la banda è più netta vuol dire che i frammenti sono arricchiti. A questo punto avviene la parte dell' immunoprecipitazione, cioè si precipita per una reazione immunologica infatti si sceglie l' anticorpo di interesse che contro la proteina presa in considerazione, ovviamente l' anticorpo deve essere altamente specifico per quella proteina, si vanno ad utilizzare dei supporti che vengono chiamate biglie magnetiche che servono per appesantire il materiale da considerare e distinguerlo dal resto. L' anticorpo riconosce la modifica istonica ed è cosi capace di legarsi alla proteina presente sulla resina. La porzione Fc dell'anticorpo viene riconosciuta dalla proteina che è presente sulle biglie o sulla resina, queste ultime grazie alla loro pesantezza consentiranno la precipitazione del DNA, pertanto solo se l'anticorpo è legato alla proteina la Biglia farà immunoprecipitare il DNA. Adesso bisogna eliminare il legame tra il DNA e la proteina in quanto una volta che si è ottenuto il DNA precipitato la proteina non è più di nostro interesse ma ci importa soltanto del DNA. Avviene quindi il decrosslink tramite l'incubazione a 65 ° che è la temperatura alla quale la formaldeide non funzionano più e quindi le proteine si possono staccare. Questo DNA deve essere ora purificato tramite l’utilizzo del RNasi. A questo punto si ottengono i frammenti di DNA che erano primi legati alla proteina questi frammenti si possono analizzare tramite PCR. oltre al DNA precipitato bisogna portare una aliquota di DNA come controllo, che è stato quindi precipitato ma senza entrare in contatto con l'anticorpo e che quindi non è avvenuta l'immunoprecipitazione (questo prende il nome di input). bisogna poi portare come controllo anche le IgG, in quanto il DNA deve essere immunoprecipitato anche con degli anticorpi generali come le IgG. adesso bisogna verificare la quantità di DNA che era legato alla proteina e che quindi è stato immunoprecipitato, il risultato si ottiene dividendo l'immunoprecipitato con l'input, e poi si va ad effettuare una RT-PCR. Un altro utilizzo di questa tecnica è la cosiddetta ChiP on ChiP che ci permette di separare il DNA e di marcarlo con fluorescenza, una volta ottenuti i singoli frammenti di DNA che sono stati marcati vengono mesi sul microarray , una grata su cui ci sono tanti filamenti di sequenza nota che rappresentano determinate regioni del nostro genoma appunto quando si vanno a mettere poi i filamenti di DNA marcati, se tali filamenti riconoscono il DNA complementare e se si ibridizzato emettono fluorescenza pertanto questa variante permette di vedere dove si s « % # * # Mm Sf trova sull’intero È - - + - Specific competitor - = I * — > + =. Mutantnoncompettor == | Addreaction components genoma la sequenza Yo: ao 404040 Probe gt di DNA che sarà “ È n * + Amb =L piatta precipitata e quindi dove si va a trovare la proteina. SUPECShift ci EMSA Questa tecnica è un ' I saggio che si basa su un cambiamento di immobilità di una Free Probe = banda in un campo Gel separation of complexes -..-.-» Detection of labeled probe vanno a formare un complesso che sostituisce quello precedentemente , ma anche questo complesso ha un'attività ribonucleasica che ha la capacità di digerire nel precursore solo quei punti dove c'è il perfetto appaiamento delle sequenze determinando quindi la formazione di una sequenza più corta , a questo punto si ha la perdita della proteina DICER mentre rimane legata solo la proteina argonauta che hanno il compito di trasportare la molecola matura costituita da circa 22 nucleotidi. Queste proteine argonauta hanno la capacità di dirigere il miRNA ormai maturo verso il loro bersaglio che è l'RNA Messaggero sul quale vanno a ricercare le sequenze complementari. Se il microRNA è adoppia elica per potersi legare con l'RNA Messaggero deve avvenire il distacco dei due filamenti, inoltre l'RNA Messaggero si deve appaiare per complementarietà alle basi e filamenti devono essere in direzione opposta; Quindi se il mRNA è in posizione 5’-3’ allora il miRNA deve mettersi in direzione opposta e quindi 3’-5’. Il filamento che va a legare l'RNA Messaggero viene definito filamento guida, mentre l'altro è definito filamento passeggero. Con la separazione di questi due filamenti si forma un ulteriore complesso che prende il nome di miRISC che viene attivato quando non vi è il filamento passeggero e va trasportare la molecola andando alla ricerca del RNA Messaggero complementare. Noi sappiamo che mRNA è formato da una zona iniziale che prende il nome di cappuccio, poi vi è il tratto 5’ che non viene tradotto, al centro c'è la regione codificante CDS, in seguito troviamo la regione al 3’ che anche in questo caso non viene tradotto e infine la coda di poli- A. Il miRNA è guidato dalle proteine argonauta e cerca le sequenze complementari nella regione 3’ UTR, il legame può mandare un segnale all'inizio dell'RNA Messaggero dove si devono assemblare II ribosomi per la sintesi proteica e questo è un segnale di tipo inibitorio. Infatti negli eucarioti quando viene sintetizzato l’RNA Messaggero e va incontro poi al processo di maturazione, questo deve poi uscire nel nucleo e arrivare nel citosol dove si va ad effettuare la traduzione, se nella regione al 5’ ci sono dei tratti di RNA che tendono a formare delle ansie a forcina, questa deve essere eliminate altrimenti non si può avere lo scorrimento del ribosoma, viene effettuato da una serie di fattori di elongazione che vengono reclutati e alcuni di questi hanno un attività ATPasica grazie alla quale vanno ad eliminare la struttura a forcina. I microRNA hanno la capacità di mandare un segnale sui ribosomi che hanno già iniziato ad assemblarsi sull’RNA per la traduzione e questo è un segnale inibitorio quindi di blocco in questo modo le subunità di ribosoma si dissociano e la sintesi proteica viene bloccata. Questo viene definito regolazione post trascrizionale, infatti avviene dopo la trascrizione ma prima della traduzione. dei circa 22 nucleotidi che compongono i microRNA, vi è una sequenza fondamentale che prende il nome di sequenza seme, è formata da circa 10 nucleotidi ed è quella che va a riconoscere e a legare l'RNA Messaggero, per ogni singolo microRNA si ha una specifica sequenza seme che è appunto specifica per un determinato RNA Messaggero. Alcuni microRNA hanno delle sequenze molto conservate tra le varie specie, e questo va significare che quindi quelle sequenze hanno un ruolo importante nell’evoluzione. I geni che codificano per i vari microRNA, si possono trovare sia sullo stesso cromosoma, ma anche su cromosomi diversi. Quando sono distribuiti su più cromosomi ognuno di loro e un’unità trascrizionale a sé, ma invece ci sono alcuni geni che sono disposti vicini tra di loro a formare un unico gruppo definito anche cluster e questi possono formare un'unica unità, vanno quindi a formare un unico RNA che poi viene processato per dare microRNA diversi, oppure ci sono siti di inizio della trascrizione interposti che possono quindi dare già vita ad primitivi diversi. In alcuni casi soprattutto in drosophila la sequenza che viene riconosciuta può essere complementare e quindi l'appaiamento che si verifica è perfetto, questa è una situazione meno frequente nei mammiferi. Queste sequenze possono trovarsi sia al 3’, ma anche nella sequenza codificante e si va così a generare un substrato per la ribonucleasi che va frammentare il RNA che viene quindi fatto a monconi, ma se questi monconi non sono protetti dal capping e dalla coda poli-A possono essere degradati. A livello dei mammiferi questo è invece un evento più raro. Quando l’RNA Messaggero non viene più prodotto, il ribosoma si va a dissociare e l'’RNA Messaggero si va a legare ad una proteina che prende il nome di P54 grazie alla quale viene trasportata all'interno dei corpi cellulari citoplasmatici dove vengono depositati. Questo perché per creare gli RNA è stata utilizzata molto energia quindi se vado a degradarli questa energia viene persa, per evitare questo spreco vengono così accumulati all'interno di questi corpi cellulari da cui poi possono uscire nel momento in cui la cellula ha bisogno di quella determinata proteina. Se il segnale di blocco si va da esaurire, allora lI'RNA può essere tradotto e produrre la proteina, nel caso in cui poi il segnale di blocco persiste, l' RNA viene degradato definitivamente. Sulla regione al 3’ si possono trovare più siti di riconoscimento e quindi di legame per lo stesso micro RNA, la spiegazione a questo può essere perché magari c'è un'azione di tipo cooperativo, si va infatti a legare il primo complesso RISC per poi richiamare il secondo, il terzo e così via ; Questo viene infatti definito come attività cooperativa sinergica in cui si accumulano più complessi di quelli previsti e questa attività sembra essere legata al fatto che l'effetto di blocco della traduzione è più efficiente ma anche protratto nel tempo. Questi micro RNA intervengono nel corso dello sviluppo embrionale, ma sono importanti anche dopo la nascita perché hanno appunto questa capacità di regolare una serie di geni, una notevole importanza è la presenza di gruppi di micro RNA espressi nelle fibre muscolari perché si vanno ad interessare a delle mutazioni dei muscoli e vanno a mantenere le fibre muscolari funzionali, quando alcuni di loro vengono persi si va a collegare questo fenomeno alla patologia della distrofia muscolare e alla progressione della malattia. Un'altra funzione del microRNA è quella che hanno la capacità di tornare nel nucleo, ritornare sul DNA e andare ad esercitare un'azione di tipo regolatorio sul DNA stesso, si parla quindi di modificazioni epigenetiche che possono andare a silenziare o attivare la trascrizione , questo è possibile perché le proteine argonauta vengono sempre ritrovate all'interno del nucleo e queste fanno sì che quando ritorna nel nucleo portano con se l’RNA che si va a posizionare sul DNA e a determinare delle modifiche della cromatina che nella maggior parte dei casi sono di tipo repressorio. dsRNA siRNA shRNA Queste molecole vanno ad avere una lunghezza di circa 24 nucleotidi e anche in questo caso sono a doppio filamento perfettamente appaiato, Gullo il prodotto finale di questa molecola è uguale a quella dei microRNA ma vanno da avere una derivazione diversa. I siRNA derivano da materiale che si ritrova all'esterno della cellula Formation of che possono essere RNA che forma una struttura RISC ad ansa o a forcina, oppure RNA che forma dei lunghi tratti a doppia elica. Solitamente questa SsIRNA / MRNA- tipologia di RNA è di origine virale, queste complex strutture vengono riconosciuti dagli stessi sliced mRNA “SILENCING” componenti del complesso DICER che si Lega la molecola e si forma anche in questo caso il primo complesso di degradazione per cui le molecole vengono frammentate in corrispondenza alle regioni a doppio filamento. A questo punto l'RNA generato si va ad assemblare al complesso RISC che stacca l'elicasi e i due filamenti il filamento guida che è complementare al Messaggero bersaglio viene guidato dalla proteina argonauta. Il sito di riconoscimento questa volta è localizzato nella regione codificante ed è perfettamente complementare al siRNA, abbiamo quindi la formazione di una regione perfetto appaiamento con il funzionamento dell'attivitàribonucleasica, Il Messaggero viene dunque subito degradato. Quindi la principale differenza tra queste due molecole che stiamo studiando è che il siRNA fa soltanto degradazione del RNA, mentre il miRNA nella maggior parte dei casi blocca la degradazione perché ha funzione regolatore. Ritornando a parlare delle proteine argonauta, queste dovrebbero stare nel citoplasma legate ai ribosomi o comunque ai microRNA, ma le troviamo invece sempre nel nucleo e quindi si è pensato che queste proteine vanno ad avere a che fare anche con il DNA infatti vanno ad operare come elementi di regolazione. Noi sappiamo che la replicazione del DNA avviene lungo tutta la fase S della meiosi, e si è visto che il tempo di replicazione dei vari geni non è sempre uguale infatti vi sono delle tempistiche diverse ad esempio il DNA in forma di eucromatina è quello che viene replicato per prima e la sua replicazione persiste per tutto il tempo della fase S, mentre le regioni di eterocromatina vengono replicate soltanto alla fine della fase S , inoltre sappiamo che la cromatina va ad assorbire una serie di modifiche in particolar modo acetilazionem e metilazione, le proteine argonauta non hanno a che fare direttamente con metilazione e acetilazione degli istoni ma in realtà si portano dietro legati i micro RNA o i siRNA e vanno a partecipare alla trasformazione di un tratto di DNA formato da cromatina più aperta e trascrivibile, ad un tratto di DNA con cromatina compatta e non trascrivibile. I microRNA possono avere delle funzioni opposte, infatti possono essere positivi come nel caso dello sviluppo possono favorire la maturazione delle cellule dei muscoli, ma allo stesso tempo vi sono microRNA che possono andare a bloccare il processo di traduzione, Andremo ad avere quindi un equilibrio tra queste due forme. Inoltre ci sono alcuni micro RNA che hanno la capacità di far convertire un tessuto da una forma ad un'altra, ad esempio nel caso delle cellule tumorali si è visto che eliminare determinati microRNA fa in modo che la cellula non vada incontro a trasformazione, mentre con l'introduzione del micro RNA la cellula passa da normale a tumorale molto più velocemente , quindi nel caso in cui la cellula viene trasformata possiamo dire che il micro RNA vanno ad avere una funzione di oncogene, se invece lo togliamo e la cellula non va incontro a trasformazione tumorale allora possiamo dire che ha attività da oncosoppressore. Nel caso in cui il microRNA vada avere un'attività repressoria questa è limitata nel tempo, infatti questo processo viene anche definito knockdown, in quanto al contrario di knockout in cui abbiamo una perdita totale e definitiva dell’espressione di un gene in questo caso abbiamo azioni limitate nel tempo per cui l'effetto si può manifestare per un determinato lasso di tempo. Data la specifica sequenza dei micro RNA, noi sappiamo che vi è quella regione di circa 10 nucleotidi che è la regione di riconoscimento dell' RNA Messaggero , per conoscere Il Messaggero bersaglio di questi 10 nucleotidi di un determinato micro RNA possiamo fare riferimento ad un analisi bioinformatica con il database blast, in modo tale che la nostra sequenza viene confrontata con tutte le sequenze dei messaggeri di una determinata specie o cellula , il programma viene organizzato in maniera tale da dare degli score ad esempio se dei 10 nucleotidi della sequenza seme del micro RNA , si trova un RNA