SBOBINE BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA (PARTE III), Sbobinature di Biologia Molecolare

Scarica SBOBINE BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA (PARTE III) e più Sbobinature in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! Lezione 12 Una delle maggiori tecniche usate in diagnostica è quella che consiste nell’analizzare un genoma adulto anche se in realtà l’applicazione maggiore di questa tecnica si ha come analisi prenatale tramite l’analisi delle della blastocisti o delle cellule amniotiche. In realtà oggi questi due tipi di analisi sono di routine anche se non risolvono completamente il pericolo che è dato da un 10-4 di probabilità. Oggi si hanno anche tipologie di analisi molto più semplici in quanto è stato dimostrato che nelle cellule della madre fin dalle prime settimane circola DNA fetale consentendo di svolgere direttamente un analisi. Quindi anche queste analisi di tipo genetico hanno una invasività minima che consente il loro svolgimento anche in laboratori molto semplici e solitamente vengono svolte su diverse basi. Ad esempio l’anemia falciforme è limitata ad alcune zone geografiche in cui il tasso di incidenza è maggiore per vari motivi in quanto il genotipo di anemia falciforme in quei territori veniva selezionato positivamente in quanto rappresentava un vantaggio evolutivo. Ad ognuno di noi se si avesse una malattia genetica di cui è stato visto il problema a livello della sequenza di DNA si potrebbe mettere appunto un test che tramite amplificazione consente di studiare la zona interessata. Nel caso in cui la mutazione sia molto diversa dal wild type ad esempio a causa di una delezione si necessita solo di analizzare la taglia del frammento per stabilire l’avvenimento della mutazione, strategia che non è utilizzabile ad esempio per l’anemia falciforme e per la fibrosi cistica. Prendendo dal sangue dei leucociti si ha sicuramente ricchezza di DNA per cui tramite PCR è possibile analizzare un determinato cromosoma facendo degli inneschi non troppo distanti tra loro e si otterrà quindi una PCR positiva. Se invece si pongono due inneschi che non sono in grado di ibridizzarsi al DNA si avrà una PCR negativa perché verranno prodotte 0 molecole di amplificazione dato che gli inneschi non trovano una controparte a livello del DNA. Un altro test è quello dovuto all’infezione da parte di qualsiasi microrganismo che è saggiabile tramite un test simile alla PCR dato dall’uso di inneschi in grado di ibridizzarsi col genoma di questo microrganismo di cui voglio saggiare la presenza. Questi inneschi si ritroveranno quindi in un mare di DNA che è il DNA dell’ospite e si hanno varie sorgenti come ad esempio il liquor cerebrospinale fondamentale ad esempio per l’analisi da streptococco. In tutte queste sorgenti tra cui si ha il sangue, tamponi orofaringei, biopsie ecc…si ha una grande abbondanza di DNA del paziente ugualmente contaminato da DNA o da RNA generato dall’organismo responsabile di quella particolare patologia. Quindi utilizzando sonde specifiche per l’acido nucleico infettante posso stabilire la presenza dell’agente infettivo anche grazie alla presenza ad esempio di problemi polmonari che sono sintomo della tubercolosi una malattia che era molto comune. Per avere quindi un’analisi sicura si deve per forza applicare questo metodo che poteva anche essere fatto con metodologie classiche anche se richiedono tempi lunghissimi in quanto prima vanno fatte delle colture e successivamente va isolato l’organismo. Quindi la PCR è sicuramente una tecnica più rapida e si svolge prendendo uno ispettorato in cui si avrà tanto DNA dell’ospite ma in cui si sarà anche DNA del batterio della tubercolosi. Quindi l’analista avendo queste ipotesi utilizza na coppia di sonde specifiche per il DNA: se la PCR è positiva vuol dire che in quel campione era presente il DNA del batterio che era quindi il responsabile dell’infezione mentre se la PCR è negativa 1 Lezione 12 ovvero non si ha l’amplificato vuol dire che non è presente il DNA del batterio per cui l’infezione è dovuta a qualche altro fattore. La potenza della PCR sta nella sua sensibilità in quanto basta poco materiale per ottenere un DNA amplificato ed è estremamente selettiva per cui scegliendo accuratamente un primer questo va a posizionarsi solo a livello dell’acido nucleico di interesse. Se oggi si avesse un batterio nuovo che si è rivelato essere importante per una malattia si può comunque svolgere un processo di questo tipo prendendo la sequenza del batterio e provando a fare delle copie di inneschi alla distanza di 100-200 basi. Se la PCR non va bene perché oltre all’amplificato atteso se ne hanno anche altri dato che si è scelto una zona del genoma che presenta una sequenza comune ad altri genomi si sceglie un altra zona e in ogni caso un test di questo tipo è molto vantaggioso in quanto può essere messo a punto in tempi molto brevi. I test commerciali più comuni sono quelli contro il Papilloma e il micobatterio anche se in generale questi possono essere svolti per tutte le tipologie di microrganismo. La clamidia è una infezione ginecologica dato da un batterio particolare difficilmente coltivabile in quanto è endocellulare e quindi è un ottimo soggetto di analisi mediante PCR dato che possiede costantemente plasmidi presenti in una decina di copie nella cellula. Questo rende ancora più alta la sensibilità della PCR perché se raccolgo un batterio in realtà non raccolgo una copia di DNA ma ne raccolgo 10. Questi in questo caso si raccoglie del tessuto a livello uterino come ad esempio tramite il pap test e da queste cellule si estrae il DNA che sarà formato sia dal DNA della donna da cui è stato prelevato il campione che dal DNA plasmidico della clamidia su cui si può svolgere l’amplificato. Se la PCR è positiva vuol dire che quell’infezione è dovuta dalla clamidia. Nel caso della tubercolosi non esiste un solo un micobatterio ma ne esistono tanti ceppi diversi che reagiscono in maniera diversa agli antibiotici in quanto presentano al loro interno dei genomi diversi. Quindi nell’analisi non solo è possibile stabilire se è presente o meno il micobatterio ma si può anche definire a quelle ceppo esso appartiene usando delle coppie di inneschi che sfruttino la differenza di sequenza tra genomi dei ceppi diversi. Questo in genere è abbastanza semplice perché nell’evoluzione della vita sulla terra tutti i pluricellulari che si conoscono nascono da pochissime specie iniziali che si sono evolute: tutti noi proveniamo in realtà d pochi organismi. Quindi nell’ambito degli animali dato che derivano a partire da un organismo ancestrale comune si può definire che comunque non si ha una grande differenza dal punto di vista delle caratteristiche. In realtà la diversità genetica è enorme per cui quando si parla di due ceppi di micobatterio si parla di due ceppi che hanno una distanza genetica simile a quella che si ha tra noi e un altro animale anche se sembrano identici e questo principio è applicabile non solo ai ceppi batterici ma anche ad esempio ai ceppi virali. Quindi fare una tipizzazione ovvero un’analisi del gene è molto facile perché due ceppi apparentemente identici tra loro dal punto di vista della sequenza di DNA sono ben distinguibili l’uno dall’altro. Il vaccino del Papilloma è un vaccino particolarmente sicuro in quanto i soggetti vaccinati non dovrebbero essere infettati da Papilloma che non è strettamente ginecologica in quanto anche nel maschio si può avere l’infezione che di per sé non è particolarmente grave. Il problema sta nel fatto che questo virus così come l’epatite B che di per sè 2 Lezione 12 Nel laboratorio in cui viene fatta la PCR si hanno regole strettissime per evitare i falsi positivi perché se si fa ad esempio la diagnostica di HIV la maggiore concentrazione di sangue infetto è nei laboratori di diagnosi per cui se si deve fare una glicemia e si contamina un sangue pieno di glucosio cambierà un decimale del risultato finale. Se lo stesso si fa con una microgoccia di un campione infetto e di un campione sano quest’ultimo diventa infetto per cui si devono evitare le contaminazioni tramite una serie di modalità. Quindi su 10 test si ha in media un test falso definito mock per cui il difetto della PCR è quello di essere molto sensibile anche a contaminazioni minime. L’applicazione della PCR in genetica forense si basa sulle sequenze altamente ripetitive che non sono abbondantissime nel nostro genoma ma si trovano in specifiche zone in cui le ripetizioni sono date da corte sequenze altamente ripetitive di poche basi. Queste sequenze rappresentano il DNA satellite che forma circa il 5% del nostro genoma e nel momento della meiosi l’appaiamento del crossing over può fare degli errori dovuti al fatto che tutte queste sequenze sono identiche tra loro. Quindi l’appaiamento dei due cromatici omologhi è più facile che avvenga in maniera non corretta in questi punti per cui nella nostra storia dei crossing over ineguali si hanno alle spalle milioni di eventi di meiosi che portano ad esempio al cluster delle globine. Questi loci che hanno queste sequenze presentano quindi un altissimo polimorfismo per quanto riguarda la lunghezza di queste ripetizioni proprio perché alle spalle si ha una storia di un probabile crossing over ineguale. Parlando di sequenze che non hanno nessuna utilità di fatto non si ha nessun problema e ognuno di noi ha delle lunghezze particolari che ha ereditato dal patrimonio genetico del padre e della madre che sono molto diversificati. Questi loci sono circa un centinaio e vengono solitamente analizzate con PCR particolari date dall’uso di sequenze di primer molto corti e molto particolari. Ognuno di noi quindi avrà una sua collezione di frammenti che è la somma di quelli paterni e di quelli materni e questi polimorfismi tendono ad essere diversissimi tra due estranei ed è quindi il principio che viene utilizzato per l’identificazione personale. Quindi facendo l’analisi su un centinaio di queste bande si hanno degli algoritmi che ci dicono che se la quota di bande uguali è sotto una certa soglia i DNA sono estranei, identici (sangue trovato sul luogo del delitto) oppure se si ha una certa similarità che supera una certa soglia vuol dire che gli individui sono parenti molto stretti. Questa tecnica quindi viene anche usata per fare test di parentela non solo per analisi forense ma anche per fare il test di paternità. In questo caso se si ha un genitore incerto oggi si hanno a disposizione degli strumenti molto semplici e non molto costosi che permettono di analizzare la paternità. Nella genetica medica questi test genetici sono molto comuni e molto semplici da utilizzare in quanto si basano sull’estrazione di un tampone dalla cavità orale. 5 Lezione 12 Il progetto genoma permise di svelare la sequenza del genoma che è estremamente importante per varie applicazioni non solo a livello dell’uomo ma a livello di tantissimi organismi e ha permesso lo sviluppo di tecniche molto più rapide. Questa scoperta è stata possibile anche grazie allo viluppo delle tecnologie in quanto svolgere la sequenza manuale del genoma umano richiede una quantità di tempo enorme mentre un computer è in grado di svolgere dei calcoli molto più rapidi. Fu messo su un consorzio mondiale formato da una centinaia di laboratori e ad ogni laboratorio fu dato un pezzo di genoma sotto forma di cromosoma aggiuntivo di lievito ovvero un cromosoma umano che era stato inserito in una cellula di lievito: era diventato un cromosoma di lievito perché gli era stato aggiunto un dominio di replicazione anche se doveva avere una taglia precisa data da una decina di milioni di basi. Questi frammenti vennero analizzati usando un enzima di restrizione PCL1 che taglia normalmente una volta ogni 200 paia di basi e va quindi ad agire su una sequenza molto comune a livello dei geni: si ha quindi una reazione di taglio enzimatico che viene portata avanti per poco tempo in modo tale che PCL non fosse in grado di tagliare tutti i siti ma che tagliasse in media ogni circa mille basi. Quindi ciascuna molecola di DNA veniva tagliata in maniera casuale a seconda di quali siti venivano utilizzati ottenendo una collezione di frammenti derivanti dalla digestione di molte migliaia di copie. In questa maniera si faceva sequenza casuale di tutti questi frammenti per cui se si faceva ad esempio la sequenza di due frammenti si otteneva la sequenza di due zone senza alcuna informazione sulla loro posizione. Ogni tanto però si potevano osservare delle sovrapposizioni che permettevano di stabilire quale fosse la continuità della sequenza del DNA: ricostruendo la sequenza di tutti i frammenti era possibile generare la sequenza del frammento più grande presente nel lievito che assieme alle sequenze degli altri cromosomi permise di ottenere la sequenza totale. Oggi quello che si fa per ottenere la sequenza del DNA si prende tutto il DNA e lo si frammenta in frammenti di 100-200 basi e si comincia a sequenziare indipendentemente dai cromosomi in quanto è il computer che porta a ricostruire la sequenza complessiva. Facendo quindi più sequenze ripetute si possono evitare errori o incertezze a livello del calcolo che viene comunque svolto dai computer e non manualmente. 6